CN114990146A - 一种用于染色质分析的多任务工具包及其制备方法 - Google Patents

一种用于染色质分析的多任务工具包及其制备方法 Download PDF

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李昊峻
张全勇
陈凯
汪财雨
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Abstract

本发明属于染色质分析技术领域，公开了一种用于染色质分析的多任务工具包及其制备方法，将Tn5转座酶和抗体分别连接SpyTag和SpyCatcher，通过SpyTag和SpyCatcher之间的相互作用将转座酶Tn5与抗体进行间接融合；利用SpyTag&SpyCatcher系统，将不同的抗体与SpyCatcher进行融合，将不同的功能蛋白与SpyTag进行融合，制得用于染色质分析的多任务工具包。本发明利用SpyTag&SpyCatcher系统，将其应用扩大化，可以在不同的实验中利用该系统，将融合蛋白这一原本繁琐且活性不稳定的方式变得更高效更稳定，缩短时间，提高实验效率。

Description

一种用于染色质分析的多任务工具包及其制备方法
技术领域
本发明属于染色质分析技术领域，尤其涉及一种用于染色质分析的多任务工具包及其制备方法。
背景技术
蛋白质与DNA互作是基因转录调控的关键，也是启动基因转录的前提。与DNA互作的蛋白质主要包括组蛋白、转录因子、DNA甲基化酶和染色质重塑蛋白等。为了研究蛋白质－DNA互作，研究人员开发了很多方法，其中染色质免疫沉淀(ChIP)就是研究DNA与转录因子互作的一种重要技术，该技术将蛋白质与DNA复合体利用超声进行打断，再通过IP实验将目的蛋白拉下，从而得到与蛋白质互作的DNA序列并进行建库。这一方法从上世纪九十年代提出至今，先后经历了多次技术革新，逐渐有了现在研究蛋白质与DNA互作的方法——CUT&Tag(Henicoff)。其原理利用Tn5转座酶具有切割双链核酸这一特性，将Protein G/ATn5进行融合表达，利用Protein G/A定位到抗体，在原位将Tn5激活，直接进行建库，达到用更少细胞量得到更高信噪比这一目的。但是该技术一次只能做一种蛋白，据此本发明实验室一直在开发一次能做多个位点的multi CUT&Tag，原理即利用纳米抗体(羊驼单域重链抗体)或scFv(单链可变区片段)(之后统称抗体)与Tn5转座酶进行大肠杆菌融合表达和纯化，将抗原(感兴趣的Tag序列，可以被抗体识别)序列转染，在透膜剂的作用下让抗体－Tn5进入细胞内，最后利用抗体识别对应的抗原，将Tn5定位到原位进行酶切，以达到将酶切和建库一步完成的目的，同时可以免去对不同抗体的需求。目前，利用常规方法得到抗体与Tn5的融合蛋白需要将不同抗体序列Tn5进行融合表达，这种策略费时费力，不仅需要构建大量质粒并对单独的一种融合蛋白进行纯化，而且，根据实验室前期的实验结果发现，并不是所有的抗体与Tn5融合后都能够具备保持两个功能单元的活性，不同的融合蛋白其Tn5建库活性存在稳定的差异。
SpyTag&SpyCatcher系统源自于化脓性链球菌，该菌体内有一种结构域CnaB2，在生理条件下可以自发形成稳定的赖氨酸－天冬氨酸肽键，且在各种条件下都表现出极高的稳定性(Mark Howarth 2011PNAS)。利用该方法可以得到与融合蛋白相似的效果，并且可以避免这种稳定的建库活性差异同时可以利用这种特性进行染色质研究。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
(1)现有抗体与功能蛋白的融合表达纯化极其耗时。当你需要十种抗体分别与十种功能蛋白融合表达时，你需要构建并纯化100个质粒，工作量巨大。如果利用该系统则只需要纯化20种蛋白即可，省时省力。
(2)在实验室前期工作中发现，不是所有的抗体与Tn5融合后都具备建库能力，如上图展示不同的抗体与Tn5融合表达后所表现的活性不同，这表明不是所有的蛋白都能用来进行CUT&Tag实验。
(3)目前几乎没有利用SpyTag&SpyCatcher系统进行染色质研究的先例。我们利用该系统可以更经济高效地进行染色质研究。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于染色质分析的多任务工具包及其制备方法。
