CN115003690A - 重组生长分化因子11(gdf11) - Google Patents
重组生长分化因子11(gdf11) Download PDFInfo
- Publication number
- CN115003690A CN115003690A CN202180007896.4A CN202180007896A CN115003690A CN 115003690 A CN115003690 A CN 115003690A CN 202180007896 A CN202180007896 A CN 202180007896A CN 115003690 A CN115003690 A CN 115003690A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gdf11
- protein
- recombinant protein
- gbd
- glucan
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 102100040898 Growth/differentiation factor 11 Human genes 0.000 title claims abstract description 43
- 101000893545 Homo sapiens Growth/differentiation factor 11 Proteins 0.000 title claims abstract description 42
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 73
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 73
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims abstract description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 claims abstract description 15
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 claims abstract description 11
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims abstract description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 4
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 59
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 23
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 23
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 23
- 229920000310 Alpha glucan Polymers 0.000 claims description 15
- 230000037396 body weight Effects 0.000 claims description 14
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 13
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 12
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 11
- 244000144977 poultry Species 0.000 claims description 11
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 claims description 8
- 244000144972 livestock Species 0.000 claims description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 8
- 241000194019 Streptococcus mutans Species 0.000 claims description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 claims description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 claims description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 claims description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 claims description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 10
- 108090001082 glucan-binding proteins Proteins 0.000 abstract description 8
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 abstract description 6
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 abstract description 6
- 230000037257 muscle growth Effects 0.000 abstract description 4
