CN115006347A - 一种D-半乳糖修饰的α-亚麻酸肝靶向纳米乳液及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种D‑半乳糖修饰的α‑亚麻酸肝靶向纳米乳液及其制备方法和应用，属于宠物抗肿瘤药物技术领域。通过以α‑亚麻酸为活性功能因子，D‑半乳糖为靶向配体，壳聚糖为桥接α‑亚麻酸和靶向配体D‑半乳糖的靶向增强因子，显著提升活性因子的生物利用度及作用效果。本发明制备的负载α‑亚麻酸的肝靶向纳米乳液属于食品级材料的范畴，具有无毒、可生物降解、生物相容性好的优点，在食品及医药领域具有广阔的应用前景。本发明制备的D‑半乳糖修饰的α‑亚麻酸肝靶向纳米乳液粒径为40‑80nm，具有易被体内细胞吸收的特性，显著增强吸收利用度，并允许大幅度提高活性组分负载量。

Description

一种D-半乳糖修饰的α-亚麻酸肝靶向纳米乳液及其制备方法 和应用
技术领域
本发明涉及宠物抗肿瘤药物技术领域，特别涉及一种D-半乳糖修饰的α-亚麻酸肝靶向纳米乳液及其制备方法和应用。
背景技术
近年来，肿损伤及肝肿瘤成为困扰宠物的一类肝部疾病，越来越多的犬猫肝部位出现损伤及肿瘤，并且种类也不尽相同，宠物犬猫肝肿瘤是犬猫易发生的十大肿瘤之一，极大地威胁宠物犬猫的生命健康。α-亚麻酸(ALA)具有降低血糖血压，预防心脑血管疾病，调节血脂，抗炎、促进损伤肝细胞的再生，抗肿瘤生长等生理功能。身体组织肿瘤受到ALA及其衍生物DHA的作用，从而抑制肿瘤的生长，使肿瘤不断地缩小。开发添加α-亚麻酸的动物功能性饲料具有很好的开发前景。但由于ALA具有三个不饱和双键，在储存和递送过程中极容易被氧化，因而影响其生物利用度。因此，将其负载到递送载体保护ALA，在储存和递送阶段减少氧化损伤，提高ALA的生物利用度和递送效率。为进一步实现活性成分在目标区域的有效释放，针对性治疗，提高利用率，可以采用受体特异性识别配体的靶向作用实现靶向作用，提高α-亚麻酸作用的目标性。
去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)是动物肝细胞表面过表达的受体，是定位于肝细胞表面的主要生物靶点，组成结构末端带有半乳糖或乙酰半乳糖胺残基的糖蛋白容易被特异性识别，在良好的生理条件下具有高亲和力和高稳定性，糖蛋白受体的主要功能是通过糖蛋白的识别、结合和内吞作用来维持血清糖蛋白稳态，通过受体介导的内吞作用内化后，在核内体的酸性环境中解离并最终降解。
半乳糖化靶向递送系统是近年来靶向给药系统研究的热点。以半乳糖为端基的药物及药物载体具有去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)介导的肝实质细胞靶向性，ASGPR能特异性识别末端带有半乳糖残基或乙酰半乳糖残基的寡糖或寡糖蛋白，并与之相结合。如何利用ASGPR配基修饰一些外源性功能物质，设计合成一系列基于ASGPR受体介导的靶向给药系统；以实现负载物高效递送到目标细胞，有效作用治疗，从而减少对健康组织的毒副作用，制备出具有高效力的结合物来进行肿瘤的靶向治疗，是本领域亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种D-半乳糖修饰的α-亚麻酸肝靶向纳米乳液及其制备方法和应用。通过以α-亚麻酸为活性功能因子，D-半乳糖为靶向配体，壳聚糖为桥接α-亚麻酸和靶向配体D-半乳糖的靶向增强因子，显著提升活性因子的生物利用度及作用效果。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
