CN114949364B - 一种多层组织工程化仿生骨膜支架及制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种多层组织工程化仿生骨膜支架及制备方法和应用，涉及高分子材料和生物医用材料领域。本发明的多层组织工程化仿生骨膜支架包括层层叠加的矿化纳米纤维膜‑细胞复合层，矿化纳米纤维膜‑细胞复合层包括矿化纳米纤维膜和接种于矿化纳米纤维膜上的干细胞。本发明的制备方法包括：静电纺丝制得纳米纤维膜；将纳米纤维膜置于模拟体液中孵育，得到矿化纳米纤维膜；将干细胞接种于矿化纳米纤维膜上，得到矿化纳米纤维膜‑细胞复合层；将矿化纳米纤维膜‑细胞复合层进行层层叠加，得到多层组织工程化仿生骨膜支架。本发明还提供了多层组织工程化仿生骨膜支架在制备促进骨生长材料中的应用。本发明模拟天然骨膜中复杂的解剖结构，具有良好的促成骨性能。

Description

一种多层组织工程化仿生骨膜支架及制备方法和应用
技术领域
本发明涉及高分子材料和生物医用材料领域，尤其涉及一种多层组织工程化仿生骨膜支架及制备方法和应用。
背景技术
疾病以及事故等原因造成的骨折是骨科临床上最常见的外伤。不论是轻微的骨折修复还是大段骨的缺损修复，其修复过程均涉及细胞、组织，是一个复杂而精妙的再生过程。
骨膜是一个结缔组织薄层，其通过Sharpey纤维与骨骼外表面紧密相连，并通过动静脉串行的血管网络为骨骼生长发育输送相关物资。骨膜从结构上可细分为三层，由上至下依次为成纤维细胞/胶原纤维层(ZONE III)、基质层(ZONE II)和cambial layer(ZONEI)。三层之间没有明显的界限。其中，III区是骨膜的纤维层，细胞外基质和细胞缺乏并且血管化程度低，粗大的纤维束为骨膜提供屏障与固定作用；并且由于屏障特性的存在，使得骨膜的渗透性呈现方向性和部位特异性。另外，神经与微血管穿插其中，大部分神经纤维末端位于III区的深层部位，少部分穿插进入骨皮质。II区是III区与I区协同作用的关键纽带，多种细胞成分、胶原纤维、致密的毛细血管网络围绕该层，为骨膜组织提供充足血供和成骨相关因子，并输送细胞，还赋予骨膜组织一定的缓冲应力，也使骨膜组织神经网络更加丰富。I区血管缺乏，是由少量胶原纤维、弹性纤维和各种成骨潜能细胞构成的薄层。
近年来，得利于生物学和工程学的结合，极大地促进了研究的深度与广度。根据骨膜本身生物学基础，骨膜组织工程(PTE)应运而生，其主要包括支架、细胞和生长因子三大要素，三者互相协调与合作，达到了高效模拟天然骨膜的功能，以骨诱导、骨传导(宿主骨与植入材料表面结合，引导骨形成)和骨形成(材料含有成骨分化潜能细胞，具有骨形成作用)作用机理完成骨再生。围绕为细胞生命活动提供微环境、为矿化提供空间和原料以及刺激血管形成等要求，骨膜组织工程也是不断地发展，而生物活性支架是PTE中重要一环，承载着支持与协助细胞自身、细胞与细胞间、细胞与机体之间的各种生理功能。国内外学者应用组织工程技术构建仿生骨膜(Tissue Engineered Periosteum,TEP)已取得了一定的进展。最初应用脱细胞基质支架材料，该材料脱去了细胞成分，保留细胞外基质中的生物活性因子和结构成分，但存在免疫排斥反应。还有使用细胞片技术，其不使用外部支架，减少了外源性物质所引发的并发症。此外，合成高分子的研究增多，也促进了骨膜组织工程的发展，但单纯的合成材料生物活性的欠缺阻碍了其进一步的利用，虽然复合天然高分子材料能弥补其缺点但对于重塑天然骨膜的复杂结构，达到对骨膜功能的仿生依然是需要克服的难点。
