CN115006369B - 一种脑靶向类脂纳米囊载药系统及其制备方法和应用 - Google Patents

一种脑靶向类脂纳米囊载药系统及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN115006369B
CN115006369B CN202110235658.0A CN202110235658A CN115006369B CN 115006369 B CN115006369 B CN 115006369B CN 202110235658 A CN202110235658 A CN 202110235658A CN 115006369 B CN115006369 B CN 115006369B
Authority
CN
China
Prior art keywords
drug
lncs
act
egcg
brain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110235658.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN115006369A (zh
Inventor
陆柏益
吴礼鹏
杨开来
黄伟素
高溯楠
陈思琪
孙宇豪
徐涛
柳岩
陈祁
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang University ZJU
Original Assignee
Zhejiang University ZJU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang University ZJU filed Critical Zhejiang University ZJU
Priority to CN202110235658.0A priority Critical patent/CN115006369B/zh
Publication of CN115006369A publication Critical patent/CN115006369A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN115006369B publication Critical patent/CN115006369B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/545—Heterocyclic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/111—Aromatic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/116—Heterocyclic compounds
    • A23K20/121—Heterocyclic compounds containing oxygen or sulfur as hetero atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/158—Fatty acids; Fats; Products containing oils or fats
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/195—Antibiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6925—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a microcapsule, nanocapsule, microbubble or nanobubble
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5123—Organic compounds, e.g. fats, sugars
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5146—Organic macromolecular compounds; Dendrimers obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, polyamines, polyanhydrides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/06—Free radical scavengers or antioxidants
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Fodder In General (AREA)

Abstract

本发明公开了一种脑靶向类脂纳米囊载药系统及其制备方法和应用，属于靶向给药技术领域。所述脑靶向类脂纳米囊载药系统，包括包载药物X的类脂纳米囊，所述类脂纳米囊的组成包括：卵磷脂、中链甘油三酯和聚乙二醇12羟基硬脂酸酯，所述类脂纳米囊表面修饰有表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG。该载药系统以类脂纳米囊为载体，以EGCG作为靶向材料，利用EGCG与脑神经内皮细胞表面的大麻素1型受体的特异性结合，实现脑靶向的作用。该载药系统可以明显提高神经保护药物的血脑屏障透过能力、提高其抗阿尔茨海默病作用和延缓衰老的作用。除此之外，该载药系统还可用于宠物食品，提高老年宠物的认知能力。

Description

一种脑靶向类脂纳米囊载药系统及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于靶向给药技术领域，具体而言，涉及一种脑靶向的载药系统及其制备方法和应用。
背景技术
随着人类社会老龄化，脑部疾患的发病率逐年上升。目前，全世界约有15亿人患有不同程度的中枢神经系统疾病，这已经成为危害人类生命和健康的重大疾病。据统计，我国65岁以上人群中，神经退行性疾病的患病率已经超过5％。另外，随着社会发展，宠物饲养已经成为居民消费的新亮点，但是宠物寿命较短，一般宠物狗或猫的寿命约为10年左右，进入老年期的宠物容易出现老年痴呆，反应不灵敏等症状。目前，对神经退行性疾病尚缺乏有效的治疗药物和方法。