本发明技术方案之一：提供一种D-半乳糖修饰的α-亚麻酸肝靶向纳米乳液的制备方法，包括以下步骤：
(1)内水相的制备：将D-半乳糖和壳聚糖溶于水，得到内水相；
(2)混合油相的制备：将α-亚麻酸与油相混合，得到混合油相；
(3)W/O纳米乳液的制备：将所述内水相、表面活性剂和助表面活性剂混合均匀，加入所述混合油相，乳化，制得W/O纳米乳液；
(4)W/O/W纳米乳液的制备：将所述W/O纳米乳液、表面活性剂和助表面活性剂混合均匀，加入水，制得W/O/W纳米乳液，即为D-半乳糖修饰的α-亚麻酸肝靶向纳米乳液。
优选地，步骤(1)中所述D-半乳糖、壳聚糖和水的质量比为(1～5):(1～3):(500～1000)；所述D-半乳糖、壳聚糖和水的质量比最优选为1:1:300。
更优选地，步骤(1)中的溶解方式为超声溶解，超声的频率为30～40kHz，温度为25～40℃，时间为20～30min。
优选地，步骤(2)中所述油相为乙酸异戊酯。
更优选地，所述α-亚麻酸与所述乙酸异戊酯的质量比为(1～3):(100～300)；所述α-亚麻酸与所述乙酸异戊酯的质量比为最优选为1:100。
更优选地，步骤(2)中所述混合为在300～500rpm下搅拌10-20min。
优选地，步骤(3)和步骤(4)中：所述助表面活性剂为乙醇；所述表面活性剂为聚乙二醇甘油蓖麻酸酯和聚氧乙烯蓖麻油中的一种或两种。
更优选地，步骤(3)中所述表面活性剂为聚乙二醇甘油蓖麻酸酯和聚氧乙烯蓖麻油按质量比1:(1～3)混合所得的混合物；步骤(4)中所述表面活性剂为聚乙二醇甘油蓖麻酸酯和聚氧乙烯蓖麻油按质量比1:(5～8)混合所得的混合物。
更优选地，步骤(3)中所述内水相、表面活性剂和助表面活性剂的质量比为(3～4):(5～8):1；内水相、表面活性剂和助表面活性剂的混合物与所述混合油相的质量比为1:(4～8)。
更优选地，步骤(3)中所述混合为在35～55℃，400～600rpm下搅拌20～30min。
更优选地，步骤(4)中所述W/O纳米乳液、表面活性剂和助表面活性剂的质量比为(3～4):(5～8):1；W/O纳米乳液、表面活性剂和助表面活性剂的混合物与所述水的质量比为1:(5～15)。
更优选地，步骤(4)中所述混合为在30～35℃，400～600rpm下搅拌30～50min。
本发明技术方案之二：提供一种根据上述D-半乳糖修饰的α-亚麻酸肝靶向纳米乳液的制备方法制得的D-半乳糖修饰的α-亚麻酸肝靶向纳米乳液。
本发明技术方案之三：提供一种上述的D-半乳糖修饰的α-亚麻酸肝靶向纳米乳液在制备宠物肝肿瘤靶向药物中的应用。
本发明以乙酸异戊酯作为纳米乳液的油相，聚乙二醇甘油蓖麻酸酯+聚氧乙烯蓖麻油作为纳米乳液的表面活性剂，乙醇作为纳米乳液的助表面活性剂，多不饱和脂肪酸--α-亚麻酸为纳米乳液的负载物，构建纳米乳液载体负载抗肿瘤的生物活性因子，并采用D-半乳糖进行纳米乳液载体的修饰，所构建的动物肝靶向纳米乳液递送系统具有增溶难溶性组分，提高其对动物(例如犬猫等)的肿瘤靶向性等优势。
本发明的有益技术效果如下：
本发明制备的D-半乳糖修饰的α-亚麻酸肝靶向纳米乳液，通过将肝靶向配体D-半乳糖包裹于W/O/W纳米乳液的内水相中，减少了其在递送过程中的流失。