因此，提供一种仿生骨膜支架，能重塑天然骨膜的复杂结构，成为了本领域技术人员亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的之一在于，提供一种多层组织工程化仿生骨膜支架，其能实现模拟天然骨膜中复杂的解剖结构，并具有良好的促成骨性能。
本发明的目的之二在于，提供该多层组织工程化仿生骨膜支架的制备方法。
本发明的目的之三在于，提供该多层组织工程化仿生骨膜支架的应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供的多层组织工程化仿生骨膜支架，包括层层叠加的矿化纳米纤维膜-细胞复合层，所述矿化纳米纤维膜-细胞复合层包括矿化纳米纤维膜和接种于矿化纳米纤维膜上的干细胞。
本发明的部分实施方案中，所述矿化纳米纤维膜-细胞复合层大于等于3层，优选为5层。
本发明的部分实施方案中，所述矿化纳米纤维膜为磷酸钙矿沉积在纳米纤维膜上而成。
本发明的部分实施方案中，所述干细胞为间充质干细胞，优选为大鼠间充质干细胞。
本发明提供的多层组织工程化仿生骨膜支架的制备方法，包括以下步骤：
S1.制备纳米纤维膜：采用静电纺丝法制备纳米纤维膜；
S2.矿化：将S1制得的纳米纤维膜置于模拟体液中孵育，使磷酸钙序沉积在纳米纤维膜上，得到矿化纳米纤维膜；
S3.接种：将干细胞接种于矿化纳米纤维膜上，得到矿化纳米纤维膜-细胞复合层；
S4.叠加：将S3得到的矿化纳米纤维膜-细胞复合层进行层层叠加，得到多层组织工程化仿生骨膜支架。
本发明的部分实施方案中，所述纳米纤维膜为可降解高分子材料制成，优选地，为聚己内酯纳米纤维膜；优选地，纳米纤维膜中纳米纤维的直径为200-500nm。
本发明的部分实施方案中，所述S2中，孵育条件为37±1℃孵育0.5～4小时。
本发明的部分实施方案中，干细胞接种数量为1×104～10×104/cm2，优选为8.8×104/cm2。
本发明的部分实施方案中，所述S2矿化步骤中，将S1制得的纳米纤维膜表面包覆“胶原-PSS-胶原”三层包衣后，再置于模拟体液中孵育；
优选地，所述S4中，将矿化纳米纤维膜-细胞复合层进行层层叠加后，于37±1℃孵育2-48小时，使细胞粘附于纳米纤维膜上。
本发明通过在纳米纤维膜表面包覆胶原，引导磷酸钙有序沉积在纳米纤维膜的纳米纤维上。
本发明提供的多层组织工程化仿生骨膜支架在制备促进骨生长材料中的应用。
本发明的部分实施方案中，静电纺丝法制备纳米纤维膜时，所用的纺丝溶液中，可降解高分子材料聚的质量百分含量为12％，所用溶剂为六氟异丙醇。纺丝电压为16kV，接收距离为12cm，注射速度为0.2mL/h。
本发明的部分实施方案中，在纳米纤维膜表面包覆胶原包括以下步骤：将S1制得的纳米纤维膜浸入胶原溶液中5-30min，优选10-20min，更优选15min，取出，去离子水冲洗后，再浸入聚苯乙烯磺酸钠(PSS)溶液中，取出，去离子水冲洗，再次浸入胶原溶液，取出，去离子水冲洗，得到“胶原-PSS-胶原”3层包衣的纳米纤维膜。
优选地，胶原溶液的配制方法为：取胶原溶解于0.2mol/L醋酸溶液中，配制成浓度为1-5mg/ml，优选为3mg/ml的胶原溶液，加入NaOH液调节PH至4左右。
优选地，将聚苯乙烯磺酸钠(PSS)加入0.2mol/L醋酸溶液，配制0.1-0.50wt.％，优选为0.3wt.％的聚苯乙烯磺酸钠溶液。
本发明的部分实施方案中，将包覆胶原后的纳米纤维膜置于模拟体液中孵育。所述模拟体液可根据人血浆中各种离子浓度配制。本发明为了得矿化效果优良的纳米纤维膜，采用钙磷离子浓度均为人体血浆10倍的模拟体液。
本发明的部分实施方案中，所述S3包括以下步骤：
将干细胞接种于矿化纳米纤维膜上，37±1℃孵育，使干细胞粘附与矿化纳米纤维膜上，孵育时间为0.5～3h，优选为1h；
