CN114935655A - 一种猪il-17胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒及其制备使用方法 - Google Patents

一种猪il-17胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒及其制备使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种猪IL‑17胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒，包括试剂R1和试剂R2；试剂R1包括MOPS、KH2PO4、NaCl、山梨酸钾、EDTA；试剂R2包括MOPS、PEG8000、BSA、NaCl、偶联rpIL‑17A‑IgG的胶乳微球等。本发明还提供了上述猪IL‑17胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒的制备与使用方法。本发明首次利用胶乳增强免疫比浊法来测定猪IL‑17，在成本上可以做到0.7元/样本，大大降低了养殖户检测负担；并且，通过全自动生化分析仪进行检测，实现检测自动化，能满足临床大量样本检测的需求；同时，本发明试剂盒与ELISA法在准确度与灵敏度方面无差异性，具有高特异性和敏感性。

Description

一种猪IL-17胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒及其制备使用 方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术及免疫学测定分析领域，尤其涉及一种猪IL-17胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒及其制备使用方法。
背景技术
白细胞介素17(Interleukin-17，IL-17)是体内重要的促炎症细胞因子，由155～197个氨基酸构成，分子量约为20～30kDa，主要由活化的T淋巴细胞分泌。IL-17家族以同源或异源二聚体的形式行使功能，在炎症反应和免疫系统中有调节作用，如IL-17介导的信号通路涉及到造血系统和免疫系统，促进免疫系统中多种细胞的成熟与分化。在机体感染或受损伤的时候，迁移的淋巴细胞会在此处分泌IL-17，诱导趋化因子的表达，诱导表达组织修复相关因子以加速机体的恢复。IL-17可以诱导很多炎症因子的表达，因此在很多自身免疫病或肿瘤患者体内，过高的IL-17水平对于疾病的病理发展会起到恶化作用，在正常宿主体内抗感染和组织修复过程当中IL-17发挥扩大免疫防御反应保护自身机体的重要作用。最新的研究表明，IL-17A在黏膜免疫中起重要作用，IL-17A可促进抗体的生成。因此，在使用昂贵的黏膜免疫类疫苗前检测IL-17A的含量很有必要。IL-17作为体内炎性标记分子之一，对于炎症判定具有重要意义。
目前，猪白介素17(猪IL-17)检测方法有且仅有ELISA一种方法；在人用白介素检测方面虽有化学发光、ELISA和胶乳增强免疫比浊法，但尚未有IL-17的检测方法。其中，尚无IL-17胶乳增强免疫比浊法检测试剂的原因在于：IL-17主要以二聚体的形式存在并发挥作用，因此抗原和抗体的制备存在较大的困难，成本极高。而ELISA方法，其可以用生物素作为标记，如Abcam公司方案，但ELISA检测相对于胶乳增强免疫比浊法来说耗时过长，完整检测过程需要1.5h，而胶乳增强免疫比浊法只需要15min。同时，ELISA检测试剂盒平均单个样本检测成本最低126元，过高的成本导致该方法对于养殖户来说无法做大面积筛查使用。而化学发光法，其成本普遍比ELISA成本要高，更无法在养殖场使用。
因此，目前急需一种猪白介素17胶乳增强免疫比浊检测试剂盒，并使其保持较高准确度和灵敏度的同时，还能进一步地提高检测速度、降低检测成本。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种准确度高、灵敏度好、检测耗时短快、检测成本低，且适用于各类全自动生化分析仪的基于多克隆抗体偶联底物的猪IL-17胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒及其制备使用方法。
本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
一种猪IL-17胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
Figure BDA0003698286820000021
其溶剂为纯化水；
试剂R2：
Figure BDA0003698286820000022
其溶剂为纯化水。
作为本发明的优选方式之一，包括的成分及相应含量具体为：
试剂R1：
Figure BDA0003698286820000023
其溶剂为纯化水；
试剂R2：
Figure BDA0003698286820000024
Figure BDA0003698286820000031
其溶剂为纯化水。
作为本发明的优选方式之一，还包括IL-17A校准品，包括的成分及相应含量为：
Figure BDA0003698286820000032
其溶剂为纯化水。
作为本发明的优选方式之一，所述IL-17A校准品包括的成分及相应含量具体为：
Figure BDA0003698286820000033
其溶剂为纯化水。
作为本发明的优选方式之一，所述IL-17A校准品中的rpIL-17A为重组猪IL-17A蛋白，获取方法为：
①猪白介素17A基因的获取：
参考Genbank登录号NM_001005729.1获得猪白介素17A的CDS序列和氨基酸序列，对氨基酸序列进行分析，删除信号肽，获得猪白介素17A有效序列；取GGGGSGGGGSGGGGS作为柔性linker，将获得的两段猪白介素17A序列连接起来，并在序列首尾加BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点及保护碱基，做大肠杆菌密码子优化，最终获得如SEQ ID NO.1所示基因序列；
