CN114921420A - 一种鸭疫里氏杆菌噬菌体 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种鸭疫里氏杆菌噬菌体，其通过噬菌体富集、分离及纯化等步骤，初步筛选得到4株鸭疫里氏杆菌噬菌体，分别为WXLRAP2、WXLRAP3、WXLRAP4和Riemerella anatipestifer phage WXLRAP15，然后再对初筛获得的4株噬菌体经过发酵效率、pH耐受性实验、温度敏感性测定及裂解谱测定等复筛，最终筛选得到该具有宽裂解谱、高裂解效率的噬菌体Riemerella anatipestifer phage WXLRAP15，同时，还提供了该噬菌体的分离和纯化方法。本发明的噬菌体Riemerella anatipestifer phage WXLRAP15具有很高的发酵效价，在实验室小量发酵中效价可达2.2x109pfu/mL，对温度及pH均有良好的耐受性，并且具有较宽的裂解谱，可裂解6种血清型的鸭疫里氏杆菌，对1型鸭疫里氏杆菌的裂解率高达75.5％，同时，其裂解鸭疫里氏杆菌的速度快且维持裂解的时间长。
Description
技术领域
本发明涉及农业微生物技术领域，具体为一种鸭疫里氏杆菌噬菌体。
背景技术
鸭疫里氏杆菌(Riemerella anatipestifer)是引起的水禽及火鸡等家禽传染性浆膜炎的主要病原菌，该菌血清型众多，各种血清型之间的交叉免疫保护作用弱，且近年来抗生素耐药性问题日益严重，给临床上防控该菌引起的浆膜炎带来了极大的挑战，在自然条件下，该病一年四季都有发生，给养殖业带来了不可估量的经济损失，因此亟需寻找出一种新的防治鸭传染性浆膜炎的制剂。
噬菌体用于临床治疗由细菌引起的感染性疾病被证明是有效果的，鸭疫里氏杆菌噬菌体是一种专门侵染鸭疫里氏杆菌的病毒，其对机体其他正常菌群没有杀灭作用，可专一性解决因鸭疫里氏杆菌引起的浆膜炎问题，为绿色养殖提供了一种新的防控策略，而现有防治鸭传染性浆膜炎的手段有疫苗免疫和抗生素药物防控，但因免疫效果不理想以及抗生素耐药性等的问题，使得现有方法不足以有效地防控鸭传染性浆膜炎的发生，基于此，本申请提出一种鸭疫里氏杆菌噬菌体以解决上述问题。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种鸭疫里氏杆菌噬菌体，该鸭疫里氏杆菌噬菌体可对鸭疫里氏杆菌进行裂解，具有较宽的裂解谱且裂解效率高、抗性出现时间慢，能够短时间内杀能灭鸭疫里氏杆菌，及时控制病情发展，减少经济损失。
(二)技术方案
在本发明的一个方面，提供一种鸭疫里氏杆菌噬菌体，其能对鸭疫里氏杆菌发生裂解作用，所述噬菌体命名为鸭疫里氏杆菌噬菌体Riemerella anatipestifer phageWXLRAP15，噬菌体Riemerella anatipestifer phage WXLRAP15于2021年11月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCC NO：M20211477。
所述噬菌体以鸭疫里氏杆菌菌株WXLRA15为宿主分离得到，其为长尾噬菌体，噬菌斑大小为1mm，所述噬菌体基因组全长为47956bp，G+C含量为 34.9％，共有83个ORF。
噬菌体Riemerella anatipestifer phage WXLRAP15具有较好的裂解效果，裂解速度快且维持裂解的时间长，对多种血清型的鸭疫里氏杆菌均具有防治作用，能应用在鸭疫里氏杆菌所导致的鸭疫里氏杆菌病的预防和治疗中，可成为用于防治鸭疫里氏杆菌病抗生素的替代制剂。
在本发明的另一个方面，还提供了一种鸭疫里氏杆菌噬菌体的分离和纯化方法，包括以下步骤：
(1)采集自湖北某肉鸭养殖场附近水样、粪便样品及土壤样品共计50 份，将样品简单前处理后，5000rpm离心10min后取上清液过滤除菌，滤液与同体积的2×TSB液体培养基(含10％新生牛血清)及1mL处于对数期的鸭疫里氏杆菌菌液(107cfu/mL)均匀混合，于5％CO2培养箱中37℃过夜培养，富集噬菌体；
(2)将样本富集液5000rpm离心10min，取上清液过0.22μm的微孔滤膜除菌得到含有噬菌体的滤液；
