CN114917363B - 一种纳米复合材料及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种纳米复合材料及其制备方法和应用。所述纳米复合材料具有以上转换纳米颗粒为内核，以聚合物为外壳的核壳结构，以及负载到所述聚合物表面的核酸药物；所述上转换纳米颗粒的结构式为NaGdF4:Yb,Er@NaGdF4；所述聚合物上连接有光敏剂。本发明中，通过上转换纳米颗粒与光敏剂、以及核酸药物的配合，使得所述纳米复合材料在980nm近红外光激发下，能够提高核酸药物在内涵体中的逃逸效率，增强核酸药物的基因沉默效率，进一步增强核酸药物的治疗效果，同时，光照产生活性氧会诱导细胞凋亡，能够通过光动力治疗杀死肿瘤细胞，通过基因治疗与光动力治疗的协同增效，能实现高效抗肿瘤。

Description

一种纳米复合材料及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于纳米生物医学技术领域，具体涉及一种纳米复合材料及其制备方法和应用。
背景技术
核酸分子是常用的基因治疗试剂。然而，在基因治疗中，核酸分子的递送面临着一系列问题，比如，生理环境中含有大量核酸酶导致核酸药物在递送过程中被降解；其次，负电性的核酸药物难以通过自身作用跨越同样带有负电的细胞膜进入细胞，从而限制了其治疗效果。
目前，研究人员开发了包括阳离子聚合物、脂质体以及无机纳米颗粒等各种类型的纳米颗粒以提高其递送效率。例如，CN110101664A公开了一种用于递送具有特异性剪切HPV16型基因功能的核酸类药物的系统及其制备方法。通过筛选脂质成分、比例，制备了一种pH敏感的阳离子脂质体，可以包裹或负载CRISPR/Cas9基因药物，针对HPV16阳性细胞具有较高的药物递送效率，可以明显降低HPV16基因的表达，显著提高预防和治疗人宫颈癌的效果。但是，所述药物递送系统的递送效率有待进一步提高。
CN113940921A公开了一种具有粘液渗透的核酸药物载体及其制备方法与应用，所述核酸药物载体包括核酸药物递送内核和功能化修饰外壳，其中功能化修饰外壳为多巴胺修饰的透明质酸聚合物，所述核酸药物载体具有良好的粘液渗透能力，显著增强了核酸药物的粘液穿透能力并实现目标细胞靶向递送。但是，所述载体在内涵体中的逃逸效率差，
CN109549933A公开了一种pH响应的纳米载体及其制备方法与应用。所述pH响应的纳米载体为表面接枝有酸敏性分子的介孔二氧化硅纳米粒子。所述纳米载体有效地解决了生物大分子在到达靶细胞前泄漏或无法在细胞内特定条件下可控释放的问题，实现了负载的生物大分子在特定pH条件下的控制释放。但是，所述载体的治疗效率有待进一步提高。
现有技术的普遍缺陷是，光敏剂的激发光大多为紫外或可见光，其较低的组织穿透深度以及光毒性问题严重限制了其在活体中的应用，并且大多数纳米载体会经过内涵体/溶酶体途径进入细胞，这些纳米载体难以高效地从内涵体中逃逸，导致核酸分子由于内涵体/溶酶体中酸度增加以及酶活性增强而降解失活，限制了其基因治疗效果。
因此，开发一种能够提高药物在内涵体中的逃逸效率，并且提高治疗效率，可用于深层组织的药物递送以及治疗的载体材料，是本领域亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种纳米复合材料及其制备方法和应用。所述纳米复合材料通过上转换纳米颗粒与光敏剂协同，在近红外光照射下，能够有效递送核酸药物、促进核酸药物的内涵体逃逸，增强核酸基因沉默的效果，并且光敏剂吸收能量产生活性氧，能够诱导细胞凋亡，从而实现光动力治疗，而通过基因治疗与光动力治疗的协同增效，进一步提高抗肿瘤效率。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种纳米复合材料，所述纳米复合材料具有以上转换纳米颗粒为内核，以聚合物为外壳的核壳结构，以及负载到所述聚合物表面的核酸药物；所述上转换纳米颗粒的结构式为NaGdF4:Yb,Er@NaGdF4；所述聚合物上连接有光敏剂。
本发明中，所述上转换纳米颗粒一方面作为递送载体实现对光敏剂和核酸药物的递送，另一方面作为光能转换器吸收近红外光，并将具有高组织穿透深度的近红外光转换为可见光，光敏剂吸收可见光并产生活性氧，通过活性氧破坏内涵体膜促进核酸药物实现内涵体逃逸，避免了内涵体中核酸酶对核酸药物的降解，并且能够增强核酸的基因沉默效果，进一步提高核酸的治疗效果，释放到胞质中的核酸分子具有基因治疗的作用，同时活性氧能够诱导细胞凋亡产生光动力治疗效果，通过基因治疗和光动力治疗的协同增效，能够提高肿瘤的治疗效果，并且所述纳米复合材料具有良好的生物相容性，且制备方法简单、易代谢，适用于批量生产。
优选地，所述上转换纳米颗粒具有核壳结构。
优选地，所述上转换纳米颗粒中NaGdF4:Yb,Er为内核，NaGdF4为外壳。
优选地，所述NaGdF4:Yb,Er中Er离子的摩尔百分含量为0.5～5％，例如可以为0.8％、1％、1.2％、1.5％、1.8％、2％、2.2％、2.5％、2.8％、3％、3.2％、3.5％、3.8％、4％、4.2％、4.5％、4.8％等，进一步优选为1～3％。
优选地，所述NaGdF4:Yb,Er中Yb离子的摩尔百分含量为1～70％，例如可以为2％、4％、8％、12％、16％、20％、24％、28％、32％、34％、36％、38％、40％、44％、48％、52％、56％、58％、60％、62％、64％、68％等，进一步优选为20～70％。