本发明是这样实现的，一种用于染色质分析的多任务工具包的制备方法，所述用于染色质分析的多任务工具包的制备方法包括：
将Tn5转座酶和抗体分别连接SpyTag和SpyCatcher，通过SpyTag和SpyCatcher之间的相互作用将转座酶Tn5与抗体进行间接融合。
进一步，所述用于染色质分析的多任务工具包的制备方法还包括：
利用SpyTag&SpyCatcher系统，将不同的抗体与SpyCatcher进行融合，将不同的功能蛋白与SpyTag进行融合，制得用于染色质分析的多任务工具包。
进一步，所述用于染色质分析的多任务工具包的制备方法包括以下步骤：
步骤一，分子克隆：分别得到SpyTag与Tn5，SpyCatcher与抗体的融合蛋白，利用SpyTag和SpyCatcher得到抗体与Tn5的融合；
步骤二，原核表达纯化：构建质粒进行一代测序，将测序正确的质粒通过BL21(DE3)感受态进行转化以及蛋白纯化。
进一步，所述步骤一中的分子克隆包括：
利用实验室中的pET28原核表达载体作为骨架，骨架带有MBP和His标签用于纯化，将SpyTag Tn5和SpyCatcher ALFA通过无缝克隆连接在载体上。
进一步，所述质粒结构如下：
pET28-SpyTag3-Tn5-CBD-6His；
pET28-6His-MBP-TEV-spyCatcher3-ALFA；
pET28-SpyTag3-GFP-CBD-6His。
进一步，SpyTag序列为SEQ ID NO：1；SpyCatcher序列为SEQ ID NO：2；EGFP序列为SEQ ID NO：3；抗体序列为SEQ ID NO：4；Tn5序列为SEQ ID NO：5；MBP标签序列为SEQ IDNO：6；His标签序列为SEQ ID NO：7。
进一步，所述步骤二中的将测序正确的质粒进行转化包括：
将测序正确的质粒通过BL21(DE3)感受态进行转化，涂于Kana平板37℃生长12h，第二天挑取单克隆至10ml Kana培养基中，220rpm37℃培养7h；将菌液扩大培养至500ml LBKana培养基培养3～4h，待菌液生长到OD≈0.7时加入终浓度0.5mM的IPTG 15℃220rpm诱导16h后跑胶验证。
进一步，所述步骤二中的蛋白纯化包括：
将诱导完成的菌液10000g离心20min得到菌体，利用MBP Lysis buffer将菌体充分重悬，利用高压均质机4℃条件下将菌体充分裂解；20000G离心20min收集上清，加入终浓度0.1％的PEI充分混匀，上清液中产生乳白色沉淀，静置10min充分螯合核酸，再次20000G离心20min，上清中是不含核酸的蛋白粗液；将上清液与提前用20倍柱MBP Lysis Buffer平衡的MBP填料进行孵育，使带标签的目的蛋白与填料特异性结合30～60min；
结合完毕过层析柱将未结合的蛋白流出层析柱并收集流穿液，填料留在柱内，利用Wash Buffer对填料进行约50倍柱的洗杂处理，将体系中的杂蛋白随着流穿液洗掉，留在填料上的就是包含MBP标签的目的蛋白；用Elution Buffer将目的蛋白进行少量多次洗脱后，进行SDS-PAGE电泳验证，若体系中其他杂蛋白仍旧很多，则利用Ni柱进行二次纯化；将得到的高浓度SpyTag和SpyCatcher进行4℃孵育〉10min，得到SpyTag与SpyCatcher的结合产物。
进一步，所述MBP Lysis buffer包括20mM Tris-HCl pH8.0，200mM NaCl，1mMEDTA；
所述WashBuffer包括20mM Tris-HCl pH8.0，200mM NaCl，1mM EDTA；
所述Elution Buffer包括20mM Tris-HCl pH8.0，200mM Nacl，1mM EDTA，10mMMaltose；
所述Buffer成分如下：Wash/Load Buffer：50mM Tris-HCl pH8.0，300mM NaCl，20mM咪唑，0.1％tritonx-100，10％甘油；Elute Buffer：50mM Tris-HClpH8.0，300mMNaCl，250mM咪唑，0.1％triton x-100，10％甘油。
本发明的另一目的在于提供一种实施所述的用于染色质分析的多任务工具包的制备方法制备得到的用于染色质分析的多任务工具包。
