CN114982781A

CN114982781A - 一种PEI-MXene QD纳米颗粒及其在提高植物黄萎病抗性中的应用

Info

Publication number: CN114982781A
Application number: CN202210635977.5A
Authority: CN
Inventors: 吴洪洪; 李召虎; 李佳玥; 邱萍; 朱龙付; 邵健敏
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2022-06-07
Filing date: 2022-06-07
Publication date: 2022-09-02
Anticipated expiration: 2042-06-07
Also published as: CN114982781B

Abstract

本发明涉及纳米材料技术领域，公开了一种PEI‑MXene QD纳米颗粒，包括以下制备方法：将Ti₃C₂ MXene粉末和聚乙烯亚胺溶于水中，在110~130℃下反应7~9 h，反应后的液体离心，取上清液用透析袋透析，冷冻干燥即得。本发明制得的PEI‑MXene QD纳米颗粒，可以有效抑制黄萎病菌的生长，提高植株对黄萎病的抗性，制备简单、水溶性好、生物相容性好、无毒副作用。

Description

一种PEI-MXene QD纳米颗粒及其在提高植物黄萎病抗性中的应用

技术领域

本发明涉及纳米材料技术领域，尤其涉及一种PEI-MXene QD 纳米颗粒及其在提高植物黄萎病抗性中的应用。

背景技术

棉花是我国重要的经济作物之一，但其产量和品质受病虫害极为严重。在我国的大部分棉花生产区域，大丽轮枝菌是主要病菌，休眠时形成的微菌核能耐高温和低温，当外界环境温度合适时，又能形成有较强感病性的真菌形态。我国棉花黄萎病的发病面积近占全国种植面积的15％-20％，严重年份甚至可以达到50％之多，该病会导致产量、纤维品质的降低，有甚至会绝产。常用的农业防治措施有选育抗病品种、加强田间管理和持续化学防治，但是由于抗黄萎病的育种方法单一、选育周期长以及抗性不稳定等，而且大量使用化学用品会污染环境和危害人体健康，甚至还会诱导病原菌产生抗药性。近年生物防治和基因工程技术在一定程度上有效防治棉花黄萎病和提高棉花产，除此之外，各领域专家正在积极寻求其他防治方法有效抑制黄萎病的生长发育。

纳米技术是20世纪80年代末诞生并崛起的高科技。纳米材料是指在 1-100 nm具有物理、化学和生物特性的物质，由于其独特的尺寸效应，优良的物理化学性能、加工性能和生态性，纳米材料被广泛应用于生物医学和农业。在农业领域如：利用纳米材料缓释肥料可调节植物生长；使用各种纳米杀虫剂来防治植物病虫害。最近的研究结果表明，一些金属和金属氧化物纳米粒子在体外可以抑制病原菌的生长，在田间试验条件下对作物病害也表现出良好的防控效果。

在最近的纳米医学领域内，超薄原子层厚度的二维MXene表现出特殊的生物学效应（酶响应降解、细胞内吞、体内分布和代谢动力学等），且体内动物实验结果显示，表明其具有良好的体内生物安全性。专利CN111248224A公开了表面含有大量羧基官能团的二维MXene材料的Ti₃C₂T_x MXene量子点(MQDs)对枯草芽孢杆菌具有极强的抗菌性能。

发明内容

本发明提供了一种PEI-MXene QD 纳米颗粒，能够抑制黄萎病菌的生长，从而达到抗病的效果。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种PEI-MXene QD 纳米颗粒，包括以下制备方法：将Ti₃C₂ MXene粉末和聚乙烯亚胺溶于水中，在110~130℃下反应7~9 h，反应后的液体离心，取上清液用透析袋透析，得到PEI-MXene QD 纳米颗粒。

优选的，所述Ti₃C₂ MXene和聚乙烯亚胺的质量比为1~3：1。

优选的，所述离心为3000~8000rpm下离心3~10 min。

优选的，透析前，调整所述上清液的pH为6-8。

优选的，所述透析后的溶液进行冷冻干燥。

本发明还提供了上述PEI-MXene QD 纳米颗粒在提高植物黄萎病抗性中的应用。

具体的，将所述PEI-MXene QD 纳米颗粒与植株根部接触。

本发明还提供了一种提高植物黄萎病抗性的药剂，所述药剂的活性成分包括上述PEI-MXene QD 纳米颗粒，以及农药学上可接受的助剂。

优选的，所述PEI-MXene QD 纳米颗粒的有效作用浓度在25 mg/L以上。

优选的，所述药剂为根处理剂。

本发明的有益效果：

本发明提供了一种PEI-MXene QD纳米颗粒，可以有效抑制黄萎病菌的生长，提高植物抗黄萎病的能力。通过体外试验表明，本发明的PEI-MXene QD纳米颗粒能够抑制液体培养基和固体培养基中黄萎病菌的生长，分生孢子数明显减少，菌丝体生长减慢。经本发明PEI-MXene QD纳米颗粒处理棉花根部后，棉花黄萎病发病的病情指数显著下降，棉花植株叶片内·OH、·O^2-和H₂O₂的含量也显著降低。

