CN114949339A - 一种封装纳米酶和外泌体的多功能水凝胶的制备方法及应用 - Google Patents

一种封装纳米酶和外泌体的多功能水凝胶的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物材料和生物应用领域，具体涉及一种封装纳米酶和外泌体的多功能水凝胶的制备方法及应用，包括如下步骤：从碱/尿素体系均相反应得到不同取代度和不同脱乙酰度的甲壳素/壳聚糖衍生物；加入偶联剂和苯硼酸溶液反应，得到苯硼酸改性的甲壳素/壳聚糖衍生物；加入纳米酶和外泌体溶液，得到封装纳米酶和外泌体的多功能水凝胶。本发明制备的水凝胶突破了传统水凝胶敷料功能单一，对伤口覆盖不彻底，无法有效调节伤口微环境等缺点，具有可注射、自愈合、自适应性、抗菌性和抗氧化活性，并可以显著促进糖尿病慢性创面愈合，而且治疗效果明显优于临床上用于治疗糖尿病足的商业敷料。

Description

一种封装纳米酶和外泌体的多功能水凝胶的制备方法及应用
技术领域
本发明属于生物材料和生物应用领域，具体涉及一种封装纳米酶和外泌体的多功能水凝胶的制备方法及应用。
背景技术
甲壳素是自然界含量最丰富的氨基多糖，甲壳素经过脱乙酰处理可以得到壳聚糖，它们均具有良好的生物相容性、生物可降解性、来源广泛且成本低廉等优点，是制备医用敷料的理想原料。由于甲壳素难溶于大部分溶剂，其开发和利用一直受到限制。
近年来随着人口老龄化加剧，患有糖尿病足等慢性创面的患者数量与日俱增。糖尿病患者伤口部位的持续高血糖和反复感染会导致难以根除的细菌生物膜和过度的氧化应激，不仅会诱发剧烈的炎症反应，还会损伤正常细胞和组织，最终导致糖尿病伤口难以愈合。由于糖尿病伤口的复杂性，功能单一的伤口治疗材料无法发挥出足够的愈合效果，因此，智能化设计出多功能的促伤口愈合敷料至关重要。由生物相容性大分子组成的水凝胶材料被认为在伤口治疗中具有显著的优势，它们为伤口提供了一个水合微环境，为微生物感染和潮湿环境提供物理屏障，并具有良好的载药能力。值得注意的是，传统的水凝胶功能单一，粘附性差，固定困难，覆盖不彻底，而自适应的多功能水凝胶具有可注射的微创给药模式和强大的成型能力，可以适应伤口缺陷的不规则形状。此外，如果水凝胶本身能够发挥抗细菌感染或促进血管生成的活性，并且不需要封装抗生素或添加促血管生成因子，将是非常理想的。鉴于这些情况，开发一种用于慢性糖尿病伤口治疗的、具有自适应性、内在抗菌性、可调节伤口微环境且制备简易的水凝胶仍然具有挑战性。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种封装纳米酶和外泌体的多功能水凝胶的制备方法，制备工艺简便，易于调节，制备的水凝胶具有优异的生物活性，可用于促进糖尿病创面愈合。
本发明的目的之二在于提供一种封装纳米酶和外泌体的多功能水凝胶的应用。
本发明实现目的之一所采用的方案是：一种封装纳米酶和外泌体的多功能水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
(1)配制浓度为5wt％～30wt％的氢氧化钾、浓度为1wt％～20wt％的尿素和水的混合液，将不同脱乙酰度的甲壳素或壳聚糖粉末分散在上述溶液中，并于(-30)～5℃溶解，加入衍生化试剂，于0-60℃反应，反应完成后调节pH至中性并透析，得到不同取代度和不同脱乙酰度的甲壳素/壳聚糖衍生物；
(2)将步骤(1)得到的甲壳素/壳聚糖衍生物分散在水中，调节溶液pH至4.0-6.0，依次加入偶联剂和苯硼酸溶液进行反应，得到苯硼酸改性甲壳素/壳聚糖衍生物；
(3)将纳米酶和外泌体分散在水、PBS或生理盐水溶液中，配制成纳米酶和外泌体溶液，加入步骤(2)得到的苯硼酸改性甲壳素/壳聚糖衍生物，混合均匀后，得到封装纳米酶和外泌体的多功能水凝胶。
步骤(1)中采用本课题组已经公开的溶解方式进行甲壳素或壳聚糖的溶解，制备的甲壳素或壳聚糖溶液的浓度为0.5wt％-12wt％。