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 abstract description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 52
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 15
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 13
- 108010056852 Myostatin Proteins 0.000 description 11
- 102100039939 Growth/differentiation factor 8 Human genes 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 244000309466 calf Species 0.000 description 5
- 239000012053 oil suspension Substances 0.000 description 5
- 241000283903 Ovis aries Species 0.000 description 4
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 102100034134 Activin receptor type-1B Human genes 0.000 description 3
- WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N Benzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000799189 Homo sapiens Activin receptor type-1B Proteins 0.000 description 3
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 2
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 2
- 101150080985 GDF11 gene Proteins 0.000 description 2
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 2
- 229920001218 Pullulan Polymers 0.000 description 2
- 239000004373 Pullulan Substances 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 235000019423 pullulan Nutrition 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 102100034135 Activin receptor type-1C Human genes 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 101710194452 Growth/differentiation factor 11 Proteins 0.000 description 1
- 101000799193 Homo sapiens Activin receptor type-1C Proteins 0.000 description 1
- 235000019687 Lamb Nutrition 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 101000786326 Mus musculus Zinc finger BED domain-containing protein 6 Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000255969 Pieris brassicae Species 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 102100033456 TGF-beta receptor type-1 Human genes 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 108010011702 Transforming Growth Factor-beta Type I Receptor Proteins 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229910021502 aluminium hydroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 235000019445 benzyl alcohol Nutrition 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000003966 growth inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- -1 isopropyl- Chemical group 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000028504 regulation of cardiac muscle cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