本发明中，所述NaGdF4:Yb,Er中Yb、Er离子的摩尔百分含量在特定的范围内，光转换效率高；摩尔百分含量过高或过低都会影响发光效率，并且当Er离子的摩尔百分含量为1～3％时，Yb离子的摩尔百分含量小于20％或大于70％，发光效率差。
优选地，所述上转换纳米颗粒的粒径为2～100nm，例如可以为5nm、10nm、15nm、20nm、25nm、30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm等，进一步优选为10～30nm。
本发明中，所述上转换纳米颗粒的粒径太大，不容易被细胞摄取和代谢；粒径太小，发光效率差。
优选地，所述聚合物包括阳离子聚合物。
优选地，所述聚合物包括聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、聚烯丙基胺盐酸盐或聚多巴胺中的任意一种或至少两种的组合，进一步优选为聚乙烯亚胺(PEI)。
优选地，所述聚合物的数均分子量为8000～12000，例如可以为8500、9000、9500、10000、10500、11000、11500等。
优选地，所述光敏剂通过共价键与聚合物连接。
优选地，所述光敏剂与聚合物的摩尔比为(1～150):1，例如可以为2:1、3:1、4:1、8:1、10:1、12:1、14:1、18:1、22:1、26:1、28:1、32:1、36:1、40:1、44:1、46:1、48:1、55:1、60:1、70:1、80:1、85:1、90:1、95:1、100:1、105:1、110:1、115:1、120:1、125:1、130:1、135:1、140:1、145:1等，进一步优选为(90～110):1。
本发明中，所述光敏剂与聚合物在特定的配比内，既能保证高效的发光效率和治疗效果，又能避免光敏剂的浪费；所述光敏剂用量太少，发光效率差；用量太多，负载效率低。
优选地，所述光敏剂包括玫瑰红、酞菁锌或卟啉中的任意一种或至少两种的组合，进一步优选为玫瑰红(RB)。
本发明中，所述连接有光敏剂的聚合物通过光敏剂与聚合物进行酰胺化反应制备得到，示例性地，所述连接有玫瑰红的聚乙烯亚胺(PEI-RB)的制备方法包括以下步骤：首先通过酰胺反应将玫瑰红光敏剂与α-溴己酸(HA)连接得到RB-HA分子，取RB(122mg)与HA(20mg)于DMF溶液中以70℃反应24h得到RB-HA；接着在1mL含有RB-HA分子的DMF溶液中加入30mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)和28mg N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，反应后获得RB-NHS活化酯。接下来将活化后的光敏剂加入的PEI分子的乙醇溶液(10mL，PEI浓度4mg/mL)中避光反应2h。反应结束后离心并收集上清液得到PEI-RB分子。
优选地，所述核酸药物包括小干扰RNA、微小RNA、脱氧核酶或脱氧核反义核酸中的任意一种或至少两种的组合，进一步优选为脱氧核酶。
优选地，所述核酸药物通过静电作用吸附到聚合物表面。
第二方面，本发明提供一种根据第一方面所述的纳米复合材料的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将上转换纳米颗粒与聚合物混合，得到表面包覆有聚合物的上转换纳米颗粒；
(2)将步骤(1)得到的上转换纳米颗粒与核酸药物共孵育，得到所述纳米复合材料。
优选地，所述上转换纳米颗粒的制备方法包括：
(1”)将稀土金属氧化物与三氟乙酸反应，得到上转换纳米颗粒前驱体；
(2”)将步骤(1”)得到的上转换纳米颗粒前驱体与三氟乙酸钠、溶剂1反应，得到α-NaGdF4:Yb,Er；
(3”)将步骤(2”)得到的α-NaGdF4:Yb,Er与上转换纳米颗粒前驱体、三氟乙酸钠、溶剂2反应，得到β-NaGdF4:Yb,Er；
(4”)将步骤(3”)得到的β-NaGdF4:Yb,Er与三氟醋酸钆、三氟乙酸钠和溶剂2反应，得到所述上转换纳米颗粒。
优选地，步骤(1”)中所述稀土金属氧化物包括氧化钆、氧化镱或氧化铒。
优选地，以稀土金属氧化物的质量为1g计，所述三氟乙酸的体积为2～3mL，例如可以为2.2mL、2.3mL、2.4mL、2.5mL、2.6mL、2.7mL、2.8mL、2.9mL等。
本发明中，步骤(1”)在溶剂中进行。
优选地，所述溶剂包括去离子水。
优选地，以稀土金属氧化物的质量为1g计，所述去离子水的体积为8～12mL，例如可以为8.5mL、9mL、9.5mL、10mL、10.5mL、11mL、11.5mL等。
优选地，步骤(1”)中所述反应的温度为110～130℃，例如可以为112℃、114℃、116℃、118℃、120℃、122℃、124℃、126℃、128℃等。
本发明中，步骤(1”)所述反应至溶液变为澄清透明，反应停止，随后将溶液转移至烧杯中，在80～90℃(例如可以为82℃、84℃、86℃、88℃等)条件下加热烧杯干燥，待溶液蒸发完全后，转移至烘箱中继续干燥，得到白色固体。
优选地，步骤(2”)中所述上转换纳米颗粒前驱体包括三氟乙酸钆、三氟乙酸镱和三氟乙酸铒的组合。
优选地，所述三氟乙酸钆、三氟乙酸镱和三氟乙酸铒的摩尔比为(35～40):(5～15):1，例如可以为35:5:1、36:8:1、38:12:1、39:10:1、40:15:1等。
优选地，步骤(2”)中所述上转换纳米颗粒前驱体与三氟乙酸钠、溶剂1的摩尔比为1:(0.8～1.2):(35～45)，例如可以为1:0.8:35、1:1:38、1:1:40、1:1:42、1:1.2:45等。
