CN114994205A - 地拉罗司颗粒剂中相关杂质的检测方法 - Google Patents

地拉罗司颗粒剂中相关杂质的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测地拉罗司颗粒剂中相关杂质的方法，包括使用高效液相色谱法检测以下杂质：水杨酰胺、水杨酸、苯并恶嗪酮中间体、地拉罗司甲酯、水杨酸酰亚胺、1,2‑异构体、1,3‑异构体和地拉罗司乙酯。本发明的方法适合地拉罗司颗粒剂中相关杂质的检测/监测。

Description

地拉罗司颗粒剂中相关杂质的检测方法
技术领域
本发明涉及药物杂质的检测领域，具体涉及一种检测地拉罗司颗粒剂中相关杂质的方法，更具体地涉及一种使用有效的流动相梯度比例的高效液相色谱法检测地拉罗司颗粒剂中相关杂质的方法。
背景技术
地拉罗司(deferasirox)是由瑞士诺华制药公司研究开发的铁螯合剂产品，是美国FDA批准的第一个能够常规使用的口服驱铁剂，在体内可以与三价铁高亲和螯合，从而降低体内铁的含量，用于2岁及以上患者因输血治疗所致的慢性铁过载(CIO)的治疗和用于10岁及以上非输血依赖型地中海贫血综合征(NTDT)患者慢性铁过载(CIO)的治疗。Ⅱ、Ⅲ期临床试验及药代动力学研究均表明，其具有良好的安全性和耐受性，且能显著降低心脏、肝脏铁负荷，易于被患者接受。同时，其也具有抗真菌、抗细胞增殖、抗疟疾、抗氧化应激损伤、抗细胞毒诱导细胞凋亡等药物学特性；可用于继发性血色病、迟发性皮肤卟啉病等疾病的治疗。地拉罗司是口服的铁螯合剂类药物，。
地拉罗司(Deferasirox)的化学名称为4-[3,5-二(2-羟基苯基)-1,2,4-三唑-1-基]苯甲酸，结构式如下：
Figure BDA0003668819970000011
目前上市制剂产品主要有地拉罗司分散片及地拉罗司颗粒剂，由Novartis公司研发的地拉罗司口服颗粒剂，商品名为JADENU SPRINKLE，规格为360mg，180mg，90mg，该颗粒剂属于儿童剂型，副反应小，可撒在面包和果酱或者酸奶中服用，口味良好，儿童服药顺应性高。
目前，需要开发出一种对地拉罗司颗粒剂中相关杂质进行监测和检测的方法，包括对于地拉罗司颗粒剂所含杂质的监测和检测的方法，以及对于当将地拉罗司颗粒剂撒入例如面包和果酱或者酸奶后所含杂质的监测和检测的方法。
发明内容
本发明在对地拉罗司口服颗粒剂进行使用过程中稳定性研究中发现，当口服的颗粒剂在撒在酸奶中，如一段时间内未口服，意外的发现有两个未知峰，经结构确认发现是地拉罗司1,3异构体和地拉罗司乙酯。这两种杂质目前尚无相关文献报道。为了对地拉罗司口服颗粒剂进行严格的杂质监测和检测，需要开发一种能更全面、更准确的对包括这两种新杂质在内的杂质进行监测和检测的方法。
一方面，本发明提供了一种测定地拉罗司颗粒剂中杂质的方法，包括采用高效液相色谱法对地拉罗司颗粒剂中杂质进行检测的步骤，所述杂质包括选自以下至少一种杂质：水杨酰胺、水杨酸、苯并恶嗪酮中间体、地拉罗司甲酯、水杨酸酰亚胺、1,2-异构体、1,3-异构体和地拉罗司乙酯；且
所述方法包括采用高效液相色谱法对地拉罗司颗粒剂进行检测，其中所述高效液相色谱法检测条件包括：
-色谱柱固定相的填充料：十八烷基硅烷键合硅胶；
-流动相A：缓冲液与水与乙腈按一定比例的混合溶液，所述缓冲液为乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)缓冲液，且所述缓冲液浓度为50～110mg/L，所述缓冲液pH为1.5-2.5，所述缓冲液-水-乙腈的体积比(v/v/v)为100/800/100；
-流动相B：缓冲液与乙腈的混合溶液，所述缓冲液为乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)缓冲液，且所述缓冲液浓度为50～110mg/L，所述缓冲液pH为1.5-2.5，所述缓冲液-乙腈的体积比(V/V)为100/900；
-流动相梯度
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 70 30
4.5 70 30
9 58 42
18 58 42
25 20 80
29 20 80
30 70 30
40 70 30
-流动相流速：0.5～1.0ml/min；
-色谱柱柱温：40℃～80℃；
-自动进样器温度：1℃～9℃；
-检测波长：220～270nm；和
-进样量：10μl～20μl。
在一些实施方式中，所述杂质包括选自以下杂质或者由以下的杂质组成：水杨酰胺、水杨酸、苯并恶嗪酮中间体、地拉罗司甲酯、水杨酸酰亚胺、1,2-异构体、1,3-异构体和地拉罗司乙酯。
在一些实施方式中，所述色谱柱为Waters Symmetry Shield RP 18，规格为3.0mm×150mm，3.5μm。
在一些实施方式中，所述高效液相色谱法采用的高效液相色谱仪选自以下的一种：安捷伦1260Ⅱ、Waters e2695、戴安Ulitimate 3000、岛津LC-2050C/2060C或其他任何同类型的色谱仪。
在一些实施方式中，所述缓冲液浓度为90～110mg/L，优选地所述缓冲液浓度为100mg/L。在一些实施方式中，所述缓冲液pH为1.9-2.3，优选地所述缓冲液pH为2.1。
在一些实施方式中，所述流动相流速为0.8～1.0ml/min，优选地所述流动相流速为0.8ml/min。在一些实施方式中，所述色谱柱柱温为55℃-65℃，优选地所述色谱柱柱温为60℃。在一些实施方式中，所述自动进样器样品盘温为3℃-8℃，优选地所述自动进样器温度为5℃。在一些实施方式中，所述检测波长为247nm-253nm，优选地所述检测波长为250nm。在一些实施方式中，所述进样量为10μl～20μl，优选地所述进样量为10μl。