得到基因序列后，送基因公司合成，测序合格，获得目标基因序列；
②表达载体构建：
使用BamHⅠ和XhoⅠ两种内切酶对合成的基因及pET32a质粒进行双酶切，将双酶切产物使用T4连接酶连接，并导入感受态细胞中；不含抗性的LB培养基37℃、220rpm发酵2h，涂布于含氨苄的LB培养基平板培养过夜，取氨苄LB平板上生长的单菌落扩大培养后提质粒进行基因测序，以鉴定目的基因；当鉴定为阳性克隆时，即表示表达载体构建成功，记为rpIL-17A工程菌；
③重组猪IL-17A的表达和纯化：
取rpIL-17A工程菌于含氨苄的LB培养基中37℃、220rpm发酵6h至OD值达到0.6时，加入诱导剂IPTG于16℃、220rpm诱导表达8h；收集细菌，7500r/min离心30min取菌体；加入质量体积比1:2的PBS重悬沉淀，经高压均质机0.2Mpa破碎3次，12000r/min离心15min取上清；
使用肠激酶于23℃酶切过夜；将酶切后蛋白过滤处理后过GST亲和层析柱收集rpIL-17A峰；过脱盐柱，平衡好柱体，用Elution buffer梯度洗脱，收集rpIL-17A峰，过分子筛层析柱，Elution buffer收集rpIL-17A峰；
使用IL-17A抗体为一抗，使用HRP标记山羊抗兔IgG为第二抗体做WB，样本在48kD处均有阳性条带，即表明重组猪IL-17A成功表达；纯化后的蛋白记为rpIL-17A，无菌分装保存备用。
作为本发明的优选方式之一，所述偶联rpIL-17A-IgG的胶乳微球的获取方法为：使用直径30～60nm的聚苯乙烯胶乳微球，并采用共价偶联法将兔抗猪IL-17A多克隆抗体交联到聚苯乙烯胶乳微球上。
作为本发明的优选方式之一，所述兔抗猪IL-17A多克隆抗体的制备方法为：
①家兔的免疫：
选择3月龄、体重2.3kg的雄性新西兰家兔，取1mL rpIL-17A抗原与相同体积的弗氏佐剂充分匀浆形成稳定乳液，记为乳化抗原；每只兔的背部多点注射乳化抗原，进行第1次免疫；7日后进行第2次免疫，免疫方案如前；21日后进行第3次免疫，免疫方案如前；42日后进行第4次免疫，免疫方案如前；49日后进行第5次免疫，采用耳缘静脉注射2mL rpIL-17A抗原；55日取耳缘静脉血使用琼脂双扩散法测抗体效价，测得效价1:64及以上，如未达到加强免疫至达到效价1:64终止免疫；采用心脏采血获得全血；
②多克隆抗体的纯化：
将上述步骤获得的全血于4℃划十字口静置2h，37℃回温30min；于4℃，3000r/min离心15min，取上清，加入等体积的PBS混匀得混合液，向混合液中再缓慢滴加同等体积的饱和硫酸铵，于4℃静置6h后4℃，4200r/min离心30min；
取沉淀用200mL的PBS溶解，加入总体积量33％的饱和硫酸铵，在4℃下静置3h后，4℃、4200r/min离心30min；取沉淀，用200mL的PBS溶解，加入总体积量33％的饱和硫酸铵，4℃下静置3h后，4℃、4200r/min离心30min；取沉淀，用200mL的PBS溶解，装入透析袋；最后，将其置于4℃环境下，采用20倍体积的PBS透析液(pH7.2)透析12h除盐，即得兔抗猪IL-17A多克隆抗体，记为rpIL-17A-IgG；
③多克隆抗体的验证：
使用rpIL-17A为抗原，上述制备的rpIL-17A-IgG为第一抗体，使用HRP标记山羊抗兔IgG为第二抗体做Western blot实验，抗原在48kD处有阳性条带产生；因rpIL-17A已经商品化抗体验证，使用多克隆抗体rpIL-17A-IgG验证rpIL-17A同样出现阳性条带，表明多克隆抗体制备成功。
一种上述猪IL-17胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒的制备方法，包括如下具体步骤：
(1)rpIL-17A的制备
①猪白介素17A基因的获取：
参考Genbank登录号NM_001005729.1获得猪白介素17A的CDS序列和氨基酸序列，对氨基酸序列进行分析，删除信号肽，获得猪白介素17A有效序列；取GGGGSGGGGSGGGGS作为柔性linker，将获得的两段猪白介素17A序列连接起来，并在序列首尾加BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点及保护碱基，做大肠杆菌密码子优化，最终获得如SEQ ID NO.1所示基因序列；
得到基因序列后，送基因公司合成，测序合格，获得目标基因序列；
②表达载体构建：
使用BamHⅠ和XhoⅠ两种内切酶对合成的基因及pET32a质粒进行双酶切，将双酶切产物使用T4连接酶连接，并导入感受态细胞中；不含抗性的LB培养基37℃、220rpm发酵2h，涂布于含氨苄的LB培养基平板培养过夜，取氨苄LB平板上生长的单菌落扩大培养后提质粒进行基因测序，鉴定目的基因；当鉴定为阳性，即表示表达载体构建成功，记为rpIL-17A工程菌；
③重组猪IL-17A的表达和纯化：
取rpIL-17A工程菌于含氨苄的LB培养基中37℃、220rpm发酵6h至OD值达到0.6时，加入诱导剂IPTG于16℃、220rpm诱导表达8h；收集细菌，7500r/min离心30min取菌体；加入质量体积比1:2的PBS重悬沉淀，经高压均质机0.2Mpa破碎3次，12000r/min离心15min取上清；
使用肠激酶于23℃酶切过夜；将酶切后蛋白过滤处理后过GST亲和层析柱收集rpIL-17A峰；过脱盐柱，平衡好柱体，用Elution buffer梯度洗脱，收集rpIL-17A峰，过分子筛层析柱，Elution buffer收集rpIL-17A峰；
使用IL-17A抗体为一抗，使用HRP标记山羊抗兔IgG为第二抗体做Western blot实验，样本在48kD处均有阳性条带，即表明重组猪IL-17A成功表达；纯化后的蛋白记为rpIL-17A，无菌分装保存备用；