- A61K38/1841—Transforming growth factor [TGF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/495—Transforming growth factor [TGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
Abstract
本发明的目的是产生具有免疫活性的重组GDF11蛋白,该重组GDF11蛋白易于纯化并相对于生长分化因子11蛋白具有足够的免疫原性,可用于通过诱导合成GDF11的特异性自身抗体、阻断GDF11的作用,从而刺激肌肉组织生长来增加哺乳动物和鸟类的肌肉量。本发明通过产生包含GDF11和葡聚糖结合结构域的重组蛋白来实现。本发明提出了用于生产在葡聚糖上的靶蛋白的方法,该方法涉及使蛋白与含葡聚糖的吸附剂通过亲和作用结合,随后洗去未结合的细菌蛋白并回收目标产物。
Description
技术领域
本组发明涉及基因工程、生物技术和兽医学,具体涉及重组生长分化因子11、其生产方法、含有作为抗原的GDF11的免疫原性组合物、用于增加哺乳动物和家禽肌肉量的注射剂,以及使用指定注射剂增加动物肌肉量的方法。
背景技术
生长分化因子11(GDF11)蛋白属于转化生长因子-β的TGF-β超家族。GDF11是一种肌肉生长抑制素同源蛋白,可作为各种组织的生长抑制剂。GDF11能够与肌肉生长抑制素结合相同的TGF-βI型超家族ACVR1B(ALK4)、TGFBR1(ALK5)和ACVR1C(ALK7)的受体,但主要使用ALK4和ALK5来进行信号传递(AnderssonО,ReissmannЕ,Ibanez CF,2006年,EMBOReports.,第7卷第8期:第831-837页)。
在现有技术中已知美国专利号6096506,其公开了与肌肉生长抑制素多肽特异性反应的抗体。还已知以下方法:通过引入对抗肌肉生长抑制素并阻断其活性的单克隆抗体来增加动物肌肉量的方法(美国专利号6468535),以及生产具有肌肉生长抑制素序列并且能够诱导合成肌肉生长抑制素的特异性自身抗体作为免疫原性组合物的一部分、阻断该肌肉生长抑制素作用,从而刺激肌肉组织生长的融合蛋白的方法(俄罗斯联邦专利号2613420)。
GDF11与肌肉生长抑制素(一种负性肌肉生长调节剂)密切相关。(McPherron AC,Lee SJ,1997年,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,第94卷第23期:第12457-12461页)。肌肉生长抑制素和GDF11参与心肌细胞增殖调节。GDF11和肌肉生长抑制素之间的相似性意味着可能使用了参与调节组织大小(肌肉和骨骼以及软骨大小)的相同调节机制。(EgermanМА等人,Cell Metab.,2015年第22卷第l期:第164-174页;Zimmers TA等人,2017年,Basic ResCardiol.,第112卷第4期:第48页)。因此,阻断GDF11活性应导致身体肌肉量的显著增加。
本发明的作者获得了意想不到的可重复结果,证明了含有GDF11的融合重组蛋白、含有该蛋白的免疫原性组合物以及疫苗可用于增加身体的肌肉量。
发明内容
待由所要求保护的一组发明组解决的技术问题涉及产生具有免疫活性的重组GDF11,该重组GDF11易于纯化并且相对于作为抗原的GDF11具有足够的免疫原性,可用于通过诱导合成GDF11的特异性自身抗体、阻断GDF11的作用,从而刺激肌肉组织生长来提高家畜(牛、猪、马、兔等)和家禽的产肉率。待由所要求保护的一组发明解决的另一个技术问题涉及开发基于指定蛋白质的药物和建立使用该药物的方法,该方法解决了在非系统地使用该药物的情况下提高家畜和家禽的产肉率的问题。应当注意,GDF11的氨基酸序列在所有哺乳动物和鸟类中都是相同的。因此,所开发的产品是提高家畜和家禽的产肉率的通用药剂。
通过实施所要求保护的一组发明而实现的技术成果涉及能够提高家畜和家禽生产力的工具和方法集的扩展。
该技术成果通过分子量为35.9kDa的重组蛋白来实现,该重组蛋白包括:具有SEQID NO:1的序列的生长分化因子11(GDF11)蛋白的片段、具有SEQ ID NO:2的序列的Gly-Ser间隔区、具有SEQ ID NO:3的序列的来自变异链球菌(Streptococcus mutans)的基因的α葡聚糖结合结构域(GBD)和具有SEQ ID NO:4的GDF11-GBD基因核苷酸序列。
该技术成果还通过生产含葡聚糖的GDF11(GDF11-GBD)重组蛋白的方法来实现,该方法包括:
—培养表达GDF11-GBD基因的大肠杆菌(E.coli)细胞;
—使大肠杆菌菌株BL21[pGDF11-GBD]的细胞提取物中的GDF11-GBD蛋白与含葡聚糖(含α-葡聚糖)的吸附剂在孵育过程中通过亲和作用结合;
—随后进行洗涤以除去未结合的细菌蛋白并回收目标产物。
普鲁兰多糖、糖原、右旋糖酐和淀粉可用作含葡聚糖的吸附剂(葡聚糖、α葡聚糖)。
GDF11-GBD重组蛋白包括葡聚糖结合结构域的决定该蛋白与含葡聚糖的吸附剂结合的能力的蛋白序列,这使得浓缩、纯化以及将蛋白产物固定在葡聚糖(α葡聚糖,含葡聚糖吸附剂)上仅需一个步骤。来自变异链球菌的基因的α葡聚糖结合结构域中的葡聚糖结合结构域的存在确保了在葡聚糖上固定,该变异链球菌基因的α葡聚糖结合结构域对α葡聚糖具有高亲和力,并且在重组蛋白中pH值为6.0至9.0和盐浓度为0M至3M NaCl的大范围内提供与该含葡聚糖吸附剂的不可逆结合。
由于大肠杆菌细胞中不存在α葡聚糖结合蛋白,因此在大肠杆菌细胞中合成的GDF11-GBD重组蛋白是生产菌株细胞中与α葡聚糖强烈结合的唯一蛋白。这使得固定在含葡聚糖吸附剂上的高度纯化的重组蛋白制剂的单阶段生产成为可能。
技术成果还通过以下实现:用于增加家畜和家禽的肌肉量的注射剂,该注射剂含有如上所述的GDF11-GBD重组蛋白,该重组蛋白悬浮于可用于注射的含葡聚糖(α-葡聚糖)的吸附剂的液体佐剂(载体)溶液的环境中;以及实施用于增加家畜和家禽的肌肉量的方法,该方法包括将含有GDF11-GBD重组蛋白的药物以0.5-50μg指定蛋白/kg动物或家禽体重进行皮下或肌内注射,该重组蛋白悬浮于可用于注射的含葡聚糖(α-葡聚糖)的吸附剂的液体载体溶液的环境中。