优选地，所述溶剂1包括油酸、油胺和十八烯的组合。
优选地，所述溶剂1中油酸、油胺和十八烯的摩尔比为1:(0.8～1.2):(1.8～2.2)，例如可以为1:0.8:1.8、1:0.9:1.9、1:1:2、1:1.1:2.1、1:1.2:2.2等。
本发明中，所述油酸和油胺作为配体溶剂，所述十八烯为非配体溶剂。
优选地，步骤(3”)中所述的上转换纳米颗粒前驱体中三氟乙酸钆、三氟乙酸镱和三氟乙酸铒的摩尔比为(35～40):(5～15):1，例如可以为35:5:1、36:8:1、38:12:1、39:10:1、40:15:1等。
优选地，步骤(3”)中所述α-NaGdF4:Yb,Er、上转换纳米颗粒前驱体、三氟乙酸钠和溶剂2的摩尔比为1:(0.8～1.2):(0.8～1.2):(75～85)，例如可以为1:0.8:0.8:75、1:1:1:80、1:1.2:1.2:85等。
优选地，步骤(3”)中的溶剂2包括油酸和十八烯。
优选地，所述溶剂2中油酸与十八烯的摩尔比为1:(0.8～1.2)，例如可以为1:0.8、1:1、1:1.2等。
优选地，步骤(2”)、步骤(3”)中所述反应各自独立地包括经历第一阶段和第二阶段进行反应。
优选地，所述第一阶段的反应温度为115～125℃，例如可以为116℃、118℃、120℃、122℃、124℃等；反应时间为25～35min，例如可以为26min、28min、30min、32min、34min等。
本发明中，所述第一阶段在真空条件下进行，目的是除去体系中的低沸点溶剂、空气和水。
优选地，所述第二阶段的反应温度为305～315℃，例如可以为306℃、308℃、310℃、312℃、314℃等，反应时间为45～55min，例如可以为46min、48min、50min、52min、54min等。
本发明中，所述第二阶段反应在保护气氛中进行。
优选地，所述保护气氛包括氮气。
本发明中，所述第二阶段反应结束后包括离心的步骤。
优选地，所述离心的溶剂为无水乙醇。
优选地，所述离心的次数≥3次，例如可以为3次、4次、5次等。
优选地，所述离心的转速为7500～8500rpm，例如可以为7600rpm、7800rpm、8000rpm、8200rpm、8400rpm等。
优选地，所述离心的时间为8～12min，例如可以为9min、10min、11min等。
本发明中，所述离心完成后，将得到的上转换纳米颗粒分散到环己烷中待用。
优选地，步骤(4”)中所述β-NaGdF4:Yb,Er、三氟醋酸钆、三氟乙酸钠和溶剂2的摩尔比为1:(3.5～4.5):(3.5～4.5):(150～170)，例如可以为1:3.5:3.5:150、1:4:4:160、1:4.5:4.5:170等。
优选地，步骤(4”)中所述反应包括经历第一阶段和第二阶段进行反应。
优选地，所述第一阶段的反应温度为115～125℃，例如可以为116℃、118℃、120℃、122℃、124℃等，反应时间为25～35min，例如可以为26min、28min、30min、32min、34min等。
优选地，所述第二阶段的反应温度为305～315℃，例如可以为306℃、308℃、310℃、312℃、314℃等，反应时间为45～55min，例如可以为46min、48min、50min、52min、54min等。
本发明中，所述步骤(4”)第二阶段反应在氮气保护中进行。
优选地，步骤(4”)中反应后还包括加入无水乙醇离心的步骤，所述离心的次数≥3次，例如可以为3次、4次、5次等，所述离心的转速为7500～8500rpm，例如可以为7600rpm、7800rpm、8000rpm、8200rpm、8400rpm等，所述离心的时间为8～12min，例如可以为9min、10min、11min等；离心完成后，将得到的上转换纳米颗粒分散到环己烷中待用。
优选地，步骤(1)所述混合前还包括去除上转换纳米颗粒表面配体的步骤。
优选地，所述去除上转换纳米颗粒表面配体的方法包括：将上转换纳米颗粒与四氟硼酸亚硝离子反应，得到去除表面配体的上转换纳米颗粒。
优选地，所述上转换纳米颗粒与四氟硼酸亚硝离子反应的时间为1～3h，例如可以为1.2h、1.4h、1.6h、1.8h、2h、2.2h、2.4h、2.6h、2.8h等。
本发明中，以上转换纳米颗粒的体积为1mL计，所述四氟硼酸亚硝离子的质量为25～35mg，例如可以为26mg、28mg、30mg、32mg、34mg等。
本发明中，所述上转换纳米颗粒与四氟硼酸亚硝离子反应后还包括：将反应后的液体静置分层，取下层液体离心的步骤。
优选地，所述取下层液体离心的转速为12500～13500rpm，例如可以为12800rpm、13000rpm、13200rpm、13400rpm等。
优选地，所述取下层液体离心的时间为8～12min，例如可以为9min、10min、11min等。
本发明中，将离心后的纳米颗粒分散在N,N-二甲基甲酰胺中，然后再与聚合物混合。
优选地，步骤(1)所述聚合物为连接有光敏剂的聚合物。
优选地，步骤(1)中所述上转换纳米颗粒与聚合物的质量比为(5～15):1，例如可以为6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1等。
优选地，步骤(1)所述混合的时间为10～14h，例如可以为11h、12h、13h等。
优选地，步骤(1)所述混合在避光条件下进行。
本发明中，将上转换纳米颗粒与聚合物混合后还包括离心的步骤。