在一些实施方式中，所述地拉罗司颗粒剂为具有360mg、180mg或90mg规格的地拉罗司口服颗粒剂。在一些实施方式中，所述地拉罗司颗粒剂为撒在面包和果酱或者酸奶中的地拉罗司口服颗粒剂。
在一些实施方式中，所述方法进一步包括以下步骤：
(a)配制稀释剂、灵敏度溶液、系统适用性溶液、对照品溶液和地拉罗司待测溶液的步骤，其中：
-所述稀释剂通过乙腈与40mg/L EDTA缓冲液按体积比(V/V)为75:25混合配制，
-所述灵敏度溶液通过用所述稀释剂稀释地拉罗司对照品溶液至一定浓度配制，所述灵敏度溶液浓度为0.25μg/mL；
-所述系统适用性溶液通过用所述稀释剂溶解5mg地拉罗司系统适用性混合对照品至一定浓度配制，所述系统适用性溶液中含地拉罗司浓度为0.5mg/mL，含水杨酰胺、苯并恶嗪酮中间体、1,2-异构体、1,3-异构体、乙酯各杂质浓度均为0.25μg/mL的混合溶液；
-所述对照品溶液通过用所述稀释剂溶解地拉罗司对照品配制，所述对照品溶液浓度为5μg/mL；
-所述地拉罗司待测溶液通过用所述稀释剂溶解待测的地拉罗司颗粒剂配制，所述待测溶液中含地拉罗司的浓度为0.5mg/mL；
(b)将所述稀释剂、所述灵敏度溶液、所述系统适用性溶液、所述对照品溶液和所述地拉罗司待测溶液按照以下过程顺序进样到色谱仪，其中所述进样的过程如下：(1)空白溶液(进样次数≥1针)、(2)灵敏度溶液(进样次数为1针)、(3)系统适用性溶液(进样次数为1针)、(4)对照品溶液(进样次数为6针)、(5)地拉罗司待测溶液(进样次数≥1针；地拉罗司待测溶液进6针需进一针随行对照品溶液)、和(6)随行对照品溶液(进样次数≥1针)；
(c)记录色谱图并对得到的色谱峰进行分析，其中：
-如果地拉罗司颗粒剂的溶液的色谱图有与所述8种杂质保留时间一致的色谱峰，按以下公式计算各杂质的含量：
Figure BDA0003668819970000041
式中：RU:地拉罗司待测溶液中单个杂质的峰面积；RS:对照品溶液中地拉罗司的峰面积；WS：地拉罗司对照品的重量；P：地拉罗司对照品的含量；Wu：样品的称重；APCW:平均装量；LC：标示量。
本发明的方法可以实现对于对地拉罗司的相关8种杂质进行同时检测和监测。而且，本发明的方法具有对各杂质的优异分离度，各杂质之间互不干扰，且方法具有优异的准确度、精密度和耐用性。
附图说明
图1：采用本发明的方法检测原料药制成的颗粒剂在使用中稳定性的色谱图。
图2：采用本发明的方法检测空白溶液得到的色谱图。
图3：采用本发明的方法检测空白辅料得到的色谱图。
图4：采用本发明的方法检测地拉罗司得到的线性关系图。
具体实施方式
本发明意在开发一种对地拉罗司颗粒剂中相关杂质进行监测和检测的方法，此方法需要能够对地拉罗司颗粒剂以及将地拉罗司颗粒剂撒入例如面包和果酱或者酸奶后所含杂质进行全面、准确的监测和检测。
本发明首次在撒入酸奶中的地拉罗司颗粒剂中鉴定出了两种新杂质，即1,3-异构体和地拉罗司乙酯，并进一步证实本发明的方法可以同时检测包括1,3-异构体和地拉罗司乙酯在内的多达8种地拉罗司中的杂质，且本发明的方法在系统适应性、专属性、定量限、检测限、精密度、准确度等方面均可满足严格的检测要求。
因此，一方面，本发明提供了一种测定地拉罗司颗粒剂中杂质的方法。另一方面，本发明提供了一种监测地拉罗司颗粒剂中杂质的方法。
在一些实施方式中，所述杂质包括选自以下至少一种杂质：水杨酰胺、水杨酸、苯并恶嗪酮中间体、地拉罗司甲酯、水杨酸酰亚胺、1,2-异构体、1,3-异构体和地拉罗司乙酯。在一些实施方式中，所述杂质包括选自以下杂质或者由以下的杂质组成：水杨酰胺、水杨酸、苯并恶嗪酮中间体、地拉罗司甲酯、水杨酸酰亚胺、1,2-异构体、1,3-异构体地和地拉罗司乙酯。
在本文中，地拉罗司颗粒剂中杂质的结构如下所示：
Figure BDA0003668819970000051
Figure BDA0003668819970000061
在本文中，术语“乙酯”是指地拉罗司的乙酯；类似地，术语“甲酯”是指地拉罗司的甲酯。术语“1,3-异构体”是指地拉罗司的1,3-异构体，术语“1,2-异构体”是指地拉罗司的1,2-异构体。
在一些实施方式中，高效液相色谱法检测采用十八烷基硅烷键合硅胶作为色谱柱固定相的填充料。优选地，所述色谱柱为Waters Symmetry Shield RP 18，规格为3.0mm×150mm，3.5μm。
在一些实施方式中，高效液相色谱法检测采用的高效液相色谱仪选自以下的一种：安捷伦1260Ⅱ、Waters e2695、戴安Ulitimate 3000、岛津LC-2050C/2060C或其他任何同类型的色谱仪。在一些实施方式中，高效液相色谱法检测采用的高效液相色谱仪为安捷伦1260Ⅱ或Waters e2695。
在一些实施方式中，高效液相色谱法检测采用梯度洗脱方式。
在一些实施方式中，流动相A为缓冲液与水与乙腈按一定比例的混合溶液，所述缓冲液为乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)缓冲液，且所述缓冲液浓度为50～110mg/L，所述缓冲液pH为1.5-2.5，所述缓冲液-水-乙腈的体积比(v/v/v)为100/800/100。在一些实施方式中，流动相B为缓冲液与乙腈的混合溶液，所述缓冲液为乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)缓冲液，且所述缓冲液浓度为50～110mg/L，所述缓冲液pH为1.5-2.5，所述缓冲液-乙腈的体积比(V/V)为100/900。在一些实施方式中，所述缓冲液浓度为90～110mg/L，优选地所述缓冲液浓度为100mg/L。在一些实施方式中，所述缓冲液pH为1.9-2.3，优选地所述缓冲液pH为2.1。