本发明创新性地添加具有桥接α-亚麻酸和靶向配体D-半乳糖的靶向增强因子壳聚糖。壳聚糖分子具有较强的吸附能力，由于吸附作用其分布在内水相与油相界面，通过壳聚糖分子中的氨基与油相α-亚麻酸成盐，壳聚糖分子中的羟基与内水相D-半乳糖通过氢键键合，以桥梁臂形式将α-亚麻酸和靶向配体D-半乳糖连接起来，大大增加靶向性。
本发明通过以α-亚麻酸为活性功能因子，D-半乳糖为靶向配体，壳聚糖为桥接α-亚麻酸和靶向配体D-半乳糖的靶向增强因子，显著提升活性因子的生物利用度及作用效果，制备的新型靶向纳米乳液递送体系在食品及医药领域具有广阔的应用前景。
本发明制备的负载α-亚麻酸的肝靶向纳米乳液属于食品级材料的范畴，具有无毒、可生物降解、生物相容性好的优点。
本发明制备的D-半乳糖修饰的α-亚麻酸肝靶向纳米乳液粒径为40-80nm，具有易被体内细胞吸收的特性，显著增强吸收利用度，并允许大幅度提高活性组分负载量(本发明中α-亚麻酸添加量占W/O/W纳米乳液总质量的0.01％～1.0％时，依旧稳定)。
附图说明
图1为实施例1制备的D-半乳糖修饰的α-亚麻酸肝靶向纳米乳液的透射电镜图。
图2为实施例1制备的D-半乳糖修饰的α-亚麻酸肝靶向纳米乳液的粒径分布图。
图3为实施例1-6制备的D-半乳糖修饰的α-亚麻酸肝靶向纳米乳液的稀释水溶液图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。
另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明实施例及对比例所制备的纳米乳液对肝癌细胞抑制率的测定方法如下：
将制备的纳米乳液透过0.2μm的滤膜除菌，随后用细胞培养液(10％FBS胎牛血清+R1640培养基)进行100、200、400、800、1600、3200和6400倍稀释，配制成对应浓度为1％、0.5％、0.25％、0.125％、0.0625％、0.0313％和0.0156％的供试液。
小鼠肝癌Hepa1-6细胞孵育24h后，弃去原培养液，将配置好的含不同剂量纳米乳液的供试液进行给药，每个浓度设置6个复孔，在37℃、5％CO2培养箱中将100μL供试液与细胞作用24h，供试液作用24h结束后，用PBS清洗细胞两次，每孔加110μL配置好的CCK-8溶液(R1640培养基：CCK-8原液＝10:1)，37℃继续培养3h后，用酶标仪检测450nm处的吸光度值。
按照以下式计算细胞存活率和抑制率：
Figure BDA0003723397140000061
实施例1
将D-半乳糖、壳聚糖和水以质量比1：2：500混合后在工作频率为40kHz的超声波水浴(25℃)中溶解20min，得到溶有D-半乳糖和壳聚糖的水。
将α-亚麻酸和乙酸异戊酯以质量比1：300混合后在500rpm下搅拌10min，得到溶有α-亚麻酸的乙酸异戊酯。
将乙醇、聚乙二醇甘油蓖麻酸酯+聚氧乙烯蓖麻油(1:1)和溶有D-半乳糖和壳聚糖的水以质量比1：5：3混合，45℃和400rpm下搅拌20min。向其中滴加其质量4倍的溶有α-亚麻酸的乙酸异戊酯，得到W/O纳米乳液。
然后将聚乙二醇甘油蓖麻酸酯+聚氧乙烯蓖麻油(1：5)、乙醇和W/O纳米乳液以质量比5：1：3混合，30℃、400rpm下搅拌30min。
再向以上混合液中逐滴加入水，加入水的质量为以上混合液的5倍，得到均一透明的肝靶向W/O/W纳米乳液，即为D-半乳糖修饰的α-亚麻酸肝靶向纳米乳液，平均粒径为50nm。
