CN114990203B - 测定来自尿液的足细胞内的rna在制备糖尿病肾病疾病诊断试剂盒中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了测定来自尿液的足细胞内的RNA在制备糖尿病肾病疾病诊断试剂盒中的应用。定量检测尿液的足细胞内的MFAP4的试剂在制备糖尿病肾病诊断试剂或辅助诊断试剂中的应用。定量检测尿液的足细胞内的MFAP4的试剂为检测MFAP4的引物、探针或基因芯片。本专利通过单细胞测序鉴定了糖尿病肾病进展过程中尿液中的足细胞内一系列特异性基因，随后通过ddPCR技术构建了基于尿液足细胞的能够用于糖尿病肾病诊断的方法，MFAP4作为检测靶标用于糖尿病肾病的诊断，根据尿液足细胞内MFAP4mRNA含量鉴别糖尿病肾病与非糖尿病肾病的ROC曲线显示其准确率和精确率分别为100％和92％。
Description
技术领域
本发明属于医学诊断领域，涉及测定来自尿液的足细胞内的RNA在制备糖尿病肾病疾病诊断试剂盒中的应用。
背景技术
糖尿病肾病是糖尿病最主要的并发症之一,它不仅是导致终末期肾脏病的首要因素，也是糖尿病患者死亡的主要原因之一。糖尿病肾病早期无明显症状，且目前也无方便快捷准确的诊断方法，因此在日常检测中极容易被忽略。糖尿病肾病患者往往一旦被诊断即已经进入不可逆状态，只能进行有限的干预性治疗，肾脏依然会持续恶化，直至进展为终末期肾病，严重影响患者生活质量、大幅增加经济负担甚至导致寿命缩短。研究表明，若糖尿病肾病患者能够在早期筛查过程中得以确认并进行有效的治疗，糖尿病肾病患者终末期肾病的发生风险和死亡风险都会显著降低。因此，亟需研发可用于糖尿病肾病早期诊断的方便快捷准确的方法。
在糖尿病患者体内，足细胞会因为长期处于高血糖等恶劣环境中会出现密度和数量减少、足突增宽、足细胞脱落等改变,且可从尿中丢失,继而导致糖尿病肾病的发生。足细胞损伤是糖尿病肾病发生发展的早期事件，因此检测尿液中的足细胞可能是糖尿病肾病早期诊断最有效的方法之一。然而，囿于在糖尿病肾病早期，脱落的足细胞很少且很难捕获，再加上其它肾脏损伤也会导致足细胞脱落，因此在应用尿液中的足细胞作为糖尿病肾病早期诊断的过程中面临极大的困难。本专利首先通过单细胞测序鉴定了糖尿病肾病进展过程中尿液中的足细胞内一系列特异性基因，随后通过ddPCR技术构建了基于尿液足细胞的能够用于糖尿病肾病诊断的方法。
发明内容
本发明的目的是提供与糖尿病肾病相关的尿液的足细胞内的RNA标志物。
本发明的另一目的是提供所述标志物的应用。
本发明的又一目的是提供检测所述标志物的试剂及其应用。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
与糖尿病肾病相关的尿液的足细胞内的RNA标志物，其特征在于选自下列RNA：MFAP4。
本发明所述的尿液的足细胞内的RNA标志物在制备糖尿病肾病诊断试剂中的应用。
定量检测尿液的足细胞内的MFAP4的试剂在制备糖尿病肾病诊断试剂或辅助诊断试剂中的应用。
作为本发明的一种优选，定量检测尿液的足细胞内的MFAP4的试剂为检测MFAP4的引物、探针或基因芯片。
作为本发明的进一步优选，检测MFAP4 mRNA的引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
有益效果：
本专利通过单细胞测序鉴定了糖尿病肾病进展过程中尿液中的足细胞内一系列特异性基因，随后通过ddPCR技术构建了基于尿液足细胞的能够用于糖尿病肾病诊断的方法，MFAP4作为检测靶标用于糖尿病肾病的诊断，根据尿液足细胞内MFAP4 mRNA含量鉴别糖尿病肾病与非糖尿病肾病的ROC曲线显示其准确率和精确率分别为100％和92％。
附图说明
图1显示了podocalyxin抗体偶联的磁珠捕获尿液足细胞的示意图。
图2显示了利用流式细胞仪检测分离的尿液足细胞纯度。
图3显示了高通量测序检测的糖尿病肾病和非糖尿病肾病尿液足细胞内RNA含量(A)及MFAP4 mRNA含量(B)。
图4显示了ddPCR检测到的糖尿病肾病和非糖尿病肾病尿液足细胞内MFAP4 mRNA含量。
图5显示了尿液足细胞内MFAP4 mRNA含量鉴别糖尿病肾病与非糖尿病肾病的ROC曲线。
实施例1 尿液足细胞分离
1.收集糖尿病肾病患者和非糖尿病肾病患者尿液各50毫升，1000rpm离心5分钟，弃去上清，保留沉淀；
2.向沉淀中加入5毫升PBS溶液(137mM NaCl,2.7mM KCl,10mM Na2HPO4,2mMKH2PO4)，混合均匀后，1000rpm离心5分钟，弃去上清，保留沉淀；