因此,已经产生的双功能GDF11-GBD重组蛋白能够自发与含葡聚糖的吸附剂结合,形成多抗原形式的高度免疫原性组合物,以在施用给动物时诱导合成GDF11的特异性自身抗体,从而刺激肌肉组织生长。
GDF11(GDF11-GBD)重组融合蛋白的生产
在第一阶段获得GDF11基因,随后对该基因进行克隆。
使用化学发酵方法获得GDF11基因。已经设计了编码相应基因的寡核苷酸双链体,优化后可在大肠杆菌中表达。然后获得含有编码GDF11、间隔区和葡聚糖结合结构域(GBD)的序列的pGDF11-GBD质粒。
获得生产与葡聚糖结合结构域结合的GDF-11重组抗原的大肠杆菌菌株
用pGDF11-GBD质粒转化大肠杆菌BL21细胞,以获得生产GDF11-GBD重组蛋白的大肠杆菌菌株。向培养物中补充3μL的0.1M异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)溶液,并且在37℃的温度培养3小时。在比较由大肠杆菌菌株BL21细胞[pGDF11-GBD]合成的蛋白质的谱时,发现了另外的蛋白质条带。这条额外条带的分子量与GDF11-GBD重组蛋白预期的35.9kDa的质量一致。通过比较该重组蛋白的条带与标准分子量的对应蛋白的条带的染色强度,确定大肠杆菌中蛋白质合成的水平。已经表明,GDF11-GBD重组蛋白在大肠杆菌细胞中以包涵体形式的不溶形式合成。
α-葡聚糖固定化GDF11-GBD重组蛋白(GDF11)的生产
大肠杆菌菌株BL21[pGDF11-GBD]的细胞培养物在37℃在1,000mL含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养基中培养至波长为550nm时对应1单位吸收的光密度,以获得重组蛋白。向培养基中加入15μL的0.1MIPTG溶液,并且培养3小时。通过以5,500g离心15分钟来沉淀细胞。
将沉淀物重悬于含有溶菌酶的磷酸盐缓冲液中。再将悬浮液超声处理。在以6,000g离心后,不溶的GDF11-GBD蛋白留在沉淀物中。将沉淀物悬浮于8M尿素中,以12,000g离心30分钟,除去上清液。为了将GDF11-GBD重组蛋白固定在含葡聚糖的吸附剂上,将上清液用中性pH的生理磷酸盐缓冲液稀释四倍,加入1/10体积的α葡聚糖悬浮液(普鲁兰多糖、糖原或右旋糖酐或淀粉),并将该上清液以25℃孵育2小时。以8,000rpm的速度离心,将沉淀物重悬于磷酸盐缓冲液中;用α葡聚糖重复洗涤3次。固定在α葡聚糖上的GDF11-GBD抗原代表其上吸附有蛋白的吸附剂的悬浮液。制剂的纯度为至少90%。通过加入苯甲醇至浓度为0.1%来保存该制剂。
GDF11-GBD重组蛋白的生物学作用
在本发明的优选实施方案中,制剂含有GDF-11-GBD重组蛋白的中性pH缓冲溶液,该重组蛋白悬浮于以下佐剂中:葡聚糖溶液与水油悬浮液MONTANIDE ISA 206VG(50重量%/50重量%)或MONTANIDE ISA 70VG(30重量%/70重量%)的混合物,或与2%、3%或6%氢氧化铝悬浮液(5体积%/30体积%)的混合物;或按照制造商的使用说明的其他商业佐剂与葡聚糖溶液的混合物,并且该制剂以0.5-150μg重组蛋白/1kg动物或家禽体重的剂量用作皮下或肌内注射药物一次或两次,注射间隔为20-30天。该药物的作用机制是基于在自身抗体的帮助下暂时阻断内源性GDF11的活性。
通过以下实施例来说明该药物在增加家畜的瘦体重方面的功效。
实施例1.含有GDF11-GBD重组蛋白的药物对仔猪体重增加的影响
在工业化的养猪场中,以0.10-150μg重组蛋白/1kg动物体重的比率分两次向90-120天大、体重为20-25kg的Large White仔猪注射含有悬浮于佐剂介质(α葡聚糖(50重量%)和水油悬浮液MONTANIDE ISA206VG(50重量%)的混合物)中的GDF11-GBD重组蛋白的药物,两次注射间隔21天。药物采用皮下注射方式。实验组和对照组各10只动物。对照组的动物不接受任何注射。结果示于表1中。
表1
所示的数据表明,两次(间隔21天)注射含有GDF11-GBD重组蛋白的药物使得仔猪的体重在以0.5μg/kg的重组蛋白的剂量第二次注射药物90天后,相对于对照组中的该指标增加13.4%;当施用重组蛋白剂量为50μg/kg的药物时,这一结果为28.8%;当施用重组蛋白剂量为100μg/kg的药物时,这一结果为28.6%。因此,当以0.5μg/kg至150μg/kg范围的剂量施用药物时,仔猪的体重增加相对于对照组中的增加有显著增加。
此外,还发现即使单次施用含有GDF11-GBD重组蛋白的药物也能使仔猪的体重显著增加。
值得注意的是,当以超出0.5-150μg/kg的剂量范围的剂量施用药物时,仔猪的体重增加相对于对照组中的体重增加有显著下降。
表2示出了用含有GDF11-GBD重组蛋白的药物免疫后,仔猪血清中相对于肌肉生长抑制素的自身抗体水平(ELISA法)。
表2
用含有GDF11-GBD重组蛋白的药物进行免疫的仔猪血清样品中GDF11的自身抗体水平的ELISA测定结果
表1和表2表明,含有GDF11-GBD重组蛋白的药物在动物体内诱导自身抗体的最佳剂量为0.5-150mg/kg动物体重。
实施例2.含有GDF11-GBD重组蛋白的药物对Kholmogory公牛体重增加的影响
在养殖场中,以0.1-150μg重组蛋白/1kg动物活体重的比率分两次向3个月大的Kholmogory小牛注射含有悬浮于佐剂介质(α葡聚糖(50重量%)和水油悬浮液MONTANIDEISA 206VG(50重量%)的混合物)中的GDF11-GBD重组蛋白的药物,两次注射间隔25天。
将药物皮下注射到颈部下方的三分之一处。实验组和对照组各10只动物。对照组的动物不接受任何注射。
结果示于表3中。
表3
数据表明,两次(间隔25天)施用含有GDF11-GBD重组蛋白的药物使得小牛的体重在以0.5μg/kg的重组蛋白的剂量第二次注射药物90天后,相对于对照组中的该指标增加6.4%;当施用重组蛋白质剂量为5μg/kg的药物时,这一结果为14.1%;当施用重组蛋白剂量为50μg/kg的药物时,这一结果为10.8%,当重组蛋白剂量增加一倍至100μg/kg或150μg/kg时,其体重增加22.1%。