(3)取滤液100uL与其宿主鸭疫里氏杆菌菌液500uL均匀混合，静置 15min使其与细菌表面的受体充分结合；
(4)将上述混合液加入7mL冷却至50℃的TSB半固体琼脂培养基(含 5％新生牛血清)，混匀后立即铺于已凝固的TSA平板上，待琼脂凝固后于5％CO2培养箱中37℃倒置培养12-16h，观察噬菌斑生长情况；
(5)在形成噬菌斑的双层平板上，用无菌枪头挑取大而透亮的噬菌斑，于1mL SM液中振荡解吸附后过0.22μm的微孔滤膜除菌得噬菌体滤液，将其接种于5mL TSB液体培养基(含5％新生牛血清)中，加入100uL相应的宿主鸭疫里氏杆菌菌液并混匀，5％CO2培养箱37℃条件下过夜培养，5000rpm离心 10min取上清后以细菌滤膜过滤，采用双层平板法观察噬菌斑形态，重复操作 3-5次后，即可得形状和大小一致的噬菌斑。
(三)有益效果
与现有技术相比，本发明提供了一种鸭疫里氏杆菌噬菌体，具备以下有益效果：
经测定，本发明的噬菌体Riemerella anatipestifer phage WXLRAP15 具有很高的发酵效价，在实验室小量发酵中效价可达2.2x109pfu/mL，对温度及pH均有良好的耐受性，并且具有较宽的裂解谱，可裂解6种血清型的鸭疫里氏杆菌，对1型鸭疫里氏杆菌的裂解率高达75.5％，同时，其裂解鸭疫里氏杆菌的速度快且维持裂解的时间长，可成为用于防治鸭疫里氏杆菌病抗生素的替代制剂。
附图说明
图1为本发明的噬菌体Riemerella anatipestifer phage WXLRAP15的扫描电镜图；
图2为本发明的噬菌体Riemerella anatipestifer phage WXLRAP15的噬菌斑图；
图3为本发明的噬菌体Riemerella anatipestifer phage WXLRAP15的基因组图；
图4为本发明的噬菌体Riemerella anatipestifer phage WXLRAP15的裂解效率图。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例和附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
现有防治鸭传染性浆膜炎的手段有疫苗免疫和抗生素药物防控，但因免疫效果不理想以及抗生素耐药性等的问题，使得现有方法不足以有效地防控鸭传染性浆膜炎的发生，噬菌体用于临床治疗由细菌引起的感染性疾病被证明是有效果的，其对机体其他正常菌群没有杀灭作用，可专一性解决因鸭疫里氏杆菌引起的浆膜炎问题。
基于此，在本发明的一个方面，提供一种鸭疫里氏杆菌噬菌体，该噬菌体命名为鸭疫里氏杆菌噬菌体Riemerella anatipestifer phage WXLRAP15，是以鸭疫里氏杆菌菌株WXLRA15为宿主分离得到，具体为：通过噬菌体富集、分离及纯化等步骤，初步筛选得到4株鸭疫里氏杆菌噬菌体，分别为WXLRAP2、 WXLRAP3、WXLRAP4和Riemerella anatipestiferphage WXLRAP15，然后再对初筛获得的4株噬菌体经过发酵效率、pH耐受性实验、温度敏感性测定及裂解谱测定等复筛，最终筛选得到具有宽裂解谱、高裂解效率的噬菌体Riemerella anatipestifer phage WXLRAP15。
请参阅图1-3，通过扫描电镜及基因组测序比对，确定噬菌体Riemerellaanatipestifer phage WXLRAP15为长尾噬菌体，如图1所示，噬菌斑大小为 1mm，如图2所示，全基因组测序发现该噬菌体基因组全长为47956bp，G+C 含量为34.9％，共有83个ORF，如图3所示，其基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1 所示，该噬菌体于2021年11月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称 CCTCC，地址为：湖北省武汉市武汉大学内)，保藏编号为CCTCC NO：M20211477。
在本发明的另一方面，还提供了上述噬菌体的分离纯化方法，其包括以下步骤：
