CN114990003A

CN114990003A - 一种防治香蕉枯萎病的微生物菌剂及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN114990003A
Application number: CN202210400089.5A
Authority: CN
Inventors: 段雅婕; 庞振才; 胡会刚; 胡玉林; 孙德权; 李伟明; 谢江辉
Original assignee: South Subtropical Crops Research Institute CATAS
Current assignee: South Subtropical Crops Research Institute CATAS
Priority date: 2022-04-15
Filing date: 2022-04-15
Publication date: 2022-09-02
Anticipated expiration: 2042-04-15
Also published as: CN114990003B

Abstract

本发明属于微生物领域，具体涉及一种防治香蕉枯萎病的微生物菌剂、其制备方法和应用。本发明的所述的生防菌制剂，将各菌剂复配使用，对香蕉枯萎病菌4号小种的拮抗作用显著增强。采用本发明所述的防治方法，将本发明所述的生防菌制剂施用到土壤中后，能够有效防治蕉园中香蕉枯萎病的发生和扩展，在香蕉枯萎病的防治中具有广阔的发展空间，具有很好的开发应用前景。

Description

一种防治香蕉枯萎病的微生物菌剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一种防治香蕉枯萎病的微生物菌剂、其制备方法和应用。

背景技术

香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)引起的维管束堵塞造成的萎蔫病害，常常会给香蕉种植园带来毁灭性的伤害。目前还没有理想的化学药剂和优质的抗病品种问世。随着微生物防治方法的兴起，越来越多的具有抗香蕉枯萎病的生防菌被分离筛选出来。

但是单一的生防菌菌株对于香蕉枯萎病的防治常常存在局限性，特别是在香蕉幼苗移栽大田之后，难以实现理想的防治效果。因此，研发在大田中有效防治香蕉枯萎的生防菌制剂是有效防治香蕉枯萎病的重要途径。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种微生物菌剂及其制备方法，在香蕉幼苗移栽到大田后使用，可以增强香蕉幼苗对于香蕉枯萎病的抗性，减少香蕉枯萎病的发生，提高香蕉产量。

一种生防菌制剂，按照活菌数计，包括以下组分：冠霉素链霉菌s-24 10-20份，枯草芽孢杆菌1-15份，哈茨木霉0.5-2份，根瘤菌0.1-1份；所述的冠霉素链霉菌s-24 保藏编号为CCTCC No：M 2017353。

进一步，所述的生防菌制剂，按照活菌数计，包括以下组分：冠霉素链霉菌s-24 15份，枯草芽孢杆菌10份，哈茨木霉1份，根瘤菌0.5份。

进一步，所述的生防菌制剂中，活菌总数≥10⁸cfu/mL。

一种生防菌制剂的制备方法，包括以下步骤：

取配方量的冠霉素链霉菌s-24、枯草芽孢杆菌、哈茨木霉和根瘤菌的菌粉，混匀即得。

一种防治香蕉枯萎病的复合菌剂，其含有上述的生防菌制剂。

以上所述的生防菌制剂或者复合菌剂在制备抑制香蕉枯萎病病原菌制剂中的应用。

以上所述的生防菌制剂或者复合菌剂在制备抑制香蕉枯萎病病原菌所导致的病害的制剂中的应用。

一种香蕉枯萎病的防治方法，采用上述生防菌制剂或者复合菌剂，加水混匀后，先连续3天淋根处理；之后每隔15-20天施用一次，淋根或者在靠近香蕉植株的地面喷施。

进一步，所述的生防菌制剂或者复合菌剂，加水至总菌株浓度10⁴-10⁶cfu/mL的溶液施用。

进一步，淋根或者靠近香蕉植株地面喷施，每株用量为500-800mL。

本发明的所述的生防菌制剂，将各菌剂复配使用，对香蕉枯萎病菌4号小种的拮抗作用显著增强。采用本发明所述的防治方法，将本发明所述的生防菌制剂施用到土壤中后，能够有效防治蕉园中香蕉枯萎病的发生和扩展，在香蕉枯萎病的防治中具有广阔的发展空间，具有很好的开发应用前景。

附图说明

图1为为基于16S rDNA序列构建的菌株s-24与相关菌株的系统发育树

图2为不同菌剂对香蕉枯萎病的拮抗效果，其中a为香蕉枯萎病菌4号生理小种，A1-A4分别为4个实施例组菌液，B为对照组1菌液，C为对照组2菌液，D 为对照组3菌液，E为对照组4菌液。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。