因此,当以0.5μg/kg至150μg/kg范围的剂量施用药物时,小牛的体重增加相对于对照组中的增加有显著增加。
此外,还发现即使单次施用含有GDF11-GBD重组蛋白的药物也能使小牛的体重显著增加。
值得注意的是,当以超出0.5-150μg/kg的剂量范围的剂量施用药物时,小牛的体重增加相对于对照组中的增加有显著下降。
实施例3.含有GDF11-GBD重组蛋白的药物对羔羊体重增加的影响
以0.1-150μg重组蛋白/1kg动物活体重的比率分两次向2-3个月大的Romanov羔羊注射含有悬浮于佐剂介质(α葡聚糖(50重量%)和3%氢氧化铝(15体积%)悬浮液的混合物)中的GDF11-GBD重组蛋白的药物,两次注射间隔30天。药物采用肌内注射方式。实验组和对照组各10只动物。对照组的动物不接受任何注射。结果示于表4中。
表4
数据表明,两次(间隔30天)向Romanov羔羊施用含有GDF11-GBD重组蛋白的药物使得这些动物的体重在以0.5μg/kg的重组蛋白的剂量第二次注射药物90天后,相比于对照组中的该指标增加11.4%;当施用重组蛋白剂量为5μg/kg的药物时,这一结果为16.6%;当施用重组蛋白剂量为50μg/kg的药物时,这一结果为22.9%;当施用重组蛋白剂量为100μg/kg的药物时,这一结果为23.2%;当施用重组蛋白剂量为150μg/kg的药物时,这一结果为23.4%。
此外,还发现即使单次施用含有GDF11-GBD重组蛋白的药物也能使羔羊的体重显著增加。
值得注意的是,当以超出0.5-150μg/kg的剂量范围的剂量施用药物时,羔羊的体重增加相对于对照组中的增加有显著下降。
实施例4.含有GDF11-GBD重组蛋白的药物对兔体重增加的影响
以0.1-150μg重组蛋白/1kg动物活体重的比率分两次向2-3个月大的White Giant兔注射含有悬浮于佐剂介质(α葡聚糖(50重量%)和3%氢氧化铝(10体积%)悬浮液的混合物)中的GDF11-GBD重组蛋白的药物,两次注射间隔28天。药物采用肌内注射方式。实验组和对照组各10只动物。对照组的动物不接受任何注射。结果示于表5中。
表5
此外,还发现即使单次施用含有GDF11-GBD重组蛋白的药物也能使兔的体重显著增加。
值得注意的是,当以超出0.5-150μg/kg的剂量范围的剂量施用药物时,兔的体重增加相对于对照组中的增加有显著下降。
实施例5.含有GDF11-GBD重组蛋白的药物对火鸡体重增加的影响
向50-60天大的Broad Breasted White(重杂交)火鸡(雄性)施用含有重组蛋白的药物。以0.1、0.3、0.5、5、50、100、110、130、150μg/kg重组蛋白/1kg火鸡体重的剂量分两次施用含有悬浮于佐剂介质(α葡聚糖(30重量%)和水油悬浮液MONTANIDE ISA 70VG(70重量%)的混合物)中的GDF11-GBD重组蛋白的药物,两次施用间隔21天。药物采用肌内注射方式。实验组和对照组各10只动物。对照组的家禽不接受任何注射。结果示于表6中。
表6
数据表明,两次(间隔21天)向火鸡施用含有悬浮于佐剂介质(α葡聚糖(30重量%)和水油悬浮液MONTANIDE ISA 70VG(70重量%)的混合物)中的GDF11-GBD重组蛋白的药物使得这些动物的体重在以0.5μg/kg的重组蛋白的剂量第二次注射药物90天后,相比于对照组中的该指标增加8.4%;当施用重组蛋白剂量为5μg/kg的药物时,这一结果为11.4%;当施用重组蛋白剂量为50μg/kg的药物时,这一结果为21.1%;当施用重组蛋白剂量为150μg/kg的药物时,这一结果为21.6%。
此外,还发现即使单次施用含有GDF11-GBD重组蛋白的药物也能使火鸡的体重显著增加。
值得注意的是,当以超出0.5-150μg/kg的剂量范围的剂量施用药物时,火鸡的体重增加相对于对照组中的体重增加有显著下降。
本发明的上述示例并非穷举性的。其他可能的实施方案对应于本专利权利要求的范围。
Claims (4)
1.分子量为35.9kDa的GDF11重组蛋白,所述GDF11重组蛋白包括:具有SEQ ID NO: 1的序列的生长分化因子11蛋白的片段、具有SEQ ID NO: 2序列的间隔区、具有SEQ ID NO: 3的序列的来自变异链球菌(Streptococcus mutans)的α葡聚糖结合结构域和具有SEQ IDNO: 4的GDF11-GBD基因核苷酸序列。
2.用于获得在葡聚糖上的GDF11重组蛋白的方法,所述方法包括以下步骤:使大肠杆菌(E. coli)菌株BL21[pGDF11-GBD]的细胞提取物中的GDF11-GBD蛋白与含α-葡聚糖吸附剂在孵育过程中通过亲和作用结合;随后进行洗涤以除去任何未结合的细菌蛋白并回收目标产物。
3.用于增加家畜的肌肉量的注射剂,所述注射剂包含根据权利要求1所述的GDF11重组蛋白,所述GDF11重组蛋白悬浮于能够用于注射的含α-葡聚糖的吸附剂介质的液体佐剂溶液中。
4.用于增加哺乳动物和家禽的肌肉量的方法,所述方法包括将含有根据权利要求1所述的GDF11重组蛋白的药物以0.5-150μg指定蛋白/1kg所述动物或家禽体重的剂量进行皮下或肌内注射,所述GDF11重组蛋白悬浮于能够用于注射的含α-葡聚糖的吸附剂的液体佐剂溶液中。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2020105836 | 2020-02-07 | ||
RU2020105836A RU2750267C1 (ru) | 2020-02-07 | 2020-02-07 | Рекомбинантный ростовой дифференцировочный фактор роста 11 (GDF11), способ его получения, инъекционный препарат для повышения мышечной массы млекопитающих животных и птицы, а также способ использования препарата |