优选地，步骤(2)中所述表面包覆有聚合物的上转换纳米颗粒与核酸药物的摩尔比为1:(10～50)，例如可以为1:12、1:15、1:18、1:21、1:24、1:27、1:30、1:33、1:37、1:40、1:42、1:44、1:46、1:48等，进一步优选为1:(10～30)。
本发明中，所述核酸药物用量过多，负载效率低；用量太少，治疗效果差。
优选地，步骤(2)所述共孵育的时间为15～25min，例如可以为16min、18min、20min、22min、24min等。
优选地，步骤(2)所述共孵育在静止状态下进行。
本发明中，将步骤(1)得到的表面包覆有聚合物的上转换纳米颗粒与核酸药物共孵育后还包括离心、并将负载核酸药物的纳米复合材料分散在PBS缓冲液中的步骤。
作为本发明优选的技术方案，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将上转换纳米颗粒与四氟硼酸亚硝离子反应1～3h后，在避光条件下与连接有光敏剂的聚合物混合10～14h，得到表面包覆有聚合物的上转换纳米颗粒；
(2)将步骤(1)得到的上转换纳米颗粒与核酸药物在静止状态下共孵育15～25min，得到所述纳米复合材料。
第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的纳米复合材料在递送核酸药物中的应用。
第四方面，本发明提供一种如第一方面所述的纳米复合材料在制备基因-光动力协同抗肿瘤药物中的应用。
本发明中，所述纳米复合材料在980nm近红外光作用下能够产生单线态氧(1O2)用于抗肿瘤治疗。
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供的纳米复合材料，通过上转换纳米颗粒和光敏剂以及核酸药物的协同作用，能够作为药物载体，实现向深层组织有效递送核酸药物，促进细胞摄取；
(2)通过上转换纳米颗粒与光敏剂的协同，能够实现在近红外光照射下，增强核酸在内涵体中的逃逸能力，避免了内涵体中核酸酶对核酸药物的降解，并且增强核酸的基因沉默效果，进一步增强核酸的治疗效果；
(3)光敏剂接收能量产生活性氧，能够诱导细胞凋亡，产生光动力治疗效果，通过基因与光动力治疗协同增效，能够有效杀死肿瘤细胞，降低肿瘤细胞活性，提高抗肿瘤效率，并且所述纳米复合材料的制备方法简单、无需复杂的设备与严苛的反应条件，可重复性高，易于工业化生产。
附图说明
图1为本发明制备例1提供的上转换纳米颗粒的透射电镜图片；
图2为本发明制备例1提供的上转换纳米颗粒的上转换纳米颗粒发光光谱图以及光敏剂玫瑰红的紫外可见吸收光谱图；
图3为本发明实施例1提供的上转换纳米颗粒(UCNP)、表面包覆有连接玫瑰红的上转换纳米颗粒(UCNP@PEI-RB)以及纳米复合材料的电势测试结果图；
图4为本发明测试例1中对实施例1提供的纳米复合材料在980nm近红外光照射后以及无光照条件下活性氧生成能力的测试结果图；
图5为本发明测试例2中对实施例1提供的纳米复合材料以及游离的脱氧核酶被细胞摄取难易程度的测试结果图(比例尺＝20μm)；
图6为本发明测试例3中对实施例1提供的纳米复合材料在近红外光照射后以及未进行光照条件下，核酸从内涵体逃逸能力的测试结果图(比例尺＝20μm)；
图7为本发明测试例4中实施例1提供的纳米复合材料在近红外光照射下及其对照组在促进核酸基因沉默效果的测试结果图；
图8为本发明测试例5中实施例1提供的纳米复合材料在近红外光照射下及其对照组抑制肿瘤细胞活性的测试结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
本发明中，所有制备例、实施例以及测试例用到的材料如下：
氧化钆(Gd3O2)、氧化镱(Yb2O3)、氧化铒(Er2O3)、油酸(OA，90％)、油胺(OM，95％)、十八烯(ODE，95％)购自比利时Acros公司；
四氟硼酸亚硝离子(NOBF4)、聚乙烯亚胺(PEI)、三氟乙酸(CF3COOH)、玫瑰红(RoseBengal，RB)购自美国Sigma-Aldrich公司；
细胞核染料Hoechst 33342和溶酶体染料(Lyso-Tracker DND-26)购自翌圣(YEASEN)生物科技公司；
CCK-8试剂盒购自索莱宝(Solarbio)公司；
qRT-PCR试剂盒(TransStart Green qPCR SuperMix)购自全式金(Transgene)公司；
脱氧核酶(10-23DNAzyme序列：CCTCGGCCAGGCTAGCTACAACGACCGCTCC)购自生工生物工程股份有限公司；
Opti-MEM培养基(Thermo Fisher Scientific，11058021)；
HeLa宫颈癌细胞来自美国模式培养物集存库(American type culturecollection，ATCC)。
制备例1
一种上转换纳米颗粒NaGdF4:Yb,Er@NaGdF4，其中，NaGdF4:Yb,Er中Er离子的摩尔百分比为2％，Yb离子的摩尔百分比为20％；所述上转换纳米颗粒NaGdF4:Yb,Er@NaGdF4的制备方法包括：
(1)分别称取2g氧化钆、氧化镱和氧化铒于单口烧瓶中，加入20mL去离子水以及5mL三氟乙酸，放入磁子后固定于油浴锅中，冷凝回流，在120℃条件下反应至溶液澄清透明，结束加热，并将反应得到的液体转移至烧杯中，在90℃的条件下干燥，随后转移至烘箱中烘干，分别得到三氟乙酸钆、三氟乙酸镱和三氟乙酸铒；
(2)通过热分解法，在室温下，将0.78mmol三氟乙酸钆，0.20mmol三氟乙酸镱，0.02mmol三氟乙酸铒和1mmol三氟乙酸钠加入到40mmol含有油酸、油胺和十八烯的混合物中(所述油酸、油胺和十八烯的摩尔比为1:1:2)，首先在真空条件下剧烈搅拌，逐步加热至120℃保持30min，以除去体系中的低沸点溶剂、空气和水；接着在氮气保护下升温至310℃并保持50min，反应结束后将体系降至室温，向体系中加入20mL无水乙醇并离心(转速为8000rpm离心10min)，离心结束后去除上清液加入10mL环己烷并超声至澄清透明，然后加入20mL无水乙醇离心(8000rpm，10min)，重复三次后将纳米颗粒重新分散在10mL环己烷中得到α-NaGdF4:Yb,Er；
(3)将5mL步骤(2)得到α-NaGdF4:Yb,Er的环己烷溶液与40mmol含有油酸和十八烯的混合物(油酸与十八烯的摩尔比为1:1)、0.36mmol三氟乙酸钆、0.10mmol三氟乙酸镱、0.01mmol三氟乙酸铒和0.5mmol三氟乙酸钠混合，在真空条件下剧烈搅拌并逐步加热至120℃反应30min，随后在氮气保护下升至310℃反应50min，待反应结束后降至室温并加入无水乙醇后离心，去除上清液并加入环己烷超声分散后加入无水乙醇沉淀，接着离心并重复以上步骤3次，最终将产物分散在10mL环己烷中得到β-NaGdF4:Yb,Er。
(4)将5mL步骤(3)得到的β-NaGdF4:Yb,Er加入到含有20mmol油酸、20mmol十八烯、1mmol三氟乙酸钆以及1mmol CF3COONa的三口烧瓶中，在真空条件下剧烈搅拌并升温至120℃，保持30min，以除去溶液中的氧气以及水等杂质，接着升温至310℃并保持50min至反应结束。然后降至室温加入无水乙醇沉淀出纳米颗粒，离心并去除上清液后分散在环己烷中，重复以上步骤三次后将产物重新分散在10mL环己烷中得到所述具有核壳结构的NaGdF4:Yb,Er@NaGdF4上转换纳米颗粒。
采用透射电子显微镜(HT-7700，HITACHI，日本)对制备例1提供的上转换纳米颗粒NaGdF4:Yb,Er@NaGdF4的结构进行表征，结果如图1所示，得到的纳米颗粒形貌规则、粒径均一，粒径大小为17.5nm。
采用荧光分光光度计(F4600，HITACHI，日本)测试制备例1提供的上转换纳米颗粒NaGdF4:Yb,Er@NaGdF4在980nm近红外光激发下的发射光谱，使用紫外可见分光光度计(UH5300，HITACHI，日本)测试光敏剂玫瑰红的吸收光谱，结果如图2所示，在980nm近红外激光的激发下，所述上转换纳米颗粒NaGdF4:Yb,Er@NaGdF4的发射光谱图显示出明显的Er离子发射特征峰，在525nm和541nm处具有强烈的绿光发射以及在656nm处具有较弱的红光发射；而玫瑰红的紫外可见吸收光谱显示在550nm左右具有最大的吸收峰，表明上转换纳米颗粒的发射峰和玫瑰红的吸收峰高度重合。
制备例2
一种上转换纳米颗粒及其制备方法，其与制备例1的区别仅在于，所述制备方法中，步骤(3)中没有加入三氟乙酸钆、三氟乙酸镱和三氟乙酸铒，得到粒径为5nm的上转换纳米颗粒，其它原料、用量及制备方法均与制备例1相同。
制备例3
一种上转换纳米颗粒及其制备方法，其与制备例1的区别仅在于，所述制备方法中，步骤(2)以及步骤(3)中保证三氟乙酸钆、三氟乙酸镱和三氟乙酸铒的配比不变，金属三氟乙酸盐的总摩尔量分别为2mmol，得到粒径为35nm的上转换纳米颗粒，其它原料、用量及制备方法均与制备例1相同。
实施例1
本实施例提供一种纳米复合材料，所述纳米复合材料具有以制备例1提供的上转换纳米颗粒NaGdF4:Yb,Er@NaGdF4为内核，以连接有玫瑰红的聚乙烯亚胺为外壳的核壳结构，以及负载到聚乙烯亚胺表面的脱氧核酶；所述玫瑰红与聚乙烯亚胺的摩尔比为100:1。
本实施例提供一种所述纳米复合材料的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将1mL制备例1得到的NaGdF4:Yb,Er@NaGdF4的环己烷分散液与等体积N,N-二甲基甲酰胺(DMF)混合，随后加入30mg四氟硼酸亚硝离子在剧烈搅拌条件下反应2h后，静置分层，取下层液体离心(13000rpm，10min)，去除上清液后将底部纳米颗粒重新分散在DMF中，加入4mg修饰了玫瑰红的聚乙烯亚胺，在避光条件下搅拌12h，离心(8000rpm，3min)并收集底部纳米颗粒重新分散在去离子水中，重复离心三次，得到表面包覆有聚乙烯亚胺的上转换纳米颗粒；
(2)将步骤(1)得到的包覆有聚乙烯亚胺的上转换纳米颗粒与脱氧核酶(所述上转换纳米颗粒与脱氧核酶的摩尔比为1:20)静止孵育20min，离心(13000rpm，5min)并重新分散在PBS缓冲溶液中，得到所述纳米复合材料。
采用激光粒度仪(Zetasizer Nano ZS90，Malvern，英国)分别对上转换纳米颗粒NaGdF4:Yb,Er@NaGdF4(UCNP)、表面包覆有连接玫瑰红的聚乙烯亚胺的上转换纳米颗粒(UCNP@PEI-RB)以及纳米复合材料的电势进行表征，结果如图3所示，与UCNP相比，UCNP@PEI-RB的正电位变高，表明带正电的聚乙烯亚胺成功包覆在上转换纳米颗粒表面，吸附脱氧核酶后纳米复合材料的电位由正转负，表明脱氧核酶在聚乙烯亚胺的表面成功吸附。
实施例2
本实施例提供一种纳米复合材料，其与实施例1的区别仅在于，将所述脱氧核酶替换为等量的碱基突变的脱氧核酶(序列为CCTCGGCCAGGCTACCTACAACGACCGCTCC)，其它原料、用量、结构以及制备方法均与实施例1相同。
实施例3
本实施例提供一种纳米复合材料，其与实施例1的区别仅在于，所述玫瑰红与聚乙烯亚胺的摩尔比为1:1，其它原料、用量及制备方法均与实施例1相同。
实施例4
本实施例提供一种纳米复合材料，其与实施例1的区别仅在于，所述玫瑰红与聚乙烯亚胺的摩尔比为1:150，其它原料、用量及制备方法均与实施例1相同。
实施例5
本实施例提供一种纳米复合材料，其与实施例1的区别仅在于，所述上转换纳米颗粒与脱氧核酶的摩尔比为1:10，其它原料、用量及制备方法均与实施例1相同。
实施例6
本实施例提供一种纳米复合材料，其与实施例1的区别仅在于，所述上转换纳米颗粒与脱氧核酶的摩尔比为1:50，其它原料、用量及制备方法均与实施例1相同。
实施例7
本实施例提供一种纳米复合材料，其与实施例1的区别仅在于，所述上转换纳米颗粒选用制备例2提供的上转换纳米颗粒，其它原料、用量及制备方法均与实施例1相同。
实施例8
本实施例提供一种纳米复合材料，其与实施例1的区别仅在于，所述上转换纳米颗粒选用制备例3提供的上转换纳米颗粒，其它原料、用量及制备方法均与实施例1相同。
测试例1
对实施例1提供的纳米复合材料进行活性氧生成能力的测试：
以1,3-二苯异苯并呋喃(DPBF)为单线态氧(1O2)指示剂用来验证1O2的生成，测试步骤为：将所述纳米复合材料加入装有1mL DPBF(10μM)溶液的比色皿中，采用980nm近红外光照射溶液(照射功率1.2W/cm2)，利用紫外分光光度计于不同的时间点测量吸收光谱，通过420nm处DPBF的吸收值变化来评价纳米复合材料在980nm近红外光作用下生成活性氧的能力，对照组为没有经过近红外光照射。
结果如图4所示，在980nm近红外光照射下，DPBF的吸收值随着时间的延长而逐渐降低，而未经980nm近红外光照射情况下其吸收值保持不变，表明所述纳米复合材料在980nm近红外光激发下产生了1O2。
测试例2
对实施例1提供的纳米复合材料进行细胞摄取实验的测试：
在实施例1提供的纳米复合材料中脱氧核酶的一端标记Cy5荧光染料，将HeLa细胞以每皿1×105的密度培养于35mm共聚焦小皿中，细胞密度达到80％左右时移去培养基并用新鲜的PBS洗涤三次，然后加入500uL含有Cy5标记的纳米复合材料的Opti-MEM培养基在细胞培养箱中孵育3h，弃去培养基并用PBS洗涤三次，采用细胞核染料Hoechst 33342染色10min，PBS清洗后，采用激光共聚焦进行共聚焦成像，激发波长为350nm，发射波长为460nm，观察细胞对纳米复合材料的摄取情况，对照组为将纳米复合材料替换为Cy5标记的脱氧核酶。
结果如图5所示，由于核酸分子带有负电难以跨越细胞膜进入细胞，所以脱氧核酶处理的细胞几乎没有Cy5荧光信号出现。相比之下，纳米复合材料处理的细胞表现出强烈的Cy5荧光信号，表明细胞能够有效摄取纳米复合材料，证明通过实施例1中制备的纳米复合材料可以实现核酸药物的高效内化。
测试例3
对实施例1提供的纳米复合材料在促进核酸内涵体逃逸的能力进行测试：
具体步骤包括：将HeLa细胞(1×105/皿)接种在35mm共聚焦小皿中，24h后更换新鲜培养基并用PBS洗涤，加入含有Cy5标记的实施例1提供的纳米复合材料的Opti-MEM培养基继续培养3h；洗去未被细胞摄取的纳米材料后，用980nm激光器照射细胞(1.2W/cm2，照射1min，间隔3min，总计20min)，然后更换新鲜培养基并用含有溶酶体绿色荧光染料(Lyso-Tracker DND-26)的培养基继续培养30min。最后，用Hoechst 33342染料染细胞核并用PBS洗涤3次后通过激光共聚焦成像，观察纳米复合材料以及溶酶体在细胞中的分布，对照组为未经过近红外光照射处理。
结果如图6所示，未经近红外光照射的情况下，经Cy5标记的纳米复合材料的红色荧光与经Lyso-Tracker DND-26标记的溶酶体的绿色荧光具有良好的共定位效果，其皮尔森系数为0.65，表明大部分纳米复合材料依然在溶酶体中；而经980nm激光近红外光处理20min的实验组中，纳米复合材料的红色荧光与溶酶体绿色荧光信号的共定位系数(皮尔森系数)仅有0.35，表明绝大部分的纳米材料从内涵体中逃逸出来。由此可以证明，通过近红外光照射产生的1O2可以显著提高纳米复合材料在内涵体中逃逸的能力，从而有效地避免脱氧核酶在递送过程中被核酸酶降解而失去活性。
测试例4
对实施例1提供的纳米复合材料在增强基因沉默中的测试：
通过PCR分析细胞内靶标mRNA的水平用于评价脱氧核酶在细胞中的活性，具体方法如下，首先在六孔板中接种HeLa细胞(2×105/孔)培养至细胞密度达到80～90％时，移除培养基并用PBS洗涤3次，加入含有实施例1提供的纳米复合材料的Opti-MEM培养基孵育3h，洗去培养基中游离的纳米复合材料后，用980nm近红外光照射(1.2W/cm2，每照1min间隔3min，共20min)，继续培养24h后，更换培养基并用PBS洗涤3次，接着按照操作手册用Trizol提取细胞中的总RNA，定量后反转录得到cDNA，接着利用PCR试剂盒在实时定量PCR仪中完成对靶标RNA的定量分析，PBS对照组，不加入任何纳米材料，对照组1为采用实施例2提供的纳米复合材料且经近红外光照射，对照组2为采用实施例1提供的纳米复合材料，但未采用近红外光照射。
结果如图7所示，与PBS对照组相比，在实验组中，经980nm近红外光照射后，采用实施例1制备的纳米复合材料处理的细胞中靶标mRNA表达水平显著降低，只有39.7％，而对照组2中，细胞表现出较低的靶标mRNA切割效率，mRNA表达水平较高，为70.82％，表明近红外光调控内涵体逃逸增强了脱氧核酶对mRNA的沉默能力；对照组1中，采用实施例2制备的纳米复合材料处理的细胞，经近红外光照射后，靶标mRNA表达水平无明显变化；由此表明，本发明提供的纳米复合材料在近红外光作用下显著增强了基因沉默效果。
测试例5
对实施例1提供的纳米复合材料抑制肿瘤细胞活性的测试：
通过CCK-8测试肿瘤细胞活性评价治疗效果，具体测试方法包括：将HeLa细胞(培养密度为1×104/孔，100μL)培养于96孔板中，当细胞密度达到80％左右时移除培养基，用PBS清洗后加入含有实施例1提供的纳米复合材料的培养基，继续培养3h，洗去未被摄取的纳米颗粒后对含有实施例1提供的纳米复合材料的实验组用980nm近红外光进行光照(1.2W/cm2，照射1min间隔5min，共20min)，然后将细胞置于细胞培养箱中继续培养24h后，向每个孔中加入100μL含有10％CCK-8试剂的PBS，继续孵育1h后，在微孔板分光光度计(Epoch 2T，BioTek，美国)上测量样品在450nm出的吸收值，与PBS对照组对比，得出细胞活力值。对照组1为采用实施例2提供的纳米复合材料且经近红外光照射，对照组2为采用实施例1提供的纳米复合材料，但未采用近红外光照射。
结果如图8所示，实验组经980nm近红外光照射的实施例1提供的纳米复合材料处理的细胞活力值为26.68％，远远低于对照组2的细胞活性(76.34％)，而对照组1中细胞活性虽然有一定程度的下降(39.79％)，但细胞存活率仍高于实验组，由此表明，近红外光诱导的光动力治疗可以杀伤肿瘤细胞，同时近红外光可以进一步增强基因治疗，实现基因治疗与光动力治疗的协同联合作用。
综上所述，本发明提供的纳米复合材料，将上转换纳米颗粒、光敏剂以及核酸药物协同，能够将高组织穿透能力的近红外光转为可见光，激活光敏剂产生活性氧，随后通过活性氧破坏内涵体膜，增强核酸药物从内涵体中逃逸的能力，实现高效的基因治疗；同时活性氧能够诱导细胞凋亡产生光动力治疗效果，并且光照能增强核酸药物的基因沉默效率，光调控的基因治疗与光动力治疗具有协同增效的治疗效果。此外，本发明提供的基因-光动力协同治疗的纳米复合材料的制备方法工艺简单，可重复性高，不需要复杂的生产设备与苛刻的反应条件，具有较高的推广应用价值。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (42)

1.一种纳米复合材料，其特征在于，所述纳米复合材料具有以上转换纳米颗粒为内核，以聚合物为外壳的核壳结构，以及负载到所述聚合物表面的核酸药物；
所述上转换纳米颗粒的结构式为NaGdF4:Yb,Er@NaGdF4；
所述上转换纳米颗粒具有核壳结构；所述上转换纳米颗粒中NaGdF4:Yb,Er为内核，NaGdF4为外壳；
所述NaGdF4:Yb,Er中Er离子的摩尔百分含量为0.5～5％；
所述NaGdF4:Yb,Er中Yb离子的摩尔百分含量为20～70％；
所述聚合物包括聚乙烯亚胺；所述聚合物上连接有光敏剂；
所述光敏剂与聚合物的摩尔比为(1～150):1；
所述核酸药物包括脱氧核酶；所述核酸药物通过静电作用吸附到聚合物表面。
2.根据权利要求1所述的纳米复合材料，其特征在于，所述NaGdF4:Yb,Er中Er离子的摩尔百分含量为1～3％。
3.根据权利要求1所述的纳米复合材料，其特征在于，所述上转换纳米颗粒的粒径为2～100nm。
4.根据权利要求3所述的纳米复合材料，其特征在于，所述上转换纳米颗粒的粒径为10～30nm。
5.根据权利要求1所述的纳米复合材料，其特征在于，所述聚合物的数均分子量为8000～12000。
6.根据权利要求1所述的纳米复合材料，其特征在于，所述光敏剂通过共价键与聚合物连接。
7.根据权利要求1所述的纳米复合材料，其特征在于，所述光敏剂与聚合物的摩尔比为(90～110):1。
8.根据权利要求1所述的纳米复合材料，其特征在于，所述光敏剂包括玫瑰红、酞菁锌或卟啉中的任意一种或至少两种的组合。
9.根据权利要求8所述的纳米复合材料，其特征在于，所述光敏剂包括玫瑰红。
10.一种根据权利要求1～9任一项所述的纳米复合材料的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将上转换纳米颗粒与聚合物混合，得到表面包覆有聚合物的上转换纳米颗粒；
(2)将步骤(1)得到的表面包覆有聚合物的上转换纳米颗粒与核酸药物共孵育，得到所述纳米复合材料。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述上转换纳米颗粒的制备方法包括：
(1”)将稀土金属氧化物与三氟乙酸反应，得到上转换纳米颗粒前驱体；
(2”)将步骤(1”)得到的上转换纳米颗粒前驱体与三氟乙酸钠、溶剂1反应，得到α-NaGdF4:Yb,Er；
(3”)将步骤(2”)得到的α-NaGdF4:Yb,Er与上转换纳米颗粒前驱体、三氟乙酸钠、溶剂2反应，得到β-NaGdF4:Yb,Er；
(4”)将步骤(3”)得到的β-NaGdF4:Yb,Er与三氟乙酸钆、三氟乙酸钠和溶剂2反应，得到所述上转换纳米颗粒。
12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，步骤(1”)中所述稀土金属氧化物包括氧化钆、氧化镱或氧化铒。
13.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，以稀土金属氧化物的质量为1g计，所述三氟乙酸的体积为2～3mL。
14.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，步骤(1”)中所述反应的温度为110～130℃。
15.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，步骤(2”)中所述上转换纳米颗粒前驱体包括三氟乙酸钆、三氟乙酸镱和三氟乙酸铒的组合。
16.根据权利要求15所述的制备方法，其特征在于，所述三氟乙酸钆、三氟乙酸镱和三氟乙酸铒的摩尔比为(35～40):(5～15):1。
17.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，步骤(2”)中所述上转换纳米颗粒前驱体与三氟乙酸钠、溶剂1的摩尔比为1:(0.8～1.2):(35～45)。
18.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述溶剂1包括油酸、油胺和十八烯的组合。
19.根据权利要求18所述的制备方法，其特征在于，所述溶剂1中油酸、油胺和十八烯的摩尔比为1:(0.8～1.2):(1.8～2.2)。
20.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，步骤(3”)中所述上转换纳米颗粒前驱体中三氟乙酸钆、三氟乙酸镱和三氟乙酸铒的摩尔比为(35～40):(5～15):1。
21.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，步骤(3”)中所述α-NaGdF4:Yb,Er、上转换纳米颗粒前驱体、三氟乙酸钠和溶剂2的摩尔比为1:(0.8～1.2):(0.8～1.2):(75～85)。
22.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，步骤(3”)中的溶剂2包括油酸和十八烯。
23.根据权利要求22所述的制备方法，其特征在于，所述溶剂2中油酸与十八烯的摩尔比为1:(0.8～1.2)。
24.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，步骤(2”)、步骤(3”)中所述反应各自独立地包括经历第一阶段和第二阶段进行反应。
25.根据权利要求24所述的制备方法，其特征在于，所述第一阶段的反应温度为115～125℃，反应时间为25～35min。
26.根据权利要求24所述的制备方法，其特征在于，所述第二阶段的反应温度为305～315℃，反应时间为45～55min。
27.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，步骤(4”)中所述β-NaGdF4:Yb,Er、三氟醋酸钆、三氟乙酸钠和溶剂2的摩尔比为1:(3.5～4.5):(3.5～4.5):(150～170)。
28.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，步骤(4”)中所述反应包括经历第一阶段和第二阶段进行反应。
29.根据权利要求28所述的制备方法，其特征在于，所述第一阶段的反应温度为115～125℃，反应时间为25～35min。
30.根据权利要求28所述的制备方法，其特征在于，所述第二阶段的反应温度为305～315℃，反应时间为45～55min。
31.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述混合前还包括去除上转换纳米颗粒表面配体的步骤。
32.根据权利要求31所述的制备方法，其特征在于，所述去除上转换纳米颗粒表面配体的方法包括：将上转换纳米颗粒与四氟硼酸亚硝离子反应，得到去除表面配体的上转换纳米颗粒。
33.根据权利要求32所述的制备方法，其特征在于，所述上转换纳米颗粒与四氟硼酸亚硝离子反应的时间为1～3h。
34.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述聚合物为连接有光敏剂的聚合物。
35.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述上转换纳米颗粒与聚合物的质量比为(5～15):1。
36.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述混合的时间为10～14h。
37.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述混合在避光条件下进行。
38.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述表面包覆有聚合物的上转换纳米颗粒与核酸药物的摩尔比为1:(10～50)。
39.根据权利要求38所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述表面包覆有聚合物的上转换纳米颗粒与核酸药物的摩尔比为1:(10～30)。
40.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述共孵育的时间为15～25min。
41.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述共孵育在静止状态下进行。
42.一种基因-光动力协同抗肿瘤药物，其特征在于，所述基因-光动力协同抗肿瘤药物包括如权利要求1～9中任一项所述的纳米复合材料。
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