本发明的部分实施方案中，所述S4的操作为：
S41.配制胶原溶液：将胶原蛋白溶解于醋酸溶液中得到胶原蛋白含量为3-10wt.％胶原溶液；优选地，胶原蛋白含量为6wt.％；优选地，醋酸溶液浓度为0.1-0.3mol/L，更优选为0.2mol/L；S42.吸取胶原溶液铺展于S3得到的矿化纳米纤维膜-细胞复合层上，然后将矿化纳米纤维膜-细胞复合层进行层层叠加，叠加完毕后于37±1℃孵育5-20min，再于培养基中培养24小时以上，得到多层组织工程化仿生骨膜支架。
本发明的一个实施例中，将矿化纳米纤维膜-细胞复合层放置于培养皿中央，移液枪吸取20ul/cm2的胶原溶液铺展其上，随后取另一片矿化纳米纤维膜-细胞复合层覆盖在涂有胶原的矿化纳米纤维膜-细胞复合层上，依次完成5层的叠加，得到了5层矿化纳米纤维膜-细胞复合层结构，先37±1℃孵育5-20min，再加入完全培养基于37±1℃培养24小时以上，得到多层组织工程化仿生骨膜支架。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明利用层层叠加组合法构建的多层组织工程化仿生骨膜支架，其包括多层的矿化纳米纤维膜-细胞复合层，纳米纤维膜为细胞的粘附生长提供了合适的界面；将胶原固定于纤维表面，促进了磷酸钙矿物质的有序沉积，取向生长均匀分布，形成的多孔结构更好的仿生天然骨形成方式，并且矿化提供的钙磷离子有利于间充质干细胞的增殖与分化；胶原蛋白的存在于干细胞粘附分泌细胞外基质促进了层间粘合，并且胶原蛋白作为天然的纤维型蛋白，增加了纳米纤维膜的生物相容性，将其与合成高分子聚己内酯的联合，改善了支架材料的力学性能与降解性。
此外，层层叠加组合法对构建层状组织具有显著的优势，包括：可以充分模拟组织的多层结构；可以精确调控每层中基质纤维的组成、形貌和取向，以及细胞类型和比例；可以将细胞包埋于多层纤维基质内部，克服传统微纳米纤维支架因孔径狭小而限制细胞浸润的局限性，将单片的矿化纳米纤维膜-细胞复合层从二维平面拓展到三维立体结构，更有利于模仿天然细胞所处的一个生理环境，增加了细胞负载量与组织修复的速率。如此，此多层组织工程化仿生骨膜支架可跨越制备骨膜替代物难以逾越的瓶颈。
附图说明
附图1为实施例4的未进行三层包衣处理的纳米纤维膜不同的矿化孵育时间考察结果图。
附图2为实施例5的三层包衣处理后的纳米纤维膜不同的矿化孵育时间考察结果图。
附图3为实施例7的5层结构的仿生骨膜支架显微图；
附图4为实施例8的DNA总量检测结果图；
附图5为实施例8的培养5天的单层与多层成骨标志性基因表达、成骨标志性蛋白表达的测定结果图；
附图6为实施例8的培养5天的单层与多层ALP活性结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
一种多层组织工程化仿生骨膜支架，包括层层叠加的矿化纳米纤维膜-细胞复合层，所述矿化纳米纤维膜-细胞复合层包括矿化纳米纤维膜和接种于矿化纳米纤维膜上的干细胞。
所述矿化纳米纤维膜-细胞复合层大于等于3层，优选为5层。
所述矿化纳米纤维膜为磷酸钙沉积在纳米纤维膜上而成。
所述干细胞为间充质干细胞。
多层组织工程化仿生骨膜支架的制备方法，包括以下步骤：
S1.制备纳米纤维膜：采用静电纺丝法制备纳米纤维膜；所述纳米纤维膜为可降解高分子材料制成，优选地，为聚己内酯纳米纤维膜；优选地，纳米纤维膜中纳米纤维的直径为200-500nm。
S2.矿化：将S1制得的纳米纤维膜表面包覆“胶原-PSS-胶原”三层包衣后，置于模拟体液中孵育，使磷酸钙有序沉积在纳米纤维膜上，得到矿化纳米纤维膜；孵育条件为37±1℃孵育0.5～4小时。
S3.接种：将干细胞接种于矿化纳米纤维膜上，得到矿化纳米纤维膜-细胞复合层；干细胞接种数量为1×104～10×104/cm2，优选为8.8×104/cm2；再于37±1℃孵育，使干细胞粘附与矿化纳米纤维膜上，孵育时间为0.5～3h，优选为1h；
S4.叠加：将胶原蛋白溶解于醋酸溶液中得到胶原蛋白含量为3-10wt.％胶原溶液；优选地，胶原蛋白含量为6wt.％；优选地，醋酸溶液浓度为0.1-0.3mol/L，更优选为0.2mol/L；
吸取胶原溶液铺展于S3得到的矿化纳米纤维膜-细胞复合层上，进行层层叠加，叠加完毕后于37±1℃孵育5-20min，优选为10min，再加入完全培养基于37±1℃培养24小时-以上，得到多层组织工程化仿生骨膜支架。
本发明提供的多层组织工程化仿生骨膜支架在制备促进骨生长材料中的应用。
实施例1
本实施例公开了静电纺丝法制备纳米纤维膜，具体步骤为：
1.用移液器吸取2mL六氟异丙醇加入10ml容量瓶中，加入240mg聚己内酯，在磁力搅拌器上搅拌12h使其溶解，得到纺丝液；
2.确认纺丝仪处于安全状态，保证器件接头连接正确。裁取适当尺寸锡箔纸铺展与收集板上，在通风橱中将20G针头安装于5ml注射器上吸取纺丝液，排净针头内空气后，将注射器固定于供液泵上，连接高压电源。在环境温度25±1℃，环境湿度30±2％，以贴附铁丝环的收集板，16KV电压、12cm接受距离与0.2ml/h的供液速度进行电纺。连续纺丝5min后停止，待纺丝结束后，关闭仪器与高压电源，取下电纺膜，室温干燥，得到纳米纤维膜，其纤维的直径为200-500nm。
实施例2
本实施例公开了纳米纤维膜表面包覆胶原的方法，具体步骤为：
1.将胶原在4℃条件下溶解在0.2M醋酸中配制成2mg/ml的胶原溶液，加入5M NaOH调节PH至4左右，制得胶原溶液，备用。
2.将聚苯乙烯磺酸钠(PSS)加入0.2mol/L乙酸溶液，配制0.3wt.％聚苯乙烯磺酸钠溶液。
3.取干净的六孔板，每孔加入5ml胶原溶液，放入按实施例1方法制得的纳米纤维膜，使其完全浸没，15min后取出，去离子水冲洗，再将纳米纤维膜浸入5ml聚苯乙烯磺酸钠溶液中15min，取出，去离子水冲洗，再次浸入胶原溶液15min，取出，去离子水冲洗，得到“胶原-PSS-胶原”3层包衣的纳米纤维膜。
实施例3
本实施例公开了矿化纳米纤维膜的制备方法，具体步骤为：
1.模拟体液配制
常规模拟体液(SBF)是根据人血浆中各种离子浓度配制，本发明使用10×SBF，即溶液中钙磷离子浓度均为人体血浆的10倍。具体操作步骤：
(1).在恒温水浴37℃条件下，将表1中NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2·6H2O、NaH2PO4·2H2O按照顺序与相应质量加入900ml去离子水中，注意前后试剂的添加需要保证前一试剂溶解后再进行下一步操作。
(2).将溶液定容至1000ml，转移至封闭玻璃瓶中，得到模拟体液储备液，备用。
(3).取200ml模拟体液储备液回温后，加入序号6相应质量的NaHCO3，搅拌溶解后，得到10×SBF，立即使用。
表1
序号 试剂 浓度(mM) 分子量(g)
1 NaCl 1000 58.443
2 KCl 5 0.3728
3 CaCl<sub>2</sub> 25 2.7746
4 MgCl<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O 5 1.0165
5 NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O 10 1.5600
