CN108308177B - 一种激活蛋白PeaT1纳米粒子及其在作物抗病促生方面的应用 - Google Patents
一种激活蛋白PeaT1纳米粒子及其在作物抗病促生方面的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种激活蛋白PeaT1纳米粒子及其在作物抗病促生方面的应用。激活蛋白纳米粒子,以二氧化硅(SiO2)或两亲性共聚物mPEG‑PLGA为纳米载体,形状大致呈圆形,直径约为200nm,表面zeta电位约为‑16.5mV,激活蛋白PeaT1在其中的包封率约为30.7%,蛋白随着扩散及纳米载体的降解可以持续向外释放,从而持续激发小麦、水稻、生菜和黄瓜等作物自身的免疫系统,促进植物本身抗逆相关物质的表达与合成,并能够促进其生长发育,提高抗性,对病害具有一定的广谱防治效果。本发明提供一种绿色高效的激活蛋白纳米粒子,可以很好地促进作物生长,增产增收,同时控制作物病害发生。
Description
技术领域
本发明涉及一种新型激活蛋白PeaT1纳米粒子及其应用,属于生物技术领域。
背景技术
长期以来,作物的增产抗病主要依靠化肥、农药等试剂的使用。这些化学试剂的长期使用不仅会污染环境,还会导致植物病原菌对杀菌剂产生抗药性,甚至会损害人体健康。利用植物自身产生的诱导抗病性对病害进行防治,以及相应诱抗剂农药的研发,因其具有绿色、高效的特点,发展迅速并且具有广阔的前景。相比于传统的农药等方法,这种新型农药为蛋白制剂,是一种新型、安全、高效的“新概念”植物免疫诱抗剂,来源于细菌或真菌的天然蛋白,是当前一种极具前景的植物抗病促生的方式(邱德文.蛋白质生物农药[M].北京:科学出版社,2010.)。
但是,由于为蛋白制剂,本身具有不稳定性,容易发生水解、氧化等反应,引起其结构的变化。而聚集、宏观沉淀、表面吸附以及蛋白质变性等现象,都会引起其性能的变化。本身不利于长期保存,也影响其长效性使用。目前常见的使用方法为将其制备成可湿性粉剂,主要组成包括:活性蛋白质原粉、保护剂、稳定剂、pH平衡缓冲剂、多种非离子表面活性剂及其他辅助成分等,需要的时候将其与水混合再进行施用。引入这些新的化学制剂,有违绿色环保这一初衷。随着纳米技术的不断发展,其在植物上的应用也逐渐被发现,纳米粒子(Nanoparticles,NPs)所具有的独特的物理化学性质,例如:高比表面积、高反应活性、可调节的孔径以及粒子形态,可以穿过细胞膜,使得相比于传统农业方法,能够减少农药化肥等输入以及产生更少的废物污染物,也就是提高了效率和持效性。同时可以包覆一些药物或制剂,作为递送媒介,具有高效、靶向、缓释等的特点(M.H.Siddiqui,M.H.Al-Whaibi,F.Mohammad.Nanotechnology and Plant Sciences[M].Switzerland:Springer,2015.)。二氧化硅在地表含量十分丰富,其对于植物生长有重要作用,随着研究发现其对于植物抵抗病虫害方面有重要的作用,能够提高抗性,降低植物发病,可以用作纳米载体。另外有研究发现 PLGA NPs可以通过气孔开口进入葡萄叶组织,并且它们可以被根吸收并通过维管组织运输到茎。而通过向烟草叶片喷施载Harpin蛋白(rHrpZ)的PLGA-NPs,NPs可以帮助蛋白质进入叶表皮和细胞壁,持续原位释放rHrpZ,并提高rHrpZ的生物利用度。因此,纳米粒子载体技术能够为激活蛋白的施用以及对植物抗病促生作用的生物技术提供重要技术支撑。
发明内容
本发明的目的是提供一种绿色高效的激活蛋白纳米粒子,可以很好地促进作物生长,控制作物病害发生的生物试剂及其用途。
该纳米粒子特征:以二氧化硅或者共聚物mPEG-PLGA为载体,形状大致呈圆形,直径约为200nm,表面zeta电位约为-16.5mV,激活蛋白PeaT1在其中的包封率约为30.7%,蛋白随着扩散及纳米载体的降解可以持续向外释放,从而持续激发小麦、水稻、生菜和黄瓜等作物自身的免疫系统,促进植物本身抗逆相关物质的表达与合成,并能够促进其苗期生长发育,提高抗性,对病害具有一定的广谱防治效果。