本发明的PEI-MXene QD 纳米颗粒具有提高植株抗黄萎病的作用，具有价格低廉、制备简单、水溶性好、生物相容性好、无毒副作用等特点，使用方法简便，作用明显。

附图说明

图1为本发明PEI-MXene QD 纳米颗粒的TEM图像（左）和电位图（右），其中左图右上角的小图是PEI-MXene QD 纳米颗粒的晶格图片。

图2为PEI-MXene QD 纳米颗粒对黄萎病菌分生孢子的影响；其中A中，上为对照组，下为施用PEI-MXene QD 纳米颗粒的处理组。

图3为PEI-MXene QD 纳米颗粒对黄萎病菌菌丝体的影响；其中A中，左为对照组，右为施用PEI-MXene QD 纳米颗粒的处理组。

图4为PEI-MXene QD 纳米颗粒对棉花抗黄萎病鲜重的影响。

图5为PEI-MXene QD 纳米颗粒对棉花黄萎病病情指数的影响。

图6为PEI-MXene QD 纳米颗粒对棉花黄萎病的抗性表型；其中，上为对照组，下为施用PEI-MXene QD 纳米颗粒的处理组。

图7为PEI-MXene QD 纳米颗粒对棉花茎秆的恢培实验结果。

图8为PEI-MXene QD 纳米颗粒在棉花根部的共定位，左图为共聚焦图像，右图为共定位率。

图9为棉花叶片内H₂DCFDA、HPF和DHE的共聚焦图像和荧光强度。

具体实施方式

本发明提供了一种PEI-MXene QD 纳米颗粒，该量子点纳米颗粒的制备方法包括：将Ti₃C₂ MXene粉末和聚乙烯亚胺溶于水中，在110~130℃下反应7~9 h，反应后的液体离心，取上清液用透析袋透析，得到PEI-MXene QD 纳米颗粒。

本发明中，Ti₃C₂ MXene粉末和聚乙烯亚胺的质量比优选为1~3：1，更优选为2：1。作为一种实施方式，本发明聚乙烯亚胺与水的质量体积比为2~3：1。作为一种实施方式，本发明在上述混合溶液中充氮气5~10min，排除溶液中的氧气。

本发明将Ti₃C₂ MXene粉末和聚乙烯亚胺的混合溶液在110~130℃下反应7~9 h。优选反应在聚四氟乙烯反应釜中进行，反应温度优选为120℃，反应时间优选为8 h。反应后得到淡黄色溶液进行离心。本发明对离心的方式没有特殊限定，采用本领域中的常规离心方法即可。本发明优选离心速率为3000~8000rpm，更优选为4000~6000rpm；离心时间优选为3~10 min，更优选为5~6min。

离心后的上清液用透析袋透析，得到PEI-MXene QD 纳米颗粒。作为一种可实施的方式，透析前，调整所述上清液的pH为6~8，优选为7。本发明的透析袋采用常规透析袋，对透析袋的来源没有特殊限定。透析时间优选的为24~48h，间隔8~12 h换一次水。透析得到的溶液中含有PEI-MXene QD 纳米颗粒。为了便于使用和储存，将透析液冷冻干燥，得到PEI-MXene QD 纳米颗粒的粉末。

通过对本发明制备得到的PEI-MXene QD 纳米颗粒TEM图像中可以看到，本发明的PEI-MXene QD 纳米颗粒为粒径大约3-6 nm的纳米颗粒，PEI-MXene QD 纳米颗粒的晶格间距为0.267nm，符合对碳量子的普遍认知。本发明的PEI-MXene QD 纳米颗粒可以提高植物对黄萎病菌的抗性，避免黄萎病带来的损失。本发明的黄萎病菌包括大丽轮枝菌。