6 NaHCO<sub>3</sub> 10 0.8400
2.矿化孵育
将200ml 10×SBF转移至六孔板，每孔加5ml溶液，放入按实施例2的方法制得的表面包覆有胶原的纳米纤维膜，37℃孵育1h，取出，用去离子水冲洗2-3次，室温干燥，得到矿化纳米纤维膜。
实施例4
本实施例对未进行三层包衣处理的纳米纤维膜(FM组)不同的矿化孵育时间进行了考察：采用实施例1的纳米纤维膜，按实施例3的方法分别制备矿化孵育时间为0.5h、1h、2h、4h的矿化纳米纤维膜。结果如图1显示，上述矿化孵育时间均得制得矿化纳米纤维膜，磷酸钙矿物质杂乱沉积于纳米纤维膜上。
实施例5
本实施例对三层包衣的纳米纤维膜(CC-FM组)不同的矿化孵育时间进行了考察：采用实施例2的包覆“胶原-PSS-胶原”的纳米纤维膜，按实施例3的方法分别制备矿化孵育时间为0.5h、1h、2h、4h的矿化纳米纤维膜。结果如图2显示，上述矿化孵育时间均得制得矿化纳米纤维膜，磷酸钙矿物质均沉积于纳米纤维膜上，沿纳米纤维膜中纳米纤维取向生长。
实施例6
本实施例公开了矿化纳米纤维膜-细胞复合层、以及多层组织工程化仿生骨膜支架的制备方法，具体为：
步骤1.取按实施例3方法将纳米纤维膜(CC-FM组)10×SBF处理1h得到的矿化纳米纤维膜(命名为CaP-CC-FM)灭菌，备用；
步骤2.将胶原蛋白溶解于0.2mol/L醋酸溶液中，得到胶原蛋白含量为6mg/ml的胶原溶液，加2M NaOH溶液调节PH至7.0左右，备用；
步骤3.将干细胞消化离心后，用完全培养基将其重悬，备用；
步骤4.取灭菌后的矿化纳米纤维膜一张，将干细胞以8.8×104/cm2接种于矿化纳米纤维膜上，37℃培养箱孵育1h便于细胞的粘附，得到矿化纳米纤维膜-细胞复合层；
步骤5.超净台中，移液枪吸取20ul胶原溶液并铺展整个矿化纳米纤维膜-细胞复合层表面，随后取一张矿化纳米纤维膜-细胞复合层，将其覆盖再第一张复合层上，得到两层矿化纳米纤维膜-细胞复合层；如此反复操作，得到5层矿化纳米纤维膜-细胞复合层，操作完成后将5层矿化纳米纤维膜-细胞复合层置于37℃培养箱孵育10min，10min后补加7ml完全培养基，再于37℃培养箱孵育24h，从而得到的5层结构的仿生骨膜支架成品。
实施例7
本实施例公开了多层组织工程化仿生骨膜支架的表征：
取按实施例6的方法制备的5层结构的仿生骨膜支架成品，PBS清洗后，将铁环夹取下，加入4％多聚甲醛固定24h后，切片进行HE染色观察层间结构，结果如图所示。5层结构的仿生骨膜支架层与层之间并无间隙，层与层直接紧密联系，不存在分层现象。
实施例8
本实施例公开了单层与多层组织工程化仿生骨膜支架的体外生物学评价：
按实施例6的方法步骤1-4制备了矿化纳米纤维膜-细胞单层支架，通过37℃培养箱孵育3天与5天后，成骨标志性基因表达的测定(qRT-PCR)以及成骨标志性蛋白表达的测定(ALP定量)。
按实施例6的方法步骤1-5制备的5层结构的仿生骨膜支架成品，通过37℃培养箱孵育1天，3天与5天后，进行了细胞增殖——DNA总量检测；成骨标志性基因表达的测定(qRT-PCR)以及成骨标志性蛋白表达的测定(ALP定量)，结果如附图4-6所示。
其中DNA总量检测方法为：采用QbtestTM X-Green II双链DNA定量试剂盒(USEVERBRIGHT；Q2038S,Q2038L)荧光检测dsDNA含量；
成骨标志性基因表达的测定方法为：选用SteadyPure Universal RNAExtraction Kit(AG21017)进行成骨标志性基因表达的测定；