(2)兔抗猪IL-17A多克隆抗体的制备：
①家兔的免疫：
选择3月龄、体重2.3kg的雄性新西兰家兔，取1mL rpIL-17A抗原与相同体积的弗氏佐剂充分匀浆形成稳定乳液，记为乳化抗原；每只兔的背部多点注射乳化抗原，进行第1次免疫；7日后进行第2次免疫，免疫方案如前；21日后进行第3次免疫，免疫方案如前；42日后进行第4次免疫，免疫方案如前；49日后进行第5次免疫，采用耳缘静脉注射2mL rpIL-17A抗原；55日取耳缘静脉血使用琼脂双扩散法测抗体效价，测得效价1:64及以上，如未达到加强免疫至达到效价1:64终止免疫；采用心脏采血获得全血；
②多克隆抗体的纯化：
将上述步骤获得的全血于4℃划十字口静置2h，37℃回温30min；于4℃，3000r/min离心15min，取上清，加入等体积的PBS混匀得混合液，向混合液中再缓慢滴加同等体积的饱和硫酸铵，于4℃静置6h后4℃，4200r/min离心30min；
取沉淀用200mL的PBS溶解，加入总体积量33％的饱和硫酸铵，4℃下静置3h后，4℃、4200r/min离心30min；取沉淀，用200mL的PBS溶解，加入总体积量33％的饱和硫酸铵，4℃下静置3h后，4℃、4200r/min离心30min；取沉淀，用200mL的PBS溶解，装入透析袋；最后，将其置于4℃环境下，采用20倍体积的PBS透析液(pH7.2)透析12h除盐，即得兔抗猪IL-17A多克隆抗体，记为rpIL-17A-IgG；
③多克隆抗体的验证：
使用rpIL-17A为抗原，上述制备的rpIL-17A-IgG为第一抗体，使用HRP标记山羊抗兔IgG为第二抗体做Western blot实验，抗原在48kD处有阳性条带产生；因重组rpIL-17A已经商品化抗体验证，使用多克隆抗体rpIL-17A-IgG验证rpIL-17A同样出现阳性条带，表明多克隆抗体制备成功；
(3)偶联rpIL-17A-IgG的胶乳微球的制备
使用直径30～60nm的聚苯乙烯胶乳微球，并采用共价偶联法将步骤(2)制得的兔抗猪IL-17A多克隆抗体交联到聚苯乙烯胶乳微球上，即得目标所需的偶联rpIL-17A-IgG的胶乳微球；
(4)猪IL-17胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒的制备
①配制试剂R1：
按照试剂R1的组分含量，将各组分物质于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂R1；
②配制试剂R2：
按照试剂R2的组分含量，将步骤(3)制得的偶联rpIL-17A-IgG的胶乳微球以及余下的其他组分物质于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂R2；
③配制IL-17A校准品：
IL-17A校准品包括的成分及相应含量如下：
Figure BDA0003698286820000071
其溶剂为纯化水；
按照试剂上述IL-17A校准品的组分含量，将步骤(1)制得的rpIL-17A以及余下的其他组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得IL-17A校准品。
一种上述猪IL-17胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒的使用方法，包括如下具体步骤：
(1)吸取30μL样本，加入180μL试剂R1，37℃孵育5min；
(2)再加入60μL试剂R2进行混合，并使其充分反应；
(3)1min后读取吸光值A1，3min后读取吸光值A2，计算ΔA；
(4)定标方法为6点定标，采用全自动生化分析仪进行检测，并设置校准品浓度分别为：0、6.25、12.5、25、50、100ng/mL；依据定标值，根据ΔA测算样本中IL-17含量。
本发明首次利用胶乳增强免疫比浊法来测定猪IL-17，并可通过以下两个方面降低试剂盒成本：
一方面，通过取GGGGSGGGGSGGGGS作为柔性linker，将两段猪白介素17A序列连接起来(最终获得如序列1所示基因序列)，并将合成基因连接到表达质粒并导入到细胞中进行发酵表达，从而获得二聚体形式的原核表达蛋白rpIL-17A，进一步的降低了抗原制备成本；
另一方面，采用IL-17A多克隆抗体与较小直径且均一的聚苯乙烯胶乳微球偶联，其中，IL-17A多克隆抗体本身成本不高，且聚苯乙烯胶乳微球较传统的磁珠微球成本低80％，进一步降低抗体制备成本；
经计算与验证，本发明在成本上仅需要0.7元/样本，大大降低了养殖户检测负担；并且，通过全自动生化分析仪进行检测，实现了检测的自动化，更加方便、快捷、节省时间，能够满足临床大量样本检测的需求；同时，本发明可做到较ELISA法相差无几的高准确度与灵敏度；因此，本发明方法可以作为普查方法，应用于高价值黏膜免疫类疫苗使用前的辅助筛查手段。
本发明相比现有技术的优点在于：
(1)相比化学发光法，本发明采用IL-17A多克隆抗体与直径较小且均一的聚苯乙烯胶乳微球偶联，试剂的均匀度较高，且聚苯乙烯胶乳微球较磁珠微球成本低80％，较高浓度的多克隆抗体胶乳微球的适用可以提高本试剂较化学发光的特异度；同时，聚苯乙烯微球偶联抗体工艺较磁珠方法简单便于工业化生产，且在试剂中加入了抗干扰蛋白和表面活性剂，以保证试剂盒的稳定性和精密度；
(2)本发明利用胶乳增强免疫比浊法测定猪白介素17，检测信号倍数放大，达到了与ELISA同等水平的准确度和灵敏度；且可用于全自动生化分析仪，相对于全自动ELISA仪器更加省时，且一次检测样本量较ELISA方法更加灵活；同时，检测成本降低到ELISA方法的1％；提高了猪白介素17检测的临床使用价值。
附图说明
图1是实施例4中重组猪IL-17A的蛋白Western Blot鉴定结果图(图中，泳道M：蛋白Marker 26616；泳道1：重组猪IL-17A纯化后样本)；