结合上述的技术方案和解决的技术问题，请从以下几方面分析本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：
第一、针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，紧密结合本发明的所要保护的技术方案以及研发过程中结果和数据等，详细、深刻地分析本发明技术方案如何解决的技术问题，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下：
本发明通过将不同的抗体与SpyCatcher进行融合，将不同的功能蛋白与SpyTag进行融合，这样分别融合也避免了因抗体与Tn5在折叠过程中相互影响而导致酶活丧失；利用SpyTag与SpyCatcher可以在自然条件下共价结合的特性间接将抗体与功能蛋白进行“融合”，在做不同的实验时只需将SpyTag与SpyCatcher进行两两组合孵育即可得到不同实验所需的蛋白。
本发明开发了一种多任务工具包用于染色质分析，即利用SpyTag&SpyCatcher系统，该系统源自于化脓性链球菌，该菌体内有一种结构域CnaB2，在生理条件下可以自发形成稳定的赖氨酸－天冬氨酸肽键，且在各种条件下都表现出极高的稳定性(MarkHowarth2011PNAS)。目前在很多期刊上都已有该技术的报道，其在酶工程，成像，免疫，疫苗工程以及材料方面都有广泛的应用，但在染色质方面的研究却非常少。本发明将Tn5转座酶和抗体分别连接上SpyTag和SpyCatcher，通过SpyTag和SpyCatcher之间的互作将转座酶Tn5与抗体进行间接“融合”，以此达到与抗体－Tn5融合蛋白相同的目的。
本发明本着提高实验效率，在尽量短的时间内得到更多的带有不同抗体的融合蛋白。目前没有一种技术在蛋白水平上将抗体与功能蛋白进行融合，都是先进行分子克隆，得到相应的质粒，一种质粒对应一种蛋白，而本发明所做的是在蛋白水平上通过蛋白之间的互作融合抗体和功能蛋白。当需要多种抗体和功能蛋白融合时，这种方法大大缩短了时间，提高了实验效率。在实验室前期的实验基础上本发明得出并不是所有的抗体和功能蛋白的融合蛋白都有其活性，针对这一问题，本发明利用已有的SpyTag&SpyCatcher系统，将其应用扩大化，可以在不同的实验中利用该系统，将融合蛋白这一原本繁琐并且活性不稳定的方式变得更高效更稳定。
1.通过SpyTag SpyCatcher将抗体与功能蛋白进行快速“融合”，且在“融合”过程中不影响他们的活性。
2.将抗体与Tn5融合后可以得到与单纯Tn5一致的活性，同时可以用于蛋白质与染色质互作的研究，如ATAC-seq，ChIPmentation，CUT&Tag等。
3.本发明还可将抗体与微球菌核酸酶(MNase)融合，用于CUT&RUN实验。
4.将SpyCatcher与感兴趣的蛋白融合，SpyTag与GFP融合，用作示踪、成像技术。
5.SpyTag&SpyCatcher系统可以使结合后的蛋白变得异常稳定，所以，除了可以在以上所说的实验中发挥作用外，该系统还可应用在疫苗工程，免疫，酶工程，以及材料科学中。
第二，把技术方案看做一个整体或者从产品的角度，本发明所要保护的技术方案具备的技术效果和优点，具体描述如下：
目前通过查阅资料，还没有利用本发明进行染色质分析的技术，而传统方法得到不同的抗体－功能蛋白的融合蛋白需要分别构建这些质粒，再进行原核表达，但如果利用本方法，则只需要纯化几种抗体和功能蛋白，纯化后进行两两组合即可得到更多的融合蛋白。例如，当需要5种抗体(ALFA，BC2，GP41，Syn2,1170)和4种功能蛋白(Tn5，MNase，GFP，HRP)他们分别融合表达时需要构建20个质粒，纯化20种蛋白，但用SpyTag&SpyCatcher系统时只需纯化5种抗体融合SpyCatcher和4种功能蛋白融合SpyTag，共9个蛋白，使用时只需将抗体和功能蛋白混合孵育，利用SpyTag和SpyCatcher可以快速形成共价键这个特性，即可直接得到新蛋白。
第三，作为本发明的权利要求的创造性辅助证据，还体现在以下几个重要方面：
(1)本发明的技术方案填补了国内外业内技术空白：