步骤(3)中，分离提取外泌体的方法为：收集细胞培养24h后的培养基上清，首先通过两次离心，除去细胞碎片，收集上清液。然后将收集的上清液进行超高速离心，并收集沉淀(外泌体)。经过洗涤后，用PBS溶液重悬外泌体，并在-80℃保存直到进一步使用。此外，步骤(3)中的离心方法如下：300×g离心15分钟，2000×g离心30分钟，弃去细胞碎片；收集的上清液在100000×g离心1小时，得到外泌体沉淀备用。
纳米酶的制备方法为：例如，二氧化铈纳米粒子制备方法如下：将0.43g乙酸铈和3.25g油胺加入15mL二甲苯中，所得溶液在室温下搅拌2h，然后在真空下加热到90℃。在90℃剧烈搅拌下，将1mL去离子水注入溶液中，溶液颜色变为米白色。将得到的混合物在90℃下陈化3h，得到浅黄色的胶体溶液，然后冷却至室温。加入乙醇(100mL)使二氧化铈纳米粒子沉淀，沉淀物用乙醇和丙酮洗涤，离心得到的二氧化铈纳米粒子分散在有机溶剂中，并在4℃保存直到进一步使用。
苯硼酸溶液的配制方法为：将苯硼酸溶于有机溶剂中，一般浓度为0.5wt％-20wt％，此为常规操作，一般采用的有机溶剂为二甲基亚砜。
优选地，所述步骤(1)中，甲壳素/壳聚糖衍生物的脱乙酰度为4.8％及以上，取代度为0.14-1.82。
优选地，所述步骤(1)中，衍生化试剂为烷基化试剂、羧基化试剂、羟基化试剂、胍基化试剂、酰胺化试剂、季铵化试剂中的至少一种。
一般，衍生物试剂为氯乙酸、氯丙酸、氯丁酸、氯乙酸钠、环氧乙烷、2,3-环氧丙基三甲基氯化铵、2,3-环氧丙基三丙基氯化铵、氯乙烷、3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵、硫酸二甲酯、对甲基苯磺酰氯、甲脒亚磺酸、二氰二胺、琥珀酸酐、马来酸酐、丙烯酰胺、丙烯腈中的至少一种。
优选地，所述步骤(2)中，苯硼酸为：3-羧基苯硼酸、4-羧基苯硼酸、3-氟-4羧基苯硼酸中的至少一种。
优选地，所述步骤(2)中，偶联剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺或1,3-二环己基碳二亚胺。
优选地，所述步骤(2)中，甲壳素/壳聚糖衍生物的浓度为0.5wt％-20wt％，苯硼酸与甲壳素/壳聚糖衍生物的氨基摩尔比为1:5～10:1，苯硼酸改性甲壳素/壳聚糖的取代度为0.1-1.0。
优选地，所述步骤(3)中，纳米酶为具有清除活性氧性能的金属纳米粒子。一般，纳米酶为二氧化铈纳米粒子、二氧化锰纳米片、过氧化钙纳米粒子中的至少一种。
优选地，所述步骤(3)中，外泌体来自于多能干细胞、胚胎干细胞、间充质干细胞、脂肪干细胞中的至少一种。
优选地，所述步骤(3)中，纳米酶和外泌体溶液中纳米酶浓度为25-800μg/mL，外泌体的浓度为1×105～9×109个/mL，苯硼酸改性甲壳素/壳聚糖衍生物的浓度为0.5wt％～20wt％。
步骤(3)中，将体系置于常温中即可发生自凝胶化，一般温度范围为4-37℃。
制备的封装纳米酶和外泌体的多功能水凝胶中甲壳素衍生物材料或壳聚糖衍生物材料的浓度为0.5wt％～20wt％。
本发明实现目的之二所采用的方案是：一种所述的制备方法制备的封装纳米酶和外泌体的多功能水凝胶的应用，将所述封装纳米酶和外泌体的多功能水凝胶应用于制备创面敷料。
本发明采用的KOH/尿素溶液体系均相法获得的甲壳素/壳聚糖衍生物材料的技术能够简单高效地获得不同功能的甲壳素/壳聚糖衍生物。由于甲壳素/壳聚糖衍生物分子表面含有丰富的氨基(-NH2)，可以与苯硼酸通过偶联反应制备苯硼酸改性的甲壳素/壳聚糖衍生物。由于分子链缠结、氢键和疏水相互作用，该系列衍生物材料加水即可自凝胶化形成性能优异的多功能水凝胶，并且通过调节材料浓度和官能团比例可以控制水凝胶的模量。由于甲壳素/壳聚糖水凝胶具有良好的可注射性和自凝胶性，我们将具有氧化还原性能的纳米酶和干细胞来源的外泌体一步封装到水凝胶中，用于治疗糖尿病足等慢性创面。甲壳素/壳聚糖衍生物都具有很好的生物相容性和生物活性，经过改性之后的衍生物材料加水即可凝胶化，操作简便，而且水凝胶本身具有良好的生物活性，在促进糖尿病创面上展现出优异的性能，且优于临床上用于治疗糖尿病足的水凝胶敷料，具有非常广阔的应用前景。