本发明所述的冠霉素链霉菌s-24(Streptomyces Chrestomyceticus s-24)，是从生长良好的蕉园土壤中分离得到。选用细菌16S rDNA通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)，1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′) 建立PCR扩增体系进行扩增(PCR反应体系和反应条件见表1-2)。产物经纯化后测定基因序列；采用GenBank搜索序列相似性，选取相似性较高的模式菌株序列，用MEGA5.0中Neighbor-Joining法比较同源性，构建系统发育树图1所示。结果表明，该菌株为冠霉素链霉菌(StreptomycesChrestomyceticus)，命名为冠霉素链霉菌s-24 (Streptomyces Chrestomyceticus s-24)，保藏编号为CCTCC NO：M 2017353，保藏日期为2017年6月19日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址在中国武汉的武汉大学。

实施例1

一种生防菌制剂，按照活菌数计，包括以下组分：冠霉素链霉菌s-24 10份，枯草芽孢杆菌1份，哈茨木霉0.5份，根瘤菌0.1份；所述的生防菌制剂中，活菌总数为10⁸cfu/g。

一种生防菌制剂的制备方法，包括以下步骤：

实施例2

一种生防菌制剂，按照活菌数计，包括以下组分：冠霉素链霉菌s-24 20份，枯草芽孢杆菌15份，哈茨木霉2份，根瘤菌1份；所述的生防菌制剂中，活菌总数为 10⁹cfu/mL。

一种生防菌制剂的制备方法，包括以下步骤：

实施例3

一种生防菌制剂，按照活菌数计，包括以下组分：冠霉素链霉菌s-24 15份，枯草芽孢杆菌10份，哈茨木霉1.5份，根瘤菌0.5份；所述的生防菌制剂中，活菌总数为10¹²cfu/mL。

一种生防菌制剂的制备方法，包括以下步骤：

实施例4

一种生防菌制剂，按照活菌数计，包括以下组分：冠霉素链霉菌s-24 10份，枯草芽孢杆菌10份，哈茨木霉0.5份，根瘤菌0.1份；所述的生防菌制剂中，活菌总数为10¹⁰cfu/mL。

一种生防菌制剂的制备方法，包括以下步骤：

实施例5

一种香蕉枯萎病的防治方法，采用实施例1-3任一项所述的生防菌制剂，加水混匀后，先连续3天淋根处理；之后每隔15-20天施用一次，淋根或者在靠近香蕉植株的地面喷施。淋根或者靠近香蕉植株地面喷施，每株用量为500-800mL。所述的生防菌制剂加水至总菌株浓度10⁴-10⁶cfu/mL的溶液后施用。

一、本发明所述的生防菌制剂拮抗活性评价

分别按照表1的配方分别配制不同组合方式的菌剂。

表1菌剂的组成及各组分比例

将不同组合的复合菌剂分别加水稀释至总活菌数10⁶cfu/mL。分别在直径为 10cm的PDA培养基四周接入不同的复合菌剂(采用直径为5mm的孔接入菌液)，以不接拮抗菌的平板为对照。平板中央接入直径

为5mm的香蕉枯萎病菌4号生理小种(Fusariumoxysporumf.sp.cubense Snyder&Hansen，简称为Foc4)的菌丝块，28℃对峙培养7天，测量抑菌带的宽度，每次处理三个重复。

表2不同菌剂对香蕉枯萎病的拮抗效果比较

处理组	抑菌带宽度(mm)
		实施例1	10.1
实施例2	9.7
		实施例3	9.8
实施例4	10.2
		对照组1	6.5
对照组2	7.1
		对照组3	7.3
对照组4	8.1

从表2可知，4个实施例组对Foc4均有不同程度的拮抗效果，并且4个实施例组的拮抗效果要明显高于4个对照组。说明本发明所述的生防菌制剂通过组合配伍，对Foc4抑制效果显著增强，显著高于4个对照组。