目前该系统在酶工程，成像，免疫，疫苗工程以及材料方面都有广泛的应用，但在染色质方面的研究却非常少。本发明利用SpyTag&SpyCatcher系统两配体可以自发形成共价键的特性，将该系统用于CUT&Tag，CUT&RUN，ChIPmentation等方法进行染色质研究，其目的可使实验对抗体的需求变少，同时可以缩短实验时间。
(2)本发明的技术方案是否解决了人们一直渴望解决、但始终未能获得成功的技术难题：
对于蛋白质研究来说，其中非常重要的一部分就是抗体，抗体的质量直接影响实验结果，这也是大多数实验室共同的问题，利用本发明即可做到无抗体进行蛋白质研究，大大节省了实验成本，并且该系统非常成熟稳定。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的用于染色质分析的多任务工具包的制备方法流程图；
图2是本发明实施例提供的SpyTag&SpyCatcher结合验证示意图；
图3是本发明实施例提供的采用同样的孵育方式进行结合的示意图；
图4是本发明实施例提供的复合体Tn5活性示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于染色质分析的多任务工具包及其制备方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
一、解释说明实施例。为了使本领域技术人员充分了解本发明如何具体实现，该部分是对权利要求技术方案进行展开说明的解释说明实施例。
如图1所示，本发明实施例提供的用于染色质分析的多任务工具包的制备方法包括以下步骤：
S101，分子克隆：分别得到SpyTag与Tn5，SpyCatcher与抗体的融合蛋白质粒；
S102，原核表达纯化：将构建好的质粒进行一代测序，测序正确的质粒通过BL21(DE3)感受态进行转化以及蛋白纯化。
作为优选实施例，本发明实施例提供的用于染色质分析的多任务工具包的制备方法具体包括以下步骤：
1.分子克隆：
要利用SpyTag和SpyCatcher得到抗体与Tn5的融合，必须分别得到SpyTag与Tn5，SpyCatcher与抗体的融合蛋白，通过查阅文献得到蛋白或DNA序列，本发明利用实验室已有的pET28原核表达载体作为骨架，骨架带有MBP和His标签用于纯化，将SpyTag Tn5和SpyCatcher ALFA通过无缝克隆连接在载体上。质粒结构及序列如下：
质粒结构：pET28-SpyTag3-Tn5-CBD-6His
pET28-6His-MBP-TEV-spyCatcher3-ALFA
pET28-SpyTag3-GFP-CBD-6His
SpyTag序列(见SEQ ID NO：1)：
RGVPHIVMVDAYKRYK
SpyCatcher序列(见SEQ ID NO：2)：
MVTTLSGLSGEQGPSGDMTTEEDSATHIKFSKRDEDGRELAGATMELRDSSGKTISTWISDGHVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATPIEFTVNEDGQVTVDGEATEGDAHTGS
EGFP序列(见SEQ ID NO：3)：
MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK
抗体序列(ALFA)(见SEQ ID NO：4)：
QLQESGGGLVQPGGSLRLSCTASGVTISALNAMAMGWYRQAPGERRVMVAAVSERGNAMYRESVQGRFTVTRDFTNKMVSLQMDNLKPEDTAVYYCHVLEDRVDSFHDYWGQGTQVT
Tn5序列(见SEQ ID NO：5)：
MITSALHRAADWAKSVFSSAALGDPRRTARLVNVAAQLAKYSGKSITISSEGSKAMQEGAYRFIRNPNVSAEAIRKAGAMQTVKLAQEFPELLAIEDTTSLSYRHQVAEELGKLGSIQDKSRGWWVHSVLLLEATTFRTVGLLHQEWWMRPDDPADADEKESGKWLAAAATSRLRMGSMMSNVIAVCDREADIHAYLQDKLAHNERFVVRSKHPRKDVESGLYLYDHLKNQPELGGYQISIPQKGVVDKRGKRKNRPARKASLSLRSGRITLKQGNITLNAVLAEEINPPKGETPLKWLLLTSEPVESLAQALRVIDIYTHRWRIEEFHKAWKTGAGAERQRMEEPDNLERMVSILSFVAVRLLQLRESFTPPQALRAQGLLKEAEHVESQSAETVLTPDECQLLGYLDKGKRKRKEKAGSLQWAYMAIARLGGFMDSKRTGIASWGALWEGWEALQSKLDGFLAAKDLMAQGIKI