本发明实施例1制备的D-半乳糖修饰的α-亚麻酸肝靶向纳米乳液的透射电镜图见图1。从图1中可以看出，纳米乳液呈球形颗粒，分散均匀，无聚集。
本发明实施例1制备的D-半乳糖修饰的α-亚麻酸肝靶向纳米乳液的粒径分布图见图2。从图2中可以看出，纳米乳液粒径呈正态分布，主粒径在50纳米左右。
实施例2
与实施例1相比，区别在于将D-半乳糖、壳聚糖和水以质量比1：1：300混合，其他条件与实施例1相同。
实施例2所制得肝靶向W/O/W纳米乳液的平均粒径为40nm。
实施例3
与实施例1相比，区别在于将D-半乳糖、壳聚糖和水以质量比5：3：1000混合，其他条件与实施例1相同。
实施例3所制得肝靶向W/O/W纳米乳液的平均粒径为50nm。
实施例4
与实施例1相比，区别在于将α-亚麻酸和乙酸异戊酯以质量比1:100混合，其他条件与实施例1相同。
实施例4所制得肝靶向W/O/W纳米乳液的平均粒径为60nm。
实施例5
与实施例1相比，区别在于将α-亚麻酸和乙酸异戊酯以质量比1：200混合，其他条件与实施例1相同。
实施例5所制得肝靶向W/O/W纳米乳液的平均粒径为50nm。
实施例6
将D-半乳糖、壳聚糖和水以质量比2：2：800混合后在工作频率为30kHz的超声波水浴(35℃)中溶解30min，得到溶有D-半乳糖和壳聚糖的水。
将α-亚麻酸和乙酸异戊酯以质量比2：300混合后在500rpm下搅拌20min，得到溶有α-亚麻酸的乙酸异戊酯。
将乙醇、聚乙二醇甘油蓖麻酸酯+聚氧乙烯蓖麻油(1:2)和溶有D-半乳糖和壳聚糖的水以质量比1：6：3混合，55℃和500rpm下搅拌20min。向其中滴加其质量5倍的溶有α-亚麻酸的乙酸异戊酯，得到W/O纳米乳液。
然后将聚乙二醇甘油蓖麻酸酯+聚氧乙烯蓖麻油(1：6)、乙醇和W/O纳米乳液以质量比6：1：4混合，30℃、500rpm下搅拌30min。
再向以上混合液中逐滴加入水，加入水的质量为以上混合液的8倍，得到均一透明的肝靶向W/O/W纳米乳液，即为D-半乳糖修饰的α-亚麻酸肝靶向纳米乳液，平均粒径为50nm。
实施例7
将D-半乳糖、壳聚糖和水以质量比4：3：700混合后在工作频率为40kHz的超声波水浴(40℃)中溶解30min，得到溶有D-半乳糖和壳聚糖的水。
将α-亚麻酸和乙酸异戊酯以质量比3：250混合后在500rpm下搅拌20min，得到溶有α-亚麻酸的乙酸异戊酯。
将乙醇、聚乙二醇甘油蓖麻酸酯+聚氧乙烯蓖麻油(1:3)和溶有D-半乳糖和壳聚糖的水以质量比1：7：4混合，45℃和600rpm下搅拌20min。向其中滴加其质量6倍的溶有α-亚麻酸的乙酸异戊酯，得到W/O纳米乳液。
然后将聚乙二醇甘油蓖麻酸酯+聚氧乙烯蓖麻油(1：7)、乙醇和W/O纳米乳液以质量比7：1：3混合，30℃、400rpm下搅拌50min。
再向以上混合液中逐滴加入水，加入水的质量为以上混合液的10倍，得到均一透明的肝靶向W/O/W纳米乳液，即为D-半乳糖修饰的α-亚麻酸肝靶向纳米乳液，平均粒径为60nm。
实施例8
将D-半乳糖、壳聚糖和水以质量比3：3：800混合后在工作频率为30kHz的超声波水浴(30℃)中溶解30min，得到溶有D-半乳糖和壳聚糖的水。
将α-亚麻酸和乙酸异戊酯以质量比2：300混合后在400rpm下搅拌20min，得到溶有α-亚麻酸的乙酸异戊酯。
将乙醇、聚乙二醇甘油蓖麻酸酯+聚氧乙烯蓖麻油(1:2)和溶有D-半乳糖和壳聚糖的水以质量比1：6：4混合，35℃和500rpm下搅拌30min。向其中滴加其质量7倍的溶有α-亚麻酸的乙酸异戊酯，得到W/O纳米乳液。