具体内容如下:
在本发明中,以无机材料二氧化硅(SiO2)或者可生物降解的有机两亲性共聚物mPEG-PLGA 为纳米载体,通过水解法、乳化溶剂蒸发法等,制备得到包载激活蛋白PeaT1的纳米粒子。对该纳米粒子进行理化性质表征,结果表明,具有良好的纳米粒子的特性,可以控释缓释,辅助激活蛋白进入作物体内从而发挥作用。通过在小麦上的施用,以及对小麦生长、抗性酶活力、最终产量等的测定,结果表明,这种激活蛋白纳米粒子可以促进作物的苗期生长,提高作物的抗性,并且提高作物产量,可用于作物的抗病促生。
本发明的有益效果如下:
针对传统农业温室、大田等环境,化学试剂的滥用情况较为严重,以及密闭空间的植物栽培,容易产生病菌侵染,传统方法效果不理想,容易产生环境污染等问题,本发明创新性地提供了一种新型的激活蛋白PeaT1纳米粒子,可以绿色高效的促进作物生长,提高作物的抗性,提高产量。利用该纳米粒子对作物进行处理,效果稳定,适用性强,可显著提高作物发芽率和苗期株高、鲜重和干重,提高根系活力、光合速率,提高产量,该纳米粒子可作为生长促进剂使用,不仅可以减少化学农药的用量,减轻环境污染,同时还可以增产增收,增加农民经济收入,并具有良好的生态效益和社会效益。
附图说明
图1-A为激活蛋白纳米粒子的TEM形貌图;
图1-B为激活蛋白纳米粒子的粒径分布图;
图2为激活蛋白纳米粒子中PeaT1蛋白的累积释放曲线;
图3-A为小麦叶片的叶绿素含量;
图3-B为小麦叶片的净光合速率。
具体实施方式
为了更好地理解本发明,下面通过具体实施例对发明作进一步详述,但是本发明并不局限于此。
实施例1激活蛋白PeaT1纳米粒子的合成与表征
(1)纳米粒子的合成
通过水解法制备了二氧化硅的纳米粒子。在烧瓶中加入70mL去离子水、0.8mL氨水、15mL 乙醚、5mL乙醇,加入0.5g CTAB粉末室温下搅拌30min,然后逐滴加入2.5mL TEOS与0.1mL APES混合溶液,室温搅拌4h,加入1mL 37%盐酸停止反应,4200rpm离心12min,沉淀用水和乙醇洗涤,均匀分散在乙醇中得纳米粒子粗产物。经梯度离心纯化,加入15mL37%盐酸与 120mL乙醇,70℃下反应24h去除CTAB模板,离心水洗,分散在PBS溶液中,加入PeaT1蛋白水溶液磁力搅拌1h,得到包载激活蛋白PeaT1的纳米粒子。
通过乳化溶剂蒸发法制备了包载激活蛋白PeaT1的纳米粒子。首先,将4mg mPEG-PLGA 共聚物超声溶解于2mL乙酸乙酯(O)中,并加入400μL 2.5mg/mL的激活蛋白PeaT1水溶液 (W1)。通过在冰浴中超声处理3分钟使混合物乳化以形成W1/O乳液。之后,加入PVA(1%,w/v)和F68(1%,w/v)的5mL等体积混合溶液(W2)并超声处理5min,以获得W1/O/W2乳液。接着,在旋转蒸发器中通过真空蒸发除去有机溶剂。最后,通过在室温下以15000g离心10 分钟来收集纳米粒子沉淀,用去离子水洗涤两次,冻干,最终得到产物包载激活蛋白PeaT1 的纳米粒子。
(2)纳米粒子的性质表征
透射电子显微镜(TEM,Tecnai G220S-TWIN(200kV),FEI,USA)用于观察纳米粒子的形态(图1-A)。使用ZetaSizer Nano系列Nano-ZS(Malvern Instruments Ltd,Malvern,UK)应用动态光散射(DLS)法测定纳米粒子的Zeta电位,粒径和多分散性指数(图1-B)。
通过测量离心上清液中蛋白质的浓度来确定激活蛋白PeaT1在纳米粒子中的包封率(EE)。蛋白质的浓度通过BCA法来测定,使用酶标仪在562nm波长下通过分光光度法分析样品。如下计算蛋白质包封率:EE(%)=(W0-Wt)/W0×100%。W0和Wt分别是初始蛋白质的总量和离心后上清液中剩余蛋白质的量。每个样品测定三次。