图2是实施例4中重组猪IL-17A兔多克隆抗体的Western Blot鉴定结果图(图中，泳道M：蛋白Marker26616；泳道1：猪IL-17A兔多克隆抗体纯化后样本)；
图3是实施例6中本发明试剂盒与Abcam公司商品化猪IL-17A检测试剂盒线性关系曲线图；
图4是实施例6中本发明试剂盒线性范围线性回归图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
本实施例的一种猪IL-17胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
Figure BDA0003698286820000091
其溶剂为纯化水。
试剂R2：
Figure BDA0003698286820000092
其溶剂为纯化水。
此外，还包括IL-17A校准品，包括的成分及相应含量为：
Figure BDA0003698286820000093
Figure BDA0003698286820000101
其溶剂为纯化水。
进一步地，IL-17A校准品中rpIL-17A具体为重组猪IL-17A蛋白(制备方法见实施例4)。
进一步地，试剂R2中偶联rpIL-17A-IgG的胶乳微球的获取方法为：使用直径30～60nm的聚苯乙烯胶乳微球，并采用共价偶联法将兔抗猪IL-17A多克隆抗体(制备方法见实施例4)交联到聚苯乙烯胶乳微球上。
实施例2
本实施例的一种猪IL-17胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
Figure BDA0003698286820000102
其溶剂为纯化水。
试剂R2：
Figure BDA0003698286820000103
其溶剂为纯化水。
此外，还包括IL-17A校准品，包括的成分及相应含量为：
Figure BDA0003698286820000104
Figure BDA0003698286820000111
其溶剂为纯化水。
进一步地，IL-17A校准品中rpIL-17A具体为重组猪IL-17A蛋白(制备方法见实施例4)。
进一步地，试剂R2中偶联rpIL-17A-IgG的胶乳微球的获取方法为：使用直径30～60nm的聚苯乙烯胶乳微球，并采用共价偶联法将兔抗猪IL-17A多克隆抗体(制备方法见实施例4)交联到聚苯乙烯胶乳微球上。
实施例3
本实施例的一种猪IL-17胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
Figure BDA0003698286820000112
其溶剂为纯化水。
试剂R2：
Figure BDA0003698286820000113
其溶剂为纯化水。
此外，还包括IL-17A校准品，包括的成分及相应含量为：
Figure BDA0003698286820000121
其溶剂为纯化水。
进一步地，IL-17A校准品中rpIL-17A具体为重组猪IL-17A蛋白(制备方法见实施例4)。
进一步地，试剂R2中偶联rpIL-17A-IgG的胶乳微球的获取方法为：使用直径30～60nm的聚苯乙烯胶乳微球，并采用共价偶联法将兔抗猪IL-17A多克隆抗体(制备方法见实施例4)交联到聚苯乙烯胶乳微球上。
实施例4
本实施例的一种猪IL-17胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒的制备方法，包括如下具体步骤：
(1)rpIL-17A的制备
①猪白介素17A基因的获取：
参考Genbank登录号NM_001005729.1获得猪白介素17A的CDS序列和氨基酸序列，对氨基酸序列进行分析，删除信号肽，获得猪白介素17A有效序列；取GGGGSGGGGSGGGGS作为柔性linker，将获得的两段猪白介素17A序列连接起来，并在序列首尾加BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点及保护碱基，做大肠杆菌密码子优化，最终获得如SEQ ID NO.1所示基因序列；
得到基因序列后，送送华大基因合成，测序合格，获得目标基因序列。
②表达载体构建：
使用BamHⅠ和XhoⅠ两种内切酶对合成的基因及pET32a质粒进行双酶切，将双酶切产物使用T4连接酶连接，并导入BL21 Star(DE3)pLysS感受态细胞中；不含抗性的LB培养基37℃、220rpm发酵2h，涂布于含氨苄的LB培养基平板培养过夜，取氨苄LB平板上生长的单菌落扩大培养后提质粒送华大基因再次测序，以鉴定目的基因；当鉴定为阳性克隆时，即表示表达载体构建成功，记为rpIL-17A工程菌。
③重组猪IL-17A的表达和纯化：
取rpIL-17A工程菌于含氨苄的LB培养基中37℃、220rpm发酵6h至OD值达到0.6时，加入诱导剂IPTG于16℃、220rpm诱导表达8h；收集细菌，7500r/min离心30min取菌体；加入质量体积比1:2的PBS重悬沉淀，经高压均质机0.2Mpa破碎3次，12000r/min离心15min取上清。
使用ROCHE公司肠激酶(11334115001)于23℃酶切过夜；将酶切后蛋白使用0.45μm滤头过滤处理后过GST亲和层析柱收集rpIL-17A峰；过脱盐柱，平衡好柱体，用Elutionbuffer(25mMTris-Cl，0.5M NaCl，pH8.0)梯度洗脱，收集rpIL-17A峰，过分子筛层析柱，Elution buffer(50mMNa2HPO4，0.15MNaCl，pH7.0)收集rpIL-17A峰。
使用Abcam公司IL-17A抗体(ab193955)为一抗，使用Abcam公司HRP标记山羊抗兔IgG(ab6721)为第二抗体做WB，样本在48kD处均有阳性条带(见图1)；图1中泳道1阳性片段位置大小与预测基本一致，可以判定重组猪IL-17A成功表达。
纯化后的蛋白记为rpIL-17A，无菌分装保存备用。
(2)兔抗猪IL-17A多克隆抗体的制备：
①家兔的免疫：