(1)采集自湖北某肉鸭养殖场附近水样、粪便样品及土壤样品共计50 份，将样品简单前处理后，5000rpm离心10min后取上清液过滤除菌，滤液与同体积的2×TSB液体培养基(含10％新生牛血清)及1mL处于对数期的鸭疫里氏杆菌菌液(107cfu/mL)均匀混合，于5％CO2培养箱中37℃过夜培养，富集噬菌体；
(2)将样本富集液5000rpm离心10min，取上清液过0.22μm的微孔滤膜除菌得到含有噬菌体的滤液；
(3)取滤液100uL与其宿主鸭疫里氏杆菌菌液500uL均匀混合，静置 15min使其与细菌表面的受体充分结合；
(4)将上述混合液加入7mL冷却至50℃的TSB半固体琼脂培养基(含 5％新生牛血清)，混匀后立即铺于已凝固的TSA平板上，待琼脂凝固后于5％CO2培养箱中37℃倒置培养12-16h，观察噬菌斑生长情况；
(5)在形成噬菌斑的双层平板上，用无菌枪头挑取大而透亮的噬菌斑，于1mL SM液中振荡解吸附后过0.22μm的微孔滤膜除菌得噬菌体滤液，将其接种于5mL TSB液体培养基(含5％新生牛血清)中，加入100uL相应的宿主鸭疫里氏杆菌菌液并混匀，5％CO2培养箱37℃条件下过夜培养，5000rpm离心 10min取上清后以细菌滤膜过滤，采用双层平板法观察噬菌斑形态，重复操作 3-5次后，即可得形状和大小一致的噬菌斑。
对鸭疫里氏杆菌噬菌体Riemerella anatipestifer phage WXLRAP15的最佳发酵条件进行测定，步骤如下：
(1)挑取宿主鸭疫里氏杆菌单个菌落，接种到盛有3ml TSB培养液(含 5％新生牛血清)的试管中，于5％CO2培养箱37℃培养过夜，得到宿主菌悬液；
(2)将菌悬液以1:100比例转接到l0ml TSB培养液(含5％新生牛血清)，于5％CO2培养箱37℃培养；
(3)将噬菌体Riemerella anatipestifer phage WXLRAP15稀释至一定的浓度并计数，与宿主菌按照不同比例混合培养；
(4)在5％CO2培养箱37℃培养过夜，培养结束后5000rpm离心l0min并收集上清，测定噬菌体效价，实验重复3次。
结果如表1所示，噬菌体Riemerella anatipestifer phage WXLRAP15 浓度为4.5×105pfu/mL，宿主菌浓度为2.3×107cfu/mL时发酵效果最好，效价达109pfu/ml以上。
表1不同浓度比例下鸭疫里氏杆菌噬菌体Riemerella anatipestifer phageWXLRAP15的效价
对鸭疫里氏杆菌噬菌体Riemerella anatipestifer phage WXLRAP15的 pH稳定性进行试验，步骤如下：
(1)取无菌细菌瓶分别加入不同pH(3、4、5、6、7、8、9、10、11) 的TSB培养基9mL后将上述细菌瓶置于25℃的恒温水浴中，待温度平衡后加入lmL噬菌体纯培养液，于25℃环境中静置4h；
(2)分别于第1h、2h和4h取样品做适当稀释后采用双层平板法测定噬菌体效价，各点均作双份复管培养取平均值，实验重复3次。
结果如表2所示，鸭疫里氏杆菌噬菌体Riemerella anatipestifer phageWXLRAP15在pH为4-10范围内处理1h其效价无明显变化，4h后仍具有较高效价。
表2反应不同时间后鸭疫里氏杆菌噬菌体Riemerella anatipestifer phageWXLRAP15的pH值稳定性
对鸭疫里氏杆菌噬菌体Riemerella anatipestifer phage WXLRAP15的温度稳定性进行试验，步骤如下：
(1)取若干支无菌50mL离心管，各加入45mL TSB后置于相应温度的恒温水浴中，待温度平衡后分别加入5mL噬菌体纯培养液，于5℃、25℃、35℃、 45℃、55℃、65℃、75℃的温度中作用1h、24h、48h、72h；
(2)作用时间结束后取出样品管并立即置于冷水中冷却，经适当稀释后采用双层平板法测定噬菌体效价，各点均作双份复管培养取平均值，实验重复3次。
结果如表3所示，鸭疫里氏杆菌噬菌体Riemerella anatipestifer phageWXLRAP15在温度为55℃以下较易存活，在55℃水浴1h后仍有较高的效价，在5-35℃具有良好的稳定性，可长时间保存。
表3噬菌体Riemerella anatipestifer phage WXLRAP15不同温度下存放后的效价(起始效价：5.2x109pfu/mL)
为测试鸭疫里氏杆菌噬菌体Riemerella anatipestifer phage WXLRAP15 对鸭疫里氏杆菌的裂解范围，进行鸭疫里氏杆菌噬菌体Riemerella anatipestifer phageWXLRAP15对鸭疫里氏杆菌裂解范围试验，取效价为 1.0x108pfu/mL鸭疫里氏杆菌噬菌体Riemerella anatipestifer phage WXLRAP15，采用点滴法来测定噬菌体的裂解谱，步骤如下；
(1)挑取分离自全国不同地区包含RA1型在内的7种不同血清型的66 株鸭疫里氏杆菌的单克隆，分别接种于盛有3mL TSB(含5％新生牛血清)的离心管中，于5％CO2培养箱37℃培养过夜，制得各株细菌菌悬液；
(2)取300uL菌悬液分别与TSB半固体(含5％新生牛血清)培养基混合铺于已制备好的TSA平板上，取5uL噬菌体Riemerella anatipestifer phage WXLRAP15滴于平板上，待自然风干后于5％CO2培养箱37℃培养过夜，观察结果。
结果如表4所示，鸭疫里氏杆菌噬菌体Riemerella anatipestifer phageWXLRAP15可裂解66株鸭疫里氏杆菌中的41株，包含所有的6种血清型，裂解率为62.1％，对其中45株1型鸭疫里氏杆菌的裂解率为75.5％，说明噬菌体Riemerella anatipestiferphage WXLRAP15具有较宽的宿主谱，能为开发出防治由鸭疫里氏杆菌尤其是血清1型引起的鸭传染性浆膜炎提供优良的生物制剂。
表4鸭疫里氏杆菌噬菌体Riemerella anatipestifer phage WXLRAP15 裂解谱测定结果
其中，“-”表示不裂解；“+”表示有轻微裂解，裂解斑模糊；“++”表示裂解，裂解斑较为清晰；“+++”表示裂解，裂解斑非常清晰。
同时，还对噬菌体Riemerella anatipestifer phage WXLRAP15的裂解效率进行测定，以WXLRA08为宿主菌，过夜活化后以1:100比例转接新鲜的培养基中，测量OD600并进行细菌计数，步骤如下：
照宿主菌浓度为107cfu/mL，噬菌体浓度为105pfu/mL比例接入两者后共培养，每小时测培养液OD600，连续监测12h，观察噬菌体裂解细菌动态及裂解效率，同时以实验室保存的3株鸭疫里氏杆菌噬菌体做对比。
实验结果如图4所示，图4结果显示，噬菌体Riemerella anatipestifer phageWXLRAP15与宿主细菌共培养至12h时仍具有很强的裂解性，而噬菌体 WXLRAP2、WXLRAP3和WXLRAP4与宿主菌分别在共培养了9h、5h和6h时宿主菌的浓度即开始上升，裂解效率下降，结果表明噬菌体Riemerella anatipestifer phage WXLRAP15具有很强的裂解效率并且裂解时间维持时间长，将其用于鸭传染性浆膜炎的防治具有很强的应用价值。
经过上述测定，本发明的噬菌体Riemerella anatipestifer phage WXLRAP15具有很高的发酵效价，在实验室小量发酵中效价可达 2.2x109pfu/mL，对温度及pH均有良好的耐受性，具有较宽的裂解谱，可裂解 6种血清型的鸭疫里氏杆菌，对1型鸭疫里氏杆菌的裂解率高达75.5％，其裂解鸭疫里氏杆菌的速度快且维持裂解的时间长，可成为用于防治鸭疫里氏杆菌病抗生素的替代制剂。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (4)
1.一种鸭疫里氏杆菌噬菌体，其特征在于，其能对鸭疫里氏杆菌发生裂解作用，所述噬菌体命名为鸭疫里氏杆菌噬菌体Riemerella anatipestifer phage WXLRAP15，噬菌体Riemerella anatipestifer phage WXLRAP15于2021年11月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M20211477。
2.根据权利要求1所述的一种鸭疫里氏杆菌噬菌体，其特征在于，所述噬菌体以鸭疫里氏杆菌菌株WXLRA15为宿主分离得到，其为长尾噬菌体，噬菌斑大小为1mm，所述噬菌体基因组全长为47956bp，G+C含量为34.9％，共有83个ORF。
3.权利要求1或2所述的一种鸭疫里氏杆菌噬菌体在鸭疫里氏杆菌所导致的鸭疫里氏杆菌病的预防和治疗中的应用。
4.权利要求1或2所述的鸭疫里氏杆菌噬菌体的分离和纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采集自湖北某肉鸭养殖场附近水样、粪便样品及土壤样品共计50份，将样品简单前处理后，5000rpm离心10min后取上清液过滤除菌，滤液与同体积的2×TSB液体培养基(含10％新生牛血清)及1mL处于对数期的鸭疫里氏杆菌菌液(107cfu/mL)均匀混合，于5％CO2培养箱中37℃过夜培养，富集噬菌体；
(2)将样本富集液5000rpm离心10min，取上清液过0.22μm的微孔滤膜除菌得到含有噬菌体的滤液；
(3)取滤液100uL与其宿主鸭疫里氏杆菌菌液500uL均匀混合，静置15min使其与细菌表面的受体充分结合；
(4)将上述混合液加入7mL冷却至50℃的TSB半固体琼脂培养基(含5％新生牛血清)，混匀后立即铺于已凝固的TSA平板上，待琼脂凝固后于5％CO2培养箱中37℃倒置培养12-16h，观察噬菌斑生长情况；
(5)在形成噬菌斑的双层平板上，用无菌枪头挑取大而透亮的噬菌斑，于1mL SM液中振荡解吸附后过0.22μm的微孔滤膜除菌得噬菌体滤液，将其接种于5mL TSB液体培养基(含5％新生牛血清)中，加入100uL相应的宿主鸭疫里氏杆菌菌液并混匀，5％CO2培养箱37℃条件下过夜培养，5000rpm离心10min取上清后以细菌滤膜过滤，采用双层平板法观察噬菌斑形态，重复操作3-5次后，即可得形状和大小一致的噬菌斑。
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101575592A (zh) * | 2009-04-22 | 2009-11-11 | 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 | 鸭疫里氏杆菌敏感的烈性噬菌体及应用 |
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|---|---|---|---|---|
| CN101575592A (zh) * | 2009-04-22 | 2009-11-11 | 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 | 鸭疫里氏杆菌敏感的烈性噬菌体及应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| CHENG等: "Complete genomic sequence of the virulent bacteriophage RAP44 of Riemerella anatipestifer.", AVIAN DISEASES * |
| 程龙飞等: "鸭疫里氏杆菌敏感烈性噬菌体的分离鉴定", 中国兽医科学 * |
| 钟敏等: "鸭疫里氏杆菌敏感烈性噬菌体RAP44的生物学特性", 中国兽医科学 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112646786A (zh) * | 2021-01-21 | 2021-04-13 | 海南海壹水产种苗有限公司 | 一株坎式弧菌噬菌体快速初步分离方法 |
| CN117987378A (zh) * | 2024-02-01 | 2024-05-07 | 青岛润达生物科技有限公司 | 一株耐高温鸭疫里默氏杆菌噬菌体及其应用 |
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