二、本发明所述的生防菌制剂对香蕉枯萎病的活性评价

(一)对香蕉植株不同生长时期香蕉枯萎病的防控效果

活化后的FOC4病原菌接种到YPD液体培养基里28℃，165rad/min振荡培养 3d；无菌水稀释至孢子浓度为10⁵cfu/mL的病原菌孢子悬浮液。

按照香蕉生长的不同时期，分批次在未检测出香蕉枯萎病的地块选择生长状态相似的香蕉植株，每株浇灌病原菌孢子悬浮液100mL接种香蕉枯萎病病菌。接种时间分别选择香蕉幼苗定植到田里之后一周、定植一周之后过一个月、定植一周之后两个月。接种之后，立即施用表1所述的配比不同的菌剂，定植一周时，每株施用 500mL菌剂，定植一周+一个月时，每株施用600mL菌剂，定植一周+两个月时，每株施用800mL菌剂。使用时，将上述制得的生防菌制剂加水稀释至总菌株浓度 10⁵cfu/mL的溶液，以施用清水作为对照组5。上述处理组参考实施例5的防治方法进行操作，即先连续3天淋根；15天后，再对香蕉植株进行淋根，之后每隔15天淋根一次。对照组6不进行连续3天淋根处理，只每间隔15天淋一次菌剂；对照组 7只进行连续3天淋根处理，之后不做任何处理。对照组6和对照组7均采用实施例3的菌剂。各处理组统一进行常规的田间管理。处理之后，从喷施菌剂当天开始计算，分别在不同时间观察香蕉枯萎病的发病情况，比较不同处理方法对于香蕉枯萎防治效果的影响。具体见表4-6。

病情指数分级标准参考下表。

表3病情指数分级情况

表4不同处理方法对香蕉植株病情指数的影响(第一次接种)

处理组	第0天	第15天	第30天	第45天	第60天	第75天
							实施例1	0	0.83	2.50	4.17	5.83	7.50
实施例2	0	0.00	2.50	3.33	5.83	8.33
							实施例3	0	1.67	2.50	3.33	5.00	7.50
实施例4	0	0.83	2.50	3.33	4.17	5.83
							对照组1	0	4.17	10.83	16.67	27.50	41.67
对照组2	0	4.17	12.50	19.92	26.67	39.17
							对照组3	0	5.00	10.83	17.50	25.83	30.83
对照组4	0	5.83	10.00	21.67	26.67	35.83
							对照组5	0	18.33	26.67	31.67	37.50	49.17
对照组6	0	14.17	12.50	25.00	25.83	29.17
							对照组7	0	5.83	13.33	22.50	40.00	45.83

表5不同处理方法对香蕉植株病情指数的影响(第二次接种)

处理组	第0天	第15天	第30天	第45天	第60天	第75天
							实施例1	0	0.00	2.50	3.33	5.00	5.83
实施例2	0	0.83	0.83	2.50	3.33	6.67
							实施例3	0	0.00	0.83	3.33	4.17	5.83
实施例4	0	0.83	1.67	2.50	4.17	5.00
							对照组1	0	5.00	15.00	15.83	26.67	35.83
对照组2	0	5.00	15.83	18.33	28.33	35.83
							对照组3	0	7.50	13.33	20.00	30.00	34.17
对照组4	0	7.50	12.50	21.67	25.83	37.50
							对照组5	0	15.83	25.83	37.50	40.83	47.50
对照组6	0	11.67	15.83	22.50	30.00	31.67
							对照组7	0	6.67	15.83	20.83	39.17	44.17

表6不同处理方法对香蕉植株病情指数的影响(第三次接种)

由表4-6可以看出，采用本发明4个实施例的菌剂，先连续3天喷施地面，1-2 天后，再进行灌根，可以显著防治香蕉枯萎病的发生。直至第75天，香蕉枯萎病的病情指数最高为8.33，最低的为5.00，明显低于各个对照组。

相对于对照组5(清水处理组)，对照组1-4虽然病情指数也有不同程度的降低，但是仍高于实施例1-4，说明本发明4个实施例中的成分通过组合配比，对香蕉枯萎病的防控效果明显提高。

对照组6和对照组7虽然也采用了实施例3的菌剂，但是由于使用方法和本发明并不相同，香蕉枯萎病的病情指数明显提高，明显高于4个实施例组，而且随着时间的延长，防治效果越差。说明本发明采用先连续喷施菌剂、再重复喷施菌剂的使用方法，可以显著提升菌剂的作用效果，对香蕉枯萎病的防治效果明显提升。