选择3月龄、体重2.3kg的雄性新西兰家兔，取1mL rpIL-17A抗原(2mg/mL)与相同体积的弗氏佐剂充分匀浆形成稳定乳液，记为乳化抗原；每只兔的背部多点注射乳化抗原，进行第1次免疫；7日后进行第2次免疫，免疫方案如前；21日后进行第3次免疫，免疫方案如前；42日后进行第4次免疫，免疫方案如前；49日后进行第5次免疫，采用耳缘静脉注射2mLrpIL-17A抗原(1mg/mL)；55日取耳缘静脉血使用琼脂双扩散法测抗体效价，测得效价1:64及以上，如未达到加强免疫至达到效价1:64终止免疫；采用心脏采血获得全血。
②多克隆抗体的纯化：
将上述步骤获得的全血于4℃划十字口静置2h，37℃回温30min；于4℃，3000r/min离心15min，取上清，加入等体积的PBS混匀得混合液，向混合液中再缓慢滴加同等体积的饱和硫酸铵，于4℃静置6h后4℃，4200r/min离心30min。
取沉淀用200mL的PBS溶解，加入总体积量33％的饱和硫酸铵，在4℃下静置3h后，4℃、4200r/min离心30min；取沉淀，用200mL的PBS溶解，加入总体积量33％的饱和硫酸铵，4℃下静置3h后，4℃、4200r/min离心30min；取沉淀，用200mL的PBS溶解，装入透析袋(＞10kD)；最后，将其置于4℃环境下，采用20倍体积的PBS透析液(pH7.2)透析12h除盐，即得兔抗猪IL-17A多克隆抗体，记为rpIL-17A-IgG。
③多克隆抗体的验证：
使用制备的rpIL-17A为抗原，上述制备的rpIL-17A-IgG为第一抗体，使用Abcam公司HRP标记山羊抗兔IgG(ab6721)为第二抗体做WB，抗原在48kD处有阳性条带产生(见图2)；因rpIL-17A已经商品化抗体验证，使用多克隆抗体rpIL-17A-IgG验证rpIL-17A同样出现阳性条带，表明多克隆抗体制备成功。
(3)偶联rpIL-17A-IgG的胶乳微球的制备
取10mL空白微球(直径30～60nm的聚苯乙烯胶乳微球)于离心管中，加入清洗缓冲液(25mM MES，pH6.5)至50mL，混匀，16℃，20000r/m离心30min；弃上清，加入10mL清洗缓冲液，用移液器将沉淀吹打开，补足清洗缓冲液至50mL；超声(功率210W，时间5min，1S+4S，超声4遍)；加入1.25mL 1％EDC活化剂，室温混匀活化30min；于16℃，20000r/m离心30min；弃上清，加入10mL清洗缓冲液，用移液器将沉淀吹打开，补足清洗缓冲液至50mL；超声(功率210W，时间5min，1S+4S，超声4遍)。
在活化好的空白微球(直径30～60nm的聚苯乙烯胶乳微球)中加入20mgrpIL-17A-IgG抗体；45℃混匀1h，标记结束后，加入2.5mL封闭液(BSA0.4％，Tris 2.42％，甘氨酸0.75％)，室温混匀2h；于16℃，20000r/m离心30min；弃上清，加入10mL胶乳储存液(Tris1.21g/L，BSA 2g/L，吐温-20 10uL/L，PC300 0.5ml/L)，用移液器将沉淀吹打开，补足胶乳储存液至50mL；超声(功率210W，时间5min，1S+4S，超声4遍)烘箱37℃老化16小时；取老化好后的胶乳于16℃，20000r/m离心30min；弃上清，加入10mL胶乳储存液，用移液器将沉淀吹散，用胶乳储存液补足至50mL，超声一遍(条件同上)开始第二遍离心；离心结束后，弃上清，加入10mL胶乳储存液，用移液器将沉淀吹散，用胶乳储存液补足至50mL，超声一遍(条件同上)；开始第三遍离心(条件同上)。离心结束后，弃上清，加入10mL胶乳储存液，用移液器将沉淀吹散，用胶乳储存液补足至50mL，超声四遍(条件同上)；用胶乳储存液稀释标记好抗体的微球浓度约1.5mg/mL，0.45μm滤器过滤，于烘箱37℃老化7天，记为偶联rpIL-17A-IgG的胶乳微球。
(4)猪IL-17胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒的制备
①配制试剂R1：
按照试剂R1的组分含量，将各组分物质于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂R1。
②配制试剂R2：
按照试剂R2的组分含量，将步骤(3)制得的偶联rpIL-17A-IgG的胶乳微球以及余下的其他组分物质于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂R2。
③配制IL-17A校准品：
按照试剂IL-17A校准品的组分含量，将步骤(1)制得的rpIL-17A以及余下的其他组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得IL-17A校准品。
实施例5
本实施例的一种上述猪IL-17胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒的测定方法：
分析方法：两点终点法；
反应方向：上升反应；
校准方式：Logit-Log(4P)；
测定波长：600nm；
测定温度：37℃；
样本：试剂R1：试剂R2＝30：180：60(μL)；
测试步骤：吸取30μL样本，加入180μL试剂R1，37℃孵育5min，加入60μL试剂R2，1min后读取吸光值A1，3min后读取吸光值A2，计算ΔA。
定标方法：6点定标，采用贝克曼AU680全自动生化分析仪(或其他品牌型号)进行检测，并设置校准品浓度分别为：0、6.25、12.5、25、50、100ng/mL。
依据定标值根据ΔA测算样本中IL-17含量。
实施例6
本实施例用以评价上述实施例中猪IL-17胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒：
(1)线性相关性验证