PCT/RU2021/050009 WO2021158146A1 (ru) | 2020-02-07 | 2021-01-18 | Рекомбинантный ростовой дифференцировочный фактор роста 11 (gdf11), |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN115003690A true CN115003690A (zh) | 2022-09-02 |
CN115003690B CN115003690B (zh) | 2024-04-05 |
Family
ID=76504823
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202180007896.4A Active CN115003690B (zh) | 2020-02-07 | 2021-01-18 | 重组生长分化因子11(gdf11) |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN115003690B (zh) |
RU (1) | RU2750267C1 (zh) |
WO (1) | WO2021158146A1 (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2024014989A1 (ru) * | 2022-07-14 | 2024-01-18 | Общество с ограниченной ответственностью "БИОМЕД-РЕСУРС" | Рекомбинантный белок gbd-actriib для увеличения мышечной массы сельскохозяйственных животных и птицы |
Citations (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20060216279A1 (en) * | 2005-03-22 | 2006-09-28 | Glass David J | Myostatin inhibiting fusion polypeptides and therapeutic methods thereof |
US20060263354A1 (en) * | 2005-04-25 | 2006-11-23 | Amgen Fremont Inc. | Antibodies to myostatin |
CN102286513A (zh) * | 2011-07-06 | 2011-12-21 | 西南民族大学 | 藏绵羊肌肉生长抑制素重组表达蛋白质 |
WO2014168973A2 (en) * | 2013-04-08 | 2014-10-16 | President And Fellows Of Harvard College | Methods and compositions for rejuvenating skeletal muscle stem cells |
CN105073781A (zh) * | 2013-01-11 | 2015-11-18 | 加州生物医学研究所 | 牛融合抗体 |
WO2015188132A1 (en) * | 2014-06-06 | 2015-12-10 | The California Institute For Biomedical Research | Methods of constructing amino terminal immunoglobulin fusion proteins and compositions thereof |
RU2613420C1 (ru) * | 2016-04-13 | 2017-03-16 | Сергей Михайлович Юдин | Рекомбинантный белок Мио-ГСД, способ его получения, инъекционный препарат для повышения мышечной массы сельскохозяйственных животных, птицы и животных семейства псовых, а также способ использования препарата |
WO2017049011A1 (en) * | 2015-09-15 | 2017-03-23 | Scholar Rock, Inc. | Anti-pro/latent-myostatin antibodies and uses thereof |
US20180208648A1 (en) * | 2015-07-22 | 2018-07-26 | Scholar Rock, Inc. | Gdf11 binding proteins and uses thereof |
CN108473562A (zh) * | 2015-12-18 | 2018-08-31 | 中外制药株式会社 | 抗-肌肉生长抑制因子抗体、包含变体fc区的多肽及使用方法 |
CN109311969A (zh) * | 2016-06-17 | 2019-02-05 | 中外制药株式会社 | 抗-肌肉生长抑制因子抗体及使用方法 |
US20190111108A1 (en) * | 2016-02-04 | 2019-04-18 | Kangstem Biotech Co., Ltd. | Composition Including GDF11 and Use Thereof |
WO2019144053A1 (en) * | 2018-01-19 | 2019-07-25 | President And Fellows Of Harward College | Gdf11 variants and uses thereof |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5994618A (en) * | 1997-02-05 | 1999-11-30 | Johns Hopkins University School Of Medicine | Growth differentiation factor-8 transgenic mice |
-
2020
- 2020-02-07 RU RU2020105836A patent/RU2750267C1/ru active
-
2021
- 2021-01-18 WO PCT/RU2021/050009 patent/WO2021158146A1/ru active Application Filing
- 2021-01-18 CN CN202180007896.4A patent/CN115003690B/zh active Active
Patent Citations (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20060216279A1 (en) * | 2005-03-22 | 2006-09-28 | Glass David J | Myostatin inhibiting fusion polypeptides and therapeutic methods thereof |
US20060263354A1 (en) * | 2005-04-25 | 2006-11-23 | Amgen Fremont Inc. | Antibodies to myostatin |
CN102286513A (zh) * | 2011-07-06 | 2011-12-21 | 西南民族大学 | 藏绵羊肌肉生长抑制素重组表达蛋白质 |
CN105073781A (zh) * | 2013-01-11 | 2015-11-18 | 加州生物医学研究所 | 牛融合抗体 |
WO2014168973A2 (en) * | 2013-04-08 | 2014-10-16 | President And Fellows Of Harvard College | Methods and compositions for rejuvenating skeletal muscle stem cells |
WO2015188132A1 (en) * | 2014-06-06 | 2015-12-10 | The California Institute For Biomedical Research | Methods of constructing amino terminal immunoglobulin fusion proteins and compositions thereof |
US20180208648A1 (en) * | 2015-07-22 | 2018-07-26 | Scholar Rock, Inc. | Gdf11 binding proteins and uses thereof |
WO2017049011A1 (en) * | 2015-09-15 | 2017-03-23 | Scholar Rock, Inc. | Anti-pro/latent-myostatin antibodies and uses thereof |
CN108473562A (zh) * | 2015-12-18 | 2018-08-31 | 中外制药株式会社 | 抗-肌肉生长抑制因子抗体、包含变体fc区的多肽及使用方法 |
US20190111108A1 (en) * | 2016-02-04 | 2019-04-18 | Kangstem Biotech Co., Ltd. | Composition Including GDF11 and Use Thereof |
RU2613420C1 (ru) * | 2016-04-13 | 2017-03-16 | Сергей Михайлович Юдин | Рекомбинантный белок Мио-ГСД, способ его получения, инъекционный препарат для повышения мышечной массы сельскохозяйственных животных, птицы и животных семейства псовых, а также способ использования препарата |
CN109311969A (zh) * | 2016-06-17 | 2019-02-05 | 中外制药株式会社 | 抗-肌肉生长抑制因子抗体及使用方法 |
WO2019144053A1 (en) * | 2018-01-19 | 2019-07-25 | President And Fellows Of Harward College | Gdf11 variants and uses thereof |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
C. MCPHERRON等: "Metabolic Functions of Myostatin and GDF11", IMMUNOLOGY, ENDOCRINE & METABOLIC AGENTS IN MEDICINAL CHEMISTRY, vol. 10, no. 4, pages 217 - 231, XP055200150, DOI: 10.2174/187152210793663810 * |
P.C. BESSA等: "Expression, purification and osteogenic bioactivity of recombinant human BMP-4, -9, -10, -11 and -14", PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION, vol. 63, no. 2, pages 89 - 94, XP025686803, DOI: 10.1016/j.pep.2008.09.014 * |
李倩等: "生长分化因子11: TGF-p 超家族的新成员", ⽣物化学与⽣物物理进展, vol. 42, no. 7, pages 616 - 623 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2021158146A1 (ru) | 2021-08-12 |
RU2750267C1 (ru) | 2021-06-25 |
CN115003690B (zh) | 2024-04-05 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DK201100184Y4 (da) | Antistoffer fra immuniserede fugle | |
CN1668637B (zh) | 使用衍生自ap205外壳蛋白的病毒样颗粒的分子抗原阵列 | |
SE509359C2 (sv) | Användning av stabiliserade protein- eller peptidkonjugat för framställning av ett läkemedel | |
WO1993024136A1 (en) | Tumor killing effects of enterotoxins, superantigens, and related compounds | |
DE69133484T2 (de) | Verwendung von Staphylococcus-Enterotoxinen oder verwandte Verbindungen für Krebs-Therapie | |
CN112870341B (zh) | 一种山羊传染性胸膜肺炎亚单位疫苗及其制备方法和应用 | |
CN108066755B (zh) | 一种抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗及其制备方法和应用 | |
CN115003690B (zh) | 重组生长分化因子11(gdf11) | |
CN116102640A (zh) | 重组乳铁蛋白衍生肽及其在提高免疫力方面的应用 | |
RU2613420C1 (ru) | Рекомбинантный белок Мио-ГСД, способ его получения, инъекционный препарат для повышения мышечной массы сельскохозяйственных животных, птицы и животных семейства псовых, а также способ использования препарата | |
CN108904788B (zh) | GnRH-防御素重组去势疫苗及其制备 | |
US10428112B2 (en) | Multiplexed same type-antigenic peptide | |
CN101959526A (zh) | 白介素-1偶联物在糖尿病治疗中的用途 | |
JP5227028B2 (ja) | インターロイキン−2の中和能を有する免疫治療用製剤 | |
RU2316342C1 (ru) | Вакцинная композиция для профилактики и лечения онкологических заболеваний, рекомбинантная плазмидная днк, обеспечивающая синтез гибридного белка, способ его получения | |
US7763452B2 (en) | Purification of HER-2 variants | |
RU2614115C1 (ru) | Рекомбинантный соматостатинсодержащий белок, способ его получения, инъекционный препарат для повышения мясной и молочной продуктивности сельскохозяйственных животных, а также способ использования препарата | |
CN108175853A (zh) | 一种肿瘤细胞疫苗及其制备方法 | |
RU2792817C1 (ru) | Рекомбинантный белок GBO-ActRIIB для увеличения мышечной массы сельскохозяйственных животных и птицы | |
RU2590701C2 (ru) | Антигенная композиция и ее терапевтическое применение для профилактики и лечения онкологических заболеваний, рекомбинантная плазмидная днк, обеспечивающая синтез гибридного белка, а также способ получения белка | |
WO2024014989A1 (ru) | Рекомбинантный белок gbd-actriib для увеличения мышечной массы сельскохозяйственных животных и птицы | |
US7223412B1 (en) | Staphylococcal enterotoxin SEC-SER, expression vector and host cell, production method thereof, and manufacturing method of vaccine | |
CN110787291A (zh) | 一种加强型佐剂 | |
CN111944838B (zh) | 革兰氏阳性菌表达系统在表达腐败梭菌毒素中的应用、腐败梭菌α毒素的制备方法和疫苗 | |
CN1321189A (zh) | 细胞性免疫的诱导方法以及被诱导了细胞免疫的细胞 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |