CN114931116B - 一种在持续高温胁迫下生长快、抗逆性强的罗非鱼品系的选育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种在持续高温胁迫下生长快、抗逆性强的罗非鱼品系的选育方法，以高温胁迫手段，并设定体重增长率、血清抗氧化和血清免疫11个指标作为选育指标，通过各个测定点各指标的变化对选育组进行排序，并在至少6个指标的排序均相同时，确定此排序为总体变化趋势，确定至少1个选育组作为耐高温选育品系，进行后续繁殖培养；若选育组未能针对至少6个指标的排序达成一致，则需重新选育。本发明创造性地建立了适宜高温培育的罗非鱼选育方法，选定体重增长率、6个抗氧化能力和4个血清免疫指标的变化来评估罗非鱼的长期高温胁迫效应，科学地选育出了高温胁迫下生长快、抗逆性强的罗非鱼品系，也为下一步罗非鱼耐高温新品系的选育奠定基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种适宜高温养殖的罗非鱼的选育方法，属于水产育种技术领域。
背景技术
罗非鱼是一种被广泛食用的鱼类，尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)原产于非洲，隶属于鲈形目(Perciformes)，丽鱼科(Cichlidae)，口孵鱼属(Oreochromis)，是联合国粮农组织(FAO)在世界范围内积极推广养殖的经济鱼类。
近几年来，在广东罗非鱼主产区，每年高温季节(6～9月)，特别是当日间水温维持在34℃以上时，罗非鱼选育系生长受到明显抑制、发病率显著升高，主要体现在：①饲料利用率下降、生长速度减慢；②机体免疫力和对致病菌的抵抗力下降、极易因感染病原菌(如海豚链球菌、无乳链球菌等)而暴发大规模病害。以上这些因持续高温引发的不利影响已给罗非鱼养殖业带来了重大经济损失。鉴于此，在高温季节，通过科技手段提高罗非鱼生长速度、降低病害发生率已势在必行。目前，已有较多的养殖科技人员通过改良养殖模式，如高温季节提高池塘水位、合理投饲、调节水质等方式来减少高温造成的损失，也取得了一定的进展。但这只能在一定程度上改善罗非鱼的生长状况，并不能从根本上解决问题，制定科学育种方案对尼罗罗非鱼的耐高温性状进行遗传改良，选育出生长性能优良的耐高温新品种才是解决这一问题的根本，也必将成为提高养殖效益和健康化养殖水平的重要手段。但迄今为止，国内外尚无这一方面的研究报道。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明提供一种在持续高温胁迫下生长快、抗逆性强的罗非鱼品系的选育方法，通过高温胁迫下罗非鱼各个生理指标的变化，制定科学的选育标准，选育出合格、稳定的罗非鱼品系。
高温应激是影响鱼类生理状态的关键非生物因素之一，温度影响生物体新陈代谢反应速率，从而调控其能量收支、生长发育、酶活水平和抗病能力，高温下生物体内的抗氧化酶活性、代谢活性、细胞调亡速度、机体活性氧指标(包括过氧化氢(H2O2)、超氧阴离子(O2 -)、羟基自由基(·OH)等)、机体免疫指标(如碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、溶菌酶(lysozyme,LYS)、补体、细胞因子[白细胞介素(Interleukin,IL)、干扰素(Interferon,IFN)]和免疫球蛋白M(Immunoglobulin M,IgM)等)都会产生相应的变化。本发明的发明人基于以上研究发现，综合各个指标并深入分析，科学选择各个指标并制定标准，选育出耐高温生长的罗非鱼品系。本发明的技术方案如下：
一种在持续高温胁迫下生长快、抗逆性强的罗非鱼品系的选育方法，包括以下内容：
从生长状况良好的罗非鱼群中随机选择部分作为选育的基础鱼苗，所述鱼苗的平均体重为350-450g，以每组不少于20尾鱼进行分组，分为对照组和不少于3组的平行选育组，对照组以26-28℃进行培养，选育组以34-36℃进行培养，每日投喂两次，经过5-10天的培养条件稳定调节期后，开始计时进行为期25-35 天的选育期，以起始第0天及最后一天设置为两个检测点，再根据选育期的时长，在选育期内按时长间隔平均设定2-5个检测点，对各试验组内鱼苗的平均体重、血清抗氧化指标和血清免疫指标进行测定，其中血清抗氧化指标包括：过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、还原型谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽还原酶(GR)和氧化型谷胱甘肽(GSSH)；血清免疫指标包括：白细胞介素10(IL-10)、碱性磷酸酶(ALP)、溶菌酶(LYS) 和干扰素γ(IFN-γ)；对各选育组在不同检测点的平均体重、以上6个血清抗氧化指标和4个血清免疫指标共11个指标进行统计学分析，计算体重增长率、血清抗氧化指标和血清免疫指标，并根据鱼苗的以上指标分别对选育组进行排序：