在一些实施方式中，所述缓冲溶液通过以下方法制备：取100mg乙二胺四乙酸二钠，精密称定，加入1000ml水溶解，混匀。在一些实施方式中，流动相A通过以下方法制备：按照缓冲液与水与乙腈的体积比(V/V/V)为100/800/100，混合均匀来配制流动相A。在一些实施方式中，流动相B通过以下方法制备：按照缓冲液与乙腈的体积比(V/V)为100/900，混合均匀来配制流动相B。
在一些实施方式中，高效液相色谱法检测采用以下流动相梯度：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 70 30
4.5 70 30
9 58 42
18 58 42
25 20 80
29 20 80
30 70 30
40 70 30
在一些实施方式中，高效液相色谱法检测采用的流动相流速为0.5～1.0ml/min，优选地所述流动相流速为0.8～1.0ml/min，更优选地所述流动相流速为0.8ml/min。
在一些实施方式中，高效液相色谱法检测采用的色谱柱柱温为40℃～80℃，优选地所述色谱柱柱温为55℃-65℃，更优选地所述色谱柱柱温为60℃。
在一些实施方式中，高效液相色谱法检测采用的自动进样器的温度为1℃～9℃，优选地所述自动进样器的温度为3℃～8℃，更优选地所述自动进样器的温度为5℃。
在一些实施方式中，高效液相色谱法检测采用的检测波长为220nm～270nm，优选地所述检测波长为247nm-253nm，优选地所述检测波长为250nm。
在一些实施方式中，高效液相色谱法检测采用的进样量为10μl～20μl，优选地所述进样量为10μl。
实验证实，本发明的方法可以检测到包括1,3-异构体地和地拉罗司乙酯在内的多达8种地拉罗司中的杂质。并非受任何理论束缚，新鉴定到的杂质或许来自于原料药本身，或许是在颗粒剂置于酸奶等食品一段时间后产生。如实施例表2的数据所示，本发明方法对于全部8种杂质均具有大于1.5的分离度，这确保了本发明的检测方法可以将全部8种杂质与地拉罗司显著分开。而且，本发明的方法在各种高温、酸、碱、氧化和光照条件下，主峰及各已知杂质之间均能达到基线分离，表明方法专属性良好。
重要地，本发明方法所采用专有流动相体系，尤其是本发明方法所采用的特定的检测条件的组合使得本发明的方法实现了对1,3-异构体和地拉罗司乙酯的首次鉴定，并且实现了对包括1,3-异构体地和地拉罗司乙酯在内的多达8种地拉罗司中的杂质的同时检测。
因此，在一些优选实施方式中，为了实现对包括1,3-异构体和地拉罗司乙酯在内的多达8种地拉罗司中的杂质的同时检测，本发明采用以下流动相体系：
-流动相A：缓冲液与水与乙腈按一定比例的混合溶液，所述缓冲液为乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)缓冲液，且所述缓冲液浓度为100mg/L，所述缓冲液pH为2.1，所述缓冲液-水-乙腈的体积比(v/v/v)为100/800/100；
-流动相B：缓冲液与乙腈的混合溶液，所述缓冲液为乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)缓冲液，且所述缓冲液浓度为100mg/L，所述缓冲液pH为2.1，所述缓冲液-乙腈的体积比(V/V)为100/900；
-梯度洗脱方式，流动相梯度为：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 70 30
4.5 70 30
9 58 42
18 58 42
25 20 80
29 20 80
30 70 30
40 70 30
在一些更优选实施方式中，为了实现对包括1,3-异构体和地拉罗司乙酯在内的多达8种地拉罗司中的杂质的同时检测，本发明采用以下色谱条件：
-色谱柱：Waters Symmetry ShieldRP 18，规格为3.0mm×150mm，3.5μm；
-高效液相色谱仪：安捷伦1260Ⅱ或Waters e2695；
-流动相A：缓冲液与水与乙腈按一定比例的混合溶液，所述缓冲液为乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)缓冲液，且所述缓冲液浓度为100mg/L，所述缓冲液pH为2.1，所述缓冲液-水-乙腈的体积比(v/v/v)为100/800/100；
-流动相B：缓冲液与乙腈的混合溶液，所述缓冲液为乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)缓冲液，且所述缓冲液浓度为100mg/L，所述缓冲液pH为2.1，所述缓冲液-乙腈的体积比(V/V)为100/900；
-梯度洗脱方式，流动相梯度为：
Figure BDA0003668819970000081
Figure BDA0003668819970000091
-流动相流速：0.8ml/min；
-色谱柱柱温：60℃；
-自动进样器的温度：5℃；
-检测波长：250nm；和
-进样量：10μl。
在另一些更优选实施方式中，为了实现对包括1,3-异构体和地拉罗司乙酯在内的多达8种地拉罗司中的杂质的同时检测，本发明进一步采用以下检测方法，所述方法包括以下步骤：
(a)配制稀释剂、灵敏度溶液、系统适用性溶液、对照品溶液和地拉罗司待测溶液的步骤，其中：
-所述稀释剂通过乙腈与40mg/L EDTA缓冲液按体积比(V/V)为75:25混合配制，
-所述灵敏度溶液通过用所述稀释剂稀释地拉罗司对照品溶液至一定浓度配制，所述灵敏度溶液浓度为0.25μg/mL；