血液系统与脑组织之间存在一种屏障系统—血脑屏障(blood brain barrier)，血脑屏障(BBB)是由大脑微血管内皮细胞、毛细管基底膜、星形细胞末端和周皮细胞组成，这些细胞具有维持神经元微环境的稳定性和调节血管，溶解纤维蛋白和平衡体内组织等功能。BBB作为血液循环与中枢神经系统之间特殊的生物屏障，它保护大脑免受血源性病原体如病毒，细菌，寄生虫等毒素的侵害，严格限制流体和离子的进入以确保中枢神经系统的最佳状态。但同时也限制了多数药物的脑内转运。据统计，目前临床使用的药物中，约有98％的小分子化合物和几乎100％的大分子药物，包括蛋白多肽和基因药物都难以入脑，这严重阻碍了脑肿瘤、帕金森、阿尔茨海默病等严重威胁人类健康的中枢神经系统疾病的临床药物治疗。因此，血脑屏障成为了中枢神经系统疾病药物治疗的瓶颈。
转运药物通过血脑屏障的研究受到了广泛的关注。物质透过BBB主要通过以下5中途径：(1)亲水小分子通过紧密连接的被动转运；(2)亲脂物质的跨胞转运；(3)转运蛋白介导转运葡萄糖、氨基酸、胆碱等小分子营养物质；(4)受体介导转运蛋白质等大分子多肽；(5)通过静电作用力吸附阳离子物质后胞吞入脑。
为了增强药物的血脑屏障透过性，人们尝试了多种策略以增加药物的脑内递送。纳米材料特别是表面功能化的纳米材料，已成为增强药物从血液到脑的运输的有效工具。根据药物透过血脑屏障的机制不同，脑靶向递药系统可以分为两类：①以化学为基础的脑靶向递送系统，如制备脂溶性较高的前体药物和化学药物递送系统，药物主要以被动扩散透过血脑屏障；②以生物学为基础的脑靶向递药系统，药物主要以受体、吸附或转运体介导的方式实现跨血脑屏障转运。
ApoE修饰包载白藜芦醇的固体脂质纳米粒后，白藜芦醇通过体外血脑屏障的能力提高了1.8倍。用山榆酸甘油酯，吐温-80和聚乙烯醇制成负载白藜芦醇的固体脂质纳米粒，可以使白藜芦醇在脑内的浓度提高5倍。用转铁蛋白修饰负载有α-倒捻子素的脂质体后，可以提高脑神经细胞对α-倒捻子素的摄取率，提高α-倒捻子素的入脑浓度，提高药效。但目前尚未有通过纳米递送系统提高苯乙醇苷类物质脑靶向性的报道。
类脂纳米囊(LNCs)具有不含有机溶剂，能量低，性质较稳定，易吸收等特点，同时，类脂纳米囊的包封率较高，载药性能良好。LNCs的结构由类脂构成的囊核和表面活性剂构成的囊壳组成。LNCs由油、水、表面活性剂及助表面活性剂组成，常用的油相有辛酸/葵酸甘油三酯，软脂酸乙酯等，水相多为氯化钠水溶液，乳化剂多用卵磷脂，吐温80等。表面活性剂常用十二烷酸，聚乙二醇12羟基硬脂酸酯等。最常用的类脂纳米囊制备方法是相转变温度法，需要往复循环数次的升温降温(90℃—60℃)的过程，但是一些具有神经保护作用的化合物在高温下容易降解。因此，需要温和的条件来制备类脂纳米囊。
开发一种能够实现跨血脑屏障转运的类脂纳米囊，同时能够保持包载的神经保护药物药效，将是本领域技术人员需要解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有脑靶向作用的类脂纳米囊载药系统，以解决因血脑屏障对外源性物质的抵御作用而导致药物无法进入脑组织发挥神经保护作用的问题。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种脑靶向类脂纳米囊载药系统，包括包载药物X的类脂纳米囊，所述类脂纳米囊的组成包括：卵磷脂、中链甘油三酯和聚乙二醇12羟基硬脂酸酯，所述类脂纳米囊表面修饰有表没食子儿茶素没食子酸酯。
本发明提供了一种表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)修饰的包载有药物X的类脂纳米囊，以类脂纳米囊作为载体，以EGCG作为靶向配体。利用EGCG配基特异性识别脑神经内皮细胞表面的大麻素1型(CB1)受体，通过受体介导的吞噬作用，以及脂性的纳米粒材料与大脑细胞膜亲和力强和纳米粒吞噬透膜途径，帮助包载有药物X的类脂纳米囊有效进入脑内，提高药物X在脑组织和细胞内的药物浓度。该载药系统能够实现药物的跨血脑屏障、靶向治疗的双重功能，能够解决现有脑部疾病药物靶向性不足、用药剂量过高的技术问题。
所述药物X可以为具有神经保护活性的化合物，优选的，所述药物X为毛蕊花糖苷、松果菊苷、阿霉素、紫杉醇或姜黄素。
本发明还提供了一种制备所述脑靶向类脂纳米囊载药系统的方法，该制备方法包括以下步骤：
(1)将药物X溶解于无水乙醇中，再加入聚乙二醇12羟基硬脂酸酯、中链甘油三酯、卵磷脂和氯化钠，搅拌混匀，得到油相混合液；
(2)将上述油相混合液逐滴加入0℃蒸馏水中，搅拌使油相和水相混匀，再用旋转蒸发仪除去乙醇，分离得到包载药物X的类脂纳米囊；
(3)将包载药物X的类脂纳米囊与表没食子儿茶素没食子酸酯乙醇溶液混合，搅拌至乙醇完全蒸发，制得所述的脑靶向类脂纳米囊载药系统。
进一步地，以质量百分比计，油相混合液中聚乙二醇12羟基硬脂酸酯的浓度为10～50％，中链甘油三酯的浓度为10～20％，卵磷脂的浓度为1～5％，氯化钠的浓度为1～3％；药物X的浓度为1～3％。
所述中链甘油三酯为辛酸/葵酸甘油三酯。
优选地，以质量百分比计，油相混合液中聚乙二醇12羟基硬脂酸酯的浓度为20～30％，中链甘油三酯的浓度为15～20％，卵磷脂的浓度为1.5～2％，氯化钠的浓度为1.5～2％；药物X的浓度为1～2％。
更为优选，以质量百分比计，油相混合液中聚乙二醇12羟基硬脂酸酯的浓度为30％，中链甘油三酯的浓度为15％，卵磷脂的浓度为1.5％，氯化钠的浓度为1.5％；药物X的浓度为2％。
步骤(2)中，蒸馏水的重量为混合液的5～10倍，搅拌的速率为500～600rpm。混合液滴加过程中配合一定速率的搅拌有助于形成粒径均匀的类脂纳米囊。
滴加完成后，采用旋转蒸发仪蒸发掉乙醇，得到不含乙醇的X-LNCs溶液；然后将制得的X-LNCs溶液过凝胶色谱柱，以除去氯化钠和未包封的X。
步骤(3)中，将包载药物X的类脂纳米囊与表没食子儿茶素没食子酸酯乙醇溶液混合，于室温下以250rpm的速度磁力搅拌24h以上，使乙醇完全蒸发。在搅拌过程中，EGCG吸附于类脂纳米囊表面，赋予类脂纳米囊跨越血脑屏障的性能。
进一步地，步骤(3)中，包载药物X的类脂纳米囊与表没食子儿茶素没食子酸酯乙醇溶液以体积比3:1混合，其中表没食子儿茶素没食子酸酯乙醇溶液的浓度为10～30mg/mL。优选地，EGCG乙醇溶液的浓度为25mg/mL。
本发明制备的包载有药物X的类脂纳米囊通过用EGCG修饰后，制成EGCG-X-LNCs，借助EGCG以CB1受体介导胞吞转运方式增加X的脑内转运，增强X的血脑屏障透过性，是一种具有脑靶向的纳米粒药物剂型。另外，类脂纳米囊有助于延缓药物的释放速率，延长其在体内循环时间。因此，本发明提供了所述的脑靶向类脂纳米囊载药系统在制备跨越血脑屏障药物中的应用。