表1纳米粒子的性质
类别 | 包封率(%) | Zeta电位(mV) | 平均粒径(nm) | 多分散性指数(PDI) |
空白纳米粒子 | N/A | -19.0±0.2 | 147.6±1.2 | 0.069-0.095 |
激活蛋白PeaT1纳米粒子 | 30.7±14.1 | -16.5±1.2 | 183.8±3.3 | 0.282-0.296 |
(3)激活蛋白纳米粒子中PeaT1蛋白的累积释放曲线
在室温下,将80mg激活蛋白纳米粒子均匀分散于10mL PBS中,并以约100rpm的转速进行磁力搅拌。以设定的时间间隔,取出0.5mL样品并以15000g离心10分钟,测定上清液中的蛋白质的含量,同时将沉淀物重新溶解于0.5mL新的PBS中,然后加回到释放介质中。计算PeaT1蛋白的累积释放量,对时间作图得到图2。
实施例2激活蛋白纳米粒子对小麦种子发芽和苗期生长的影响
选择春小麦作为植物材料,应用水培法栽培小麦。首先将种子浸泡在0.1%KMnO4溶液中 20分钟以消毒表面,然后用无菌水冲洗3次洗净。之后,将所有种子分成4组分别浸泡过夜 (约10小时)。第一组(CK)中以去离子水作为对照,第二组(NPs)使用空白纳米粒子的水溶液,第三组(P)使用蛋白质水溶液,第四组(PNPs)中使用激活蛋白纳米粒子水溶液。之后,取出种子,擦去表面上的残余溶液。
将新的滤纸剪成直径约5cm的圆形,并用去离子水浸湿。然后将种子排列放在纸的中部并用塑料薄膜覆盖。之后,将纸张沿着一侧卷起来,并垂直放置在含有培养液的试管中,使得液体不浸没种子,但保持滤纸与液体相接触。每个试管含有3个种子,每组种植有5个试管。每天补充营养液,观察生长状况。先用去离子水作为培养液,一周后用0.5×Hoagland 营养液代替。
小麦幼苗培养2周后,用便携式光合仪(Li-6400XT,LI-COR Inc.Lincoln,Nebraska,USA) 测量小麦幼苗第二叶片的光合参数。之后将各处理中的幼苗从滤纸上取下,称各自鲜重,并分别测量根长和冠长,测量含水率,叶片叶绿素含量以及根系脱氢酶活力。
目标激活蛋白纳米粒子对小麦叶绿素含量与光合作用的提高效果如图3-A和图3-B所示,对苗期的促生效果如表2所示,结果表明,激活蛋白纳米粒子能显著促进生长,使苗期株高、鲜重和根长增加,提高叶片的光合效率。
表2激活蛋白纳米粒子对小麦种子发芽和苗期的影响
CK | NPs | P | PNPs | |
株高(mm) | 167.9±21.7a | 170.5±20.8a | 187.1±18.2ab | 196.0±21.5b |
根长(mm) | 97.9±14.9a | 115.9±15.9ab | 123.0±14.4b | 130.7±17.3b |
地上部分鲜重(mg) | 203.9±45.6a | 203.3±53.5a | 234.0±48.7ab | 255.8±43.4b |
根干重(mg) | 18.1±4.5a | 17.3±3.9a | 16.0±4.6a | 19.3±3.3ab |
根系活力(mg/g/h) | 0.66±0.02a | 0.49±0.01b | 0.67±0.01a | 0.90±0.05c |
注:同行的相同字母表示Duncan多重检验差异不显著。
实施例3激活蛋白纳米粒子对小麦幼苗的防病促生效果
进行了激活蛋白纳米粒子防治小麦根腐病的生防试验。小麦种子进行表面消毒,采用 0.1%KMnO4溶液浸泡30分钟,分5组浸泡过夜。B:空白组,用无菌水浸泡,不接菌;CK:对照组,用无菌水浸泡;NPs:用空白纳米粒子水溶液浸泡;P:用PeaT1蛋白水溶液浸泡;PNPs:用激活蛋白纳米粒子水溶液浸泡。除第一组(B)外,后四组浸泡后均用离蠕孢叶枯病菌孢子悬浮液浸泡30min后种植,种植方法与实施例2中相同。生长两周后进行激活蛋白纳米粒子的防效评价,从小麦的形态(根长、茎高)、生长情况(鲜重)和病害指数(叶片黄化指数)等方面进行评价。