若11个指标中，在每个检测点，选育组针对至少6个指标的排序均相同，则以少数服从多数的原则，确定此排序为总体变化趋势，根据末位淘汰，将相对性能指标差的选育组舍弃，最后选出至少1个选育组作为耐高温选育品系，进行后续繁殖培养；
若11个指标中，在每个检测点，选育组未能针对至少6个指标的排序达成一致，则需重新进行选育，否则，需重新选育。
进一步的，11个指标中，在每个检测点，选育组针对至少7个指标的排序均相同时，确定排序为总体变化趋势，进行选育操作，否则，需重新选育。
进一步的，以每组不少于30尾鱼进行分组。
进一步的，每个检测点抽样率为所述对照组和选育组的起始鱼苗数的 1/3-1/6，优选为1/4-1/5。
进一步的，所述选育期为30天；所述检测点为5个，分别在第0天、第5 天、第10天、第20天和第30天取样测定各指标。
进一步的，选育期前，所述选育组以0.5-1.2℃/天的升温速率升温至培养温度。
进一步的，对照组以28℃进行培养，选育组以35℃进行培养。
进一步的，所述罗非鱼为尼罗罗非鱼。
进一步的，所述体重增长率具体还分为特定增重率、绝对增重率和相对增重率，一般地，对各个检测点的数据进行以上三种指标的计算，其趋势一致，任选其一作为体重增长率的数据计算基础；其中：
瞬时(特定)增重率(SGR，％/d)＝[(lnW2-lnW1)/(t2-t1)]×100
绝对增重率(AGR，g/d)＝(W2-W1)/(t2-t1)
相对增重率(RGR,％)＝[(W2－W1)/W1]×100
式中，W1、W2分别为时间t1、t2时的体重。
本发明中，血清抗氧化指标和血清免疫指标的测定方法为：从对照组和选育组内选取试验鱼，使用2mL无菌注射器对每尾试验鱼尾静脉取血1.5mL，保存于无菌离心管中。完成取样后，将试验鱼迅速放回养殖桶中继续试验。全血室温(25℃)静置2h后，3000r·min-1离心10min，吸取上层血清，保存于-80℃备用。测定时取冻存的血清样品，4℃融化，采用酶联免疫分析试剂盒进行检测，用酶联免疫分析法中的双抗体夹心法测定血清中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)、还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)、谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase,GR)和氧化型谷胱甘肽(glutathione disulfide,GSSH)的含量。
数据处理使用Excel 2013软件对数据进行初步整理分析和作图，数据结果用平均值±标准差表示。采用SPSS 18.0软件对数据进行分析，采用单因素方差(One-WayANOVA)分析完成不同温度组间生长性能指标(特定增重率、相对增重率和绝对增重率等)比较、以及不同温度组在相同取样时间点酶活数据间的比较，使用Duncan方法完成相同温度组内不同取样时间点及不同试验重复酶活数据间的多重比较，使用LSD多重比较方法比较相同温度组内不同试验重复间生长性能指标(特定增重率、相对增重率和绝对增重率等)的差异，差异显著性水平定在α＝0.05。
本发明的技术方案具有以下优势：
本发明打破现有技术的局限，创造性地建立了适宜高温培育的罗非鱼选育方法，本发明根据罗非鱼的生长特性，选定体重增长率、6个抗氧化能力和4个血清免疫指标的变化来评估罗非鱼的长期高温胁迫效应，科学地选育出了高温胁迫下生长快、抗逆性强的罗非鱼品系，也为下一步罗非鱼耐高温新品系的选育奠定基础。
本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
本试验所用试验鱼均为新吉富罗非鱼选育系F23鱼种，采自上海海洋大学滨海水产科教创新基地。其亲本新吉富罗非鱼选育系F22于2020年6月16日配组繁殖，7月6日开始孵化出苗。水花经过20天左右强化培育，长成20mm左右夏花鱼种。再经过一年的培育，试验鱼平均体重已达400g以上，选育工作开始前，调整28℃水温驯养一周以适应实验条件，然后随机选取180尾试验鱼进行选育。
实施例1