-所述系统适用性溶液通过用所述稀释剂溶解5mg系统适用性混合对照品至一定浓度配制，所述系统适用性溶液中含地拉罗司浓度为0.5mg/mL，含水杨酰胺、苯并恶嗪酮中间体、1,2-异构体、1,3-异构体、乙酯各杂质浓度均为0.25μg/mL的混合溶液；；
-所述对照品溶液通过用所述稀释剂溶解地拉罗司对照品配制，所述对照品溶液浓度为5μg/mL；
-所述地拉罗司待测溶液通过用所述稀释剂溶解待测的地拉罗司颗粒剂配制，所述待测溶液中含地拉罗司的浓度为0.5mg/mL；
(b)将所述稀释剂、所述灵敏度溶液、所述系统适用性溶液、所述对照品溶液和所述地拉罗司待测溶液按照以下过程顺序进样到色谱仪，其中所述进样的过程如下：(1)空白溶液(进样次数≥1针)、(2)灵敏度溶液(进样次数为1针)、(3)系统适用性溶液(进样次数为1针)、(4)对照品溶液(进样次数为6针)、(5)地拉罗司待测溶液(进样次数≥1针；地拉罗司待测溶液进6针需进一针随行对照品溶液)、和(6)随行对照品溶液(进样次数≥1针)；
(c)记录色谱图并对得到的色谱峰进行分析，其中：
-如果地拉罗司颗粒剂的溶液的色谱图有与所述8种杂质保留时间一致的色谱峰，按以下公式计算各杂质的含量：
Figure BDA0003668819970000101
式中：RU:地拉罗司待测溶液中单个杂质的峰面积；RS:对照品溶液中地拉罗司的峰面积；WS：地拉罗司对照品的重量；P：地拉罗司对照品的含量；Wu：样品的称重；APCW:平均装量；LC：标示量。
并非所有HPLC方法都可以实现对多种杂质的检测。因此，在最优选实施方式中，为了实现对包括1,3-异构体和地拉罗司乙酯在内的多达8种地拉罗司中的杂质的同时检测，本发明进一步采用以下检测方法和色谱条件的组合，其包括以下步骤：
(a)配制稀释剂、灵敏度溶液、系统适用性溶液、对照品溶液和地拉罗司待测溶液的步骤，其中：
-所述稀释剂通过乙腈与40mg/L EDTA缓冲液按体积比(V/V)为75:25混合配制，
-所述灵敏度溶液通过用所述稀释剂稀释地拉罗司对照品溶液至一定浓度配制，所述灵敏度溶液浓度为0.25μg/mL；
-所述系统适用性溶液通过用所述稀释剂溶解5mg地拉罗司系统适用性混合对照品至一定浓度配制，所述系统适用性溶液中含地拉罗司浓度为0.5mg/mL，含水杨酰胺、苯并恶嗪酮中间体、1,2-异构体、1,3-异构体、乙酯各杂质浓度均为0.25μg/mL的混合溶液；
-所述对照品溶液通过用所述稀释剂溶解地拉罗司对照品配制，所述对照品溶液浓度为5μg/mL；
-所述地拉罗司待测溶液通过用所述稀释剂溶解待测的地拉罗司颗粒剂配制，所述待测溶液中含地拉罗司的浓度为0.5mg/mL；
(b)将所述稀释剂、所述灵敏度溶液、所述系统适用性溶液、所述对照品溶液和所述地拉罗司待测溶液按照以下过程顺序进样到色谱仪，
其中所述进样的过程如下：(1)空白溶液(进样次数≥1针)、(2)灵敏度溶液(进样次数为1针)、(3)系统适用性溶液(进样次数为1针)、(4)对照品溶液(进样次数为6针)、(5)地拉罗司待测溶液(进样次数≥1针；地拉罗司待测溶液进6针需进一针随行对照品溶液)、和(6)随行对照品溶液(进样次数≥1针)；
其中色谱条件如下：
-色谱柱：Waters Symmetry ShieldRP 18，规格为3.0mm×150mm，3.5μm；
-高效液相色谱仪：安捷伦1260Ⅱ或Waters e2695；
-流动相A：缓冲液与水与乙腈按一定比例的混合溶液，所述缓冲液为乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)缓冲液，且所述缓冲液浓度为100mg/L，所述缓冲液pH为2.1，所述缓冲液-水-乙腈的体积比(v/v/v)为100/800/100；
-流动相B：缓冲液与乙腈的混合溶液，所述缓冲液为乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)缓冲液，且所述缓冲液浓度为100mg/L，所述缓冲液pH为2.1，所述缓冲液-乙腈的体积比(V/V)为100/900；
-梯度洗脱方式，流动相梯度为：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 70 30
4.5 70 30
9 58 42
18 58 42
25 20 80
29 20 80
30 70 30
40 70 30
-流动相流速：0.8ml/min；
-色谱柱柱温：60℃；
-自动进样器的温度：5℃；
-检测波长：250nm；和
-进样量：10μl；
(c)记录色谱图并对得到的色谱峰进行分析，其中：
-如果地拉罗司颗粒剂的溶液的色谱图有与所述8种杂质保留时间一致的色谱峰，按以下公式计算各杂质的含量：
Figure BDA0003668819970000111
式中：RU:地拉罗司待测溶液中单个杂质的峰面积；RS:对照品溶液中地拉罗司的峰面积；WS：地拉罗司对照品的重量；P：地拉罗司对照品的含量；Wu：样品的称重；APCW:平均装量；LC：标示量。
为了增加患者、尤其是幼儿对地拉罗司口服颗粒剂的依从性，地拉罗司口服颗粒剂通常在服用前撒在面包和果酱或者酸奶中。在一些实施方式中，所述地拉罗司颗粒剂为具有360mg、180mg或90mg规格的地拉罗司口服颗粒剂；和/或所述地拉罗司颗粒剂为撒在面包和果酱或者酸奶中的地拉罗司口服颗粒剂。优选地，在一些实施方式中，所述地拉罗司颗粒剂为撒在面包和果酱或者酸奶中的地拉罗司口服颗粒剂。
通过采用上述色谱条件和检测条件的组合，本发明的方法可以实现大于1.5的分离度，0.017％的检测限，0.05％的定量限，上述优异的检测限度实现了对包括1,3-异构体和地拉罗司乙酯在内的多达8种地拉罗司中的杂质的同时检测。
实施例