药物X可以采用具有神经保护活性的化合物，经过本发明制备方法的改造之后，帮助神经保护化合物透过血脑屏障，增加其在脑组织和细胞内积累浓度，提高其抗AD作用，延缓衰老的作用和提高老年宠物的认知能力。
因此，本发明提供了所述的脑靶向类脂纳米囊载药系统在制备治疗阿尔茨海默病药物中的应用。
本发明还提供了所述的脑靶向类脂纳米囊载药系统在制备抗衰老药物中的应用。
与现有技术比，本发明的有益效果如下：
1)本发明制备的EGCG-X-LNCs利用类脂纳米囊载体包裹具有神经保化合物X，使其在体内循环过程中保持稳定，延长其在体内循环时间，通过EGCG特异性的识别脑内受体，可以透过血脑屏障，提高脑组织和细胞内的药物浓度，从而提高其神经保护作用。
2)本发明提供的制备方法条件温和，可以有效的解决一些神经保护化合物高温不稳定问题，得到高负载量的X-LNCs，然后用EGCG修饰，提高X的血脑屏障通过率。
3)本发明制备的EGCG-X-LNCs的药物释放率为65.38％，且不存在突释现象和药物降解现象，表明类脂纳米囊大大延缓X的释放速率，具有缓释作用，不仅可以避免药物直接大量释放造成的毒性，还可以防止其在血液循环过程中药物的泄露，提高其循环次数，进而增加药物在脑部的蓄积。
4)本发明提供的EGCG-X-LNCs制备方法操作简单，所得EGCG-X-LNCs可以提高细胞摄取，增强脑靶向作用，因此易于推广，可用于制备治疗阿尔茨海默病的药物，和延缓衰老的药物，同时还可添加到宠物饲料中，延缓宠物衰老，具有广阔的临床应用前景和明显的社会经济价值。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
通用方法
1、EGCG修饰的包载有神经保护化合物X的类脂纳米囊的制备：
首先将20mg化合物X加入到500mg乙醇中，于室温下以500rpm的速度磁力搅拌，使化合物X完全溶解，然后加入300mg聚乙二醇12羟基硬脂酸酯，150mg辛酸/葵酸甘油三酯，15mg卵磷脂，15mg氯化钠，使整个体系的总重量为1g，继续搅拌混匀，形成有机相。将上述有机相溶剂逐滴加入5g 0℃的蒸馏水中，以500rpm的速度磁力搅拌10min。然后用旋转蒸发仪蒸发掉其中的乙醇，形成稳定不含乙醇的的X-LNCs溶液。再将制得的X-LNCs溶液过凝胶色谱柱，以除去氯化钠和未包封的化合物X。通过调节各试剂间的不同比例，可以形成不同粒径的X-LNCs。
将制备好的X-LNCs同25mg/mL的EGCG醇溶液以3:1(v/v)的比例混合，于室温下以250rpm的速度磁力搅拌24h以上，使乙醇完全蒸发，最终形成不含乙醇的液相体系，EGCG的量约占总质量的0.85％。通过调节X-LNCs和EGCG的比例，可以制得不同粒径的EGCG-X-LNCs。
2、类脂纳米囊包封率的测定
包封率＝过膜离心后类脂纳米囊中X的含量/过膜前类脂纳米囊中X的含量×100％。
3、类脂纳米囊理化性质、粒径和zeta电位测定
取200μL类脂纳米囊，加蒸馏水稀释至2mL。使用Malvern激光粒度仪，以动态光散射法测定不同类脂纳米囊的粒径、多分散系数和zeta电位。重复测定3次，每次设定循环测10次。
4、透射电子显微镜观察类脂纳米囊形态
透射电镜观察EGCG-X-LNCs形态。透射电镜加速电压设为120kV。取适量类脂纳米囊稀释至合适浓度，滴一滴在电镜专用铜网上，用2％磷钨酸染色，晾干后采用透射电镜观察其形态。
5、类脂纳米囊体外释放考察
采用透析法考察类脂纳米囊体外释放行为。分别取1mL X醇溶液、X-LNCs、EGCG-X-LNCs于截留分子量为7000-12000Da的透析袋中，置于25mL的PBS(含10％ FBS)溶液中。将释放体系放入摇床中，分别于6，12，24，48，72h取样0.5mL，同时补充0.5mL新的PBS。每种制剂重复3次。测定各取出样品中X的浓度，并计算每种制剂在各时间点的累积释放量。
实施例1EGCG修饰的毛蕊花糖苷(ACT)类脂纳米囊的制备、表征及模拟体外释放的研究
1、制备方法见通用方法
2、结果
ACT-LNCs及EGCG-ACT-LNCs的粒径、多分散指数(PDI)、zeta电位、包封率如表1所示。ACT-LNCs和EGCG-ACT-LNCs的平均粒径分别为93.4nm和118.4nm，且具有小窄的PDI(约0.2)，说明分散性良好；zeta电位-10.5、10.2mV，且包封率均大于90％，说明制备重现性良好。
表1、毛蕊花糖糖类脂纳米囊的粒径、zeta电位和包封率
LNCs 粒径(nm) PDI Zeta(mV) 包封率(％)
Blank-LNCs 90.6 0.195 -10.8
ACT-LNCs 93.4 0.202 -10.5 93.7
EGCG-ACT-LNCs 118.4 0.201 -10.2 94.1
体外释放实验结果表明，游离ACT在前12h就已经释放了85％左右，ACT-LNCs和EGCG-ACT-LNCs的释放速率明显慢于游离ACT；ACT-LNCs和EGCG-ACT-LNCs均呈现稳定缓慢的释放状态，在PBS(pH7.4)中透析72小时后，游离ACT、ACT-LNCs和EGCG-ACT-LNCs的药物释放率分别为88.38％，64.46％和65.38％，类脂纳米囊中的毛蕊花糖苷不存在突释现象和药物降解现象，表明类脂纳米囊能大大延缓毛蕊花糖苷的释放速率，具有缓释作用。结果如表2所示。
表2、EGCG-ACT-LNCs模拟体外释放结果
3、结论
制备的EGCG-ACT-LNCs，具有良好的理化性质：平均粒径约100nm，多分散指数窄，zeta电位相对稳定，对毛蕊花糖苷的包封率均较高(90％以上)。选用透析袋法模拟体内释放环境，发现在pH7.4的条件下，72h后，EGCG-ACT-LNCs的药物释放率为65.38％，且不存在突释现象和药物降解现象。EGCG-ACT-LNCs呈现稳定缓慢的释放状态，这种缓释的特点，可以防止类脂纳米囊在血液循环过程中药物的泄露，有利于增加类脂纳米囊在脑部的蓄积。
实施例2EGCG修饰的松果菊苷(ECH)、或阿霉素(DOX)、或紫杉醇(PTX)或姜黄素(CUR)类脂纳米囊的制备、表征及模拟体外释放的研究
1、制备方法见通用方法
2、结果
EGCG-ECH-LNCs，EGCG-DOX-LNCs，EGCG-PTX-LNCs，和EGCG-CUR-LNCs的粒径、多分散指数(PDI)、zeta电位、包封率如表3所示。模拟体外释放结果如表4所示。松果菊苷(ECH)，阿霉素(DOX)，紫杉醇(PTX)，和姜黄素(CUR)的多分散指数(PDI)、zeta电位、包封率和模拟体外释放结果同毛蕊花糖糖苷类似，说明该载体系统可以包载不同的神经保护化合物。
表3、EGCG修饰类脂纳米囊的粒径、zeta电位和包封率
LNCs 粒径(nm) PDI Zeta(mV) 包封率(％)