利用实施例3配方配制试剂，与Abcam公司的猪IL-17ELISA检测试剂盒进行对照检测，检测100份不同性别不同年龄段的猪临床血清样本，检测结果如下表1，获得了本发明试剂盒与Abcam公司在售猪IL-17ELISA检测试剂的相关性曲线(见图3)，通过检测结果显示，两试剂盒的线性相关曲线为y＝0.9298x+2.6696，相关系数R2＝0.8108，说明两者有较大的相关性。从图3中可以看出试剂盒与商品化猪IL-17检测试剂盒线性关系良好。
表1本发明试剂盒与Abcam公司在售猪IL-17试剂盒线性相关性比对
Figure BDA0003698286820000151
Figure BDA0003698286820000161
(2)线性范围验证
使用重组猪IL-17A纯化品和生理盐水配制成浓度500ng/mL、100ng/mL、20ng/mL、4ng/mL、0.8ng/mL和0ng/mL(生理盐水对照)的测试品，使用本发明试剂盒测定各测试品浓度，以稀释浓度为自变量，以测定结果为因变量求出线性回归方程，计算测定结果的相对偏差。结果显示测定结果与稀释浓度之间的线性回归方程为y＝1.0158x-0.3218，见图4。相关系数R2＝0.9999，说明线性关系良好，线性范围可达500ng/mL。从图中可以看出本案试剂盒线性范围良好。
表2本发明试剂线性范围验证
Figure BDA0003698286820000171
(3)准确度验证
取Abcam ELISA试剂盒中校准品的高值和低值，使用本发明试剂盒检测6次，取均值，与靶值进行比对。结果表明检测值较靶值相对偏差较小，准确度较高。见表3。
表3所述试剂盒准确度验证结果
Figure BDA0003698286820000172
(4)精密度验证
取经Abcam试剂盒检测的临床血清样本高值和低值各一份，使用本发明试剂盒对同一份血清样本连续检测10次，计算所述试剂盒的变异系数。精密度检测数据如下表4，检测结果表明所述试剂盒在检测高值和低值样本时的变异系数较小分别为4.06％和4.22％，精密度较好。
表4所述试剂盒精密度验证结果
Figure BDA0003698286820000181
(5)灵敏度及特异度验证
选取确诊细菌感染和病毒感染的病猪50份阳性血清和健康猪50份阴性血清，选择Abcam ELISA法IL-17检测试剂盒与所述试剂盒同步检测此100份血清样本，按各试剂盒判定标准设高于参考标准为阳性，低于参考标准为阴性，计算各试剂盒的灵敏度和特异度，结果见表5。结果表明本发明试剂盒较市售Abcam公司ELISA试剂盒有较高的灵敏度和特异。本案的突出优点是能达到ELISA检测试剂盒的灵敏度和特异度，且试剂成本极低能使用全自动生化仪进行检测，可极大满足临床检测的需求。
表5所述试剂盒灵敏度及特异度与市售检测试剂比较
Figure BDA0003698286820000182
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 安徽农业大学
<120> 一种猪IL-17胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒及其制备使用方法
<130> 2022
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 846
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cgcggatcca tgatcatgat cccacaaagt ccaggatgcc caaaaactga ggacaagaac 60
ttccctcagc atgtaagggt caacttgaac atcttgaacc ggagcacacc tgccagacgg 120
ccctcagatt actccaaacg cttcacctca ccatggactc tccaacgcaa cgaggacccc 180
gagaggtact cctccgtgat ctgggaggcc aagtgcagcc actcgggctg tatcaatgct 240
gaagggaagg aagatcatca catgaactct gtccccatcc agcaagagat cttggtcctg 300
cgaagggagc ctcgccactg ccccaactcc ttccggctgg agaaagtgat ggtgacagtg 360
ggctgcacct gtgtcacccc catcgtccgc catatttctg gcggcggcgg cagcggcggc 420
ggcggcagcg gcggcggcgg cagcatgatc atgatcccac aaagtccagg atgcccaaaa 480
actgaggaca agaacttccc tcagcatgta agggtcaact tgaacatctt gaaccggagc 540
acacctgcca gacggccctc agattactcc aaacgcttca cctcaccatg gactctccaa 600
cgcaacgagg accccgagag gtactcctcc gtgatctggg aggccaagtg cagccactcg 660
ggctgtatca atgctgaagg gaaggaagat catcacatga actctgtccc catccagcaa 720
gagatcttgg tcctgcgaag ggagcctcgc cactgcccca actccttccg gctggagaaa 780
gtgatggtga cagtgggctg cacctgtgtc acccccatcg tccgccatat ttcttaactc 840
gagcgg 846

Claims (9)

1.一种猪IL-17胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒，其特征在于，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
Figure FDA0003698286810000011
其溶剂为纯化水；
试剂R2：
Figure FDA0003698286810000012