MBP标签序列(见SEQ ID NO：6)：
KIEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATGDGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSALMFNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSNIDTSKVNYGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELAKDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEALKDAQT
构建质粒进行一代测序，将正确的质粒进行原核表达纯化。
2.原核表达纯化
将测序正确的质粒通过BL21(DE3)感受态进行转化，涂于Kana平板37℃生长12h，第二天挑取单克隆至10ml Kana培养基中，220rpm37℃培养7小时左右，将菌液扩大培养至500ml LB Kana培养基培养约3～4h，待菌液生长到OD≈0.7时加入终浓度0.5mM的IPTG 15℃220rpm诱导16h后跑胶验证。
蛋白纯化：将诱导完成的菌液10000g离心20min得到菌体，利用MBP Lysis buffer(20mM Tris-HCl pH8.0，200mM NaCl，1mM EDTA)将菌体充分重悬，利用高压均质机4℃条件下将菌体充分裂解，随后20000G离心20min收集上清，加入终浓度0.1％的PEI充分混匀，此时上清液中产生乳白色沉淀，静置10min充分螯合核酸，再次20000G离心20min，此时上清中是不含核酸的蛋白粗液，将上清液与提前用20倍柱MBP Lysis Buffer平衡的MBP填料(天地人和)进行孵育，使带标签的目的蛋白与填料特异性结合30～60min。结合完毕过层析柱将未结合的蛋白流出层析柱并收集流穿液，填料留在柱内，随后利用Wash Buffer(20mMTris-HCl pH8.0，200mM NaCl，1mM EDTA)对填料进行约50倍柱的洗杂处理，将体系中的杂蛋白随着流穿液洗掉，留在填料上的就是包含MBP标签的目的蛋白，最后用ElutionBuffer(20mM Tris-HCl pH8.0，200mM Nacl，1mM EDTA，10mM Maltose)将目的蛋白进行洗脱，为防止洗脱体积过大导致蛋白浓度变稀，可以少量多次进行洗脱，最后进行SDS-PAGE电泳验证，若体系中其他杂蛋白仍旧很多，则可利用Ni柱进行二次纯化，尽量得到单一的目的蛋白，免受体系中其他杂蛋白的影响。(操作与MBP纯化一致，Buffer成分如下：Wash/Load Buffer：50mM Tris-HCl pH8.0，300mM NaCl，20mM咪唑，0.1％triton x-100，10％甘油；EluteBuffer：50mM Tris-HCl pH8.0，300mM NaCl，250mM咪唑，0.1％triton x-100，10％甘油)
将得到的高浓度SpyTag和SpyCatcher进行4℃孵育〉10min即可得到SpyTag与SpyCatcher的结合产物(见图2)。
通过图2可以看出，SpyTag和SpyCatcher结合效率非常高，而连接了GFP的SpyTag接上相应抗体的Tag(抗原)序列，后续可以用来成像示踪。
同时，为了解决本发明Tn5建库活性的问题，本发明将上一个结果中的GFP换成本发明的目的蛋白Tn5，采用同样的孵育方式进行结合(见图3)。
结果发现SpyTag Tn5&SpyCatcher ALFA的结合与SpyTag GFP&SpyCatcher ALFA的结合效率相同，接着本发明为了验证复合体的活性，将结合后的蛋白与结合前的单纯SpyTag Tn5同时进行活性检测，结果如图4所示。