表3激活蛋白纳米粒子对小麦根腐病菌的防治效果
B | CK | NPs | P | PNPs | |
株高(mm) | 167.9±21.7c | 118.7±23.6a | 141.1±19.4b | 134.8±24.3b | 136.5±18.3b |
根长(mm) | 97.9±14.9a | 92.9±18.4a | 107.1±13.8b | 118.1±25.2bc | 130.8±15.5c |
地上部分鲜重(mg) | 203.9±45.6c | 123.7±39.3a | 170.0±30.5b | 149.8±34.6ab | 167.9±40.3b |
根干重(mg) | 18.1±4.5b | 12.9±4.8a | 13.5±3.8a | 13.1±3.5a | 18.2±3.9b |
叶黄指数(%) | 22.2±3.1a | 48.9±11.3c | 42.2±8.3c | 33.2±5.4b | 28.9±3.1ab |
注:同行的相同字母表示Duncan多重检验差异不显著。
实施例4激活蛋白纳米粒子对小麦的促生效果
将小麦种子播种在蛭石基质中,分为4组,待其发芽后第5天(苗期)和第30天(四叶一心),分别向其叶部喷洒激活蛋白纳米粒子水溶液,对照组相应喷洒清水,在温度23±1℃、湿度55±5%、全光照的条件下培养,定期浇水,测量小麦收获时的各收获指标。由表4可知,激活蛋白能够提高小麦作物的单株产量和单位产量,同时提高种子质量。
表4激活蛋白纳米粒子对小麦的促生效果
处理 | 平均种子重/kgm<sup>-2</sup> | 单株种子重/g | 千粒重/g |
对照 | 0.93±0.03a | 0.66±0.02b | 32.68±2.08a |
苗期喷叶 | 0.97±0.05a | 0.69±0.04b | 33.90±1.71a |
四叶期喷叶 | 1.27±0.17b | 0.91±0.13c | 35.16±2.02b |
注:同列的相同字母表示处理与对照T检验差异不显著。
实施例的结果均表明,本发明激活蛋白纳米粒子对小麦病害有较好的防治效果,明显降低了作物的发病率,并且对于作物的生长发育有促生效果。由于其载体材料可生物降解,其中激活蛋白又是环境友好、无污染的生物制剂,有利于环境效益和经济效益的平衡发展,在农田、大棚甚至密闭环境中下作物病害防治、增产增收方面有良好的应用前景。
Claims (4)
1.一种用于作物抗病促生的激活蛋白 PeaT1 纳米粒子,其特征在于使用有机两亲性共聚物 mPEG-PLGA 包覆蛋白,制备成为纳米级微粒,该纳米粒子形状大致呈圆形,直径183.8±3.3nm,表面 zeta 电位为-17.7~-15.3mV,激活蛋白 PeaT1 在其中的包封率为16.6%~44.8%。
2.如权利要求1所述的激活蛋白PeaT1纳米粒子,其特征在于,在水溶液中PeaT1 蛋白随着扩散及纳米载体的降解持续向外释放,室温下性质稳定。
3.如权利要求 1 或 2 所述的激活蛋白PeaT1纳米粒子的应用,其特征在于,该纳米粒子用于作物病原菌的生物防治。
4.如权利要求 3 所述的激活蛋白PeaT1纳米粒子的应用,其特征在于该纳米粒子用于小麦根腐病的生物防治。
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Legal Events
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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