本发明还提供了一种提高植物黄萎病抗性的药剂，所述药剂的活性成分包括上述PEI-MXene QD 纳米颗粒，以及农药学上可接受的助剂。PEI-MXene QD 纳米颗粒的浓度越高，其提高植物对黄萎病抗性的效果越好。作为优选的，所述药剂中的PEI-MXene QD 纳米颗粒的有效作用浓度为25 mg/L以上，更优选为50-200mg/L。本发明对助剂的种类没有特别限定，本领域技术人员可根据药剂的剂型选择合适的助剂。药剂剂型可以为水分散剂、微乳剂、水乳剂、颗粒剂、包衣剂、乳油等剂型。助剂的种类可以为溶剂、润湿剂、分散剂、乳化剂、增效剂、稳定剂、缓释剂、渗透剂、粘着剂、消泡剂、防腐剂、防冻剂等。

本发明的上述药剂优选为根处理剂。将PEI-MXene QD 纳米颗粒制作成适合于根处理的剂型，与植株根部接触，提高植物对黄萎病的抗性能力。作为一种实施方式，可以制作成水分散剂、水乳剂或微乳剂，冲施于植株根部；或者制作成包衣缓释剂，待种子生根后直接保护植株免于黄萎病侵害。

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

以下实施例中的Ti₃C₂ MXene粉末购自吉林省科技有限公司，聚乙烯亚胺货号为Sigma MV 1800，本领域技术人员可自由选择材料来源。

以下实施例以棉花为例，说明PEI-MXene QD 纳米颗粒能够提高植株对黄萎病的抗性能力。

实施例1

本实施例提供一种PEI-MXene QD 纳米颗粒的制备方法。

将50 mg的Ti₃C₂ MXene粉末、25 mg的聚乙烯亚胺溶于10 ml ddH₂O中，充氮气5min，放入反应釜中120 ℃反应8 h。反应后得到淡黄色液体，5000 rpm离心5 min，除去黑色沉淀。取上清液，调试pH在7左右，用透析袋透析24 h，间隔12 h换一次水，得到PEI-MXeneQD 纳米颗粒。-20 ℃冰箱冷冻24 h，冷冻干燥24 h，得到PEI-MXene QD 纳米颗粒粉末，密封放入干燥器中待用。

从图1可以看到，合成的PEI-MXene QD 纳米颗粒粒径大约为3-6 nm，右上角的小图是PEI-MXene QD 纳米颗粒的晶格图片。经过测量，本发明的PEI-MXene QD 纳米颗粒的晶格间距为0.267 nm，符合对碳量子的普遍认知。

实施例2

本实施例提供一种PEI-MXene QD 纳米颗粒的制备方法。

将60 mg的Ti₃C₂ MXene粉末、25mg的聚乙烯亚胺溶于10 ml ddH₂O中，充氮气5min，放入反应釜中115℃反应9 h。反应后得到淡黄色液体，5000 rpm离心5 min，除去黑色沉淀。取上清液，调试pH在7左右，用透析袋透析24 h，间隔12 h换一次水，得到PEI-MXeneQD 纳米颗粒。-20℃冰箱冷冻24 h，冷冻干燥24 h，得到PEI-MXene QD 纳米颗粒粉末，密封放入干燥器中待用。

实施例3

本实施例提供一种PEI-MXene QD 纳米颗粒的制备方法。

将45 mg的Ti₃C₂ MXene粉末、25mg的聚乙烯亚胺溶于10 ml ddH₂O中，充氮气5min，放入反应釜中125℃反应7.5h。反应后得到淡黄色液体，5000 rpm离心5 min，除去黑色沉淀。取上清液，调试pH在7左右，用透析袋透析24 h，间隔12 h换一次水，得到PEI-MXeneQD 纳米颗粒。-20℃冰箱冷冻24 h，冷冻干燥24 h，得到PEI-MXene QD 纳米颗粒粉末，密封放入干燥器中待用。

实施例4

体外液体培养实验

在查比克培养基中加入PEI-MXene QD 纳米颗粒（使其浓度为50 mg/L）和黄萎病菌菌块，同时设置只添加黄萎病病菌菌块的对照组。在黑暗条件下，185 rpm/min，25℃摇菌6天，通过显微镜和血球计数板计算其分生孢子的数量。

通过图2A可以看出，对照组的摇瓶中菌液较为浑浊，菌液中所含有的孢子数量较多；添加了PEI-MXene QD 纳米颗粒的菌液较为清澈，菌液中孢子数量明显减少。图2B为汤麦式血球计数板上观察并计算得到分生孢子数，PEI-MXene QD 纳米颗粒处理组与对照组之间有显著性差异。