EGCG-ECH-LNCs 124.9 0.215 -11.8 93.56
EGCG-DOX-LNCs 122.5 0.221 -11.5 92.48
EGCG-PTX-LNCs 123.4 0.221 -12.8 91.67
EGCG-CUR-LNCs 121.4 0.225 -11.9 92.26
表4、EGCG-X-LNCs模拟体外释放结果
实施例3EGCG修饰的毛蕊花糖苷类脂纳米囊的处方工艺的研究
用单因素考察研究EGCG修饰的毛蕊花糖苷类脂纳米囊的处方工艺。固定其它制备条件不变，只改变单个因素，调节乙醇的用量，使整个体系的质量为1g，以粒径和包封率为指标，来考察EGCG-ACT-LNCs的处方和工艺。
(1)毛蕊花糖苷用量的考察
分别投入ACT的质量为10、15、20、25、30mg。其余试剂比例不变，制备ACT-LNCs。结果如表5所示。当ACT用量为20mg时，ACT-LNCs的包封率最高。
表5、ACT用量对ACT-LNCs粒径和包封率的影响
ACT用量(mg) 10 15 20 25 30
乙醇用量(mg) 510 505 500 495 490
粒径(nm) 82.3 86.5 93.4 83.6 102.3
包封率(％) 81.31 91.25 94.17 91.16 92.25
(2)卵磷脂用量的考察
分别投入卵磷脂的质量为10、15、20、25、30mg。其余试剂比例不变，制备ACT-LNCs。结果如表6所示。当卵磷脂用量为15mg时，ACT-LNCs包封率最高。
表6、卵磷脂用量对ACT-LNCs粒径和包封率的影响
卵磷脂用量(mg) 10 15 20 25 30
乙醇用量(mg) 505 500 495 490 485
粒径(nm) 91.3 93.4 94.5 96.8 108.2
包封率(％) 80.46 94.17 92.08 85.36 84.59
(3)聚乙二醇12羟基硬脂酸酯用量的考察
分别投入聚乙二醇12羟基硬脂酸酯的质量为100、200、300、400、500mg。其余试剂比例不变，制备ACT-LNCs。结果如表7所示。当聚乙二醇12羟基硬脂酸酯用量为300mg时，ACT-LNCs包封率最高。
表7、聚乙二醇12羟基硬脂酸酯用量对ACT-LNCs粒径和包封率的影响
(4)辛酸/葵酸甘油三酯用量的考察
分别投入辛酸/葵酸甘油三酯的质量为100、125、150、175、200mg。其余试剂比例不变，制备ACT-LNCs。结果如表8所示。当辛酸/葵酸甘油三酯用量的用量为150mg时，ACT-LNCs包封率最高。
表8、辛酸/葵酸甘油三酯用量对ACT-LNCs粒径和包封率的影响
(5)EGCG溶液浓度的考察
将制备好的ACT-LNCs分别同10mg/mL，15mg/mL，20mg/mL,25mg/mL，30mg/mL的EGCG溶液以3:1(v/v)的比例混合，于室温下以250rpm的速度搅拌24h。制备EGCG-ACT-LNCs。结果如表9所示。当EGCG溶液浓度为25mg/mL和30mg/mL时，制得的EGCG-ACT-LNCs的粒径差异不大，从成本的角度考虑，选择EGCG溶液浓度为25mg/mL。
表9、EGCG溶液浓度对粒径的影响
EGCG浓度(mg/mL) 10 15 20 25 30
粒径(nm) 94.6 96.5 98.5 118.4 119.6
实施例4EGCG修饰毛蕊花糖苷类脂纳米囊体外血脑屏障透过能力
1、测试方法
(1)体外BBB模型的建立
星形胶质细胞(AS)在细胞共培养池的种植：取AS，冷PBS洗涤2遍，0.25％胰蛋白酶与0.02％ EDTA1:1混合液消化，待细胞收缩变圆，吸去消化液，加入含20％胎牛血清的DMEM培养基终止消化，离心100r/min，5min，收集细胞，加入含20％胎牛血清的DMEM完全培养基重悬，调整细胞密度至5×105/mL种植于细胞培养池PCM的下侧，200μL/孔，依靠液体张力培养4h，然后将培养池翻转放入6孔培养板继续培养，在6孔板内加1.5mL完全培养基，共培养池内加入0.5mL完全培养基，放入5％CO2培养箱37℃培养，3d换液1次，待AS融合至90％时，在PCM上侧种植脑神经内皮细胞(BMECs)。
BMECs在细胞共培养池的种植：取BMECs，冷PBS洗涤细胞2遍，加入0.25％胰蛋白酶与0.02％EDTA1:1混合液消化，待细胞收缩变圆，吸去消化液，加入含20％FBS的DMEM培养基终止消化，离心800r/min，收集细胞，加入DMEM完全培养基重悬，调整细胞密度至4×105mL，吸取0.5mL种植于细胞培养池内，使PCM上细胞密度为2×105/cm2，在培养池外侧6孔培养板内加入完全培养基1.5mL，3d换液1次，至两种细胞分别在PCM两侧成单层生长时，测量跨内皮细胞电阻(TEER)。
(2)EGCG-ACT-LNCs对体外BBB模型TEER值的影响
待体外BBB模型培养7天后，吸出膜两侧的培养液，用预热至37℃的无血清DMEM培养基清洗模型2～3次，将受试化合物用无血清DMEM培养基配制成浓度为50、100、200、400μM的稀释液，分别每孔200μL加入模型的AP侧，BL侧加入1.2mL的无血清DMEM培养基，37℃、5％CO2培养箱中孵育3h后，测定TEER值。
(3)EGCG-ACT-LNCs对体外BBB模型通透性的影响
待体外BBB模型培养7天后，吸出膜两侧的培养液，用预热至37℃的无血清DMEM培养基清洗模型2～3次，将受试化合物用无血清DMEM培养基配制成浓度为50、100、200、400μM的稀释液，分别每孔200μL加入模型的AP侧，BL侧加入1.2mL的无血清DMEM培养基，37℃、5％CO2培养箱中孵育3h后，测定Na-FLU的表观渗透系数。
(4)EGCG-ACT-LNCs在体外BBB模型中的透过性研究
待体外BBB模型培养7天后，吸出膜两侧的培养液，测定毛蕊花糖苷的浓度。
2、结果
受试化合物(游离ACT，ACT-LNCs，EGCG-ACT-LNCs)对体外BBB模型的影响：实验结果见表10，在50～400μM浓度范围内，细胞存活率随着受试化合物(游离ACT，ACT-LNCs，EGCG-ACT-LNCs)浓度的增加而显示不同程度的升高，但无明显的抑制作用，因此，受试化合物在50～400μM浓度范围内可用于体外BBB的透过性。在50～400μM浓度范围内，受试化合物对体外BBB模型的TEER值和通透性无显著影响(表11)，表明受试化合物在此浓度范围内对模型的完整性无影响，可用于体外BBB的透过性研究。
表10、不同浓度受试化合物细胞对细胞存活率的影响
表11、不同浓度受试化合物细胞对BBB模型的TEER值的影响