本发明具有以下优点和有益效果：
本发明开发了一种绿色高效的KOH/尿素水溶液体系，可以实现不同脱乙酰度的甲壳素/壳聚糖的全覆盖溶解，为均相制备不同脱乙酰度的甲壳素/壳聚糖衍生物材料提供高效的衍生化平台。
本发明进一步利用均相改性得到的甲壳素/壳聚糖衍生物，将其苯硼酸化改性，得到了一系列苯硼酸改性的甲壳素/壳聚糖衍生物材料，该系列衍生物在水溶液中通过氢键和疏水相互作用自组装形成物理交联的甲壳素/壳聚糖水凝胶。针对伤口处高活性氧和缺氧的微环境，本发明将具有高效氧化催化性能的纳米酶封装至多糖水凝胶中。此外，外泌体是细胞分泌的纳米大小的囊泡，作为细胞间的通讯介质行使其功能。本发明通过将外泌体封装至水凝胶中，提高材料的体内促伤口愈合功能。封装纳米酶和外泌体的水凝胶突破了传统水凝胶敷料功能单一，对伤口覆盖不彻底，无法有效调节伤口微环境等缺点，并具有良好的自修复、可注射、自适应性、抗菌性和促愈合性能。
本发明通过智能化设计得到纳米酶和外泌体封装的多功能甲壳素/壳聚糖基水凝胶，通过实验证明：纳米酶和外泌体封装的多功能甲壳素/壳聚糖基水凝胶可以有效地促进糖尿病创面愈合，且治疗效果明显优于临床上用于治疗糖尿病足的商业敷料。
附图说明
图1分别为实施例49制备的季铵化壳聚糖水溶液(a)，实施例93制备的苯硼酸改性的甲壳素季铵盐水凝胶(b)，实施例97制备的苯硼酸改性的壳聚糖季铵盐水凝胶(c)；
图2分别为实例104中表中的水凝胶18的扫描电镜图(a)，水凝胶11的扫描电镜图(b)，及水凝胶11的扫描电镜能谱图片，其中图(c-f)分别为C、N、Cl和Ce元素的分布；
图3为空白对照组(a)、实施例104中水凝胶18(b)和实施例104中水凝胶11(c)的对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和耐药金黄色葡萄球菌的抗菌活性图；
图4为实施例104中水凝胶18和11的促进耐药金黄色葡萄球菌感染的糖尿病创面愈合进程，以商用的水凝胶敷料和空白对照组分别为阳性对照和阴性对照，从a-d分别为，商用水凝胶组(Tegaderm3M)，季铵化壳聚糖水凝胶(水凝胶18)，封装纳米酶的季铵化壳聚糖水凝胶(水凝胶11)和空白对照组。
具体实施方式
为更好的理解本发明，下面的实施例是对本发明的进一步说明，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1：
配制98g含5wt％～30wt％氢氧化钾，1wt％～20wt％尿素的水溶液，预冷至–30℃，室温下加入2g甲壳素，机械搅拌30分钟后得到透明澄清的2wt％甲壳素溶液；向甲壳素溶液中加入5.96g 3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵，使得季铵化试剂与甲壳素单元的摩尔比为4:1，反应温度25℃，搅拌24小时后加入HCl中和反应液；反应液经蒸馏水透析7天，冷冻干燥，即得到白色纤维状甲壳素季铵盐，测得产物的取代度为0.18，脱乙酰度为15％。
实施例2～12的制备方法与实施例1类似，区别点如下表1所示。
表1实施例2～12制备参数与所得甲壳素季铵盐产物的取代度和产物脱乙酰度
Figure BDA0003686202050000051
实施例13：
配制98g含5wt％～30wt％氢氧化钾，1wt％～20wt％尿素的水溶液，预冷至–30℃，室温下加入2g甲壳素，机械搅拌30分钟后得到透明澄清的2wt％甲壳素溶液；向甲壳素溶液中加入5.96g环氧乙烷，使得环氧乙烷与甲壳素单元的摩尔比为4:1，反应温度25℃，搅拌24小时后加入HCl中和反应液；反应液经蒸馏水透析7天，冷冻干燥，即得到白色纤维状羟烷基化甲壳素，测得所得产物取代度为0.18，脱乙酰度为15％。
实施例14～25的制备方法与实施例13类似，区别点如下表2所示。
表2实施例14～18制备参数与产物参数
Figure BDA0003686202050000052
Figure BDA0003686202050000061
实施例26：
配制98g含5wt％～30wt％氢氧化钾，1wt％～20wt％尿素的水溶液，预冷至–30℃，室温下加入2g甲壳素，机械搅拌30分钟后得到透明澄清的2wt％甲壳素溶液；向甲壳素溶液中加入5.96g琥珀酸酐，使得琥珀酸酐与甲壳素单元的摩尔比为4:1，反应温度25℃，搅拌24小时后加入HCl中和反应液；反应液经蒸馏水透析7天，冷冻干燥，即得到白色纤维状琥珀酸酐化甲壳素，测得产物取代度为0.18，脱乙酰度为15％。
实施例27～38的制备方法与实施例26类似，区别点如下表3所示。
表3实施例27～38制备参数与产物参数
Figure BDA0003686202050000062
Figure BDA0003686202050000071
实施例39：
配制98g含5wt％～30wt％氢氧化钾，1wt％～20wt％尿素的水溶液，预冷至–30℃，室温下加入2g壳聚糖，机械搅拌30分钟后得到透明澄清的2wt％壳聚糖溶液；向壳聚糖溶液中加入5.96g季铵化试剂，使得季铵化试剂与壳聚糖单元的摩尔比为4:1，反应温度25℃，搅拌24小时后加入HCl中和反应液；反应液经蒸馏水透析7天，冷冻干燥，即得到白色纤维状壳聚糖季铵盐，测得所得产物取代度为0.18，脱乙酰度为55％。
实施例40～51制备方法与实施例39类似，区别点如下表4所示。
表4实施例40～51制备参数与产物参数
Figure BDA0003686202050000072
实施例52：
配制98g含5wt％～30wt％氢氧化钾，1wt％～20wt％尿素的水溶液，预冷至–30℃，室温下加入2g壳聚糖，机械搅拌30分钟后得到透明澄清的2wt％壳聚糖溶液；向壳聚糖溶液中加入5.96g氯乙酸钠，使得羧甲基化试剂与壳聚糖单元的摩尔比为4:1，反应温度25℃，搅拌24小时后加入HCl中和反应液；反应液经蒸馏水透析7天，冷冻干燥，即得到白色纤维状羧甲基壳聚糖，测得所得产物取代度0.18，脱乙酰度55％。
实施例53～64制备方法与实施例52类似，区别点如下表5所示。
表5实施例53～64制备参数与产物参数
Figure BDA0003686202050000081
实施例65：
配制98g含5wt％～30wt％氢氧化钾，1wt％～20wt％尿素的水溶液，预冷至–30℃，室温下加入2g壳聚糖，机械搅拌30分钟后得到透明澄清的2wt％壳聚糖溶液；向壳聚糖溶液中加入5.96g硫酸二甲酯，使得硫酸二甲酯与壳聚糖单元的摩尔比为4:1，反应温度25℃，搅拌24小时后加入HCl中和反应液；反应液经蒸馏水透析7天，冷冻干燥，即得到白色纤维状壳聚糖季铵盐，测得所得产物取代度为0.18，脱乙酰度为55％。
实施例66～77制备方法与实施例65类似，区别点如下表6所示。
表6实施例66～77制备参数与产物参数
Figure BDA0003686202050000082
Figure BDA0003686202050000091
实施例78：
配制98g含5wt％～30wt％氢氧化钾，1wt％～20wt％尿素的水溶液，预冷至–30℃，室温下加入2g壳聚糖，机械搅拌30分钟后得到透明澄清的2wt％壳聚糖溶液；向壳聚糖溶液中加入5.96g甲脒亚磺酸，使得甲脒亚磺酸与壳聚糖单元的摩尔比为4:1，反应温度25℃，搅拌24小时后加入HCl中和反应液；反应液经蒸馏水透析7天，冷冻干燥，即得到白色纤维状胍基化壳聚糖，测得所得产物取代度为0.18，脱乙酰度为55％。
实施例79-90制备方法与实施例78类似，区别点如下表7所示。
表7实施例79-90制备参数与产物参数
Figure BDA0003686202050000092
Figure BDA0003686202050000101
实施例91：
采用上述实施例中制备得到的甲壳素/壳聚糖衍生物材料，溶解在pH为4.0～6.0的MES缓存溶液中，配置成1wt％(一般控制浓度为0.5wt％-20wt％，本实施例中优选1wt％)的甲壳素/壳聚糖衍生物溶液，然后将一定量的羧基苯硼酸(羧基与氨基摩尔比为1:1)溶于DMSO中，加入上述1wt％的甲壳素/壳聚糖衍生物溶液中，在25℃条件下反应24h，反应液经蒸馏水透析7天，冷冻干燥，即得到白色纤维状苯硼酸改性的甲壳素/壳聚糖衍生化样品，测得所得产物取代度0.18。
实施例92-103制备方法与实施例91类似，区别点如下表8所示。
表8实施例92-103制备参数与产物参数
Figure BDA0003686202050000102
实施例104：
将苯硼酸改性的甲壳素衍生物或壳聚糖衍生物置于含纳米酶和外泌体的溶液中，可自凝胶化形成不同质量分数的甲壳素或壳聚糖水凝胶，其中不同含量的纳米酶和外泌体的水凝胶组分如下表9所示。
表9封装纳米酶和外泌体多功能水凝胶组分参数
Figure BDA0003686202050000111
Figure BDA0003686202050000121
利用实施例49制备得到的季铵化壳聚糖，将其溶解在水中可以得到2％的季铵化壳聚糖溶液(附图1a)；将实施例93制备得到的苯硼酸改性的季铵化甲壳素分散在水中，即可得到苯硼酸改性的季铵化甲壳素水凝胶(附图1b)；将实施例97制备得到的苯硼酸改性的季铵化壳聚糖分散在水中，即可得到苯硼酸改性的季铵化壳聚糖水凝胶(附图1c)。
实施例104中水凝胶11的制备方法为将实施例97得到的苯硼酸改性的季铵化壳聚糖分散在含纳米酶和外泌体的水溶液中，实施例104中水凝胶18的制备方法为将实施例97得到的苯硼酸改性的季铵化壳聚糖分散在水中。利用扫描电镜对水凝胶18和水凝胶11的物理形貌进行分析，他们均有纳米纤维构成的三维立体结构(附图2a)，且封装纳米酶的水凝胶11中可以看到Ce元素的均匀分布，说明二氧化铈纳米粒子均匀分布其中(附图2b-f)。
实施例105：
选择不同的大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)和耐甲氧西林菌(MRSA)，利用平板稀释涂板法对水凝胶11和18的抗菌性质进行评价，如附图3所示，水凝胶11和18可以完全杀死三种细菌，表现优异的抗菌活性。
利用MRSA感染的糖尿病小鼠伤口模型来评估多功能水凝胶的体内抗感染和促愈合效果，以PBS处理组为阴性对照，以商用的糖尿病足Tegaderm3M水凝胶敷料作为阳性对照，Tegaderm3M hydrogel是3M公司生产的一款温和无刺激和有效抑菌的水凝胶敷料，其主要成分为四硼酸钠、水、丙二醇和瓜尔豆胶，临床上常被用来治疗糖尿病足。利用MRSA对糖尿病伤口感染两天形成细菌生物膜，然后用实施例104中水凝胶11和18进行处理，伤口愈合进展的结果表明，在愈合的过程中，负载纳米酶和外泌体的多功能壳聚糖水凝胶(水凝胶11)表现出了四组中最优异的抗菌效果：MRSA生物膜被有效地清除和抑制(附图4c)。空白对照组和Tegaderm3M的伤口呈黄色，并且在愈合过程中观察到持续存在的、大量的伤口渗出物(附图4a)，这与多功能壳聚糖水凝胶处理的伤口明显不同，后者的伤口更干净，渗出物更少(附图4b-c)。
以上所述是本发明的优选实施方式而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和变动，这些改进和变动也视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种封装纳米酶和外泌体的多功能水凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)配制浓度为5wt％～30wt％的氢氧化钾、浓度为1wt％～20wt％的尿素和水的混合液，将不同脱乙酰度的甲壳素或壳聚糖粉末分散在上述溶液中，并于(-30)～5℃溶解，加入衍生化试剂，于0-60℃反应，反应完成后调节pH至中性并透析，得到不同取代度和不同脱乙酰度的甲壳素/壳聚糖衍生物；
(2)将步骤(1)得到的甲壳素/壳聚糖衍生物分散在水中，调节溶液pH至4.0-6.0，依次加入偶联剂和苯硼酸溶液进行反应，得到苯硼酸改性甲壳素/壳聚糖衍生物；
(3)将纳米酶和外泌体分散在水、PBS或生理盐水溶液中，配置成纳米酶和外泌体溶液，加入步骤(2)得到的苯硼酸改性甲壳素/壳聚糖衍生物，混合均匀后，得到封装纳米酶和外泌体的多功能水凝胶。
2.根据权利要求1所述的封装纳米酶和外泌体的多功能水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，甲壳素/壳聚糖衍生物的脱乙酰度为4.8％及以上，取代度为0.14-1.82。
3.根据权利要求1所述的封装纳米酶和外泌体的多功能水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，衍生化试剂为烷基化试剂、羧基化试剂、羟基化试剂、胍基化试剂、酰胺化试剂、季铵化试剂中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的封装纳米酶和外泌体的多功能水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，苯硼酸为：3-羧基苯硼酸、4-羧基苯硼酸、3-氟-4羧基苯硼酸中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的封装纳米酶和外泌体的多功能水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，偶联剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺或1,3-二环己基碳二亚胺。
6.根据权利要求1所述的封装纳米酶和外泌体的多功能水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，甲壳素/壳聚糖衍生物的浓度为0.5wt％-20wt％，苯硼酸与甲壳素/壳聚糖衍生物的氨基摩尔比为1:5～10:1，苯硼酸改性甲壳素/壳聚糖衍生物的取代度为0.1-1.0。
7.根据权利要求1所述的封装纳米酶和外泌体的多功能水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中，纳米酶为具有清除活性氧性能的金属纳米粒子。
8.根据权利要求1所述的封装纳米酶和外泌体的多功能水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中，外泌体来自于多能干细胞、胚胎干细胞、间充质干细胞、脂肪干细胞中的至少一种。
9.根据权利要求1所述的封装纳米酶和外泌体的多功能水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中，纳米酶和外泌体溶液中纳米酶浓度为25-800μg/mL，外泌体浓度为1×105～9×109个/mL，苯硼酸改性甲壳素/壳聚糖衍生物的浓度为0.5wt％～20wt％。
10.一种如权利要求1-9任一项所述的制备方法制备的封装纳米酶和外泌体的多功能水凝胶的应用，其特征在于：将所述封装纳米酶和外泌体的多功能水凝胶应用于制备创面敷料。
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