实施例5

体外固体培养实验

PDA培养基灭菌，冷却至50-60度左右，加入PEI-MXene QD 纳米颗粒，使其浓度为50 mg/L。待培养皿中的培养基冷却凝固后，用打孔器打取直径一致的菌块于培养皿中间，在25℃的培养箱中倒置培养。生长3天后第一次画线（十字划线），再过5天后第二次画线（十字画线），并计算其生长速度。

在固体培养基上插上灭菌后的盖玻片，等菌丝体生长至盖玻片的时候，将其取下去显微镜下观察，观察分生孢子梗的形态。

从图3A可以看出，从固体培养基中获得的菌丝体，在研究级体式显微镜下观察两者的分生孢子梗的形态没有特别大的差异。图3B为十字交叉法得到黄萎病菌在PDA 培养基上的生长速度，说明本发明的PEI-MXene QD 纳米颗粒从一定程度上能够抑制黄萎病菌菌丝体的生长。

实施例6

盆栽实验

1、棉花催芽：

在250 ml 锥形瓶中用200 ml水浸种200粒种子，用0.3%的过氧化氢消毒1~2 min，用清水冲洗40 min，平铺布的盘子上放置种子，再盖上一层布，26 ℃的培养箱中放置一天。待所有种子发芽后，转入蛭石中生长，每盆种植20粒种子，放入较大的盆子里面，缓慢加入清水，水深为1-2 cm。盆子上用白色薄膜覆盖，两天后掀膜去壳，等到子叶平展的时候进行水培。

2、棉花水培

使用Hoagland营养液进行水培，每个黑色小瓶（直径3 cm）里面移栽3-4株苗子，室温26℃，光照时间14小时。

3、纳米材料处理棉花根部

第二片真叶平展时，用纳米材料对棉花根部进行处理。

处理方法：配置含有50 mg/L PEI-MXene QD 纳米颗粒的溶液（溶液体积能够完全浸没苗子根部）。挑选大小一致的苗子，将其根部浸入配制好的PEI-MXene溶液中（对照组为水），使其根部完全浸没，黑暗中孵育3小时，移除PEI-MXene溶液，重新加入500 mL的清水，再将苗子放入水中。每个浓度处理16株以上苗子，一天后接种黄萎病菌进行实验。

4、棉花接菌实验：

将黄萎病菌培养制成1×10⁵ CFU/mL的孢子悬浮液。将实验用的棉花植株根部浸入菌液2 min后取出，并移入土壤中，每盆4株苗子，并放入大盆里，浇入大概1~2升水，在光照培养室培养。10~12天后，开始统计病情指数，测定其干鲜重等数据并拍照。

图4是棉花接菌20天后称量的鲜重，经本发明PEI-MXene QD 纳米颗粒处理后的棉花的鲜重与对照组之间有着极显著差异性。

从第13天开始统计病情指数，病指=[各级病株数分别乘以相应级数之和÷(调查总株数×最高级数)]×100。图5是棉花黄萎病统计的病情指数结果，可以明显看出对照组的病指远远高于PEI-MXene QD 纳米颗粒处理组。

图6为棉花接菌18天后的表型图，相比于对照组（上），施用本发明PEI-MXene QD纳米颗粒处理组（下）中棉花发病的株树要明显减少，植株损害表型明显减轻。

实施例7

剖杆和恢培实验

在实施例6的棉花接菌20天以后，截取棉花子叶节以下的地上部分做剖杆实验，在倒置显微镜下观察其结果。

在棉花接菌20天以后截取棉花子叶节以下的地上部分做恢培实验。在用84消毒液（原浓度）消毒5分钟后，用清水浸泡2-3min，将其分成同等长度的节段，在加入千分之一浓度头孢的PDA 培养基中放置，生长5-7天后观察其生长情况。

图7分别是对照组和PEI-MXene QD 纳米颗粒处理组的茎秆的恢培实验结果。结果：相比于对照恢复培养的实验结果来看，经PEI-MXene QD 纳米颗粒处理过的茎秆没有被菌丝体侵染的数量较多，对照中长出菌落的茎秆占比约76.92%，处理中其数值为17.39%。对照组中茎秆发病的数量明显多于处理组。