成骨标志性蛋白表达的测定方法为：采用碱性磷酸酶检测试剂盒(
Figure BDA0003669321890000091
pNPPAlkaline Phosphatase Assay Kit*Colorimetric*，72146)进行碱性磷酸酶定量分析；
由图4可知：DNA总量检测结果显示CaP-CC-FM材料组促进了细胞的增殖，rBMSCs均生长状态良好，不具有任何细胞毒性。
由图5可知：对成骨标志性基因(RUNX2，ALP和OPN)表达进行测定(qRT-PCR)，结果显示通过磷酸钙表面沉积的纳米纤维膜促进了成骨标志性基因(RUNX2，ALP和OPN)表达，并且多层结构基因表达明显高于单层支架。
由图6可知：对成骨标志性蛋白ALP表达进行了定量测定，结果显示多层结构相对于单层支架，具有更好的体外成骨生物活性。
本发明实施例中采用的干细胞为间充质干细胞，基于本发明的构思，采用其他细胞接种于矿化纳米纤维膜上，再进行层层叠加，也能得到多层组织工程支架。
尽管上面已经通过结合示例性实施例描述了本发明，但是本领域技术人员应该清楚，在不脱离权利要求所限定的精神和范围的情况下，可对本发明的示例性实施例进行各种修改和改变。

Claims (10)

1.一种多层组织工程化仿生骨膜支架，其特征在于，包括层层叠加的矿化纳米纤维膜-细胞复合层，所述矿化纳米纤维膜-细胞复合层包括矿化纳米纤维膜和接种于矿化纳米纤维膜上的干细胞；所述矿化纳米纤维膜-细胞复合层大于等于3层；
所述多层组织工程化仿生骨膜支架的制备方法包括以下步骤：
S1. 制备纳米纤维膜：采用静电纺丝法制备纳米纤维膜；
S2. 矿化：将S1制得的纳米纤维膜表面包覆“胶原-PSS-胶原”三层包衣后，置于模拟体液中孵育，使磷酸钙有序沉积在纳米纤维膜上，得到矿化纳米纤维膜；
S3. 接种：将干细胞接种于矿化纳米纤维膜上，得到矿化纳米纤维膜-细胞复合层；
S4. 叠加：将S3得到的矿化纳米纤维膜-细胞复合层进行层层叠加，得到多层组织工程化仿生骨膜支架；具体操作步骤包括：
S41. 配制胶原溶液：将胶原蛋白溶解于醋酸溶液中得到胶原蛋白含量为3-10wt.%胶原溶液；
S42. 吸取胶原溶液铺展于S3得到的矿化纳米纤维膜-细胞复合层上，然后将矿化纳米纤维膜-细胞复合层进行层层叠加，叠加完毕后于37±1℃孵育5-20min，再于培养基中培养24小时以上，得到多层组织工程化仿生骨膜支架。
2.根据权利要求1所述的一种多层组织工程化仿生骨膜支架，其特征在于，所述矿化纳米纤维膜-细胞复合层为5层。
3.根据权利要求1或2所述的一种多层组织工程化仿生骨膜支架，其特征在于，所述干细胞为间充质干细胞。
4.根据权利要求3所述的多层组织工程化仿生骨膜支架，其特征在于，所述纳米纤维膜为可降解高分子材料制成。
5.根据权利要求4所述的多层组织工程化仿生骨膜支架，其特征在于，所述纳米纤维膜为聚己内酯纳米纤维膜。
6.根据权利要求4所述的多层组织工程化仿生骨膜支架，其特征在于，纳米纤维膜中纳米纤维的直径为200-500nm。
7.根据权利要求1所述的多层组织工程化仿生骨膜支架，其特征在于，所述S2中，孵育条件为37±1℃孵育0.5~4小时。
8.根据权利要求1所述的多层组织工程化仿生骨膜支架，其特征在于，干细胞接种数量为1×104~10×104/cm2。
9.根据权利要求8所述的多层组织工程化仿生骨膜支架，其特征在于，干细胞接种数量为8.8×104/cm2。
10.权利要求1-9任意一项所述的多层组织工程化仿生骨膜支架在制备促进骨生长材料中的应用。
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