此外，对比表4-6数据发现，在香蕉定植之后一周时，施用本发明所述的菌剂，第75天时香蕉枯萎病的发病率低于定植(一周+一个月)和定植(一周+两个月)。因此，在香蕉栽培过程中，在香蕉幼苗定植一周后，施用本发明所述的菌剂，防治效果最好。

(二)本发明所述的生防菌制剂连续使用对香蕉枯萎病的防治效果

选择尚未出现香蕉枯萎病、位置相近、生产条件相近香蕉种植园，选取生长环境相似、面积相同的区域，分别按照表1的配比配制不同的菌剂。将上述制得的生防菌制剂加水稀释至总菌株浓度10⁵cfu/mL的溶液，以施用清水作为对照组5，上述处理组参考实施例5的防治方法进行操作，即先连续3天淋根；之后每隔15-20天淋根一次。对照组6不进行连续3天淋根处理，只每间隔15-20天淋一次菌剂；对照组7只进行连续3天淋根处理，之后不做任何处理。对照组6和对照组7均采用实施例3的菌剂。在香蕉定植一周后，分别按照上述方法和配比施用菌剂，各处理组统一进行常规的田间管理。连续种植3年，统计各处理组香蕉枯萎病的发病率。每个处理100株香蕉植株。其结果如表3所示。

发病率(％)＝发病植株数/处理总植株数x100％

表7不同处理方法对香蕉枯萎病发病率(％)的影响

由表7可见，连续种植3年，本发明4个实施例的菌剂和防控方法，香蕉枯萎病的发病率均保持在极低的水平。对照组1-4中，虽然采用了和本发明实施例组相同的防控方法，但是由于菌剂的组成与实施例组不同，香蕉枯萎病的发病率相对于清水处理组有不同程度的降低，但是仍明显高于个各实施例组。尤其是第3年，对照组1-4发病率显著增加，均超过了40％。而4个实施例组，第3年发病率最高仅为6％，仍低于10％。对照组6和7虽然采用了实施例3的菌剂，但是采用了不同的防控方法，虽然第1年香蕉枯萎病发病率低于10％，但是第2年和第3年香蕉枯萎病的发生率仍明显增加，对照组6由16％升高到39％，对照组3由22％升高到42％，发病率虽然低于对照组1-4，但是仍远远高于实施例1-4。以上实验结果说明，本申请4个实施例中所述的菌剂和本发明所述的防治方法，可以有效防治香蕉枯萎病的发生，二者结合使用，香蕉枯萎病的防治效果显著增加。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims

1.一种生防菌制剂，其特征在于，按照活菌数计，包括以下组分：冠霉素链霉菌s-2410-20份，枯草芽孢杆菌1-15份，哈茨木霉0.5-2份，根瘤菌0.1-1份；所述的冠霉素链霉菌s-24保藏编号为CCTCC No：M 2017353。

2.如权利要求1所述的一种生防菌制剂，其特征在于，所述的生防菌制剂，按照活菌数计，包括以下组分：冠霉素链霉菌s-24 15份，枯草芽孢杆菌10份，哈茨木霉1份，根瘤菌0.5份。

3.如权利要求1所述的一种生防菌制剂，其特征在于，所述的生防菌制剂中，活菌总数≥10⁸cfu/mL。

4.如权利要求1-3任一项所述的一种生防菌制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.一种防治香蕉枯萎病的复合菌剂，其含有权利要求1-3任一项所述的生防菌制剂。

6.如权利要求1-3任一项所述的生防菌制剂或者权利要求5所述的复合菌剂在制备抑制香蕉枯萎病病原菌制剂中的应用。

7.如权利要求1-3任一项所述的生防菌制剂或者权利要求5所述的复合菌剂在制备抑制香蕉枯萎病病原菌所导致的病害的制剂中的应用。

8.一种香蕉枯萎病的防治方法，其特征在于，采用权利要求1-3任一项所述的生防菌制剂或者权利要求5所述的复合菌剂，加水混匀后，先连续3天淋根处理；之后每隔15-20天施用一次，淋根或者在靠近香蕉植株的地面喷施。

9.如权利要求8所述的一种香蕉枯萎病的防治方法，其特征在于，所述的生防菌制剂或者复合菌剂，加水至总菌株浓度10⁴-10⁶cfu/mL的溶液施用。

10.如权利要求8所述的一种香蕉枯萎病的防治方法，其特征在于，淋根或者靠近香蕉植株地面喷施，每株用量为500-800mL。