下面的实施例仅用于进一步说明本发明但并不将本发明的范围限制于这些实施例。
实施例1-地拉罗司口服颗粒剂中杂质的发现和鉴定
为了考察从不同厂家购买的地拉罗司原料药制备的地拉罗司口服颗粒剂在使用中的稳定性，申请人从包括MSN、Biocon等多家原料药厂商购了地拉罗司原料药，并随后将其制备为适用于儿童服用的颗粒剂，随后将其撒在酸奶中，并在之后不同时间点，根据原料药厂提供的质控标准对于颗粒剂中的杂质进行检测。
色谱条件如下：
-色谱系统：Waters e2695；
-色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(Waters Symmetry ShieldRP 18，3.0mm×150mm，3.5μm)；
-流动相A：100mg/LEDTA缓冲液-水-乙腈的体积比为100/800/100(V/V/V)的混合溶液；
-流动相B：100mg/L EDTA缓冲液-乙腈的体积比为100/900(V/V)的混合溶液；
-流动相梯度：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 70 30
4.5 70 30
9 58 42
18 58 42
25 20 80
29 20 80
30 70 30
40 70 30
-流动相流速：0.8ml/min
-色谱柱柱温：60℃；
-自动进样器温度：5℃；
-检测波长：250nm；
-进样量：10μl。
检测所用试剂：
100mg/L EDTA缓冲液：称取100mg乙二胺四乙酸二钠盐，加入1000ml水溶解，混匀，过滤。
40mg/L EDTA缓冲液：称取40mg乙二胺四乙酸二钠盐，加入1000ml水溶解，混匀，过滤。
稀释剂(空白溶液)：将乙腈与40mg/L EDTA缓冲液按体积比(V/V)为75:25混合均匀，即得。
空白阴性对照溶液：称取相当于含地拉罗司100mg的空白辅料粉末，于含有一定量酸奶的200ml容量瓶中，于不同时间点，加入80％体积的稀释剂，超声10分钟，于摇床振摇30分钟后，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，经0.45μm TF滤膜过滤，弃去前2ml后，作为空白阴性对照溶液。
供试品溶液(地拉罗司待测溶液)：称取相当于含地拉罗司100mg的粉末，于含有一定量酸奶的200ml容量瓶中，根据通常配药的实践放置一段时间后，于不同时间点，加入80％体积的稀释剂，超声10分钟，于摇床振摇30分钟后，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，经0.45μm TF滤膜过滤，弃去前2ml后，取续滤液作为待测溶液。
检测方法如下：
分别取空白溶液(稀释剂)和供试品溶液，进样分析，记录色谱图。
进样的过程如下：(1)空白溶液(进样次数≥1针)、(2)空白阴性对照溶液(进样次数≥1针)和(3)供试品溶液(进样次数≥1针)。
图1为由一家原料药厂的某一批次原料药制备的颗粒剂的色谱图。如图1中所示，除了水杨酸、水杨酰胺、苯并恶嗪酮中间体等原料药厂已公开的部分杂质外，申请人意外的发现在保留时间为12.6分钟和23.7分钟出现了两个未知杂峰，这是原料药厂的质控清单上不曾披露的。更换其它原料药制备颗粒剂后，再次进行测定，类似的未知杂峰依旧存在(数据未示出)。进一步的LC-MS/MS测定显示，保留时间为12.6分钟的未知峰的结构式为式I；保留时间为23.7分钟的未知峰的结构式为式Ⅱ。申请人推测上述新发现的杂质峰或许与特定的流动相梯度有关。
Figure BDA0003668819970000141
经确认发现，式I为“地拉罗司1,3异构体”，式Ⅱ为“地拉罗司乙酯”。除2种新杂质之外，色谱图中还出现了其他6种杂质，包括水杨酰胺、水杨酸、水杨酸酰亚胺、地拉罗司甲酯、1,2-异构体、苯并恶嗪酮中间体。
为了能更全面、更准确的对地拉罗司口服颗粒剂进行严格的质量进行控制，需要对已知的6种杂质以及新发现的2种杂质进行全面的监测和检测。为实现此目的，需要进一步开发一种能够对8种杂质同时进行测定的方法。而且，对于此方法，仍需要从系统适应性、专属性、定量限、检测限、精密度、准确度等方面进行全面考察。
实施例2-系统适用性试验
本实验的一个目的是测定本发明开发的高效液相色谱法对于地拉罗司颗粒剂中的相关杂质检测方法系统适用性。
本实验的色谱条件同实施例1。
本实验的进样过程如下：
检测所用试剂：
100mg/L EDTA缓冲液：称取100mg乙二胺四乙酸二钠盐，加入1000ml水溶解，混匀，过滤。
40mg/L EDTA缓冲液：称取40mg乙二胺四乙酸二钠盐，加入1000ml水溶解，混匀，过滤。
稀释剂：将乙腈与40mg/L EDTA缓冲液按体积比(V/V)为75:25混合均匀，即得。
对照品贮备液(100μg/mL)：取地拉罗司对照品约20mg，精密称定，于200ml容量瓶中，加入80％容量瓶体积的稀释剂，超声溶解，稀释剂定容，摇匀，即得。
对照品溶液(5μg/mL)：精密移取5.0mL对照品贮备溶液于100mL容量瓶中，稀释剂定容，摇匀，即得。
灵敏度溶液(0.25μg/mL)：取精密移取1.0mL对照品溶液于20mL容量瓶中，稀释剂定容，摇匀，即得。
系统适用性溶液：取地拉罗司系统适用性混合对照品约5mg，精密称定，于10ml容量瓶中，加入80％容量瓶体积的稀释剂，超声溶解，稀释剂定容，摇匀，即得含地拉罗司浓度为0.5mg/ml；含水杨酰胺、苯并恶嗪酮中间体、1,2-异构体、1,3-异构体、乙酯各杂质浓度均为0.25μg/mL的混合溶液。
供试品溶液(地拉罗司待测溶液)：称取相当于含地拉罗司100mg的粉末，于200ml容量瓶中，加入80％体积的稀释剂，超声10分钟，于摇床振摇30分钟后，加稀释剂稀释至刻度，摇匀。
检测方法如下：
分别取空白溶液(稀释剂)、灵敏度溶液、系统适用性溶液、对照品溶液及各供试品溶液，进样分析，记录色谱图。
进样的过程如下：(1)空白溶液(进样次数≥1针)、(2)灵敏度溶液(进样次数为1针)、(3)系统适用性溶液(进样次数为1针)、(4)对照品溶液(进样次数为6针)、(5)供试品溶液(进样次数≥1针；供试品溶液进6针需进一针随行对照品溶液)、和(6)随行对照品溶液(进样次数≥1针)。
色谱图峰面积计算公式：
Figure BDA0003668819970000151
式中：RU:供试品溶液中单个杂质的峰面积；RS:工作对照品溶液中地拉罗司的峰面积；WS：地拉罗司对照品的重量；P：地拉罗司对照品的含量；Wu：样品的称重；APCW:平均装量；LC：标示量。
系统适用性要求：空白溶液应无干扰；灵敏度溶液中地拉罗司的信噪比应不小于10；系统适用性溶液中地拉罗司与1,3异构体的分离度应不小于1.5；第一针对照品溶液的拖尾因子应不大于2.0；平行进样6针对照品溶液地拉罗司峰面积的RSD应不大于5.0％。结果如下表所示：
表1对照品溶液峰面积系统适用性结果
对照品溶液 1 2 3 4 5 6 RSD
峰面积 263859 263890 263799 263801 263478 263799 0.06％
数据结果显示：空白溶液无干扰，系统适用性溶液中地拉罗司与1,3异构体的分离度大于1.5，第一针对照品溶液的拖尾因子是1.05，远小于2.0；平行6针对照品溶液峰面积的RSD为0.06％，远小于5.0％。
此结果表明，实施例2的方法系统适用性均满足要求。
实施例3-专属性试验
本实验目的是为了考察在其他成分(如空白稀释剂、辅料、杂质等)可能存在下，采用的HPLC方法能正确测定出被测物的能力。
本实验的色谱条件同实施例2。
空白辅料溶液：称取相当于含地拉罗司100mg的空白辅料粉末，于200ml容量瓶中，加入80％体积的稀释剂，超声10分钟，于摇床振摇30分钟后，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，取一部分液体经0.45umTF滤膜过滤，弃去前2ml后，取续滤液作为待测溶液，或者取一部分液体经4000rpm离心10分钟后，取上清液作为待测溶液。
各杂质对照品贮备液：分别取各杂质对照品约2.5mg，精密称定，分别转移至不同的50ml容量瓶中，加入适量稀释剂超声溶解，定容混匀，分别配制成各杂质浓度为50μg/ml的各杂质对照品贮备溶液。
各杂质定位液：精密量取5.0ml各杂质对照品贮备溶液于不同的50ml容量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，配制成约含杂质为5μg/ml的各杂质定位溶液。
各杂质混标溶液：取地拉罗司对照品约50mg，精密称定，于100ml容量瓶中，加稀释剂超声溶解，分别取各杂质对照品贮备液1.0mL于上述容量瓶中，定容混匀，配制成含地拉罗司浓度为0.5mg/ml，各杂质浓度为0.5μg/ml的杂质混标溶液。
取空白溶液(稀释剂)、空白辅料溶液、对照品溶液、各杂质定位液，各杂质混标溶液及供试品溶液，按上述色谱条件进样分析，记录色谱图。
图2示出了采用本发明的方法检测空白溶液得到的色谱图,图3示出了采用本发明的方法检测空白辅料溶液得到的色谱图。如图2及图3所示，空白溶剂及空白辅料在地拉罗司或其他各已知杂质出峰位置无干扰。表2示出了采用本发明的方法检测各杂质混标溶液得到的相对保留时间结果。如表2所示，各杂质混标溶液中相邻两个杂质峰的分离度均大于1.5，表明全部8种杂质与地拉罗司可以显著分开。结果表明实施例1的方法的专属性良好。
表2地拉罗司及其相关杂质保留时间和相对保留时间及分离度
Figure BDA0003668819970000161
Figure BDA0003668819970000171
强制降解试验：高温、酸、碱、氧化和光照条件下，主峰及各已知杂质之间均能达到基线分离，表明方法专属性良好。
实施例4：定量限与检测限试验
本实验目的是通过采用的HPLC分析方法能准确测定出供试品中各杂质能被定量测定的最低量(定量限)和能被检测出的最低量(检测限)。
色谱条件同实施例2。除非特别说明，检测过程同实施例2。
地拉罗司对照品贮备溶液：取地拉罗司对照品约5mg，精密称定，于50ml容量瓶中，加稀释剂超声溶解，定容混匀，配制成地拉罗司浓度为100μg/ml的对照品贮备溶液。
定量限(LOQ)溶液(相当于产品浓度的0.05％)：分别精密移取1.0mL各杂质对照品贮备液(50μg/ml)及0.5mL地拉罗司对照品贮备液(100μg/ml)于200mL容量瓶中，用稀释剂定容，摇匀，作为定量限溶液(各杂质和地拉罗司浓度均为0.25μg/ml)。
检测限(LOD)溶液(相当于产品浓度的0.017％)：将定量限溶液稀释3倍作为检测限溶液。
取上述溶液分别进样，定量限溶液平行进样6针信噪比(S/N)均应大于10，峰面积的RSD应不大于5.0％；检测限溶液的信噪比(S/N)均应不小于3。结果如下表：
表3定量限考察结果
Figure BDA0003668819970000172
Figure BDA0003668819970000181
表4检测限考察结果
Figure BDA0003668819970000182
结果显示：在供试品浓度0.05％(该产品的报告限为0.05％)的定量限浓度水平下信噪比均大于10，在供试品浓度的0.017％的检测限下信噪比均大于3，表明该方法能够准确定量检测地拉罗司颗粒剂中相关杂质的含量。
实施例5：线性和范围
本实验目的是为了考察采用HPLC方法在设计的范围内(LOQ-0.6％)，被测物峰面积与浓度呈比例关系的能力，以及通过外标法计算各杂质含量的准确性。
色谱条件同实施例2。除非特别说明，检测过程同实施例2。
线性贮备液：取地拉罗司对照品约10mg，精密称定，于100ml容量瓶中，加稀释剂超声溶解，定容混匀，配制成地拉罗司浓度为100μg/ml的线性贮备溶液。
线性溶液：按下表分别移取适量体积线性贮备液于不同容量瓶中，稀释剂定容，摇匀。
表5线性溶液的配制方法
Figure BDA0003668819970000191
取上述溶液分别进样并记录色谱图，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，作线性回收，要求相关系数应不小于0.990；y轴截距应目标浓度的25％以内。
表6地拉罗司线性考察结果
Figure BDA0003668819970000192
图4示出了采用本发明的方法检测地拉罗司的线性关系图，结果显示地拉罗司在0.25μg/ml(LOQ)～6.0μg/ml浓度范围内，线性关系良好。
实施例6：准确度试验
本实验目的是为了采用HPLC方法在含有辅料的样品溶液中添加不同已知浓度的已知杂质和地拉罗司，以考察添加的各杂质能否完全提取，并考察测定结果与真实值接近程度，一般用回收率表示。
色谱条件同实施例2。除非特别说明，检测过程同实施例2。
准确度试验通过向制剂处方量的空白辅料中加入已知量的地拉罗司(代替未知杂质)和相关已知杂质进行测定，涉及三个浓度9份样品来考察。
地拉罗司对照品贮备溶液：取地拉罗司对照品约20mg，精密称定，于200ml容量瓶中，加稀释剂超声溶解，定容混匀，配制成地拉罗司浓度为100μg/ml的对照品贮备溶液。
准确度贮备液(相当于样品浓度的2.0％)：分别精密移取10mL各已知杂质对照品贮备液及20mL地拉罗司对照品贮备液于100mL容量瓶中，用稀释剂定容，摇匀，作为准确度贮备液(地拉罗司及各已知杂质浓度均为10μg/ml)。
R1准确度溶液(LOQ-0.05％)：称取处方量的空白辅料于100ml容量瓶中，精密移取上述准确度贮备液2.5ml于该容量瓶中，加稀释剂超声，定容混匀，过滤，取续滤液作为R1准确度溶液。(平行配制3份)
R2准确度溶液(0.20％)：称取处方量的空白辅料于20ml容量瓶中，精密移取上述准确度贮备液2.0ml于该容量瓶中，加稀释剂超声，定容混匀，过滤，取续滤液作为R2准确度溶液。(平行配制3份)
R3准确度溶液(0.50％)：称取处方量的空白辅料于20ml容量瓶中，精密移取上述准确度贮备液5.0ml于该容量瓶中，加稀释剂超声，定容混匀，过滤，取续滤液作为R3准确度溶液。(平行配制3份)
分别取上述各溶液进样分析并记录色谱图，按外标法计算各杂质回收率，结果如下表：
表7地拉罗司相关杂质准确度结果
Figure BDA0003668819970000201
结果表明：地拉罗司及其相关杂质在各浓度水平下各样品回收率及平均回收率均在90.0％～110.0％之间，9份回收率的RSD均小于10％，说明该方法的准确度良好。
实施例7：精密度试验
本实验目的是为了测试采用的高效液相色谱法，在一定条件下进行多次取样测定所得结果之间的接近程度。
色谱条件同实施例2。除非特别说明，检测过程同实施例2。
各已知杂质对照品贮备液：取各已知杂质对照品适量，精密称定，分别转移至不同容量瓶中，加稀释剂超声溶解，定容混匀，配制成含已知杂质浓度为100μg/ml的各杂质对照品贮备溶液。
各杂质对照品混合溶液：分别精密移取20mL各已知杂质对照品贮备液于同一200mL容量瓶中，用稀释剂定容，摇匀，作为各杂质对照品混合溶液(各杂质浓度均为10μg/ml)。
重复性溶液(加标溶液)：取地拉罗司颗粒不少于10包，完全倒出其内容物于干净的研钵中，称量确定平均装量，研磨成细粉，搅拌均匀，称取相当于含地拉罗司100mg的粉末，于200ml容量瓶中，向该容量瓶中加入20ml各杂质对照品混合溶液，加入80％体积的稀释剂，超声10分钟，于摇床振摇30分钟后，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，取一部分液体经0.45umTF滤膜过滤，弃去前2ml后，取续滤液作为重复性溶液(含各杂质分别为0.20％)。(平行配制6份)
分别取上述各溶液进样分析并记录色谱图，按外标法计算各杂质回收率，结果如下表：
表8地拉罗司相关杂质重复性结果
Figure BDA0003668819970000211
结果表明：6份样品中各杂质含量的RSD均小于10％，，说明重复性良好。
中间精密度试验
由另一名分析人员独立建立系统，取与重复性样品同一批号的样品，同法配制6份加标样品溶液，使用不同的仪器于不同天进行测定，结果见下表。
表9地拉罗司相关杂质中间精密度结果
Figure BDA0003668819970000221
结果表明：与重复性共12份样品溶液中，各杂质含量的RSD均小于10％，说明该方法的精密度良好。
实施例8：耐用性试验
本实验的目的是通过考察色谱条件的流速、流动相的pH、流动相的比例、相同品牌不同批号色谱柱、相同填料不同品牌色谱柱等条件变动，找到最优的色谱参数及确定目标参数微小变动后对结果不受影响的承受程度。具体考察项目如下表所示。
表10.耐用性考察项目
Figure BDA0003668819970000222
Figure BDA0003668819970000231
分别取空白溶液(稀释剂)、系统适用性溶液、对照品溶液分别依次进样分析，考察在不同色谱参数条件下，系统适用性是否符合要求；取各杂质的混标溶液进样分析，用于考察在不同色谱参数条件下，各已知杂质峰的相对保留时间是否一致。
系统适用性可接受标准：除溶剂峰外空白溶液应无干扰；系统适用性溶液中地拉罗司与1,3异构体的分离度应不小于1.5；第一针对照品溶液中，主峰的拖尾因子应不大于2.0；重复进样6针对照品溶液，主峰峰面积的RSD应不大于5.0％。
表11耐用性-系统适用性考察结果
缓冲液浓度 90mg/L 100mg/L 110mg/L
稀释剂是否有干扰 无干扰 无干扰 无干扰
地拉罗司与1,3异构体的分离度 1.9 2.0 2.0
拖尾因子 1.05 1.05 1.07
重复进样6针对照品溶液峰面积的RSD％ 0.3 0.72 0.90
缓冲液的pH pH1.9 pH2.1 pH2.3
稀释剂是否有干扰 无干扰 无干扰 无干扰
地拉罗司与1,3异构体的分离度 1.6 2.0 1.6
拖尾因子 1.05 1.05 1.05
重复进样6针对照品溶液峰面积的RSD％ 3.0 1.2 0.1
检测波长 247nm 250nm 253nm
稀释剂是否有干扰 无干扰 无干扰 无干扰
地拉罗司与1,3异构体的分离度 1.9 2.0 2.0
拖尾因子 1.05 1.05 1.05
重复进样6针对照品溶液峰面积的RSD％ 0.7 1.2 1.8
柱温 55℃ 60℃ 65℃
稀释剂是否有干扰 无干扰 无干扰 无干扰
地拉罗司与1,3异构体的分离度 2.0 2.0 1.9
拖尾因子 1.05 1.05 1.05
重复进样6针对照品溶液峰面积的RSD％ 1.3 1.2 0.8
表12耐用性-各杂质混标溶液考察结果
Figure BDA0003668819970000232
Figure BDA0003668819970000241
结果表明：流动相缓冲液浓度、缓冲液pH、检测波长及柱温发生微小变动时，各条件下的系统适用性均满足要求，且各已知杂质的相对保留时间基本无影响，说明本法耐用性良好。
本发明上述一系列实验证明该方法具有分离度好，灵敏度高，专属性好，准确度高，精密度高，耐用性强等众多优点，由此可实现对多种杂质的检测，这使得本发明的方法更加适用于不同来源的原料药厂的地拉罗司颗粒剂中相关杂质的检测/监测及质量控制。本发明的方法为合理的质量标准制定提供依据，以便更好控制和掌握产品质量，确保临床用药的安全性。

Claims (7)

1.一种测定地拉罗司颗粒剂中杂质的方法，其特征在于，所述杂质包括选自以下至少一种杂质：水杨酰胺、水杨酸、苯并恶嗪酮中间体、地拉罗司甲酯、水杨酸酰亚胺、1,2-异构体、1,3-异构体和地拉罗司乙酯；且
所述方法包括采用高效液相色谱法对地拉罗司颗粒剂进行检测，其中所述高效液相色谱法检测条件包括：
-色谱柱固定相的填充料：十八烷基硅烷键合硅胶；
-流动相A：缓冲液与水与乙腈按一定比例的混合溶液，所述缓冲液为乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)缓冲液，且所述缓冲液浓度为50～110mg/L，所述缓冲液pH为1.5-2.5，所述缓冲液-水-乙腈的体积比(v/v/v)为100/800/100；
-流动相B：缓冲液与乙腈的混合溶液，所述缓冲液为乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)缓冲液，且所述缓冲液浓度为50～110mg/L，所述缓冲液pH为1.5-2.5，所述缓冲液-乙腈的体积比(V/V)为100/900；
-流动相梯度
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％) 0 70 30 4.5 70 30 9 58 42 18 58 42 25 20 80 29 20 80 30 70 30 40 70 30
-流动相流速：0.5～1.0ml/min；
-色谱柱柱温：40℃～80℃；
-自动进样器温度：1℃～9℃
-检测波长：220～270nm；和
-进样量：10μl～20μl。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述杂质包括选自以下杂质或者由以下的杂质组成：水杨酰胺、水杨酸、苯并恶嗪酮中间体、地拉罗司甲酯、水杨酸酰亚胺、1,2-异构体、1,3-异构体和地拉罗司乙酯。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其特征在于，所述色谱柱为WatersSymmetry Shield RP 18，规格为3.0mm×150mm，3.5μm。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱法采用的高效液相色谱仪选自以下的一种：安捷伦1260Ⅱ、Waters e2695、戴安Ulitimate 3000、岛津LC-2050C/2060C或其他任何同类型的色谱仪。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述缓冲液浓度为90～110mg/L；和/或所述缓冲液pH为1.9-2.3。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，
-所述流动相流速为0.8～1.0ml/min；和/或
-所述色谱柱柱温为55℃-65℃；和/或
-所述自动进样器温度为3℃-8℃；和/或
-所述检测波长为247nm-253nm；和/或
-所述进样量为10μl～20μl。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述地拉罗司颗粒剂为具有360mg、180mg或90mg规格的地拉罗司口服颗粒剂；和/或所述地拉罗司颗粒剂为撒在面包和果酱或者酸奶中的地拉罗司口服颗粒剂。
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