其溶剂为纯化水。
2.根据权利要求1所述的猪IL-17胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒，其特征在于，包括的成分及相应含量具体为：
试剂R1：
Figure FDA0003698286810000013
其溶剂为纯化水；
试剂R2：
Figure FDA0003698286810000014
Figure FDA0003698286810000021
其溶剂为纯化水。
3.根据权利要求1所述的猪IL-17胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒，其特征在于，还包括IL-17A校准品，包括的成分及相应含量为：
Figure FDA0003698286810000022
其溶剂为纯化水。
4.根据权利要求3所述的猪IL-17胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒，其特征在于，所述IL-17A校准品包括的成分及相应含量具体为：
Figure FDA0003698286810000023
其溶剂为纯化水。
5.根据权利要求3所述的猪IL-17胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒，其特征在于，所述IL-17A校准品中的rpIL-17A为重组猪IL-17A蛋白，获取方法为：
①猪白介素17A基因的获取：
取GGGGSGGGGSGGGGS作为柔性linker，将两段猪白介素17A序列连接起来，并在序列首尾加BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点及保护碱基，做大肠杆菌密码子优化，最终获得如SEQ ID NO.1所示基因序列；
得到基因序列后，送基因公司合成，测序合格，获得目标基因序列；
②表达载体构建：
使用BamHⅠ和XhoⅠ两种内切酶对合成的基因及pET32a质粒进行双酶切，将双酶切产物使用T4连接酶连接，并导入感受态细胞中；不含抗性的LB培养基37℃、220rpm发酵2h，涂布于含氨苄的LB培养基平板培养过夜，取氨苄LB平板上生长的单菌落扩大培养后提质粒进行基因测序，以鉴定目的基因；当鉴定为阳性克隆时，即表示表达载体构建成功，记为rpIL-17A工程菌；
③重组猪IL-17A的表达和纯化：
取rpIL-17A工程菌于含氨苄的LB培养基中37℃、220rpm发酵6h至OD值达到0.6时，加入诱导剂IPTG于16℃、220rpm诱导表达8h；收集细菌，7500r/min离心30min取菌体；加入质量体积比1:2的PBS重悬沉淀，经高压均质机0.2Mpa破碎3次，12000r/min离心15min取上清；
使用肠激酶于23℃酶切过夜；将酶切后蛋白过滤处理后过GST亲和层析柱收集rpIL-17A峰；过脱盐柱，平衡好柱体，用Elution buffer梯度洗脱，收集rpIL-17A峰，过分子筛层析柱，Elution buffer收集rpIL-17A峰；
使用IL-17A抗体为一抗，使用HRP标记山羊抗兔IgG为第二抗体做WB，样本在48kD处均有阳性条带，即表明重组猪IL-17A成功表达；纯化后的蛋白记为rpIL-17A，无菌分装保存备用。
6.根据权利要求1～5任一所述的猪IL-17胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒，其特征在于，所述偶联rpIL-17A-IgG的胶乳微球的获取方法为：使用直径30～60nm的聚苯乙烯胶乳微球，并采用共价偶联法将兔抗猪IL-17A多克隆抗体交联到聚苯乙烯胶乳微球上。
7.根据权利要求6所述的猪IL-17胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒，其特征在于，所述兔抗猪IL-17A多克隆抗体的制备方法为：
①家兔的免疫：
选择3月龄、体重2.3kg的雄性新西兰家兔，取1mL rpIL-17A抗原与相同体积的弗氏佐剂充分匀浆形成稳定乳液，记为乳化抗原；每只兔的背部多点注射乳化抗原，进行第1次免疫；7日后进行第2次免疫，免疫方案如前；21日后进行第3次免疫，免疫方案如前；42日后进行第4次免疫，免疫方案如前；49日后进行第5次免疫，采用耳缘静脉注射2mL rpIL-17A抗原；55日取耳缘静脉血使用琼脂双扩散法测抗体效价，测得效价1:64及以上，如未达到加强免疫至达到效价1:64终止免疫；采用心脏采血获得全血；
②多克隆抗体的纯化：
将上述步骤获得的全血于4℃划十字口静置2h，37℃回温30min；于4℃，3000r/min离心15min，取上清，加入等体积的PBS混匀得混合液，向混合液中再缓慢滴加同等体积的饱和硫酸铵，于4℃静置6h后4℃，4200r/min离心30min；
取沉淀用200mL的PBS溶解，加入总体积量33％的饱和硫酸铵，在4℃下静置3h后，4℃、4200r/min离心30min；取沉淀，用200mL的PBS溶解，加入总体积量33％的饱和硫酸铵，4℃下静置3h后，4℃、4200r/min离心30min；取沉淀，用200mL的PBS溶解，装入透析袋；最后，将其置于4℃环境下，采用20倍体积的PBS透析液(pH7.2)透析12h除盐，即得兔抗猪IL-17A多克隆抗体，记为rpIL-17A-IgG；
③多克隆抗体的验证：
使用rpIL-17A为抗原，上述制备的rpIL-17A-IgG为第一抗体，使用HRP标记山羊抗兔IgG为第二抗体做Western blot实验，抗原在48kD处有阳性条带产生；因重组rpIL-17A已经商品化抗体验证，使用多克隆抗体rpIL-17A-IgG验证rpIL-17A同样出现阳性条带，表明多克隆抗体制备成功。
8.一种如权利要求1～7任一所述的猪IL-17胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下具体步骤：
(1)rpIL-17A的制备