图4中，箭头所指条带表示在该浓度下进行实验，图4(b)为各种蛋白的酶切情况，可以得出结论，SpyTag和SpyCatcher结合后复合体与单纯的SpyTag Tn5同浓度下的活性基本一致，没有影响Tn5的建库活性。
二、应用实施例。为了证明本发明的技术方案的创造性和技术价值，该部分是对权利要求技术方案进行具体产品上或相关技术上的应用实施例。
本发明主要是为染色质研究而开发的方法，利用SpyTag和SpyCatcher自发结合这种类似抗体识别抗原的特性，我们可以将SpyTag与Tn5融合，SpyCatcher与抗体融合，根据CUT&Tag实验的原理，利用这种方式做到原位CUT&Tag且不需要额外在细胞上孵育抗体，甚至可以在一个样本上完成多个蛋白的CUT&Tag；同时我们还可以将SpyCatcher偶联在羧基磁珠上，将SpyTag与目标蛋白融合，转染后可以实现ChIPmentation，利用SpyCatcher-Beads复合体作为固相载体IP拉下SpyTag－目标蛋白；将SpyTag与GFP(或其他荧光蛋白)融合，将SpyCatcher与其他任意蛋白融合，可以实现免疫荧光。总之，该方法可以代替一切与抗体相关的生化实验，避免了因抗体质量问题从而导致实验失败，节省实验时间。
三、实施例相关效果的证据。本发明实施例在研发或者使用过程中取得了一些积极效果，和现有技术相比的确具备很大的优势，下面内容结合试验过程的数据、图表等进行描述。
ChIPmentation作为一种染色质研究的方法，其主要原理是将细胞先利用超声破碎，将基因组DNA打断成200-500bp的片段，目的蛋白与DNA的复合体应该在上清中，通过一抗二抗的作用放大目的蛋白的信号。同时利用PG/PA Dynabeads(Bio-RAD)将目的蛋白拉下，再利用Tn5进行酶切，逆交联后纯化即可得到目的序列，之后建库测序即可得到该蛋白的富集信息。
利用SpyTag&SpyCatcher系统即可将实验进行简化，我们可以自行将SpyCatcher偶联在羧基磁珠上，随后将“荧光蛋白－SpyTag－目的蛋白”这个融合质粒转染入细胞中，当荧光在80％左右时即可开始实验，首先利用超声打断，然后利用SpyTag SpyCatcher自发结合的性质直接将目的蛋白拉下，之后Tn5酶切建库测序。这样改进实验之后，使整个过程不需要抗体放大信号，因为SpyTag和SpyCatcher的结合特异性非常强，并且在各种甚至极端条件下也可以结合，所以完全可以利用该系统进行ChIPmentation实验。
同样，也可以利用该系统进行CUT&Tag，CUT&RUN等实验，基本原理一致，都是利用SpyTag和SpyCatcher的这种特异性共价结合来达到与抗体孵育相同的目的，并且这种方法高效且稳定，几乎适用于所有蛋白质互作的研究。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
<110> 申请人的姓名或名称李昊峻（是该专利申请的所有申请人的姓名或名称。外国申请人还应当在中文译名之后注明英文姓名或名称，并将其用圆括号括起来）
<120>一种用于染色质分析的多任务工具包及其制备方法
<160>7
<210>1
<211>48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400>1
cgtggagtgcctcatatcgtgatggtggacgcctacaagcgttacaag
<210>2
<211>348
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Claims (10)

1.一种用于染色质分析的多任务工具包的制备方法，其特征在于，所述用于染色质分析的多任务工具包的制备方法包括：
将Tn5转座酶和抗体分别连接SpyTag和SpyCatcher，通过SpyTag和SpyCatcher之间的相互作用将转座酶Tn5与抗体进行间接融合。
2.如权利要求1所述用于染色质分析的多任务工具包的制备方法，其特征在于，所述用于染色质分析的多任务工具包的制备方法还包括：
利用SpyTag&SpyCatcher系统，将不同的抗体与SpyCatcher进行融合，将不同的功能蛋白与SpyTag进行融合，制得用于染色质分析的多任务工具包。
3.如权利要求1所述用于染色质分析的多任务工具包的制备方法，其特征在于，所述用于染色质分析的多任务工具包的制备方法包括以下步骤：