实施例8

PEI-MQD在棉花根部中的共定位

合成FITC-PEI-MQD ：用 FITC（一种荧光基团，Sigma）标记PEI-MXene QD 纳米颗粒。将 200μL 100%酒精、50μL 2.5 mg/mL FITC(无水乙醇溶解) 、1mL 50%酒精和1mL、2000mg/L PEI-MXene QD 纳米颗粒（溶解在纯水中）依次加入 20 mL 玻璃小瓶中， 1000 rpm搅拌5 分钟。使用 10 kDa 过滤器 (4200 g，5 分钟一次，至少8次) 纯化所得混合物以去除游离化学物质。最终溶液标记为 FITC-PEI-MQD 并储存在4°C 的冰箱中以供进一步使用。

将合成的FITC PEI-MQD直接作用于棉花根部，暗适应3个小时，取处理后棉花根部，尽量选择新生侧根，并将其装入载玻片内（预先在载玻片上滴加一滴全氟萘胺（PFD）以防止荧光猝灭），盖上盖玻片，并且确保没有气泡。激光共聚焦显微镜设置如下：40 倍物镜，488 nm 激发光；PMT1： 515 nm-525 nm；PMT2：700 nm-785 nm；作 4-6 次重复，使用LAS软件进行共定位分析。

结果：通过共聚焦图像表明 FITC-PEI-MQD 在植物根部中成功定位，FITC-PEI-MQD和棉花根部细胞的共定位率为72.21±13.24%（图8）。而对照处理的棉花根部中未检测到FITC荧光信号。

实施例7

棉花叶片内共聚焦成像实验：

使用激光共聚焦显微镜对棉花叶片叶肉细胞内活性氧进行成像。使用二氢乙锭（DHE）、2′，7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（H₂DCFDA）和羟基苯基荧光素（HPF）分别作为·O^2-、H₂O₂和·OH的荧光染料。

实施例4中的棉花在PEI-MXene QD 纳米颗粒处理18天后，取处理后的棉花第三片叶用打孔器打孔取叶盘浸泡于25 μM H₂DCFDA 、10 μM DHE 染料和10 μM HPF（用10 mMTES稀释，pH为7.5）中，黑暗条件下用H₂DCFDA孵育30 min、DHE孵育45 min、HPF孵育90 min。孵育结束后，用TES冲洗三次，并将其装入载玻片内（预先在载玻片上滴加一滴全氟萘胺（PFD）以防止荧光猝灭），盖上盖玻片，并且确保没有气泡。设置激光共聚焦显微镜如下：40倍物镜，488 nm 激发光；PMT1：500 nm-600 nm；PMT2：700 nm-785 nm；作4-6次重复，使用Image J软件计算 H₂DCFDA、DHE、HPF的荧光强度。

图9是棉花叶片内共聚焦成像以及通过ImageJ软件分析得到的荧光强度。在接菌18天后，由PEI-MXene QD 纳米颗粒处理后的棉花植株叶片内的·OH、·O^2-和H₂O₂的含量低于对照组。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种PEI-MXene QD 纳米颗粒，其特征在于，包括以下制备方法：将Ti₃C₂ MXene粉末和聚乙烯亚胺溶于水中，在110~130℃下反应7~9 h，反应后的液体离心，取上清液用透析袋透析，得到PEI-MXene QD 纳米颗粒。

2.根据权利要求1所述的PEI-MXene QD 纳米颗粒，其特征在于，所述Ti₃C₂ MXene粉末和聚乙烯亚胺的质量比为1~3：1。

3.根据权利要求1所述的PEI-MXene QD 纳米颗粒，其特征在于，所述离心为3000~8000rpm下离心3~10 min。

4.根据权利要求1所述的PEI-MXene QD 纳米颗粒，其特征在于，透析前，调整所述上清液的pH为6-8。

5.根据权利要求1所述的PEI-MXene QD 纳米颗粒，其特征在于，所述透析后的溶液进行冷冻干燥。

6.权利要求1~5任意一项所述的PEI-MXene QD 纳米颗粒在提高植物黄萎病抗性中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，将所述PEI-MXene QD 纳米颗粒与植株根部接触。

8.一种提高植物黄萎病抗性的药剂，其特征在于，所述药剂的活性成分包括权利要求1~5任意一项所述的PEI-MXene QD 纳米颗粒，以及农药学上可接受的助剂。

9.根据权利要求8所述的药剂，其特征在于，所述PEI-MXene QD 纳米颗粒的有效作用浓度在25 mg/L以上。

10.根据权利要求8所述的药剂，其特征在于，所述药剂为根处理剂。