①猪白介素17A基因的获取：
参考Genbank登录号NM_001005729.1获得猪白介素17A的CDS序列和氨基酸序列，对氨基酸序列进行分析，删除信号肽，获得猪白介素17A有效序列；取GGGGSGGGGSGGGGS作为柔性linker，将获得的两段猪白介素17A序列连接起来，并在序列首尾加BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点及保护碱基，做大肠杆菌密码子优化，最终获得如SEQ ID NO.1所示基因序列；
得到基因序列后，送基因公司合成，测序合格，获得目标基因序列；
②表达载体构建：
使用BamHⅠ和XhoⅠ两种内切酶对合成的基因及pET32a质粒进行双酶切，将双酶切产物使用T4连接酶连接，并导入感受态细胞中；不含抗性的LB培养基37℃、220rpm发酵2h，涂布于含氨苄的LB培养基平板培养过夜，取氨苄LB平板上生长的单菌落扩大培养后提质粒进行基因测序，以鉴定目的基因；当鉴定为阳性克隆时，即表示表达载体构建成功，记为rpIL-17A工程菌；
③重组猪IL-17A的表达和纯化：
取rpIL-17A工程菌于含氨苄的LB培养基中37℃、220rpm发酵6h至OD值达到0.6时，加入诱导剂IPTG于16℃、220rpm诱导表达8h；收集细菌，7500r/min离心30min取菌体；加入质量体积比1:2的PBS重悬沉淀，经高压均质机0.2Mpa破碎3次，12000r/min离心15min取上清；
使用肠激酶于23℃酶切过夜；将酶切后蛋白过滤处理后过GST亲和层析柱收集rpIL-17A峰；过脱盐柱，平衡好柱体，用Elution buffer梯度洗脱，收集rpIL-17A峰，过分子筛层析柱，Elution buffer收集rpIL-17A峰；
使用IL-17A抗体为一抗，使用HRP标记山羊抗兔IgG为第二抗体做WB，样本在48kD处均有阳性条带，即表明重组猪IL-17A成功表达；纯化后的蛋白记为rpIL-17A，无菌分装保存备用；
(2)兔抗猪IL-17A多克隆抗体的制备：
①家兔的免疫：
选择3月龄、体重2.3kg的雄性新西兰家兔，取1mL rpIL-17A抗原与相同体积的弗氏佐剂充分匀浆形成稳定乳液，记为乳化抗原；每只兔的背部多点注射乳化抗原，进行第1次免疫；7日后进行第2次免疫，免疫方案如前；21日后进行第3次免疫，免疫方案如前；42日后进行第4次免疫，免疫方案如前；49日后进行第5次免疫，采用耳缘静脉注射2mL rpIL-17A抗原；55日取耳缘静脉血使用琼脂双扩散法测抗体效价，测得效价1:64及以上，如未达到加强免疫至达到效价1:64终止免疫；采用心脏采血获得全血；
②多克隆抗体的纯化：
将上述步骤获得的全血于4℃划十字口静置2h，37℃回温30min；于4℃，3000r/min离心15min，取上清，加入等体积的PBS混匀得混合液，向混合液中再缓慢滴加同等体积的饱和硫酸铵，于4℃静置6h后4℃，4200r/min离心30min；
取沉淀用200mL的PBS溶解，加入总体积量33％的饱和硫酸铵，在4℃下静置3h后，4℃、4200r/min离心30min；取沉淀，用200mL的PBS溶解，加入总体积量33％的饱和硫酸铵，4℃下静置3h后，4℃、4200r/min离心30min；取沉淀，用200mL的PBS溶解，装入透析袋；最后，将其置于4℃环境下，采用20倍体积的PBS透析液(pH7.2)透析12h除盐，即得兔抗猪IL-17A多克隆抗体，记为rpIL-17A-IgG；
③多克隆抗体的验证：
使用rpIL-17A为抗原，上述制备的rpIL-17A-IgG为第一抗体，使用HRP标记山羊抗兔IgG为第二抗体做Western blot实验，抗原在48kD处有阳性条带产生；因rpIL-17A已经商品化抗体验证，使用多克隆抗体rpIL-17A-IgG验证rpIL-17A同样出现阳性条带，表明多克隆抗体制备成功；
(3)偶联rpIL-17A-IgG的胶乳微球的制备
使用直径30～60nm的聚苯乙烯胶乳微球，并采用共价偶联法将步骤(2)制得的兔抗猪IL-17A多克隆抗体交联到聚苯乙烯胶乳微球上，即得目标所需的偶联rpIL-17A-IgG的胶乳微球；
(4)猪IL-17胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒的制备
①配制试剂R1：
按照试剂R1的组分含量，将各组分物质于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂R1；
②配制试剂R2：
按照试剂R2的组分含量，将步骤(3)制得的偶联rpIL-17A-IgG的胶乳微球以及余下的其他组分物质于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂R2；
③配制IL-17A校准品：
IL-17A校准品包括的成分及相应含量如下：
Figure FDA0003698286810000061
其溶剂为纯化水；
按照试剂上述IL-17A校准品的组分含量，将步骤(1)制得的rpIL-17A以及余下的其他组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得IL-17A校准品。
9.一种如权利要求1～7任一所述的猪IL-17胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下具体步骤：
(1)吸取30μL样本，加入180μL试剂R1，37℃孵育5min；
(2)再加入60μL试剂R2进行混合，并使其充分反应；
(3)1min后读取吸光值A1，3min后读取吸光值A2，计算ΔA；
(4)定标方法为6点定标，采用全自动生化分析仪进行检测，并设置校准品浓度分别为：0、6.25、12.5、25、50、100ng/mL；依据定标值，根据ΔA测算样本中IL-17含量。
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