步骤一，分子克隆：分别得到SpyTag与Tn5，SpyCatcher与抗体的融合蛋白，利用SpyTag和SpyCatcher得到抗体与Tn5的融合；
步骤二，原核表达纯化：构建质粒进行一代测序，将测序正确的质粒通过BL21(DE3)感受态进行转化以及蛋白纯化。
4.如权利要求3所述用于染色质分析的多任务工具包的制备方法，其特征在于，所述步骤一中的分子克隆包括：
利用实验室中的pET28原核表达载体作为骨架，骨架带有MBP和His标签用于纯化，将SpyTag Tn5和SpyCatcher ALFA通过无缝克隆连接在载体上。
5.如权利要求4所述用于染色质分析的多任务工具包的制备方法，其特征在于，所述质粒结构如下：
pET28-SpyTag3-Tn5-CBD-6His；
pET28-6His-MBP-TEV-spyCatcher3-ALFA；
pET28-SpyTag3-GFP-CBD-6His。
6.如权利要求4所述用于染色质分析的多任务工具包的制备方法，其特征在于，所述SpyTag序列为SEQ ID NO：1；SpyCatcher序列为SEQ ID NO：2；EGFP序列为SEQ ID NO：3；抗体序列为SEQ ID NO：4；Tn5序列为SEQ ID NO：5；MBP标签序列为SEQ ID NO：6；His标签序列为SEQ ID NO：7。
7.如权利要求3所述用于染色质分析的多任务工具包的制备方法，其特征在于，所述步骤二中的将测序正确的质粒进行转化包括：
将测序正确的质粒通过BL21(DE3)感受态进行转化，涂于Kana平板37℃生长12h，第二天挑取单克隆至10ml Kana培养基中，220rpm37℃培养7h；将菌液扩大培养至500ml LBKana培养基培养3～4h，待菌液生长到OD≈0.7时加入终浓度0.5mM的IPTG 15℃220rpm诱导16h后跑胶验证。
8.如权利要求3所述用于染色质分析的多任务工具包的制备方法，其特征在于，所述步骤二中的蛋白纯化包括：
将诱导完成的菌液10000g离心20min得到菌体，利用MBP Lysis buffer将菌体充分重悬，利用高压均质机4℃条件下将菌体充分裂解；20000G离心20min收集上清，加入终浓度0.1％的PEI充分混匀，上清液中产生乳白色沉淀，静置10min充分螯合核酸，再次20000G离心20min，上清中是不含核酸的蛋白粗液；将上清液与提前用20倍柱MBP Lysis Buffer平衡的MBP填料进行孵育，使带标签的目的蛋白与填料特异性结合30～60min；
结合完毕过层析柱将未结合的蛋白流出层析柱并收集流穿液，填料留在柱内，利用Wash Buffer对填料进行约50倍柱的洗杂处理，将体系中的杂蛋白随着流穿液洗掉，留在填料上的就是包含MBP标签的目的蛋白；用Elution Buffer将目的蛋白进行少量多次洗脱后，进行SDS-PAGE电泳验证，若体系中其他杂蛋白仍旧很多，则利用Ni柱进行二次纯化；将得到的高浓度SpyTag和SpyCatcher进行4℃孵育〉10min，得到SpyTag与SpyCatcher的结合产物。
9.如权利要求8所述用于染色质分析的多任务工具包的制备方法，其特征在于，所述MBP Lysis buffer包括20mM Tris-HCl pH8.0，200mM NaCl，1mM EDTA；
所述WashBuffer包括20mM Tris-HCl pH8.0，200mM NaCl，1mM EDTA；
所述Elution Buffer包括20mM Tris-HCl pH8.0，200mM Nacl，1mM EDTA，10mMMaltose；
所述Buffer成分如下：Wash/Load Buffer：50mM Tris-HCl pH8.0，300mM NaCl，20mM咪唑，0.1％tritonx-100，10％甘油；Elute Buffer：50mM Tris-HClpH8.0，300mM NaCl，250mM咪唑，0.1％triton x-100，10％甘油。
10.一种实施如权利要求1～9任意一项所述用于染色质分析的多任务工具包的制备方法制备得到的用于染色质分析的多任务工具包。
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