将180尾鱼分为6个试验组，分为平行的3个对照组(28℃)和3个选育组(35℃)，每组30尾鱼，选育组的养殖桶号分别为A桶、B桶和C桶，对照组的养殖桶号分别为a桶、b桶和c桶。利用循环水养殖系统自带的空气能加热设备调节温度，对照组水温保持不变，选育组水温以1℃/24h的升温速率提升至目标温度。正式实验期间每日饱食投喂2次(8:00,16:00)，饲料为宁波天邦食品股份有限公司生产的罗非鱼2号浮性配合饲料(3.0mm粒径，粗蛋白含量≥28.5％)。正式试验过程中，每日使用便携式多功能溶氧仪测定水体溶解氧、温度和pH。一周后，选育组和对照组共6个养殖桶的水温都已保持恒定，故以当天作为耐高温选育试验的起始点(第0天)，选育期共持续30天，设置5个检测点，分别在第0天、第5天、第10天、第20天和第30天取样，对试验鱼的生长性能和血清生化指标进行连续测定。具体测定方法如下：
(1)生长性能指标测定：
在试验开始时(第0天)测定每个养殖桶中试验鱼的初始体重指标。试验结束时(第30天)，统计各养殖桶内试验鱼尾数，测量每尾试验鱼的试验末体重指标。分别按照下式计算各养殖桶试验鱼的生长率和成活率等指标：
瞬时(特定)增重率(SGR，％/d)＝[(lnW2-lnW1)/(t2-t1)]×100
绝对增重率(AGR，g/d)＝(W2-W1)/(t2-t1)
相对增重率(RGR,％)＝[(W2－W1)/W1]×100
成活率(％)＝收获尾数/放养尾数×100
体重变异系数(CV，％)＝[标准差(SD)/体重平均值(W)]×100
式中，W1、W2分别为时间t1、t2时的体重。
(2)血清生化指标测定：
达到选育组和对照组设定温度并在维持恒温后的第0天、第5天、第10天、第20天和第30天，从选育组和对照组的每个养殖桶中各随机取6尾试验鱼，使用2mL无菌注射器对每尾试验鱼尾静脉取血1.5mL，保存于无菌离心管中。完成取样后，将试验鱼迅速放回养殖桶中继续试验。全血室温(25℃)静置2h后， 3000r·min-1离心10min，吸取上层血清，保存于-80℃备用。
①血清免疫相关指标测定：
取冻存的血清样品，4℃融化，采用酶联免疫试剂盒进行检测，用酶联免疫分析法中的双抗体夹心法测定血清中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、溶菌酶(lysozyme,LYS)、干扰素γ(interferon-γ,IFN-γ)和白细胞介素10(interleukin-10,IL-10)含量。具体操作步骤参照试剂盒使用说明书，所有试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司。
②血清抗氧化相关指标测定：
取冻存的血清样品，4℃融化，采用酶联免疫分析试剂盒进行检测，用酶联免疫分析法中的双抗体夹心法测定血清中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)、还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)、谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase,GR)和氧化型谷胱甘肽(glutathione disulfide,GSSH)的含量。具体操作步骤参照试剂盒使用说明书，所有试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司。
对测定数据使用Excel 2013软件对数据进行初步整理分析和作图，数据结果用平均值±标准差表示。采用SPSS 18.0软件对数据进行分析，采用单因素方差(One-Way ANOVA)分析完成不同温度组间生长性能指标(特定增重率、相对增重率和绝对增重率等)比较、以及不同温度组在相同取样时间点酶活数据间的比较，使用Duncan方法完成相同温度组内不同取样时间点及不同试验重复酶活数据间的多重比较，使用LSD多重比较方法比较相同温度组内不同试验重复间生长性能指标(特定增重率、相对增重率和绝对增重率等)的差异，差异显著性水平定在α＝0.05。
(3)生长性能结果与分析
生长性能是衡量鱼类群体生产能力的重要指标，也是育种工作者和养殖业者高度关注的鱼类养殖性能之一。开展高温胁迫下选育群体2龄阶段生长性能评估是耐高温品系选育的重要组成部分，也可为高温养殖条件下大规格商品鱼的培育提供重要依据。鉴于此，本试验首先从生长速度指标(特定增重率、相对增重率和绝对增重率)来评估2个温度组的生长速度，结果表明(表2)，选育组试验鱼初始平均体重为(423.26±25.3848)g，平均体长为(23.59±2.30)cm；对照组试验鱼初始平均体重为(422.69±24.8357)g，平均体长为(23.21±1.80)cm。经过30天的养殖，选育组试验鱼试验末平均体重为(485.93±35.7326)g，特定增重率为 (0.4866±0.2656)％/d，绝对增重率为(2.0889±0.9878)g/d，相对增重率为 (16.0906±9.6590)％，结果见表1。
表1
注：同列不同小写字母表示不同温度组间试验鱼生长性能差异显著(P<0.05).
单因素方差分析结果表明，选育组的试验末平均体重、特定增重率、绝对增重率和相对增重率指标均显著低于对照组的相应指标(P<0.05)。结果表明，长期高温胁迫下，选育组的生长性能受到一定程度的抑制。
选育组3个试验重复(A桶、B桶、C桶)间的生长性能比较结果见表2。
表2
注：同列不同小写字母表示不同试验重复(A桶、B桶、C桶)间试验鱼生长性能差异显著(P<0.05).
选育组3个试验重复(A桶、B桶、C桶)试验鱼初始平均体重分别为 (407.02±19.2969)g、(433.34±27.7802)g和(429.41±27.3912)g，经过30天的养殖，选育组3个试验重复(A桶、B桶、C桶)试验鱼试验末平均体重分别为 (497.00±28.0278)g、(479.89±37.8058)g和(480.89±36.4530)g。由表2可知，3个主要生长性能指标(特定增重率、绝对增重率和相对增重率)在选育组3个试验重复间的变化趋势一致，即，A桶＞C桶＞B桶。经LSD多重比较发现，A桶试验鱼的特定增重率、绝对增重率和相对增重率指标均显著高于B桶和C桶试验鱼的相应指标(P<0.05)，B桶和C桶间的生长性能指标差异不显著(P＞0.05)。
体重变异系数反映了鱼类群体生长规格的一致性程度，体重变异系数越低，则说明群体内个体的生长一致性程度越高。本研究中，选育组与对照组间体重变异系数差异不显著(P＞0.05)(表3)。体重变异系数在选育组3个试验重复(A桶、 B桶、C桶)间的变化趋势一致，即，A桶＜C桶＜B桶。经LSD多重比较发现， A桶试验鱼的体重变异系数显著低于B桶和C桶(P<0.05)。B桶和C桶间的体重变异系数差异不显著(P＞0.05)。结果表明，相对于B桶而言，A桶和C桶试验鱼群体内个体间生长规格更加整齐一致。
养殖成活率的结果表明，选育组与对照组间成活率差异不显著(P＞0.05)，选育组3个试验重复(A桶、B桶、C桶)间成活率差异也不显著(P＞0.05)。
综上所述，选育组中的A桶和C桶试验鱼生长性能明显优于B桶，从生长性能的角度看，A桶和C桶试验鱼可作为高温下生长速度快的候选基础群体。
(4)血清抗氧化指标和血清免疫指标结果与分析
选育组和对照组血清抗氧化指标和血清免疫指标活性结果见表3。
表3
注：同行不同小写字母表示同一温度组内不同取样时间点间抗氧化指标或免疫指标活力差异显著(P<0.05),同列不同大写字母表示不同温度组间抗氧化指标或免疫指标活力差异显著(P<0.05).
由表3可知，选育组与对照组之间比较发现，在选育组内，随着胁迫时间的延长：
①SOD活力呈现出持续上升的趋势，即，第0天时的SOD活力最低，第 30天时的SOD活力最高；第20天和第30天时的SOD活力均显著高于第0天 (P＜0.05)；在每一个检测时间点，高温组SOD活力均显著高于对照组(P＜0.05)。
②CAT活力呈现出先降低、后升高、再降低的波动状态；第20天和第30 天时的CAT活力均显著低于第0天(P＜0.05)；在每一个检测时间点，高温组CAT 活力均显著高于对照组(P＜0.05)。
③GSH活力呈现出先升高、后降低、再升高的波动状态，第30天、第20 天、第10天和第5天的GSH活力均显著高于第0天(P＜0.05)；在每一个检测时间点，高温组GSH活力均显著高于对照组(P＜0.05)。
④GPX活力呈现出先升高、后降低、再升高的波动状态，第30天和第20 天时的GPX活力均显著高于第0天(P＜0.05)，第30天时的GPX活力显著高于第0天、第5天和第10天(P＜0.05)。在每一个检测时间点(第0天、第5天、第 10天、第20天、第30天)，高温组GPX活力均显著高于对照组(P＜0.05)。
⑤GR活力呈现出先降低后上升的趋势，第5天、第10天、第20天和第30 天时的GR活力均显著低于第0天(P＜0.05)；在每一个检测时间点(第0天、第 5天、第10天、第20天、第30天)，高温组GR活力均显著高于对照组(P＜0.05)。
⑥GSSH活力呈现出持续降低的趋势，即，第0天时的GSSH活力最高，第 30天时的GSSH活力最低；第10天、第20天和第30天时的GSSH活力均显著低于第0天(P＜0.05)；在每一个检测时间点(第0天、第5天、第10天、第20 天、第30天)，高温组GSSH活力均显著低于对照组(P＜0.05)。
⑦ALP活力呈现出持续升高的趋势，即，第0天时的ALP活力最低，第30 天时的ALP活力最高；第10天、第20天和第30天时的ALP活力均显著高于第0天(P＜0.05)；在每一个检测时间点(第0天、第5天、第10天、第20天、第30天)，高温组ALP活力均显著低于对照组(P＜0.05)。
⑧LYS在第0天时的活力最高，随着胁迫时间的延长，LYS活力呈现出波动状态；第5天、第10天和第20天时的LYS活力均显著低于第0天(P＜0.05)，第30天时的LYS活力显著高于第5天和第20天(P＜0.05)。在每一个检测时间点(第0天、第5天、第10天、第20天、第30天)，高温组LYS活力均显著高于对照组(P＜0.05)。
⑨IFN-γ活力呈现出先升高、后降低、再升高的波动状态，各检测时间点(第 0天、第5天、第10天、第20天、第30天)间IFN-γ活力不存在显著差异(P＞ 0.05)；在每一个检测时间点(第0天、第5天、第10天、第20天、第30天)，高温组IFN-γ活力均显著低于对照组(P＜0.05)。
⑩IL-10在第5天时的活力最高，随着胁迫时间的延长，IL-10活力呈现出波动状态；第5天和第20天时的IL-10活力均显著高于第10天(P＜0.05)，其余检测时间点间的IL-10活力差异不显著(P＞0.05)。在每一个检测时间点(第0天、第5天、第10天、第20天、第30天)，高温组IL-10活力均显著高于对照组(P ＜0.05)。
选育组内不同试验重复(养殖桶)间试验鱼血清抗氧化指标和血清免疫指标活性比较结果见表4。
表4
注：同列不同小写字母表示不同桶间试验鱼抗氧化指标或免疫指标活力差异显著(P<0.05).
由表4可知，选育组内不同平行试验组重复(A桶、B桶和C桶)间比较发现：
①在每一个检测时间点，A桶试验鱼血清SOD活力最高，B桶试验鱼血清 SOD活力最低，而且，SOD活力呈现出相同的桶间变化趋势，即，A桶＞C桶＞B桶；同时，A桶试验鱼和C桶试验鱼血清SOD活力均显著高于B桶(P＜0.05)。
②在每一个检测时间点，A桶试验鱼血清CAT活力最高，B桶试验鱼血清 CAT活力最低，而且，CAT活力呈现出相同的桶间变化趋势，即，A桶＞C桶＞B桶；同时，A桶试验鱼和C桶试验鱼血清CAT活力均显著高于B桶(P＜0.05)。
③在每一个检测时间点，A桶试验鱼血清GSH活力最高，B桶试验鱼血清 GSH活力最低，而且，GSH活力呈现出相同的桶间变化趋势，即，A桶＞C桶＞B桶。同时，仅在第30天时，A桶试验鱼血清GSH活力显著高于B桶和C 桶(P＜0.05)，在其他检测时间点，桶间试验鱼血清GSH活力差异不显著(P＞ 0.05)。
④在每一个检测时间点(第0天、第5天、第10天、第20天、第30天)，A 桶试验鱼血清GPX活力最高，B桶试验鱼血清GPX活力最低，而且，GPX活力呈现出相同的桶间变化趋势，即，A桶＞C桶＞B桶。同时，在第0天和第 30天时，A桶试验鱼血清GPX活力均显著高于B桶和C桶(P＜0.05)，在第10 天和第20天时，A桶和C桶试验鱼血清GPX活力均显著高于B桶(P＜0.05)。
⑤在每一个检测时间点(第0天、第5天、第10天、第20天、第30天)，A 桶试验鱼血清GR活力最高，B桶试验鱼血清GR活力最低，而且，GR活力呈现出相同的桶间变化趋势，即，A桶＞C桶＞B桶。同时，在第0天和第30天时，A桶试验鱼血清GR活力均显著高于B桶(P＜0.05)；在第5天、第10天和第20天时，A桶、B桶和C桶间试验鱼血清GR活力均无显著差异(P＞0.05)。
⑥在每一个检测时间点(第0天、第5天、第10天、第20天、第30天)，A 桶试验鱼血清GSSH活力最高，B桶试验鱼血清GSSH活力最低，而且，GSSH 活力呈现出相同的桶间变化趋势，即，A桶＞C桶＞B桶。同时，在第10天时， A桶和C桶试验鱼血清GSSH活力均显著高于B桶(P＜0.05)；在其余检测时间点(第0天、第5天、第20天和第30天)，A桶、B桶和C桶间试验鱼血清GSSH 活力均无显著差异(P＞0.05)。
可见，6种血清抗氧化指标(SOD、CAT、GSH、GPX、GR、GSSH)在选育组与对照组间均存在显著差异(P＜0.05)，因此，这6种血清抗氧化指标均可选定为罗非鱼耐高温性能评价技术指标。同时，在每一个检测时间点(第0天、第 5天、第10天、第20天、第30天)，6种血清抗氧化指标(SOD、CAT、GSH、 GPX、GR、GSSH)在选育组内不同试验重复(A桶、B桶和C桶)间变化趋势一致，即，A桶＞C桶＞B桶。结果表明，A桶和C桶试验鱼血清抗氧化能力明显强于B桶。
⑦在每一个检测时间点(第0天、第5天、第10天、第20天、第30天)，A 桶试验鱼血清ALP活力最高，B桶试验鱼血清ALP活力最低，而且，ALP活力呈现出相同的桶间变化趋势，即，A桶＞C桶＞B桶。同时，在第10天和第30 天时，A桶试验鱼血清ALP活力均显著高于B桶(P＜0.05)；在其余检测时间点 (第0天、第5天、第20天)，A桶、B桶和C桶间试验鱼血清ALP活力均无显著差异(P＞0.05)。
⑧在每一个检测时间点(第0天、第5天、第10天、第20天、第30天)，A 桶试验鱼血清LYS活力最高，B桶试验鱼血清LYS活力最低，而且，LYS活力呈现出相同的桶间变化趋势，即，A桶＞C桶＞B桶。同时，A桶、B桶和C桶间试验鱼血清LYS活力均无显著差异(P＞0.05)。
⑨在每一个检测时间点(第0天、第5天、第10天、第20天、第30天)，A 桶试验鱼血清IFN-γ活力最高，B桶试验鱼血清IFN-γ活力最低，而且，IFN-γ活力呈现出相同的桶间变化趋势，即，A桶＞C桶＞B桶。同时，A桶、B桶和 C桶间试验鱼血清IFN-γ活力均无显著差异(P＞0.05)。
⑩在每一个检测时间点(第0天、第5天、第10天、第20天、第30天)，A 桶试验鱼血清IL-10活力最高，B桶试验鱼血清IL-10活力最低，而且，IL-10 活力呈现出相同的桶间变化趋势，即，A桶＞C桶＞B桶。同时，在第0天、第 10天、第20天和第30天时，A桶试验鱼血清IL-10活力均显著高于B桶(P＜0.05)；在第5天时，A桶、B桶和C桶间试验鱼血清IL-10活力均无显著差异(P ＞0.05)。
综上所述，在每一个检测时间点(第0天、第5天、第10天、第20天、第 30天)，4种血清免疫指标(ALP、LYS、IFN-γ、IL-10)在高温组与对照组间均存在显著差异(P＜0.05)，因此，可将这4种血清免疫指标选定为罗非鱼耐高温性能评价技术指标。同时，在每一个检测时间点(第0天、第5天、第10天、第 20天、第30天)，4种血清免疫指标(ALP、LYS、IFN-γ、IL-10)在高温组内不同试验重复(A桶、B桶和C桶)间变化趋势一致，即，A桶＞C桶＞B桶。结果表明，A桶和C桶试验鱼血清免疫能力明显强于B桶。
从血清抗氧化指标和血清免疫指标结果看，选育组中的A桶和C桶试验鱼血清抗氧化能力、免疫能力均明显强于B桶，从抗逆性能的角度看，A桶和C 桶试验鱼可作为高温下抗逆性强的候选基础群体。
对于11个指标，选育组中各试验重复组(A桶、B桶、C桶)排序均一致，综合分析选育组不同试验重复(A桶、B桶、C桶)间的生长性能、血清抗氧化指标和免疫指标的试验结果可以发现：①选育组中的A桶和C桶试验鱼生长性能均明显优于B桶；②A桶和C桶试验鱼血清抗氧化能力、免疫能力均明显强于B 桶。鉴于此，A桶和C桶试验鱼可作为高温下生长速度快、抗逆性强的新吉富罗非鱼耐高温选育的候选基础群体。在下一阶段选育试验过程中，将作为选育亲本，以高温养殖条件下选育群体的生长速度、抗氧化能力和免疫能力为选育指标，继续开展继代选育。
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。
Claims (10)
1.一种在持续高温胁迫下生长快、抗逆性强的罗非鱼品系的选育方法，其特征在于，包括以下内容：
从生长状况良好的罗非鱼群中随机选择部分作为选育的基础鱼苗，所述鱼苗的平均体重为350-450g，以每组不少于20尾鱼进行分组，分为对照组和不少于3组的平行选育组，对照组以26-28℃进行培养，选育组以34-36℃进行培养，每日投喂两次，经过5-10天的培养条件稳定调节期后，开始计时进行为期25-35天的选育期，以起始第0天及最后一天设置为两个检测点，再根据选育期的时长，在选育期内按时长间隔平均设定2-5个检测点，对各试验组内鱼苗的平均体重、血清抗氧化指标和血清免疫指标进行测定，其中血清抗氧化指标包括：过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、还原型谷胱甘肽、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽还原酶和氧化型谷胱甘肽；血清免疫指标包括：白细胞介素10、碱性磷酸酶、溶菌酶和干扰素γ；对各选育组在不同检测点的平均体重、以上6个血清抗氧化指标和4个血清免疫指标共11个指标进行统计学分析，计算体重增长率、血清抗氧化指标和血清免疫指标，并根据鱼苗的以上指标分别对选育组进行排序：
若11个指标中，在每个检测点，选育组针对至少6个指标的排序均相同，则以少数服从多数的原则，确定此排序为总体变化趋势，根据末位淘汰，将相对性能指标差的选育组舍弃，最后选出至少1个选育组作为耐高温选育品系，进行后续繁殖培养；
若11个指标中，在每个检测点，选育组未能针对至少6个指标的排序达成一致，则需重新进行选育。
2.根据权利要求1所述的选育方法，其特征在于，11个指标中，在每个检测点，选育组针对至少7个指标的排序均相同时，确定排序为总体变化趋势，进行选育操作，否则，需重新选育。
3.根据权利要求1所述的选育方法，其特征在于，以每组不少于30尾鱼进行分组。
4.根据权利要求3所述的选育方法，其特征在于，每个检测点抽样率为所述对照组和选育组的起始鱼苗数的1/3-1/6。
5.根据权利要求4所述的选育方法，其特征在于，每个检测点抽样率为所述对照组和选育组的起始鱼苗数的1/4-1/5。
6.根据权利要求1所述的选育方法，其特征在于，所述选育期为30天；所述检测点为5个，分别在第0天、第5天、第10天、第20天和第30天取样测定各指标。
7.根据权利要求1所述的选育方法，其特征在于，选育期前，所述选育组以0.5-1.2℃/天的升温速率升温至培养温度。
8.根据权利要求1所述的选育方法，其特征在于，对照组以28℃进行培养，选育组以35℃进行培养。
9.根据权利要求1所述的选育方法，其特征在于，所述罗非鱼为尼罗罗非鱼。
10.根据权利要求1所述的选育方法，其特征在于所述体重增长率具体包括特定增重率、绝对增重率和相对增重率。
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