CN114994326A - 用于诊断或预防糖尿病视网膜病变的标志物及其应用 - Google Patents

用于诊断或预防糖尿病视网膜病变的标志物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体而言，提供了一种用于诊断或预防糖尿病视网膜病变的标志物及其应用。本发明中标志物包括APCS、PTPRG、MDH1、KRT1、ORM1、CALR、C7、ALDOB、TPI1、HBA1、ACTN1、IGFBP6、STOM、ADA2、S100A4、DDI2和UBA1中的至少一种血浆蛋白。通过对这些标志物的监测，可以对糖尿病视网膜病变患者疾病进展的动态监测，有助于早期预防和治疗效果评价。

Description

用于诊断或预防糖尿病视网膜病变的标志物及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种用于诊断或预防糖尿病视网膜病变的标志物及其应用。
背景技术
糖尿病是一种由多病因导致的慢性代谢性疾病，是21世纪患病率增长最快的慢性疾病之一。据WHO统计，糖尿病是引起并发症最多的一种疾病，高达100多种。目前糖尿病治疗手段不断进步，新的降糖药物不断涌现。糖尿病患者的寿命得到有效延长，因而产生大量长病程的糖尿病患者，这部分患者是糖尿病各种慢性并发症的主要人群。现有糖尿病人群数目庞大，给我国以及世界各国的医疗资源带来沉重负担。临床数据显示，糖尿病发病后10年左右，将有30％-40％的患者至少会发生一种并发症，且并发症一旦产生，药物治疗很难逆转，因此在预防与治疗糖尿病的同时，应尽早预防与控制糖尿病并发症的发生。
糖尿病视网膜病变(Diabetic Retinopathy,DR)是糖尿病患者眼部最常见、最严重的慢性并发症之一，是致成人双眼失明的首要眼病。目前该病的诊断主要包括眼底镜检查，眼底血管荧光造影，尿蛋白检测以及视网膜血管彩色多普勒检测。此外，外周血中的内皮祖细胞(EPC)，血管内皮细胞生长因子(VEGF)，红细胞生成素(EPO)等也是DR的辅助检测因子。
DR的发病原因不明，目前尚无有效的治愈方法。但是DR可以早期预防，其关键在于早期筛查。早期筛查和治疗可以使98％的DR患者避免因糖尿病而引发的视力损伤。然而，我国DR的预防及筛查现状并不乐观，绝大多数DR患者不仅没有接受过定期的筛查，而且往往在出现明显的视力损伤症状后才就诊。很多患者因此而失明，失去良好的生活质量，给家庭及社会带来沉重的经济负担。因此，如何有效开展糖尿病视网膜疾病的筛查成为了DR防治的重点及难点。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供用于诊断或预防糖尿病视网膜病变的标志物。
本发明的第二目的在于提供上述标志物的应用。
本发明第三目的在于提供检测上述标志物的检测试剂的应用。
本发明第四目的在于提供一种诊断或预防糖尿病视网膜病变的标志物的检测试剂盒。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
用于诊断或预防糖尿病视网膜病变的标志物，所述标志物包括APCS、PTPRG、MDH1、KRT1、ORM1、CALR、C7、ALDOB、TPI1、HBA1、ACTN1、IGFBP6、STOM、ADA2、S100A4、DDI2和UBA1中的至少一种血浆蛋白。
进一步地，APCS、PTPRG、MDH1、KRT1、ORM1、CALR和C7均独立地在糖尿病视网膜病变患者的血浆中特异性高表达。
进一步地，ALDOB、TPI1、HBA1、ACTN1、IGFBP6、STOM、ADA2、S100A4、DDI2和UBA1均独立地在糖尿病视网膜病变患者的血浆中特异性低表达。
进一步地，所述标志物包括APCS、PTPRG、MDH1、KRT1、ORM1、CALR、C7、ALDOB、TPI1、HBA1、ACTN1、IGFBP6、STOM、ADA2、S100A4、DDI2和UBA1。
标志物在制备诊断或预防糖尿病视网膜病变的产品中的应用。
进一步地，所述产品包括试剂或试剂盒。
检测糖尿病视网膜病变的标志物的检测试剂在制备诊断或预防糖尿病视网膜病变的试剂盒中的应用，所述标志物为上述标志物。
进一步地，所述试剂盒通过检测受试者体内的标志物或编码标志物RNA的含量来诊断或预防糖尿病视网膜病变。
一种诊断或预防糖尿病视网膜病变的标志物的检测试剂盒，所述诊断或预防试剂盒检测上述标志物或编码标志物RNA的表达量。
进一步地，所述检测试剂盒的检测样本为血浆。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的标志物与糖尿病视网膜病变密切相关，通过对标志物的监测可以实现糖尿病视网膜病变的早期诊断和积极预防，与现有技术的诊断方法相比，本发明提供的标志物为血浆来源生物标志物，可避免侵入性诊断，取样微创，易于检测，同时结果准确，可用于糖尿病视网膜病变的早期预防和治疗效果评价。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例中DR组和DM组差异蛋白火山图，其中，横坐标表示差异蛋白的差异倍数(log2值)，纵轴表示pvalue(-log10值)，黑色点代表差异不显著的蛋白，红色点代表上调蛋白(DM/DR)，绿色点代表下调蛋白(DM/DR)；
图2为本发明实施例中DR组和DM组差异蛋白聚类热图，其中，每一列是一个样品，每一行是一个蛋白，蛋白之间的距离越近代表蛋白相似性越高，DR相对于DM颜色是红色的代表上调的蛋白，相对于对照组是蓝色的是下调的蛋白；
图3-图19分别为本发明实施例中标志物蛋白相对表达箱线图；
图20为本发明实施例中DR组和DM组差异蛋白参与的信号通路(KEGG Pathway)，点越大说明该通路里的差异蛋白越多，颜色越红说明该蛋白的pvalue越小，富集越显著，通路从上至下pvalue值逐渐增大；
图21为本发明实施例中DR组和DM组差异蛋白涉及的GO富集分析，图中pvalue越小富集越显著；
图22-图38分别为本发明实施例中标志物蛋白的受试者工作特征(ROC)曲线，反应标志物蛋白在糖尿病患者中诊断或鉴定出糖尿病视网膜病变患者的敏感性和特异性。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
本发明通过科学样本筛选、系统分析和评价体系，对糖尿病患者和糖尿病视网膜病变患者的血浆样本进行生物质谱分析发现并筛选出与糖尿病视网膜病变相关的生物标志物，包括APCS、PTPRG、MDH1、KRT1、ORM1、CALR、C7、ALDOB、TPI1、HBA1、ACTN1、IGFBP6、STOM、ADA2、S100A4、DDI2和UBA1中的至少一种血浆蛋白。通过对这些标志物的监测，可以对糖尿病视网膜病变患者疾病进展的动态监测，有助于早期预防和治疗效果评价。
进一步地，APCS、PTPRG、MDH1、KRT1、ORM1、CALR和C7均独立地在糖尿病视网膜病变患者的血浆中特异性高表达。其中，APCS上调1.58倍，PTPRG上调1.90倍，MDH1上调1.99倍，KRT1上调2.43倍，ORM1上调1.53倍，CALR上调4.08倍，C7上调1.56倍。ALDOB、TPI1、HBA1、ACTN1、IGFBP6、STOM、ADA2、S100A4、DDI2和UBA1均独立地在糖尿病视网膜病变患者的血浆中特异性低表达。其中，ALDOB下调0.64倍，TPI1上调0.62倍，HBA1下调0.60倍，ACTN1下调0.52倍，IGFBP6下调0.51倍，STOM下调0.49倍，ADA2下调0.46倍，S100A4下调0.44倍，DDI2下调0.35倍，UBA1下调0.27倍。
可以理解的是，将上述蛋白同时作为诊断或预防糖尿病视网膜病变的标志物可以更加准确和全面的对糖尿病视网膜病变进行评估和预防。
基于本发明生物质谱分析得到的结果，本发明提供的标志物能够用于制备诊断或预防糖尿病视网膜病变的产品，例如试剂或试剂盒。
此外，检测上述标志物的试剂也可用于制备诊断或预防糖尿病视网膜病变的试剂盒。该试剂盒通过检测受试者体内的标志物含量来诊断或预防糖尿病视网膜病变，也可以检测表达标志物的RNA的表达量来实现糖尿病视网膜病变的诊断或预防。具体地，APCS、PTPRG、MDH1、KRT1、ORM1、CALR和C7均独立地在糖尿病视网膜病变患者的血浆中特异性高表达；ALDOB、TPI1、HBA1、ACTN1、IGFBP6、STOM、ADA2、S100A4、DDI2和UBA1均独立地在糖尿病视网膜病变患者的血浆中特异性低表达。
本发明最后提供一种诊断或预防糖尿病视网膜病变的标志物的检测试剂盒，该试剂盒检测本发明提供的标志物表达量或编码标志物的RNA的表达量。
需要说明的是，本发明中标志物是指受试者血浆样本中的浓度，检测样本为受试者的血浆。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例
1.收集病人的血浆样本
根据国际通用的糖尿病诊断标准和分类((1999年)标准)，选取糖尿病患者并确定其患病年限。根据国际较为通用的2002年由美国眼科协会和国际眼病学会发布的《糖尿病视网膜病变的国际临床分级标准》为临床分级标准，确定糖尿病患者中的糖尿病视网膜病变的患者。以患有糖尿病的中老年患者13例，糖尿病视网膜病变的患者12例为分析对象，具体的临床样本信息如表1所示。分别抽取病人3mL的静脉血于采血管中，并分离出血浆，-80℃，冻存。
表1糖尿病病人及糖尿病视网膜病变病人的基本信息
Figure BDA0003574349910000061
Figure BDA0003574349910000071
2.血浆白蛋白/IgG去除
(1)取血浆样本10μL，加入90μL binding bμffer(10mM磷酸氢二钠溶液)，温和混匀。
(2)盖住上端盖子，上下颠倒几次，使填料完全悬浮，并室温孵育1.5h。
(3)取出上下端盖子，将柱子放到2mL的离心管里室温离心，(1000g2min)。
(4)离心液体即为去除血浆白蛋白/IgG的血浆样本。
3.生物质谱样品制备
(1)向样本中加入500μL尿素裂解液(8M尿素，50mM NH4HCO3，1X罗氏蛋白酶抑制剂)，室温裂解5min。
(2)冰上超声破碎(能量35％，超3S，停3S，超声2min)，14000g离心10min，取上清，再重复离心一次。
(3)BCA测蛋白浓度，每个样本取100μg蛋白。加入DTT(终浓度10mM)，37℃孵育1h进行样本还原。加入IAA(终浓度40mM)，避光，室温孵育1h进行烷基化。
(4)加入300μl 50mM NH4HCO3平衡10kDa超滤管2次(14000g离心15min)，加入100μg还原烷基化后的样本，室温14000g离心15min，加入300μl 50mM NH4HCO3清洗3次，更换收集管。加入80μl 50mM NH4HCO3到超滤管中，加入3μg胰酶，37℃孵育12-16h。
(5)次日，4℃14000g离心20min，加100μl H2O，冲洗两次，向收集管中加入1％(体积比)的甲酸终止酶切，60℃真空蒸干。
(6)30μl 0.1％甲酸水重悬样本，nanodrop测量浓度。
(7)从样本中分别取出10μg进行高PH反相柱的分馏。
(8)配制分馏所需试剂，Buffer A:100％ACN，Buffer B:0.1％FA。
Elute buffer:
6％→141μl 0.1％三乙胺、9μl ACN(体积比)
9％→136.5μl 0.1％三乙胺、13.5μl ACN
12％→132μl 0.1％三乙胺、18μl ACN
15％→127.5μl 0.1％三乙胺、22.5μl ACN
18％→123μl 0.1％三乙胺、27μl ACN
21％→118.5μl 0.1％三乙胺、31.5μl ACN
25％→112.5μl 0.1％三乙胺、37.5μl ACN
30％→105μl 0.1％三乙胺、45μl ACN
35％→97.5μl 0.1％三乙胺、52.5μl ACN
(9)将一层C18膜用铁丝填入到200μl枪头内，用200μl Buffer A溶解30mg耐高PHC18填料，将填料加入到分馏柱子中，4℃3000g离心2min。加入200μl Buffer A清洗一次，再加入200μl Buffer B清洗3次，柱子留存备用。
(10)将酶切后的肽段load到分馏柱中，重复loading 3-5次
(11)200μl Bμffer B清洗3次，加入150μl的不同浓度的Elμte bμffer，按梯度洗脱，合并6％与35％馏分为一个馏分，每个馏分取3μg肽段进行DDA模式的质谱分析。
4.生物质谱数据分析
使用Proteinpilot软件(版本5.0.1)对DDA模式采集的原始数据进行数据库的搜索。酶切方式：trypsin。数据库为Uniprot人数据库(含20368个已注释蛋白，released2020.03)。unused protScore>0.05。将Proteinpilot的搜库结果导入到SWATH软件(版本2.0)中作为数据库，对DIA采集的数据进行定量，定量时参数设置，每个蛋白选取6个肽段，每个肽段选取6个transitions(离子对)，肽段confidence设置为99％，FDR设置为1％，排除修饰肽段，峰提取窗口10min，质量偏差50ppm以内。每10分钟选取2个内源性肽段进行保留时间的矫正，输出峰面积作为定量值。
对蛋白表达数据的处理：对原始定量值进行log2转换，使其满足正态分布，log2转换后的数据如图1所示。使用R语言preprocessCore包的normalize.median函数对log2转换后的数据进行归一化，归一化后的数据如图2所示。去除没有基因名字的蛋白，使用R语言stats包t.test函数对蛋白表达进行差异分析，筛选P值<0.05且变化倍数>1.5倍的蛋白作为差异蛋白。GO和KEGG pathway、Reactome pathway则使用clusterProfiler包进行富集分析。
5.结果
经过生物质谱分析，共鉴定到338个血浆蛋白，如图1及图2所示，在糖尿病视网膜病变患者中特异性高表达的蛋白有APCS、PTPRG、MDH1、KRT1、ORM1、CALR和C7。在糖尿病视网膜病变患者中，特异性低表达的蛋白有ALDOB、TPI1、HBA1、ACTN1、IGFBP6、STOM、ADA2、S100A4、DDI2和UBA1。这些蛋白可作为区分糖尿病患者中是否并发糖尿病视网膜病变的潜在蛋白标志物。上述标志物蛋白的相对表达箱线图如图3—图19所示。
进一步分析这些潜在的生物标志物的主要涉及通路(图20)发现，区分糖尿病患者中是否具有糖尿病视网膜病变的通路(KEGG)主要有：碳代谢(Carbon metabolism)、果糖和甘露糖的代谢(Fructose and mannose metabolism)、糖酵解和糖异生(Glycolysis/Gluconeogenesis)、氨基酸的生物合成(Biosynthesis of amino acids)、系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus)、近端小管碳酸氢盐矫正(Proximal tubulebicarbonate reclamation)、三羧酸循环(Citrate cycle(TCA cycle))、磷酸戊糖途径(Pentose phosphate pathway)、乙醛酸盐和碳酸氢盐代谢(Glyoxylate anddicarboxylate metabolism)和非洲锥虫病(African trypanosomiasis)。
DR组和DM组差异蛋白涉及的GO富集分析结果如图21所示：
区分糖尿病患者中是否具有糖尿病视网膜病变的生物学过程(BP)主要有：NADH代谢过程(NADH metabolic process)、NAD代谢过程(NAD metabolic process)、补体激活(complement activation)、糖异生(gluconeogenesis)、己糖的生物合成过程(hexosebiosynthetic process)、典型糖酵解(canonical glycolysis)、果糖-6-磷酸的糖酵解过程(glycolytic process through fructose-6-phosphate)、葡萄糖-6-磷酸的糖酵解过程(glycolytic process through glucose-6-phosphate)、宿主病毒的调节过程(modulation by host of viral process)、急性期应答(acute-phase response)、中性粒细胞脱颗粒(neutrophil degranulation)、中性粒细胞活化参与免疫反应(neutrophilactivation involved in immune response)、嗜中性粒细胞激活(neutrophilactivation)、嗜中性粒细胞调节的免疫(neutrophil mediated immunity)、细胞醛基代谢(cellular aldehyde metabolic process)和阴性调节伤口愈合(negative regulationof wound healing)。
区分糖尿病患者中是否具有糖尿病视网膜病变的分子功能(MF)主要有：调理素的结合(opsonin binding)和碳水化合物结合(carbohydrate binding)。
区分糖尿病患者中是否具有糖尿病视网膜病变的蛋白主要参与的亚细胞定位(CC)主要有血液微观粒子(blood microparticle)、包含胶原的胞外基质(collagen-containing extracellular matrix)、内吞作用囊腔(endocytic vesicle lumen)。
为了评估生物标志物的在诊断过程中的特异性和灵敏度，我们绘制了潜在的生物标志物的受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，ROC曲线)，如图22-图38所示，17个潜在的生物标志物均有一定的检测灵敏度和特异性，其中UBA1(图38)的检测灵敏度和特异性最好。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.用于诊断或预防糖尿病视网膜病变的标志物，其特征在于，所述标志物包括APCS、PTPRG、MDH1、KRT1、ORM1、CALR、C7、ALDOB、TPI1、HBA1、ACTN1、IGFBP6、STOM、ADA2、S100A4、DDI2和UBA1中的至少一种血浆蛋白。
2.根据权利要求1所述的标志物，其特征在于，APCS、PTPRG、MDH1、KRT1、ORM1、CALR和C7均独立地在糖尿病视网膜病变患者的血浆中特异性高表达。
3.根据权利要求1所述的标志物，其特征在于，ALDOB、TPI1、HBA1、ACTN1、IGFBP6、STOM、ADA2、S100A4、DDI2和UBA1均独立地在糖尿病视网膜病变患者的血浆中特异性低表达。
4.根据权利要求1-3任一项所述的标志物，其特征在于，所述标志物包括APCS、PTPRG、MDH1、KRT1、ORM1、CALR、C7、ALDOB、TPI1、HBA1、ACTN1、IGFBP6、STOM、ADA2、S100A4、DDI2和UBA1。
5.权利要求1-4任一项所述的标志物在制备诊断或预防糖尿病视网膜病变的产品中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂或试剂盒。
7.检测糖尿病视网膜病变的标志物的检测试剂在制备诊断或预防糖尿病视网膜病变的试剂盒中的应用，所述标志物为权利要求1-4任一项所述的标志物。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述试剂盒通过检测受试者体内的标志物或编码标志物RNA的含量来诊断或预防糖尿病视网膜病变。
9.一种诊断或预防糖尿病视网膜病变的标志物的检测试剂盒，其特征在于，所述诊断或预防试剂盒检测权利要求1-4任一项所述的标志物或编码标志物RNA的表达量。
10.根据权利要求9所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒的检测样本为血浆。
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