CN115006350A - 一种乳脂质体的构建及其在巨噬细胞免疫活性调节中的应用 - Google Patents
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Abstract
一种乳脂质体的构建及其在巨噬细胞免疫活性调节中的应用，通过抑制清道夫受体SRA1的活性抑制了由LPS（脂多糖）引发炎症的经典通路NF‑κB信号通路中NF‑κB二聚体入核实现对促炎症因子的转录抑制，从而抑制炎症反应。以脱脂酪乳中提取的乳极性脂质为原料，制备成空白乳脂质体，建立了LPS诱导的巨噬细胞炎症模型，乳脂质体可以抑制LPS诱导巨噬细胞的炎症反应；通过对NF‑κB通路核内p50、p65蛋白表达量的测定，发现乳脂质体是通过抑制LPS引发炎症的经典通路NF‑κB信号通路中NF‑κB二聚体入核实现对促炎症因子的转录抑制，从而抑制炎症反应；乳脂质体抑制清道夫受体SRA1的表达，从而抑制细胞对LPS的应答，可应用于制备提高免疫活性的药品。
Description
技术领域
本发明涉及巨噬细胞免疫调节领域，具体涉及一种乳脂质体的构建及其在巨噬细胞免疫活性调节中的应用。
背景技术
巨噬细胞是单核吞噬细胞系统的主要分化细胞，它包括骨髓单核细胞、前体单核细胞、外围单核细胞和巨噬细胞。巨噬细胞可以通过调节自身的生物活性，以应对环境的刺激，如可溶因子的作用，与外来粒子或细胞的接触等。巨噬细胞增强生物活性的现象，如杀菌或破坏肿瘤作用被称为巨噬细胞的激活。巨噬细胞被脂多糖（lipoplysaccharides,LPS）或其它细胞因子等刺激后激活，会分化成典型的M1型细胞，分泌大量细胞因子，如肿瘤坏死因子（TNF-α，激活自然杀伤细胞，促进Th1细胞的分化）、白细胞介素1β（IL-1β，激活血管内皮细胞和淋巴细胞，促进局部炎症反应）、白细胞介素6（IL-6，激活淋巴细胞，增加抗体产量）、白细胞介素8（IL-8，一种趋化因子，主要趋化中性粒细胞），启动炎症免疫反应，进而清除病原体或抵抗肿瘤，同时激活机体特异性免疫应答。然而，巨噬细胞的过度免疫反应则会产生损害作用，促炎性细胞因子的过量持续的活化会导致慢性炎症的产生，过度活化的巨噬细胞可转化为抑制性细胞，通过分泌抑制性细胞因子，抑制免疫细胞的活化和增殖。所以巨噬细胞的活化及程度的调节对机体防御至关重要。模式识别受体，即能够识别病原体相关分子模式的成分。巨噬细胞表达的模式识别受体，主要包括Toll样受体、清道夫受体、甘露糖受体以及磷酯酰丝氨酸受体。清道夫受体SR-A是一种三聚体形式的膜糖蛋白，由一个半胱氨酸连接的二聚体和一个非共价结合的单体组成，包括SRAI、Ⅱ和胶原样巨噬细胞受体三种类型。SRA主要存在干不同组织和器官的巨噬细胞，SRAI的表达是巨噬细胞分化成熟的标志之一。SRA在宿主防御中起着重要作用，对LPS的清除和感染原的吞噬等。
一些药物可以起到调节巨噬细胞免疫活性的作用。当药物以可溶的形式注入人体后，只有一小部分能够到达巨噬细胞，经过载体系统的发展，目前脂质体已经广泛应用于将药物载体，帮助其转移到巨噬细胞中。脂质体与巨噬细胞的复杂相互作用大致包括以下步骤：稳定吸附在细胞表面，完整囊泡的细胞摄入，溶酶体降解脂质体和药物。脂质体与巨噬细胞的结合程度和被巨噬细胞摄入的程度取决于脂质体的组成、类型、大小和表面电性等。带负电荷的脂质体与中性脂质体相比，可以更有效地结合并传递信息；小脂质体比大的脂质体传递药物更有效，它们更容易被内化；最优的脂质体是表面带负电荷、直径大小为50-100 nm。构成脂质体的极性脂质中含带负电荷的磷脂，如磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油将极大的增强与巨噬细胞的结合和吞噬作用。
乳脂质体，是利用乳制品中提取的极性脂质配合一定比例的胆固醇制成的脂质体。现有研究通过比较以乳脂肪球膜中极性脂质和大豆磷脂为原料制备的脂质体的结构与性能，发现以乳脂肪球膜中极性脂质为原料制备的脂质体具有明显的较高的相变温度、较厚的膜和较低的膜渗透率。因为乳脂肪球膜极性脂质和大豆磷脂相比，前者含有较高水平的神经鞘磷脂和更高水平的脂肪酸饱和度，而神经鞘磷脂和磷脂酰胆碱相比有更加结构化的凝胶相，饱和度高的脂肪酸更不易被氧化。除此以外，对乳极性脂质体和大豆磷脂脂质体分散的相对稳定性的调查发现，在不同pH、储存温度等条件下，乳极性脂质体比大豆脂质体更稳定。
乳极性脂质制备的脂质体被证明比普通大豆磷脂脂质体更加稳定，有报道空白脂质体并不能激活或抑制巨噬细胞的免疫应答，但用乳极性脂质制备的空白脂质体对免疫调节的影响及机制还未有研究。乳脂质体作为一种新型药物载体，对其本身对巨噬细胞免疫调节的影响的研究关系到乳脂质体包埋药品对巨噬细胞的作用效果，同时也是对乳极性脂质功能性的拓展研究，因此乳脂质体对巨噬细胞的免疫调节活性研究具有重要意义。
发明内容
针对现有技术问题，本发明目的在于提供一种乳脂质体的构建及其在巨噬细胞免疫活性调节中的应用，可广泛用于制备免疫活性调节的药品。
为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案为：
乳脂质体的构建，包括以下步骤：
步骤1，提取乳极性脂质；
步骤2，按照质量比为1-2:1，称取乳极性脂质和胆固醇，用氯仿溶解后转移到圆底烧瓶中，减压下旋转蒸发，至氯仿蒸发完全，且圆底烧瓶中形成一层贴壁透明薄膜，暂停旋转蒸发；
步骤3，取下圆底烧瓶，加入无菌双蒸水，再将圆底烧瓶置于37℃水浴锅中进行水化，至圆底烧瓶上的透明薄膜全部洗下为止；
步骤4，将水化后的悬浊液在冰水浴的条件下进行超声破碎，超声至悬浊液均匀透亮，过0.45 μm的滤膜，收集到无菌离心管中，即得乳脂质体，所述乳脂质体为球形结构，粒径在300 ±30 nm分布较为均匀，平均电位为-67.3 mV，体系稳定，置于4℃冰箱保存备用。
作为改进的是，步骤2中减压旋转蒸发时，真空度维持在-0.01 kPa，水浴温度为45℃。
上述任一项所得乳脂质体在巨噬细胞免疫调节活性中的应用。
作为改进的是，所述乳脂质体通过抑制清道夫受体SRA1，减少受体与LPS的结合，从而抑制了LPS刺激下炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和趋化因子IL-8的释放，和促进抗炎症因子IL-10的分泌，抑制由LPS诱导巨噬细胞的炎症反应，进而调节巨噬细胞免疫活性。
作为改进的是，当乳脂质体浓度达到400 μg/mL时，对NF-κB二聚体的入核抑制作用增加，炎症因子恢复至正常水平，即对LPS诱导巨噬细胞炎症模型下的抑炎作用达到最大。
有益效果：
与现有技术相比，本发明一种乳脂质体的构建及其在巨噬细胞免疫活性调节中的应用，通过建立LPS诱导的巨噬细胞炎症模型，加以空白对照组、加乳脂质体的LPS诱导组、LPS诱导组中巨噬细胞分泌的五种炎症因子（TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10）蛋白水平和基因水平上含量的比较，发现乳脂质体可以抑制LPS诱导巨噬细胞的炎症反应。通过对NF-κB通路核内p50、p65蛋白表达量的测定，发现乳脂质体是通过抑制LPS引发炎症的经典通路NF-κB信号通路中NF-κB二聚体入核实现对促炎症因子的转录抑制，从而抑制炎症反应，通过对TLR4和SRA1受体蛋白表达量的测定，发现乳脂质体对TLR4受体蛋白并无抑制作用，但可以抑制清道夫受体SR-A的表达，从而抑制细胞对LPS的应答。
附图说明
图1为乳脂质体的电镜观测图，A为标尺100 nm，B为标尺200 nm；
图2为乳脂质体的电位（a）、粒径图（b）；
图3为小鼠RAW264.7巨噬细胞生长曲线；
图4为乳脂质体对巨噬细胞增殖的影响；
图5为乳脂质体对LPS诱导的巨噬细胞细胞因子分泌量的影响；
图6为不同浓度乳脂质体对LPS诱导巨噬细胞炎症因子mRNA转录的影响；
图7为不同浓度乳脂质体对LPS诱导巨噬细胞核内p50、p65、TLR4、SRA1的Western-blot表达水平影响的条带图谱；
图8为不同浓度乳脂质体对LPS诱导巨噬细胞核内p50、p65、TLR4、SRA1的Western-blotNF-κB表达水平的影响的相对表达量图。
具体实施方式
下面的实施例可使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂家建议的条件。
本发明使用的RAW264.7细胞购买于中科院上海细胞所，各ELISA试剂盒由南京迈博生物有限公司提供，其它各类试剂盒由南京建成生物有限公司提供。
实施例1 乳脂质体的制备
参照申请号201810047792，名称为一种乳极性脂质的提取方法及其应用，提取乳极性脂质。
精确称取乳极性脂质50g与胆固醇47g，用15 mL氯仿溶解后，溶液转移到圆底烧瓶中。在通风橱里进行减压旋转蒸发，真空度保持在-0.01 kPa，水浴温度为45℃，至有机试剂蒸发完全且圆底烧瓶中形成一层贴壁透明薄膜，暂停旋转蒸发。
取下圆底烧瓶，继续加入无菌双蒸水，将圆底烧瓶置于37℃水浴锅中进行水化，时间约2 h，至圆底烧瓶上的透明薄膜全部洗下为止。
将水化后的悬浊液在冰水浴的条件下进行超声破碎至悬浊液均匀透亮，过0.45μm的滤膜，收集到无菌离心管中，置于4℃冰箱保存备用。
实施例2 乳脂质体的检测
（1）乳脂质体的电镜检测
取备用乳脂质体溶液，在高速冷冻离心机下10000 r/min转速下离心30 min，弃去上清液，吸取2 mL纯水将贴壁的脂质体吹散，成悬浮液，冷藏待电镜下观察。透射电子显微镜采用负染法，滴两滴制备好的脂质体于专用铜网上，自然晾干，再用质量分数2.5 %的磷钨酸进行负染，自然挥发干燥，使粒子在铜网上浓缩并沉积，通过透射电子显微镜观察乳脂质体并照相。
如图1A所示，是100 nm下的乳脂质体，图1B图是200 nm下的乳脂质体，从图1A中可以看出，优化条件下的乳脂质体为球形结构，中间呈白色透亮状态；右图看出脂质体形态较为规整，分散较为均匀。
（2）乳脂质体的电位及粒径测定
取备用乳脂质体溶液，用纳米粒度ZETA电位仪进行电位及粒径的测定，经动态光散射处理软件处理。如图2所示，乳脂质体只有一个Zeta电位峰，平均电位为-67.3 mV。文献报道，zeta电位越高，颗粒的分散体系就越稳定，水相中颗粒分散稳定性的临界值一般是+30 mV和-30 mV，如果颗粒的zeta电位都高于+30 mV或低于-30mV，则认为该体系比较稳定。乳脂质体的所有颗粒都低于-30mV，所以乳脂质体体系稳定性较好。同时由于乳脂质体带负电荷，可以更好得被巨噬细胞吸附并吞噬，有利于进一步研究乳脂质体的应用研究。根据统计数据计算得脂质体粒径在300nm左右，粒径分布较为均匀，乳脂质体在加入细胞前要用0.45μm滤膜去除杂菌。
实施例3 巨噬细胞模型的建立
（1）小鼠RAW264.7巨噬细胞的传代与换液
巨噬细胞的换液：将瓶中原培养液倒掉，加2mL PBS缓冲液清洗两次并倒掉，再加入新鲜培养液（含丙酮酸钠的DMEM培养基：胎牛血清：双抗=100:10:1）5 mL，置于37 ℃，5%CO2条件培养箱培养，其中含丙酮酸钠的DMEM培养基（含4500mg/L D-葡萄糖，584mg/L L-谷氨酰胺，110mg/L丙酮酸钠，3750mg/L碳酸氢钠, pH值7.0-7.4）。
巨噬细胞的传代：小鼠巨噬细胞RAW264.7生长至铺满培养瓶时，即可进行传代。吸弃原培养液，加PBS清洗两次倒掉，加入2 mL 0.25% 胰蛋白酶（0.25克胰酶溶于100mLPBS溶液）-EDTA2消化细胞，消化液加入量为盖住细胞最佳。在37 ℃条件下消化约8 min，用倒置显微镜观察细胞变圆、间隙变大。吸出胰蛋白酶，加入3 mL新鲜培养液（含丙酮酸钠的DMEM培养基：胎牛血清：双抗=100:10:1），将贴壁细胞吹下，反复吹打成细胞悬液。按1：3分装进新的无菌培养瓶中，再加入4 mL新鲜培养液，轻晃培养瓶使细胞分散均匀。置于37 ℃，5%（体积浓度）CO2条件培养箱培养，隔日换液。
（2）巨噬细胞的冻存与复苏
巨噬细胞的冻存：取处于对数生长期的细胞，倒掉原培养液，加PBS清洗三次，每次3 mL。加入1 mL 0.25%（0.25克胰酶溶于100mLPBS溶液）胰蛋白酶-EDTA2消化细胞，至显微镜下观察细胞变圆，间隙表大即可，消化完全立即移到操作台，加入2 mL培养液（含丙酮酸钠的DMEM培养基：胎牛血清：双抗=100:10:1）停止消化，用移液枪沿着瓶底将细胞全部吹下来。将细胞悬液转移至已灭菌的离心管中，1000 r/min离心5 min，弃去上清液。加入1 mL冻存液（10 % DMSO，90 %胎牛血清）重新吹打至细胞分散到液体中，再加入4 mL冻存液，轻轻将细胞悬液吹匀，分装1 mL到冻存管中，分装5管。包上脱脂棉，梯度冻存，4 ℃放置30min，-20 ℃放置30 min，-80 ℃放置过夜，最后转至液氮罐中长期保存。
巨噬细胞的复苏：在超净工作台放好消过毒的离心管、培养瓶等，打开紫外照射30min，实验时用75 %酒精擦拭台面。将冻存管取出，立即放入37 ℃水浴中，转动冻存管，尽量使细胞在1 min内解冻。将冻存管内悬液转移到离心管中，以3000 r/min速度离心3 min，吸弃上清液，然后向离心管中加入5 mL细胞培养液，再吹打成细胞悬液。将悬液分装到两个无菌培养瓶中，细胞浓度以5×105为宜，补足培养液5 mL，轻晃几次培养瓶使细胞分散均匀，置于37 ℃，5% CO2条件培养箱中，两日后更换培养液，细胞贴壁则复苏成功。
（3）巨噬细胞生长曲线的测定
待小鼠巨噬细胞RAW264.7生长至铺满培养瓶80%左右时，用胰蛋白酶-EDTA2消化细胞8 min，加新鲜培养液（含丙酮酸钠的DMEM培养基：胎牛血清：双抗=100:10:1）12 mL终止消化，并吹打贴壁细胞为细胞悬液，继续添加新鲜培养液（含丙酮酸钠的DMEM培养基：胎牛血清：双抗=100:10:1）19 mL，吹打均匀后接入24孔培养板，每孔加1 mL，3组平行，每24 h测一次活细胞数量，测试方法为细胞计数法，绘制细胞生长曲线。
如图3所示，细胞7天内生长出现了先增多后减少的总体趋势。前1-3天细胞数目增长较为缓慢，为迟缓期；3-4天细胞数目明显增多，增长速度达到最大，为细胞对数生长期；4-5天细胞数目增长速度变缓慢，为细胞减速生长期，在第5天达到细胞数目的最大值，约为9.6×105/mL；5-6天细胞数目变化不大，为平衡期；6-7天细胞数目明显变少，为衰亡期。在24孔板里，每两天换一次培养液，在第6天之后依然出现了细胞数目的缩减，可能是细胞密度过大，营养物质消耗过快，造成部分细胞衰老死亡。在细胞冻存和后续实验中，选择传代后第3天位于对数生长期的巨噬细胞。
（4）乳脂质体对巨噬细胞增殖的影响
用细胞计数法调节小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞密度为2×104/mL，在96孔板上加入细胞100μL/孔，置于37℃，5% CO2条件的细胞培养箱培养24 h。分别加入0、10、100、200、400、1000 μg/mL的脂质体水溶液100 μL，每个重复三次，继续在37℃ 5% CO2条件的细胞培养箱培养6、12、18 h。每孔分别加入50 μL MTT溶液，继续在37 ℃孵育18 h。弃去上清液，每孔中再加150 μL DMSO，置于平板摇床振荡10 min。用酶联免疫检测仪在570nm波长处检测每孔的光密度。
如图4所示，比较同一浓度下不同反应时间的细胞数目，除空白组外，都随着时间的增加细胞数目明显增加，说明此时细胞正处于生长期。空白组随着时间的增加细胞数目减少，系实验的正常误差。
总之，乳脂质体的添加，可以促进巨噬细胞的增殖，尤其以100-1000 μg/mL浓度范围内，对巨噬细胞增殖的促进作用最大，且不存在剂量依赖，因此在巨噬细胞免疫调节研究的实验中，选择了100-1000 μg/mL范围内浓度进行LPS诱导的巨噬细胞的抗炎活性研究，同时选择24 h作为乳脂质体和巨噬细胞孵育时间，使达到更好实验效果。
实施例4 乳脂质体对LPS诱导的巨噬细胞的抗炎活性研究
（1）巨噬细胞RAW264.7炎症模型建立
取小鼠巨噬细胞RAW264.7铺满的培养瓶，将细胞消化传代至6孔板中，在1-5孔中分别加入新鲜培养基5 mL，在 37 ℃，5% CO2的细胞培养箱中培养24 h。待细胞贴壁稳定后，在2-5孔炎症刺激组中分别加入1 mL浓度为100 ng/mL的LPS水溶液，继续培养3 h，建立炎症模型。3 h后取出培养瓶，在2-4孔中分别加入100、200、400 μg/mL的乳脂质体水溶液1mL，继续培养24 h。
实验分为：1孔空白对照组，未添加任何干扰因素；2-4孔为实验组，LPS诱导后加不同浓度的乳脂质体；5孔炎症对照组，通过加LPS建立过激炎症反应。
（2）乳脂质体对LPS诱导的巨噬细胞细胞因子表达的影响
建立巨噬细胞RAW264.7炎症模型，1孔为空白对照组，2孔LPS诱导后再加入100 μg/mL的乳脂质体水溶液1 mL，3孔为炎症对照组。培养后收集3孔中的细胞培养上清液，按ELISA试剂盒上的操作步骤检测细胞因子，检测的细胞因子有TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10。
如图5所示，通过对LPS诱导下的添加乳脂质体实验组、LPS对照组和空白对照组的细胞因子的含量变化的分析，我们可以得出：乳脂质体对巨噬细胞炎症反应中生成的促炎症细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6，趋化因子IL-8存在显著的抑制作用，对抗炎症因子IL-10的分泌存在显著的促进作用。
实施例5 乳脂质体对LPS诱导的巨噬细胞细胞因子的mRNA表达的影响
（1）细胞总RNA提取
6孔板吸弃培养液，PBS洗3次，加入Trizol 500 μL/孔，轻轻摇晃数次，静置5 min后反复吹打。然后将液体转移至5个1.5 mL离心管中；
在5个离心管中分别加入500 μL的氯仿，振荡30 s混匀，室温下静置5 min；
12000 ×g、4 ℃条件下，离心15 min，分相为三层。吸取上清液，转移到新的离心管中，吸取时要避免触及有机相和中间层；
加入与上清液等体积的异丙醇，振荡30 s混匀，4 ℃静置30 min后，14000 ×g、4℃条件下离心15 min；
RNA沉淀将在离心管底部形成。弃去上清液，加入1 mL 预冷的75 %乙醇-25 %DEPC-H2O振荡混匀30 s，使沉淀振荡起来，6000 ×g、4 ℃条件下离心15 min。小心弃去上清液；
倒置离心管于滤纸上，干燥15 min，用DEPC水10 μL溶解沉淀，反复吹打使其溶解。
测量吸光值后，样品放置-70 ℃保存。
（2）逆转录
取出1 μg的RNA进行逆转录反应，制备相应的cDNA样品。具体逆转录反应20 μL体系为：5× buffer 4 μL，dNTP 2 μL，RRI（Takara）0.5 μL，Oligo (dT)（Takara）1 μL，AMV 1μL，RNA (1μg/μL) 2 μL，DEPC H2O 9.5 μL。反应所用引物如表1所示：
表1 目的基因及其引物序列
反应程序为：42 ℃ 60 min，70 ℃ 10 min，4 ℃保存。
（3）荧光定量PCR
制备好的cDNA再用染料法（Evagreen）PCR对相应的基因mRNA进行实时定量，GAPDH作为内参。反应体系如表2：
表2 20μL Evagreen PCR反应体系
PCR反应程序为95 ℃ 5 min预热，95 ℃ 30 s后退火30 s（退火温度Tm根据扩增引物决定），72 ℃ 30 s，然后进行40个循环扩增，实时荧光信号均在每个循环的72 ℃采集。 数据处理方法为相对比较法，每个实验组mRNA（经小分子处理）都与对照组mRNA（经DMSO处理）比较，计算方程式为：2^-ΔCt (实验组)/ 2^-ΔCt (对照组)。
如图6所示，通过RT-qPCR技术检测炎症因子mRNA的相对表达量，发现乳脂质体对炎症因子基因水平上也存在抑制作用，且抑制作用存在剂量依赖性。
综合以上，证明了乳脂质体对LPS诱导下的巨噬细胞炎症反应具有抑制作用。
实施例6 乳脂质体对炎症相关蛋白及SRA1、TLR4受体蛋白表达量的影响
（1）细胞样本核蛋白及膜蛋白提取
收集5孔中的细胞悬液，根据凯基生物膜蛋白核蛋白抽提试剂盒的步骤，分别从沉淀物中提取5组细胞核蛋白（检测p50，p65）和膜蛋白（检测TLR4，SRA1）。
（2）蛋白定量
配置0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg/mL浓度梯度的牛血清白蛋白（BSA）溶液，Bradford法进行蛋白定量，加入考马斯亮兰G250染液混匀，测定595 nm的吸光值，绘制标准曲线。测出待测蛋白样品浓度。
（3）SDS-PAGE电泳
取干净的玻璃板在制胶架上装好，分别配置13 %丙烯酰胺浓度的分离胶和5 %浓缩胶。用移液枪吸取分离胶注入玻璃板间，至红色门夹内部突出位置，继续注入双蒸水以压实分离胶，待分离胶凝固后，针管吸弃上面的双蒸水。继续在分离胶的上端注入浓缩胶，缓慢插入样品梳子，避免产生气泡。
待成层胶聚合后，拿出胶板固定于电泳槽中，加入电泳缓冲液，拔出梳子。吸取适量样品液和标准蛋白加入样品孔中。
打开电源，于恒压80-120V电泳2 h左右。参照预染Marker的位置，目的条带进入凝胶的最佳分离区后，停止电泳。
转膜液4 ℃下预冷，打开转移盒，用转膜缓冲液浸湿有孔维垫，铺在靠近阴极侧的内面上，其上放三层滤纸，避免产生气泡。
用蒸馏水吹开玻璃板，将胶上含有目的条带的分离胶切下，用转膜液浸泡，放在三层滤纸上。用甲醇和转膜液浸湿硝酸纤维素（NC）膜，铺在凝胶上，排净气泡，膜与滤纸和凝胶的大小要基本相同。
在NC膜上放两层浸过转膜液的滤纸，避免产生气泡。盖上海绵垫，整个转印夹层形成了“纤维垫—滤纸—凝胶—NC膜—滤纸—纤维垫”的层次，关上转印夹，在转移槽中灌满转膜液，放入槽中。
打开电源，稳定电流为200 mA，转膜2 h。结束后，取出NC膜并作好标记，TBST洗膜3次，每次10 min。
（4）免疫印迹
抗原抗体反应：将NC膜放入平皿中，加入含5 %脱脂奶粉的封闭液，摇床上振荡2h，用TBST洗膜3次，每次10 min。
一抗孵育：将膜放入经稀释液稀释过的一抗的平皿中，4℃下摇床孵育，振荡过夜。第二天继续室温下振荡30 min，吸弃一抗，TBST洗膜3次，每次10 min。
二抗孵育：平皿中加入经5 %脱脂奶粉封闭液稀释过的二抗，室温下振荡2 h。反应结束后，回收二抗。TBST洗膜3次，每次5 min。
显色：按照 ECL化学发光试剂盒操作进行显色。将NC膜从TBST中取出，甩掉液体，将含蛋白质的膜朝上放置保鲜膜上，滴加适量化学发光工作液（来源于ECL化学发光试剂盒），再用保鲜膜覆盖。用凝胶成像分析系统成像，使用Gel-Pro32软件对结果进行分析。
如图7和图8A所示，LPS刺激启动了NF-κB信号通路，引发了p50，p65入核，造成促炎症因子IL-10的释放。观察添加乳脂质体的2-4实验组，与第5组的LPS对照组相比， p50和p60的含量有显著性降低（P<0.05），说明乳脂质体通过抑制NF-κB信号通路中NF-κB二聚体的入核，达到抑制促炎症因子目的基因启动转录的结果。
这与ELISA实验中添加乳脂质体组的炎症因子分泌量降低的结果一致。同时可以发现，核内p50和p60的含量随着乳脂质体浓度的增加而减少，呈剂量依赖趋势，说明随着乳脂质体浓度的增加，其对NF-κB二聚体的入核抑制作用也增加。当乳脂质体浓度达到400 μg/mL时，对LPS炎症模型下的抑炎作用达到最大，此时核内p50和p60的含量与空白组无显著性差异。
如图7和图8B所示，2-4组LPS炎症模型与空白组相比，TLR4表达量显著性增加（P<0.05），说明LPS刺激可以促进巨噬细胞TLR4受体蛋白的表达。2-4组添加乳脂质体的LPS诱导模型的TLR4表达量与LPS对照组相比，LPS+100、LPS+200 μg/mL组含量显著增加，LPS+400μg/mL组含量也增加，但无显著性差异。可见乳脂质体对LPS炎症模型下的TLR4的表达有一定的促进作用，进而促进TLR4受体与LPS的结合，说明乳脂质体对NF-κB信号通路p50，p65入核的抑制作用不是通过抑制TLR4受体表达实现。
如图7和图8C所示，2-4组LPS诱导的炎症模型组与空白组相比，SRA1受体的表达量显著增多（P<0.05），说明LPS刺激可以促进细胞上SRA1受体的增多。2-4组添加乳脂质体的实验组与LPS对照组相比，LPS+100和LPS+400 μg/mL实验组中SRA1受体含量显著降低（P <0.05），200 μg/mL实验组SRA1含量比LPS对照组略低，但无显著性差异。说明乳脂质体一定程度上可以抑制LPS诱导巨噬细胞上SRA1受体的增加，证明乳脂质体通过抑制模式识别吞噬性受体SRA1的表达，减少受体与LPS的结合，从而抑制LPS刺激下炎症因子的释放。
序列表
<110> 南京师范大学
南京健森生物技术有限公司
<120> 一种乳脂质体的构建及其在巨噬细胞免疫活性调节中的应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggcctccc tctcatcagt 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccacttggtg gtttgtgagt g 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgccaccttt tgacagtgat g 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgatgtgctg ctgcgagatt 20
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gacaaagcca gagtccttca ga 22
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgtgactcca gcttatctct tgg 23
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctaggcatct tcgtccgtcc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ttcacccatg gagcatcagg 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gctcttgcac taccaaagcc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ctgctgatcc tcatgccagt 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aatgggcagc cgttaggaaa 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gcgcccaata cgaccaaatc 20
Claims (5)
1.乳脂质体的构建，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，提取乳极性脂质；
步骤2，按照质量比为1-2:1，称取乳极性脂质和胆固醇，用氯仿溶解后转移到圆底烧瓶中，减压下旋转蒸发，至氯仿蒸发完全，且圆底烧瓶中形成一层贴壁透明薄膜，暂停旋转蒸发；
步骤3，取下圆底烧瓶，加入无菌双蒸水，再将圆底烧瓶置于37℃水浴锅中进行水化，至圆底烧瓶上的透明薄膜全部洗下为止；
步骤4，将水化后的悬浊液在冰水浴的条件下进行超声破碎，超声至悬浊液均匀透亮，过0.45 μm的滤膜，收集到无菌离心管中，即得乳脂质体，所述乳脂质体为球形结构，粒径在300 ±30 nm分布较为均匀，平均电位为-67.3 mV，体系稳定，置于4℃冰箱保存备用。
2.根据权利要求1所述的乳脂质体的构建，其特征在于，步骤2中减压旋转蒸发时，真空度维持在-0.01 kPa，水浴温度为45 ℃。
3.基于权利要求1-2中任一项所得乳脂质体在巨噬细胞免疫调节活性中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述乳脂质体通过抑制清道夫受体SRA1，减少受体与LPS的结合，从而抑制了LPS刺激下炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和趋化因子IL-8的释放，和促进抗炎症因子IL-10的分泌，抑制由LPS诱导巨噬细胞的炎症反应，进而调节巨噬细胞免疫活性。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，当乳脂质体浓度达到400 μg/mL时，对NF-κB二聚体的入核抑制作用增加，炎症因子恢复至正常水平，即对LPS诱导巨噬细胞炎症模型下的抑炎作用达到最大。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Guo Yuxing Inventor after: Zhao Jiayuan Inventor after: Wang Xiaozhi Inventor after: Wu Fan Inventor after: Luo Mengfan Inventor after: Tan Donghu Inventor after: Zhang Tao Inventor after: Liu Mingzhen Inventor before: Zhao Jiayuan Inventor before: Wang Xiaozhi Inventor before: Wu Fan Inventor before: Luo Mengfan Inventor before: Tan Donghu Inventor before: Zhang Tao Inventor before: Liu Mingzhen Inventor before: Guo Yuxing |
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| GR01 | Patent grant | ||
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