然后将聚乙二醇甘油蓖麻酸酯+聚氧乙烯蓖麻油(1：5)、乙醇和W/O纳米乳液以质量比6：1：4混合，30℃、500rpm下搅拌40min。
再向以上混合液中逐滴加入水，加入水的质量为以上混合液的12倍，得到均一透明的肝靶向W/O/W纳米乳液，即为D-半乳糖修饰的α-亚麻酸肝靶向纳米乳液，平均粒径为50nm。
实施例9
将D-半乳糖、壳聚糖和水以质量比5：3：1000混合后在工作频率为40kHz的超声波水浴(35℃)中溶解30min，得到溶有D-半乳糖和壳聚糖的水。
将α-亚麻酸和乙酸异戊酯以质量比3：100混合后在500rpm下搅拌20min，得到溶有α-亚麻酸的乙酸异戊酯。
将乙醇、聚乙二醇甘油蓖麻酸酯+聚氧乙烯蓖麻油(1:3)和溶有D-半乳糖和壳聚糖的水以质量比1：8：4混合，55℃和500rpm下搅拌20min。向其中滴加其质量8倍的溶有α-亚麻酸的乙酸异戊酯，得到W/O纳米乳液。
然后将聚乙二醇甘油蓖麻酸酯+聚氧乙烯蓖麻油(1：8)、乙醇和W/O纳米乳液以质量比8：1：4混合，30℃、600rpm下搅拌30min。
再向以上混合液中逐滴加入水，加入水的质量为以上混合液的15倍，得到均一透明的肝靶向W/O/W纳米乳液，即为D-半乳糖修饰的α-亚麻酸肝靶向纳米乳液，平均粒径为80nm。
实施例1-6制备的D-半乳糖修饰的α-亚麻酸肝靶向纳米乳液的稀释水溶液图见图3，图3中所示样品瓶从左到右依次为实施例1-6。本发明制备的水包油包水纳米乳液在制备过程包含两个过程，其一是形成油包水，然后加水即形成水包油包水，区分油包水与水包油包水纳米乳液，可以通过测定两种纳米乳液的电导率来进行区分，油包水纳米乳液，以油相作为连续相，通常具有较低的导电率，约为10.0-50.0μs/cm，而水包油包水纳米乳液具有高导电性，电导率范围约为250.0至350.0μs/cm，本申请制备纳米乳液电导率值在310-320μs/cm。另外，从图3中可以看出，实施例1所制得D-半乳糖修饰的α-亚麻酸肝靶向纳米乳液用水稀释后均形成了均一溶液，表明本发明制得的纳米乳液为W/O/W纳米乳液。
实施例1-9所制备的D-半乳糖修饰的α-亚麻酸肝靶向纳米乳液以不同剂量给药后，测定的小鼠肝癌Hepa1-6细胞存活率见表1。表1实施例1-9所制备的D-半乳糖修饰的α-亚麻酸肝靶向纳米乳液的效果数据
作用剂量(％) 细胞存活率(％)
实施例1 0.1 60
实施例2 0.1 45
实施例3 0.1 55
实施例4 0.1 50
实施例5 0.1 55
实施例6 0.3 40
实施例7 0.6 35
实施例8 0.8 25
实施例9 1 13
备注：表1中所述作用剂量百分数为纳米乳液占供试液的质量百分数，下表相同。
对比例1
与实施例1的区别在于，省略D-半乳糖的加入，其他条件与实施例1相同。
将实施例1与对比例1制备的纳米乳液分别按照不同剂量作用于小鼠肝癌Hepa1-6细胞，肝癌细胞的存活率见表2。
表2靶向配体的强化作用效果对比数据
Figure BDA0003723397140000111
Figure BDA0003723397140000121
对比例2
与实施例1的区别在于，将内水相中的D-半乳糖省略，在最后的外水相中添加实施例1中内水相等质量的D-半乳糖，其他步骤与实施例1相同。
将实施例1与对比例2制备的纳米乳液分别按照不同剂量作用于小鼠肝癌Hepa1-6细胞，肝癌细胞的存活率见表3。
表3W/O/W纳米乳液对靶向配体的强化包埋效果对比数据