EGCG-ACT-LNCs的BBB透过性：从表12和表13可以看出游离ACT的BBB透过能力极低，显著低于ACT-LNCs和EGCG-ACT-LNCs(P＜0.05)，游离ACT，ACT-LNCs，和EGCG-ACT-LNCs的BBB透过量均随着受试化合物浓度的增大和时间的延长而线性升高。通过EGCG修饰后的EGCG-ACT-LNCs可以明显的提高ACT-LNCs的BBB透过性(P＜0.05)。
表12、不同浓度受试化合物在体外BBB模型中的通透性研究
表13、受试化合物在体外BBB模型中不同时间的通透性研究
3、结论
利用BMECs细胞和AS细胞构建的体外BBB细胞模型表明：ACT的BBB透过能力极低，EGCG的修饰能够提高ACT-LNCs的BBB透过能力，初步证明了EGCG-ACT-LNCs具有脑靶向作用，但仍需体内实验进一步验证。
实施例5EGCG修饰的松果菊苷(ECH)、或阿霉素(DOX)、或紫杉醇(PTX)或姜黄素(CUR)体外血脑屏障透过能力
验证方法同实施例4，以300μM的浓度为受试浓度，验证EGCG-ECH-LNCs，EGCG-DOX-LNCs，EGCG-PTX-LNCs，和EGCG-CUR-LNCs在体外BBB模型中的通透性。
结果表明(表14)：通过EGCG修饰后的EGCG-ECH-LNCs，EGCG-DOX-LNCs，EGCG-PTX-LNCs，和EGCG-CUR-LNCs可以明显的提高松果菊苷(ECH)、或阿霉素(DOX)、或紫杉醇(PTX)或姜黄素(CUR)的BBB透过性(P＜0.05)。说明该系统可以明显的提高不同类型的具有神经保护活性的化合物血脑屏障透过率。
表14、300μM的浓度下，EGCG-ECH-LNCs，EGCG-DOX-LNCs，EGCG-PTX-LNCs，和EGCG-CUR-LNCs在体外BBB模型中的通透性研究
实施例6EGCG修饰毛蕊花糖苷类脂纳米囊对AD动物模型的脑靶向及治疗作用
1、小鼠脑组织中毛蕊花糖苷浓度测定
将36只昆明种小鼠，随机分成4组。分别为①游离ACT；②ACT-LNCs；③EGCG-ACT-LNCs。实验前禁食12h，可自由饮水。每组小鼠分别给予20mg/kg的ACT，经尾静脉一次性给药，分别于给药后0.5、2、4、6、12和24h，处死每组小鼠并取出脑组织，用PBS洗涤以洗去附着在器官上的血液并称重。制备脑组织匀浆液，检测脑组织中毛蕊花糖苷的浓度。
2、对AD动物模型的脑靶向的治疗作用
(1)Aβ侧脑室注射AD小鼠模型的建立
取小鼠称重，用3.5％水合氯醛腹腔注射麻醉。将小鼠固定在脑立体定位仪上，用无菌手术刀沿颅骨中线做约1.5cm切口，找到囟门，将微量进样器垂直悬针于囟门上，用针尖定位，记录位置，以此位置为起始位置，依照《小鼠脑立体定位图谱》，向后0.5mm，向右1.0mm距离移动微量进样器，此点为侧脑室在颅骨表面的投影位置，悬针于颅骨表面，垂直刺入，深度为3.00mm，将3μL已经聚化的Aβ1-42于1min内缓慢注入侧脑室内，留针5min用于药物弥散，随后提针，在创口处涂抹青霉素钠粉，将小鼠从脑立体定位上取下，缝合伤口，依次涂抹75％乙醇、碘伏、火棉胶，并在腿部肌肉注射0.2mL10万/mL的青霉素钠注射液，手术结束后放入鼠笼饲养，假手术组侧脑室内注入3μL生理盐水。于手术后第10天Morris水迷宫法检测AD动物模型的学习记忆能力明显降低，说明AD模型制备成功，可用于后续实验。
(2)AD模型小鼠分组及给药
将模型制备成功的小鼠随机分为假手术组(Sham)、模型组(Model)、ACT组、ACT-LNCs组及EGCG-ACT-LNCs组，按20mg/kg剂量，每日腹腔注射1次，连续6周，Sham及Model组小鼠给予等体积生理盐水。
(3)Morris水迷宫实验
用Morris水迷宫试验评估小鼠的学习和记忆能力。Morris水迷宫由一个圆形池(直径120cm，高60cm)和黑色内壁组成，黑色内壁细分为四个相等的象限，并用水(25℃)填充至30厘米的深度。将逃逸平台(直径10cm)放置在其中一个象限内并浸没在水面下约1cm处。连续5d分别从四个象限中观察小鼠的逃避潜伏期。如果小鼠在60s内无法到达平台，则将它们引导至平台并停留10s。训练5d后，移除平台并进行空间探索实验试，将各组小鼠从同一入水点放入水中，观察其穿越原平台的次数以及在原平台所在象限停留的时间。
(4)AD脑内相关炎症因子、抗氧化指标的检测
处理6周后杀死小鼠，每只小鼠各取一半脑组织，称重、匀浆、离心后取上清液，按试剂盒操作说明书进行以下检测：1)相关炎症介质IL-1β、IL-6、TNF-α含量测定；2)脑组织内超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量测定。
3、结果
3.1脑组织分布：小鼠尾静脉注射游离ACT、ACT-LNCs或EGCG-ACT-LNCs后不同时间点脑组织中ACT的含量。结果如表15所示，给药0.5h后，游离ACT组含量明显高于ACT-LNCs组，但在4h时，游离ACT组脑组织中ACT含量迅速下降，24h时已检测不到ACT，可能是药物已经被代谢。且4，6，12和24h ACT-LNCs组脑中ACT含量高于游离ACT组，差异具有统计学意义(P<0.05)。在2h时，EGCG-ACT-LNCs组脑组织中的ACT含量明显高于ACT-LNCs组，差异具有统计学意义(P<0.05)，且这种趋势一直维持至24h。进一步说明了EGCG修饰后增加了ACT-LNCs对脑组织的靶向性，能有效提高药物在脑内的积聚。
表15、不同时间点脑组织内ACT含量的定量分析
时间(h) 游离ACT ACT-LNCs EGCG-ACT-LNCs
0.5h 0.46 0.32 0.39
2h 0.58 0.57 0.98
4h 0.18 0.31 0.42
6h 0.15 0.19 0.32
12h 0.12 0.16 0.28
24h 0 0.04 0.16
3.2EGCG-ACT-LNCs改善AD小鼠的学习和记忆能力：水迷宫结果如表16-18所示，各组小鼠经历5天的定位航行训练后，与Sham组小鼠相比，Model组小鼠的逃避潜伏期显著延长(P<0.01)；EGCG-ACT-LNCs、ACT-LNCs及ACT组的逃避潜伏期相比Mode组明显缩短，差异具有统计学意义(P<0.01)。且ACT组小鼠与EGCG-ACT-LNCs、ACT-LNCs组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。在定位航行实验结束后，撤去平台进行空间探索实验来检测AD小鼠的记忆能力。结果显示，在60s内Model组小鼠穿越平台次数与原平台所在象限时间百分比明显低于Sham组，差异具有统计学意义(P<0.05)，实验结果表明Aβ侧脑室注射造模成功。经过EGCG-ACT-LNCs、ACT-LNCs及ACT治疗后小鼠的穿越平台次数与原平台所在象限时间百分比相比Model组明显延长，差异有统计学意义(P<0.01)，ACT组与EGCG-ACT-LNCs、ACT-LNCs组相比，差异具有显著性意义(P<0.05)，EGCG-ACT-LNCs与ACT-LNCs组相比，差异具有显著性意义(P<0.05)，实验结果表明EGCG修饰后可以增强ACT改善AD小鼠的学习及记忆的能力。