3.重复上述操作两次后向沉淀中加入1毫升PBS溶液，混合均匀后，转入1.5ml EP管中，加入100微升偶联podocalyxin抗体的磁珠，混合均匀后，室温孵育1h；
4.利用磁铁进行磁性分离，去除溶液，保留被磁铁吸附在管壁的细胞，撤去磁铁，加入1毫升PBS溶液充分洗涤后，利用磁铁进行磁性分离，去除溶液，保留被磁铁吸附在管壁的细胞；
5.重复上述操作两次后，撤去磁铁，用500微升PBS溶液重悬细胞，通过podocalyxin抗体，利用流式细胞仪观察足细胞纯度。
检测结果由流式细胞仪分析结果表明，我们分离的足细胞纯度接近99％(图2)。
实施例2 尿液足细胞RNA分离与高通量测序
1.收集糖尿病肾病患者和非糖尿病肾病患者尿液各50毫升，1000rpm离心5分钟，弃去上清，保留沉淀；
2.向沉淀中加入5毫升PBS溶液(137mM NaCl,2.7mM KCl,10mM Na2HPO4,2mMKH2PO4)，混合均匀后，1000rpm离心5分钟，弃去上清，保留沉淀；
3.重复上述操作两次后向沉淀中加入1毫升PBS溶液，混合均匀后，转入1.5ml EP管中，加入100微升偶联podocalyxin抗体的磁珠，混合均匀后，室温孵育1h；
4.利用磁铁进行磁性分离，去除溶液，保留被磁铁吸附在管壁的细胞，撤去磁铁，加入1毫升PBS溶液充分洗涤后，利用磁铁进行磁性分离，去除溶液，保留被磁铁吸附在管壁的细胞；
5.重复上述操作两次后，撤去磁铁，用500微升PBS溶液重悬细胞，利用微量样本总RNA提取试剂盒(TIANGEN，DP420)提取样本中的RNA，随后进行高通量测序。
检测结果由高通量测序结果表明，糖尿病肾病患者尿液中含有较多的足细胞RNA，而非糖尿病肾病患者尿液中足细胞含量较少RNA(图3A)，并且MFAP4 mRNA在来自糖尿病肾病患者尿液足细胞中显著上升(图3B)。
实施例3 尿液足细胞RNA作为糖尿病肾病诊断标志物
1.收集50例糖尿病肾病患者和50例非糖尿病肾病患者尿液各10毫升，1000rpm离心5分钟，弃去上清，保留沉淀；
2.向沉淀中加入5毫升PBS溶液(137mM NaCl,2.7mM KCl,10mM Na2HPO4,2mMKH2PO4)，混合均匀后，1000rpm离心5分钟，弃去上清，保留沉淀；
3.重复上述操作两次后向沉淀中加入1毫升PBS溶液，混合均匀后，转入1.5ml EP管中，加入100微升偶联podocalyxin抗体的磁珠，混合均匀后，室温孵育1h；
4.利用磁铁进行磁性分离，去除溶液，保留被磁铁吸附在管壁的细胞，撤去磁铁，加入1毫升PBS溶液充分洗涤后，利用磁铁进行磁性分离，去除溶液，保留被磁铁吸附在管壁的细胞；
5.重复上述操作两次后，撤去磁铁，用500微升PBS溶液重悬细胞，利用微量样本总RNA提取试剂盒(TIANGEN，DP420)提取样本中的RNA，随后利用RNA特异性引物(表1)进行ddPCR检测。
检测结果
对分离的尿液微囊泡提取RNA后，利用RNA特异性引物对RNA进行ddPCR检测，检测结果表明MFAP4 mRNA含量在糖尿病肾病患者尿液足细胞中显著高表达(图4)。利用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,简称ROC曲线)分析MFAP4mRNA区分糖尿病肾病和非糖尿病肾病的曲线下面积为0.9272(95％CI:0.8584-0.9960),准确率和精确率分别为100％和92％。
序列表
<110> 南京羿检医学检验实验室有限公司
中国药科大学
<120> 测定来自尿液的足细胞内的RNA 在制备糖尿病肾病疾病诊断试剂盒中的应用
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Claims (3)
1.定量检测尿液的足细胞内的MFAP4的试剂在制备糖尿病肾病诊断试剂或辅助诊断试剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于定量检测尿液的足细胞内的MFAP4的试剂为检测MFAP4的引物、探针或基因芯片。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于检测MFAP4 mRNA的引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
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