Figure BDA0003723397140000122
对比例3
与实施例1的区别在于，省略壳聚糖的加入，其他条件与实施例1相同。
将实施例1与对比例3制备的纳米乳液按照不同剂量作用于小鼠肝癌Hepa1-6细胞，肝癌细胞的存活率见表4。
表4壳聚糖对W/O/W纳米乳液的效果对比数据
Figure BDA0003723397140000123
Figure BDA0003723397140000131
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种D-半乳糖修饰的α-亚麻酸肝靶向纳米乳液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)内水相的制备：将D-半乳糖和壳聚糖溶于水，得到内水相；
(2)混合油相的制备：将α-亚麻酸与油相混合，得到混合油相；
(3)W/O纳米乳液的制备：将所述内水相、表面活性剂和助表面活性剂混合均匀，加入所述混合油相，乳化，制得W/O纳米乳液；
(4)W/O/W纳米乳液的制备：将所述W/O纳米乳液、表面活性剂和助表面活性剂混合均匀，加入水，制得W/O/W纳米乳液，即为D-半乳糖修饰的α-亚麻酸肝靶向纳米乳液。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述D-半乳糖、壳聚糖和水的质量比为(1～5):(1～3):(500～1000)。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述油相为乙酸异戊酯。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述α-亚麻酸与所述乙酸异戊酯的质量比为(1～3):(100～300)。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)和步骤(4)中：所述助表面活性剂为乙醇；所述表面活性剂为聚乙二醇甘油蓖麻酸酯和聚氧乙烯蓖麻油中的一种或两种。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述表面活性剂为聚乙二醇甘油蓖麻酸酯和聚氧乙烯蓖麻油按质量比1:(1～3)混合所得的混合物；步骤(4)中所述表面活性剂为聚乙二醇甘油蓖麻酸酯和聚氧乙烯蓖麻油按质量比1:(5～8)混合所得的混合物。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述内水相、表面活性剂和助表面活性剂的质量比为(3～4):(5～8):1；内水相、表面活性剂和助表面活性剂的混合物与所述混合油相的质量比为1:(4～8)。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述W/O纳米乳液、表面活性剂和助表面活性剂的质量比为(3～4):(5～8):1；W/O纳米乳液、表面活性剂和助表面活性剂的混合物与所述水的质量比为1:(5～15)。
9.一种根据权利要求1～8任一项所述D-半乳糖修饰的α-亚麻酸肝靶向纳米乳液的制备方法制得的D-半乳糖修饰的α-亚麻酸肝靶向纳米乳液。
10.权利要求9所述的D-半乳糖修饰的α-亚麻酸肝靶向纳米乳液在制备宠物肝肿瘤靶向药物中的应用。
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