表16、各组小鼠逃避潜伏期
时间 Sham Model ACT ACT-LNCs EGCG-ACT-LNCs
Day1 61 62 59 58 57
Day2 43 61 56 55 54
Day3 36 58 43 41 40
Day4 20 41 35 31 26
Day5 17 40 37 22 18
表17、各组小鼠穿越平台次数的比较
组别 Sham Model ACT ACT-LNCs EGCG-ACT-LNCs
次数 5 1 3 4 6
表18、各组小鼠在原平台所在象限停留时间百分比
组别 Sham Model ACT ACT-LNCs EGCG-ACT-LNCs
百分比 39 11 19.8 31.2 38
3.3EGCG-ACT-LNCs降低AD小鼠脑内炎性细胞因子的水平：ELISA结果如表19所示，Model组与Sham组相比，IL-1β、IL-6、TNF-α含量明显升高且具有显著性差异(P<0.01)，各组给药组与Model组相比，均能降低IL-1β、IL-6、TNF-α的含量，差异具有显著性意义(P<0.05)，对于IL-1β、IL-6、TNF-α的影响，EGCG-ACT-LNCs组、ACT-LNCs组与游离ACT组相比，差异具有显著性意义(P<0.05)，且对于IL-6和TNF-α的影响，EGCG-ACT-LNCs组对其抑制作用明显好于ACT-LNCs组，差异具有显著性意义(P<0.05)。说明EGCG修饰后可以增强ACT对AD小鼠脑内炎症因子的抑制作用。
表19、脑内炎症因子水平
3.4EGCG-ACT-LNCs提高AD小鼠抗氧化能力，减轻脑内自由基损伤。氧化应激和自由基损伤是导致AD脑内神经细胞损伤的重要原因。SOD是体内重要的自由基清除剂，对机体的氧化与抗氧化平衡起着重要作用。本实验结果如表20所示，Model组小鼠脑内SOD活性下降，清除自由基能力下降，致使脑组织过氧化产物MDA升高，与Sham组比较，差异具有显著性意义(P<0.05)；EGCG-ACT-LNCs治疗后显著提高了SOD活力，降低了MDA含量(P<0.05)，从而减轻了脑组织脂质过氧化损伤，保护并改善了神经功能，作用明显强于ACT-LNCs及游离ACT组(P<0.05)
表20、EGCG-ACT-LNCs对AD脑内小鼠SOD和MDA的影响
4、结论
1)EGCG-ACT-LNCs组AD小鼠脑内ACT质量浓度和停留时间显著增加及延长，进一步说明EGCG修饰于ACT-LNCs表面后明显增强其脑靶向能力。
2)与游离ACT相比，ACT-LNCs可以增强药物对AD小鼠学习记忆能力的改善能力；经EGCG修饰后，类脂纳米囊提高学习记忆能力的效果进一步增强。
3)EGCG-ACT-LNCs能降低AD小鼠脑内炎性细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平，从而抑制免疫炎性损伤，保护神经组织，此作用强于ACT-LNCs及游离ACT。ACT-LNCs能提高AD小鼠脑内SOD活性，增强抗氧化能力，减轻脑组织脂质过氧化损伤，降低其产物MDA含量，从而保护神经组织，此作用强于游离ACT，且经过EGCG修饰后，其作用进一步增强。
实施例7EGCG修饰毛蕊花糖苷类脂纳米囊在抗衰老作用中的潜在应用
本实验选用本发明制备的EGCG-ACT-LNCs，采用玉米培养基饲养果蝇和配制溶液灌喂小鼠两种方法，以观察EGCG-ACT-LNCs抗衰老的作用。
1、实验方法
(1)将黑腹果蝇放入含有0.2％(质量)的EGCG-ACT-LNCs或ACT-LNCs或ACT的培养管中饲养，以正常培养基为空白对照组，共分四组。每个剂量组果蝇200只左右，雌雄各半，每组设4个平行。每天早晚各观察一次，统计果蝇的死亡数目和生存数，直到全部死亡。比较各组寿命的长短，记录其半数死亡时间、最高寿命和平均寿命。
上述培养基的配方为：水76g，玉米粉10g，琼脂1.5g，酵母粉0.7g，糖13.5g，丙酸0.5mL。制备方法为：取应加水量的一半，加入琼脂煮沸搅拌融化，加入白糖；取另一半水将玉米粉调成糊状，加入到琼脂水中搅拌煮成糊状，加入0.5ml丙酸搅拌，分装入培养瓶，塞上棉塞；高压灭菌，20分种，冷却后加入酵母。
(2)选择60只健康昆明种小鼠，随机分为5组:即正常对照组、模型对照组、ACT组、ACT-LNCs组、EGCG-ACT-LNCs组。造模方法采用小鼠衰老模型，以生理盐水配置10％的D-半乳糖溶液，除正常对照组外，其余4组每天在颈背部皮下分别注射0.14g/kg的D-半乳糖溶液造小鼠衰老模型，连续给予D-半乳糖50天。从第二周开始，对给药组的小鼠，每天分别灌胃500mg/kg的EGCG-ACT-LNCs或ACT-LNCs或ACT；空白对照组、模型组对照组小鼠灌胃等量生理盐水。每日定时观察记录小鼠的体征行为及其活动情况，记录小鼠的体重变化、毛发光泽程度、采食状况、对刺激反应的灵敏度、激怒反应、嗜睡程度等。末次给药2h后，取出脑、脾、肾、肝，吸去血液，剪去脂肪、系膜。将小鼠脾脏，经生理盐水洗净后，用滤纸粘去脏器表面水分，称重并计算脾脏指数。将脑、脾、肾、肝制备成10％的组织匀浆，按试剂盒说明方法，分别测定小鼠的脑、脾、肾、肝中SOD和MDA含量。经过观察、记录，完成寿命计数后，对所得的实验数据进行统计学分析。
2、结果
(1)与培养基中不加药组相比，EGCG-ACT-LNCs或ACT-LNCs或游离ACT对果蝇的半数存活时间、平均寿命和最高寿命均有不同程度的延长作用。游离ACT组、ACT-LNCs组和EGCG-ACT-LNCs组分别将雌雄果蝇的平均寿命延长(表21)了21.6％、35.3％和42.7％。
表21、对果蝇寿命的影响
(2)正常组小鼠精神状态良好、行动敏捷、毛发光泽、不易抓取；模型组小鼠精神不振、行动迟缓、毛色枯搞不光泽、脱毛、抓取时不反抗，易于抓取；给药组小鼠上述表现较模型组有良性逆转；ACT组、ACT-LNCs组和EGCG-ACT-LNCs组较正常组小鼠外形无变化，活动如常。D-半乳糖模型组小鼠脾脏指数明显下降，与正常对照组相比有显著性差异(P<0.05)，说明D-半乳糖模型诱导的衰老小鼠免疫力明显下降。灌胃500mg/kg的ACT、ACT-LNCs和EGCG-ACT-LNCs后，与模型组相比，脾脏指数明显增高，有显著性差异(P<0.05)，且EGCG-ACT-LNCs组效果最好。正常小鼠组织的SOD含量较高，而衰老小鼠组织的SOD含量较低。灌胃500mg/kg的ACT、ACT-LNCs和EGCG-ACT-LNCs能够提高小鼠脑、肾、肝组织SOD含量，与模型组相比，具有显著的统计学意义(P<0.05)，EGCG-ACT-LNCs组的效果最好。正常小鼠组织的MDA含量较低，而衰老小鼠组织的MDA含量较高。ACT、ACT-LNCs和EGCG-ACT-LNCs能够降低小鼠脑、肾、肝组织MDA含量，与模型组相比，具有显著的统计学意义(P<0.05)，EGCG-ACT-LNCs组的效果最好。
3、结论
(1)通过果蝇生存实验，初步表明EGCG-ACT-LNCs具有一定的抗衰老作用。
(2)EGCG-ACT-LNCs提高衰老小鼠肝组织SOD含量、降低MDA含量作用最为明显。
(3)本实验还表明EGCG-ACT-LNCs能提高衰老小鼠的脾指数，能明显抑制小鼠在衰老过程中脾脏出现的萎缩，有保护免疫器官、增强免疫力的作用。这表明，EGCG-ACT-LNCs可提高机体免疫能力，清除体内氧自由基，抑制脂质过氧化，能够抗衰老，对与自由基有关的疾病有防治作用。实施例8EGCG修饰毛蕊花糖苷类脂纳米囊在抗宠物衰老药物中的潜在应用
动物(例如，猫和犬)的与年龄相关病况之一是氧化损伤，氧化应激机制是神经退行性疾病的重要发病机制。本实验以老龄化的3只犬，分别为：7岁贵宾犬，8岁边牧，7岁泰迪为研究对象，添加1％的EGCG-ACT-LNCs于犬粮中，喂养90天，以验证EGCG-ACT-LNCs在抗宠物衰老药物中的潜在应用。以喂养宠物犬后，宠物犬尿中的8-羟基脱氧鸟苷(氧化损伤的生物标志物)的尿水平来研究宠物体内的氧化状态，以活动能力和认知力两种指标来衡量对宠物衰老的改善作用。结果如表22所示。
表22、对宠物犬尿液中8-羟基脱氧鸟苷含量、活动能力和认知力的影响
/>
注：认知力：有改善+，有明显改善++
结论
(1)喂食EGCG-ACT-LNCs后，衰老的宠物犬的尿中8-羟基脱氧鸟苷水平显著降低，说明宠物犬体内氧化状态明显改善。
(2)喂食EGCG-ACT-LNCs后，衰老的宠物犬的活动能力和认识力均有明显改善，说明EGCG-ACT-LNCs可以提高宠物犬的认知力，延缓其衰老进程。

Claims (4)

1.一种脑靶向类脂纳米囊载药系统在制备跨越血脑屏障药物中的应用，其特征在于，所述载药系统包括包载药物X的类脂纳米囊，所述类脂纳米囊的组成包括：卵磷脂、中链甘油三酯和聚乙二醇12羟基硬脂酸酯，所述类脂纳米囊表面修饰有表没食子儿茶素没食子酸酯；
所述药物X为毛蕊花糖苷、松果菊苷、阿霉素、紫杉醇或姜黄素；
所述的脑靶向类脂纳米囊载药系统的制备方法包括以下步骤：
(1)将药物X溶解于无水乙醇中，再加入聚乙二醇12羟基硬脂酸酯、中链甘油三酯、卵磷脂和氯化钠，搅拌混匀，得到油相混合液；
(2)将油相混合液逐滴加入0℃蒸馏水中，搅拌使油相和水相混匀，再用旋转蒸发仪除去乙醇，分离得到包载药物X的类脂纳米囊；
(3)将包载药物X的类脂纳米囊与表没食子儿茶素没食子酸酯乙醇溶液混合，搅拌至乙醇完全蒸发，制得所述的脑靶向类脂纳米囊载药系统；
以质量百分比计，油相混合液中聚乙二醇12羟基硬脂酸酯的浓度为20~30%，中链甘油三酯的浓度为15~20%，卵磷脂的浓度为1.5~2%，氯化钠的浓度为1.5~2%；药物X的浓度为1~2%；
步骤(3)中，包载药物X的类脂纳米囊与表没食子儿茶素没食子酸酯乙醇溶液以体积比3:1混合，其中表没食子儿茶素没食子酸酯乙醇溶液的浓度为10~30 mg/mL。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，蒸馏水的重量为油相混合液的5~10倍，搅拌的速率为500~600 rpm。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为治疗阿尔茨海默病药物，其中药物X为毛蕊花糖苷。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为抗衰老药物，其中药物X为毛蕊花糖苷。
CN202110235658.0A 2021-03-03 2021-03-03 一种脑靶向类脂纳米囊载药系统及其制备方法和应用 Active CN115006369B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110235658.0A CN115006369B (zh) 2021-03-03 2021-03-03 一种脑靶向类脂纳米囊载药系统及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110235658.0A CN115006369B (zh) 2021-03-03 2021-03-03 一种脑靶向类脂纳米囊载药系统及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115006369A CN115006369A (zh) 2022-09-06
CN115006369B true CN115006369B (zh) 2023-08-29

Family

ID=83064306

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110235658.0A Active CN115006369B (zh) 2021-03-03 2021-03-03 一种脑靶向类脂纳米囊载药系统及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115006369B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5174930A (en) * 1986-12-31 1992-12-29 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Process for the preparation of dispersible colloidal systems of amphiphilic lipids in the form of oligolamellar liposomes of submicron dimensions
CN1419472A (zh) * 2000-03-02 2003-05-21 梅奈莱伯公司 脂质纳米胶囊、制备方法和作为药物的用途
US8906414B1 (en) * 2009-04-27 2014-12-09 University Of South Florida Methods and compositions for improving bioavailability of epigallocatechin gallate (EGCG)

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5174930A (en) * 1986-12-31 1992-12-29 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Process for the preparation of dispersible colloidal systems of amphiphilic lipids in the form of oligolamellar liposomes of submicron dimensions
CN1419472A (zh) * 2000-03-02 2003-05-21 梅奈莱伯公司 脂质纳米胶囊、制备方法和作为药物的用途
US8906414B1 (en) * 2009-04-27 2014-12-09 University Of South Florida Methods and compositions for improving bioavailability of epigallocatechin gallate (EGCG)

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Cannabidiol Enhances the Passage of Lipid Nanocapsules across the Blood−Brain Barrier Both in Vitro and in Vivo;Juan Aparicio-Blanco等;《Mol. Pharmaceutics》;20190313;第16卷;第1999-2010页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN115006369A (zh) 2022-09-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Lee et al. Chitosan-coated liposomes to stabilize and enhance transdermal delivery of indocyanine green for photodynamic therapy of melanoma
Liu et al. Characterization of superparamagnetic iron oxide nanoparticle-induced apoptosis in PC12 cells and mouse hippocampus and striatum
CN103040757B (zh) 核-壳型纳米药物颗粒、其制备方法及应用
Alcantara et al. Development, characterization and pharmacokinetics of mupirocin-loaded nanostructured lipid carriers (NLCs) for intravascular administration
CN116425833B (zh) 一种基于非典型疏水性氨基酸的自组装短肽及其应用
CN101103972A (zh) 一种奥沙利铂脂质体葡萄糖制剂及其制备方法、应用
CN106344924A (zh) 一种联合代谢阻断的纳米剂型及其耐药逆转应用
Yin et al. Plasmid-based Stat3 siRNA delivered by functional graphene oxide suppresses mouse malignant melanoma cell growth
CN115006369B (zh) 一种脑靶向类脂纳米囊载药系统及其制备方法和应用
CN108158997A (zh) 以鼠李糖脂为膜材料的脂质体及其制备方法和应用
CN116650673A (zh) 细胞膜包覆的药脂颗粒及其制备方法和应用
CN108853056B (zh) 一种叶酸靶向修饰共载盐酸阿霉素和藤黄酸纳米结构脂质载体制剂及其制备方法
Alves et al. Chicken embryo model for in vivo acute toxicological and antitumor efficacy evaluation of lipid nanocarrier containing doxorubicin
Messerschmidt et al. Characterization of Oxygen Nanobubbles and In Vitro Evaluation of Retinal Cells in Hypoxia
US20210322326A1 (en) Hydrogel particle carriers for delivery of therapeutic/diagnostic agents
CN114681430A (zh) 一种白藜芦醇卵磷脂纳米粒及其制备方法、用途
CN117205173A (zh) 一种大麻素1型受体介导的脑靶向类脂纳米囊载药系统及其制备和应用
Rahimi et al. Fungal infected adipose stem cells: the effects of novel lipo-niosome nanoparticles loaded with amphotericin B and thymus essential oil
CN103690556A (zh) 一种羟基喜树碱长循环脂质体
Kapare et al. Design and development of plumbagin loaded poly (ε-caprolactone) nanoparticles for improved cytotoxicity
CN114712343B (zh) 一种携载光甘草定的脾靶向纳米药物的制备方法及应用
CN115177589B (zh) 一种紫杉醇脑靶向脂质体和其制备方法及应用
CN110613724B (zh) 一种具有治疗肝细胞癌功效的药物
CN113197879B (zh) 一种神经酸微胶囊及其制备方法
CN113144213B (zh) 一种多级pH响应基因-药物共递送的纳米药物、制备方法及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant