CN116019932A - 近红外光敏miR-21上转换纳米递送颗粒的制备及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，涉及近红外光敏miR‑21上转换纳米递送颗粒及其制备方法与应用。由UCNPs@PEI和PC‑miR‑21构成，PC‑miR‑21通过静电吸附作用吸附在UCNPs@PEI的表面，UCNPs@PEI为表面修饰聚醚酰亚胺的上转换纳米颗粒，PC‑miR‑21为miR‑21正义链和miR‑21反义链互补形成的双链RNA，所述miR‑21反义链的5′端磷酸修饰有光敏基团，光敏基团的化学结构如下：
本发明不仅能够防止miR‑21在体液及细胞内被核酸酶大量降解，而且能实现靶向激活，同时辅助核酸分子实现内涵体逃逸，使其在靶组织局部细胞的细胞质中大量释放并激活。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及近红外光敏miR-21上转换纳米递送颗粒的制备方法及其应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
上颌横向发育不足(MTD)是一种正畸临床常见的颌面部骨性畸形，上颌快速扩弓(RME)通过机械力打开上颌腭中缝，是矫治青少年上颌横向发育不足的重要手段。但由于扩弓后腭中缝新骨形成不充分等原因，常出现较为明显的复发。目前在关于促进扩弓后腭中缝新骨形成的研究中，各种促进方法仍存在一些问题，如：明显的参数依赖性、机制不清、无法避免全身副作用等。因此，仍需进一步寻找能够避免全身副作用、可特异性促进腭中缝局部成骨的新方法。
发明人研究了解，microRNA-21(miR-21)与上颌快速扩弓腭中缝新骨形成有关，可促进小鼠上颌快速扩弓腭中缝处骨组织形成。然而，发明人研究发现，临床应用miR-21促进上颌快速扩弓腭中缝新骨形成存在两个关键问题：保护miR-21分子不被大量酶解以及特异性调控miR-21在腭中缝局部发挥活性。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明的目的是制备近红外光敏miR-21上转换纳米递送颗粒并应用于促进RME腭中缝局部骨形成，本发明不仅能够防止miR-21在体液及细胞内被核酸酶大量降解，而且能实现靶向激活，同时辅助核酸分子实现内涵体逃逸，使其在靶组织局部细胞的细胞质中大量释放并激活。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
一方面，一种近红外光敏miR-21上转换纳米递送颗粒，由UCNPs@PEI和PC-miR-21构成，PC-miR-21通过静电吸附作用吸附在UCNPs@PEI的表面，所述UCNPs@PEI为表面修饰聚醚酰亚胺(PEI)的上转换纳米颗粒(UCNPs)，所述PC-miR-21为miR-21正义链和miR-21反义链互补形成的双链RNA，所述miR-21反义链的5′端磷酸修饰有光敏基团，所述光敏基团的化学结构如下：
本发明通过对miR-21活性位点进行光敏基团修饰以使其“失活”，紫外光照下，光敏基团内光敏键断键后可重新暴露活性位点以发挥miR-21生物学功能，由此可实现光控激活miR-21。上转换纳米颗粒具有上转换性能，在受到穿透组织的近红外光激发后可发射紫外光使光敏键断键。通过对上转换颗粒表面修饰PEI阳离子多聚体，使其通过静电作用负载miR-21，进一步实现近红外光控miR-21分子在组织深部的激活，发挥局部促成骨功能。因而本发明提供的近红外光敏miR-21上转换纳米递送颗粒能够通过外源性光照这一外源刺激无创、易操作，且可在时间、空间上调控核酸分子特异性发挥生物功能。
另一方面，一种上述近红外光敏miR-21上转换纳米递送颗粒的制备方法，将PC-miR-21溶液与UCNPs@PEI溶液混合后，室温避光静置，即得。
第三方面，一种上述近红外光敏miR-21上转换纳米递送颗粒在制备上颌横向发育不足的药物中的应用。
本发明的有益效果为：
本发明提供的近红外光敏miR-21上转换纳米递送颗粒具有分散性良好、生物相容性良好且无明显细胞毒性等特点。在机械力作用下，本发明提供的近红外光敏miR-21上转换纳米递送颗粒可光控上调成骨前体细胞成骨分化相关基因的表达，促进成骨分化；RME扩弓力作用下，纳米递送颗粒可光控促进miR-21-/-小鼠腭中缝局部成骨细胞形成，同时腭中缝周围破骨细胞相对较少，破骨作用较弱；此新型近红外光敏miR-21上转换纳米递送颗粒可以促进上颌快速扩弓时腭中缝局部骨组织形成。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例中PC-miR-21的光敏性能图，A为PC-miR-21反义链的结构，B为PC-miR-21的体外光激活表征图，C为PC-miR-21的光激活原理示意图；
图2为本发明实施例中UCNPs@PEI@PC-miR-21纳米颗粒合成及细胞内发挥活性示意图；
图3为本发明实施例中UCNPs@PEI的表征图，(a)为TEM图像，比例尺为200nm，(b)为TEM图像，比例尺为20nm，(c)为Zeta电位，(d)为FTIR光谱，(e)为DLS，(f)为在980nm的激光激发下UCNPs@PEI的荧光发射光谱；
图4为本发明实施例中纳米颗粒的核酸负载、保护能力和释放能力的表征图，A为关于孵育时间的电泳图，B为关于加载能力的电泳图，C为核酸酶保护实验的电泳图，泳道1：阴性对照组，泳道2：阳性对照组，泳道3：实验组，D核酸释放实验，泳道1：对照组(pH＝7)，泳道2：实验组(pH＝5)；
图5为本发明实施例中UCNPs@PEI@PC-miR-21体外光控促成骨特性分析图，A为不同浓度的UCNPs@PEI@PC-miR-21处理24h后，MC3T3-E1细胞的细胞活力(n＝3，ns：p>0.05)，B为共聚焦激光扫描显微镜图片，比例尺：20μm，a为细胞核，b为上转换纳米颗粒，c为叠加图，C为qRT-PCR验证纳米颗粒促进细胞成骨分化相关基因ALP的表达情况，n＝3，*p<0.05，ns：p>0.05，D为qRT-PCR验证纳米颗粒促进细胞成骨分化相关基因RUNX2的表达情况，n＝3，*p<0.05，ns：p>0.05，E为qRT-PCR验证纳米颗粒促进细胞成骨分化相关基因COL1A1的表达情况，n＝3，*p<0.05，ns：p>0.05，F为Western Blot验证纳米颗粒促进细胞成骨分化相关蛋白ALP的表达情况，n＝3，ns：p>0.05，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，G为Western Blot验证纳米颗粒促进细胞成骨分化相关蛋白RUNX2的表达情况，n＝3，ns：p>0.05，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，H为Western Blot验证纳米颗粒促进细胞成骨分化相关蛋白COL1A1的表达情况，n＝3，ns：p>0.05，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；
图6为本发明实施例中实验小鼠的一般评价及上颌快速扩弓装置图，A为基因型验证，B为小鼠上颌快速扩弓咬合面观图片，C为单眼圈簧扩弓器图片，D为实验过程中小鼠体重的变化，p>0.05；
图7为本发明实施例中纳米颗粒在体内的光控促成骨特性分析结果图，A为ALP的柱状图，B为RUNX2的柱状图，C为OPG的柱状图，D为破骨细胞数量柱状图，ns:p>0.05,*p<0.05。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
鉴于临床应用miR-21促进上颌快速扩弓腭中缝新骨形成存在miR-21分子易被大量酶解以及难以特异性调控miR-21在腭中缝局部发挥活性的问题，本发明提出了近红外光敏miR-21上转换纳米递送颗粒的制备方法及其应用。
本发明的一种典型实施方式，提供了一种近红外光敏miR-21上转换纳米递送颗粒，由UCNPs@PEI和PC-miR-21构成，PC-miR-21通过静电吸附作用吸附在UCNPs@PEI的表面，所述UCNPs@PEI为表面修饰聚醚酰亚胺的上转换纳米颗粒，所述PC-miR-21为miR-21正义链和miR-21反义链互补形成的双链RNA，所述miR-21反义链的5′端磷酸修饰有光敏基团，所述光敏基团的化学结构如下：
在一些实施例中，所述miR-21正义链如SEQ ID NO.1所示，所述miR-21反义链如SEQ ID NO.2所示。
在一些实施例中，水合直径为70～500nm。优选地，平均水合直径为90～110nm。
本发明的另一种实施方式，提供了一种上述近红外光敏miR-21上转换纳米递送颗粒的制备方法，将PC-miR-21溶液与UCNPs@PEI溶液混合后，室温避光静置，即得。
本发明研究了UCNPs@PEI与PC-miR-21的质量比为0～40:1，在一些实施例中，UCNPs@PEI与PC-miR-21的质量比为25～40:1。该条件下UCNPs@PEI吸附PC-miR-21完全。优选为24～26:1。
避光静置时间为30～180min，在一些实施例中，避光静置时间为150～180min。该条件下，能够保证UCNPs@PEI吸附PC-miR-21完全。优选为150～160min。
在一些实施例中，PC-miR-21溶液的溶剂为无菌RNase-free水。PC-miR-21溶液的浓度为5～15μM。PC-miR-21溶液使用前在-80℃的条件下保存。
在一些实施例中，UCNPs@PEI溶液的浓度为1～3mg/mL。UCNPs@PEI的平均水合直径为50～70nm。
本发明的第三种实施方式，提供了一种上述近红外光敏miR-21上转换纳米递送颗粒在制备上颌横向发育不足的药物中的应用。
具体地，所述药物能够促进上颌快速扩弓时腭中缝局部骨组织形成。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例
UCNPs@PEI@PC-miR-21的合成：
100μM的PC-miR-21存储液用无菌RNase-free水制备，并按照说明在-80℃下保存。2mg/mL UCNPs@PEI溶液，4℃避光保存。将PC-miR-21稀释溶液(10μM，3.5μL)和UCNPs@PEI溶液(2mg/mL)完全混合，并在室温下孵育，避光，获得自组装的UCNPs@PEI@PC-miR-21。其中，PC-miR-21在赛默飞公司订制获得，miR-21的序列如表1所示，miR-21反义链的结构如图1A所示；
UCNPs@PEI溶液购自西安瑞禧生物科技有限公司。
本实施例制备的UCNPs@PEI@PC-miR-21的合成及作用如图2所示，通过对上转换颗粒表面修饰PEI阳离子多聚体，使其通过静电作用负载miR-21，在细胞内，经过近红外光激发后，经过上转换纳米颗粒的上转换发射紫外光，使得光敏键断键，从而将miR-21从UCNPs@PEI@PC-miR-21中释放，从而实现近红外光控miR-21分子在组织深部的激活，发挥局部促成骨功能。
PC-miR-21光敏性能分析：
取两份4μL浓度为10μM的PC-miR-21于两个无酶离心管中，实验组经365nm强度为30mW/cm2紫外灯照射2min，对照组避光，进行琼脂糖凝胶电泳。琼脂糖凝胶电泳的过程为：用75％乙醇将制胶板、梳齿、锥形瓶等用具清洗干净晾干备用。配制1×TAE电泳缓冲液：取11mL 50×TAE电泳缓冲液，加入539mL三蒸水，制成500mL 1×TAE电泳缓冲液待用。制作1％琼脂糖凝胶：称取0.6g琼脂糖置于小锥形瓶中，加入60mL1×TAE电泳缓冲液，混匀后放入微波炉内加热约1min，待琼脂糖完全融化后取出冷却至50～60℃时，加入6μLGelRed核酸染料，充分摇匀，缓慢倒入插有梳齿的制胶板中，静置约30min待其完全凝固为胶体。轻柔拔除梳齿，将凝胶置于水平电泳池中，加样孔靠近负极，向电泳池中倒入1×TAE电泳缓冲液至液面超过胶体约5mm。制样：分别向样品加入1μL 5×RNA loading buffer充分混匀，移液枪将上样混合液依次缓慢滴入加样孔中。电泳：连接电泳电极，设置电泳电压为100V，时间15min。电泳结束后将凝胶置于成像仪中，观察并拍照。
UCNPs@PEI的表征：
采用透射电子显微镜(TEM)检测UCNPs@PEI的形态和大小。用纳米粒度电位仪通过动态光散射(DLS)检测水合粒径及Zeta表面电势。采用显微红外光谱仪测量傅里叶红外(FTIR)光谱。采用荧光光谱仪在激发波长980nm下获取UCNPs@PEI的荧光发射光谱。
UCNPs@PEI@PC-miR-21的核酸装载能力、保护作用和释放性能：
首先，将PC-miR-21稀释溶液(10μM，3.5μL)和UCNPs@PEI溶液(2mg/mL，12.5μL)混合，在室温下分别孵育30min、60min、90min、120min、150min和180min。然后，将样品装入1％琼脂糖凝胶的孔中，并进行如上所述的电泳，以确定纳米颗粒与核酸的最佳孵育时间。然后，测试PC-miR-21的最大加载能力。具体来说，UCNPs@PEI溶液(2mg/mL)和PC-miR-21稀释溶液(10μM，3.5μL)以不同质量比分别为0：1、10：1：1、15：1、20：1、25：1、30：1、35：1和40：1混合。根据上述测定的孵育时间在室温下孵育，并避光。如上所述，通过琼脂糖凝胶电泳确定最大核酸负载能力。
然后，2mg/mL UCNPs@PEI@PC-miR-21与10mg/mL RNase A按体积比9：1孵育，37℃孵育30min，然后将2mM乙二胺四乙酸(EDTA)溶液按体积比1：5加入混合物中灭活酶。在最后一种混合物中加入等体积的2％聚丙烯酸(PAA)溶液，以充分取代负载的PC-miR-21。PC-miR-21与RNase A、EDTA和PAA混合作为阴性对照组。PC-miR-21与EDTA和PAA混合作为阳性对照组。最后，进行如上所述的琼脂糖凝胶电泳。
为了评估核酸的释放特性，将UCNPs@PEI@PC-miR-21溶液在6300g下离心10min。沉淀在pH≈5的无酶PBS中重悬，再次离心。取上清液，然后进行如上所述的琼脂糖凝胶电泳。同样的沉淀在pH≈7的无酶PBS中重悬作为对照。
体外生物评价：
细胞培养：
MC3T3-E1细胞购于国家实验细胞资源共享服务平台，细胞培养基为含10％胎牛血清及1％双抗的α-MEM培养液。细胞在37℃，5％ CO2的细胞培养箱中培养。约每隔两天用0.25％胰蛋白酶消化传代。
体外细胞毒性和细胞摄取试验：
通过CCK-8实验分析了UCNPs@PEI@PC-miR-21纳米颗粒的细胞毒性。MC3T3-E1细胞以5000个细胞的密度接种于96孔板中，直到70-80％的融合。然后，在培养基中加入不同浓度的纳米颗粒，分别为0mg/mL、0.1mg/mL、0.25mg/mL和0.5mg/mL，细胞培养24h。每孔加入10μL CCK-8，在37℃孵育1.5h。使用酶标仪在450nm处测量OD值。
通过共聚焦激光扫描显微镜成像，定性分析UCNPs@PEI@PC-miR-21的细胞摄取。MC3T3-E1细胞接种于12孔板中，密度为3×104细胞/孔，培养24小时。将UCNPs@PEI@PC-miR-21(0.5mg/mL)按1：10的体积比加入到新鲜培养基中，弃去孔板中原细胞培养基，加入新配置的含颗粒细胞培养基。细胞在培养箱中培养12小时。成像前，用PBS洗涤细胞三次，去除未被细胞内化的纳米颗粒，然后用0.5mL 4％多聚甲醛每孔固定15min。用PBS彻底冲洗后，细胞核用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色10min。在双光子共聚焦激光扫描显微镜下观察荧光。
MC3T3-E1细胞加力：
为了评估UCNPs@PEI@PC-miR-21在机械牵张力下促进成骨的能力，实验分为三组，RME组为未经UCNPs@PEI@PC-miR-21处理的MC3T3-E1细胞，RME+UCNPs@PEI@PC-miR-21组为仅UCNPs@PEI@PC-miR-21处理但没有光激活的细胞，RME+UCNPs@PEI@PC-miR-21+光照组为经UCNPs@PEI@PC-miR-21处理且光照激活的细胞。将MC3T3-E1细胞按照2×105细胞/孔接种到6孔弹性基底膜培养板中，制备新鲜的浓度为0.5mg/mL的含UCNPs@PEI@PC-miR-21细胞培养基，待细胞培养至融合度达70％左右，加药组加入含颗粒细胞培养基并孵育过夜。随后，对RME+UCNPs@PEI@PC-miR-21+光照组进行光照处理，即用980nm激光照射5min，间隔5min，重复4次。此后，对三组细胞进行频率为0.5Hz、强度为8％、时间为24h的牵张力加载。
激光辐照：
采用连续波980nm-NIR激光器对细胞和动物进行照射。通过固定光源和细胞培养皿及小鼠上颌腭中缝之间的距离和照射功率使功率密度固定在约1.2W/cm2。NIR激光束的功率使用功率计测定。
实时定量聚合酶链反应(qPCR)和蛋白印迹法：
为评估其成骨分化能力，首先进行了qPCR检测。首先使用AG RNAex Pro试剂从MC3T3-E1细胞中提取总RNA。测定样品的RNA浓度和纯度。将提取的RNA逆转录成互补DNA(cDNA)，进行qPCR。qPCR采用
Green Premix Pro Taq HS qPCR试剂盒，使用LightCycler-480系统。采用2-ΔΔCt法对碱性磷酸酶(ALP)、runt相关转录因子2(RUNX2)和I型胶原α1(COLIA1)的表达进行定量分析，并与内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)进行归一化处理，引物序列见表1。
进一步用蛋白印迹法检测相关蛋白表达情况。使用蛋白裂解液与蛋白酶抑制剂按体积比100:1混合用于裂解细胞。超声处理：超声仪器4℃预冷，超声10s，间隔30s，循环数为10。超声后，在4℃下以12000rpm离心15min，用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。用10％SDS-PAGE凝胶快速制备试剂盒制备10％SDS-PAGE凝胶。3μL样品和Marker分别加入凝胶加样孔中进行电泳、转膜，用5％脱脂封闭液室温下封闭1.5h，漂洗后在4℃下浸入一抗溶液孵育过夜。一抗：兔抗ALP，兔抗RUNX2、兔抗COLIA1和兔抗GAPDH。TBST漂洗3次，抗兔二抗溶液室温下孵育1小时，再用TBST漂洗。采用ECL显色试剂盒检测反应条带，使用ImageJ软件进行量化分析。以GAPDH作为对照。
体内生物评价：
实验动物和基因型检测：
miR-21敲基因(miR-21-/-)C57BL/6小鼠由Jackson实验室提供。动物实验依据山东大学口腔医院伦理委员会的指导方针(许可证号：20201102.)进行。所有小鼠饲养于山东省口腔组织再生重点实验室万级净化动物实验平台，平台保持恒温恒湿，12小时循环照明，相同的基础饮食、饮水饲养。标准聚合酶链反应(PCR)用于检测miR-21-/-小鼠基因分型，首先提取鼠尾基因组DNA，进行PCR扩增(PCR引物序列见表1)，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳评价。在500bp处获得一个单条带被鉴定为miR-21-/-小鼠。
RME模型、纳米颗粒注射及激光照射：
选择miR-21-/-雄性小鼠(6周龄，体重20g±2g)建立上颌快速扩弓模型。实验小鼠使用R500小动物麻醉机进行异氟烷气麻。设置诱导浓度3.5％，维持浓度1.5％，小鼠仰卧位固定在手术台上。用0.014英寸澳丝弯制单眼圈簧扩弓器，用3M光固化树脂将扩弓器粘接于磨牙牙冠，初始力值约为0.49N。建模后每日观察小鼠生命体征及口内扩弓装置保留情况，喂食磨碎鼠粮，避免扩弓器脱落。若有生命指征不稳定或扩弓器脱落，则及时处理。
所有小鼠随机分为三组，RME+UCNPs@PEI@PC-miR-21+光照组，即局部注射UCNPs@PEI@PC-miR-21并进行激光照射；RME+UCNPs@PEI@PEI@PC-miR-21组，即仅局部注射UCNPs@PEI@PC-miR-21；RME组，即局部注射PBS。三组均接受RME治疗(n＝3)。建立上颌扩弓模型后，每隔两天局部注射0.5mg/mL纳米颗粒50μL，光照组注射后在腭中缝局部进行980nm激光光照，光照强度1.2W/cm2，光照5min、间隔5min，重复4次。动物被喂食软性食物，并在扩张期间定期称重。14天后对所有小鼠实施安乐死，获取上颌腭部标本进行进一步分析。
组织学和免疫组化染色：
样品用4％多聚甲醛固定，用10％ EDTA溶液(pH：7.2-7.4)脱钙4周，梯度酒精脱水，石蜡包埋。垂直于腭中缝沿冠状位切片，厚度5μm。对切片用苏木精-伊红(HE)染色试剂盒染色并进行形态学观察，免疫组化(IHC)染色检测腭中缝区域ALP、RUNX2、OPG的表达情况。一抗：兔抗ALP、兔抗RUNX2、兔抗OPG，按照制造商说明进行稀释。抗酒石酸酸磷酸酶(TRAP)染色按照试剂盒说明书进行。应用Image-Pro Plus 6.0软件，计数腭中缝及附近区域多核TRAP阳性细胞。
统计分析：
使用GraphPad Prism 8.0进行统计学分析。结果以平均值±标准差表示。采用单因素方差分析法进行统计学比较。95％(*，p<0.05)、99％(**，p<0.01)、99.9％(***，p<0.001)置信区间均有统计学意义。
表1本实施例中使用的miR-21及引物序列
结果
1、PC-miR-21光敏性能分析：
PC-miR-21反义链的结构如图1A所示，miR-21反义链的5′磷酸基团键合一个硝基苯乙基(NPE)光可断键的“笼状”基团(生物素修饰的NPE“笼状分子”)，虚线表示紫外光激活后的裂解位置，可在365nm紫外光照射下断键。图1B为紫外光照射前后PC-miR-21核酸分子的琼脂糖凝胶电泳照片。可见左侧泳道核酸分子未经紫外光照，核酸分子质量较大，电泳速度较慢，位于靠近加样孔的位置。右侧泳道核酸分子经紫外光照，NPE分子解离后，分子量减小，电泳速度较快，位于稍远离加样孔的位置。表明PC-miR-21核酸分子可以通过紫外光照发生NPE光敏键断键。图1C为光照激活PC-miR-21的原理示意图。miRNA反义链5′磷酸对RISC复合体形成具有重要作用，胞质中的miRNA与相关蛋白质结合后形成RISC复合体，才能引导其降解靶mRNA或阻碍靶mRNA的蛋白质翻译，从而发挥miRNA的生物学功能。如前所述，PC-miR-21核酸分子反义链的5’磷酸基团键合了一个生物素修饰的NPE“笼状分子”，占据在反义链5’端附近，阻碍了RISC复合体形成，导致miR-21无法发挥生物活性。经过小剂量365nm紫外光照射后，“笼状分子”解离，相关蛋白结合位点重新暴露，miR-21可以形成RISC复合体发挥生物学功能。
2、UCNPs@PEI的表征：
UCNPs@PEI的形态如图3(a)和3(b)所示。纳米颗粒呈六边形，形貌均一，分散性良好，平均直径约为40nm。UCNPs@PEI的zeta电位约为+34.3mV(图3(c))。此外，在UCNPs@PEI的FTIR光谱中(图3(d))，方框所示为C-H键和N-H键的特征峰，均为PEI分子的特征吸收峰。由此表明，UCNPs@PEI纳米颗粒表面富含带正电荷的氨基，可以与带负电荷的核酸分子结合，通过静电作用实现核酸装载。将PC-miR-21加载到UCNPs@PEI上后，用DLS对其形态进行了表征(图3(e))。UCNPs@PEI的水合直径约为60nm，由于溶剂效应，略大于透射电镜测量的尺寸。UCNPs@PEI@PC-miR-21的水合直径由于核酸装载而增加到100nm左右。最后，在连续980nm激光的激发下，测量了UCNPs@PEI的上转换荧光。如图3(f)所示，荧光发射峰位于365nm、450nm、470nm处，表明上转换纳米颗粒在近红外光激发下可以发射一定强度的365nm紫外光。
3、UCNPs@PEI@PC-miR-21的核酸装载能力、保护性能和释放性能：
本实施例测定了最佳孵育时间和最大负载能力，以评价纳米颗粒的核酸负载能力。游离的PC-miR-21可以与GelRed结合，而UCNPs@PEI负载的PC-miR-21不能被染色。电泳结果(图4A)表明，随着孵育时间的增加，游离的PC-miR-21逐渐减少，直到150min后保持相对稳定，说明最佳孵育时间在150min左右。然后，用PC-miR-21(0.5μg)和不同浓度的UCNPs@PEI(0-20μg)共孵育150min后电泳，测定其最大负载能力。结果(图4B)显示，当质量比大于30:1时，游离PC-miR-21可以忽略不计，表明二者的最佳质量比在25：1与30：1之间，核酸的最大装载能力约为4wt％(UCNPs@PEI：PC-miR-21(w/w)＝25：1)。因此，后续实验均按照150min的孵育时间和4wt％质量比合成制备的UCNPs@PEI@PC-miR-21纳米颗粒。
进一步评估了miR-21的保护能力和UCNPs@PEI@PC-miR-21复合物的核酸释放能力。如图4C所示，游离的PC-miR-21在泳道1中RNase A的存在下完全降解。然而，与泳道2的阳性对照相比，UCNPs@PEI@PC-miR-21负载的PC-miR-21没有降解，这揭示了UCNPs@PEI@PC-miR-21复合物的核酸保护作用。PC-miR-21的释放情况如图4D所示，当复合物在pH≈7(Lane1)的PBS中重悬时，几乎没有观察到PC-miR-21的释放。相反，大量PC-miR-21在pH≈5(Lane2)下释放，表明复合物可在酸性条件下(如溶酶体或内涵体中)释放核酸分子。
4、纳米颗粒的细胞毒性和细胞摄取分析：
采用CCK-8法检测经不同浓度的UCNPs@PEI@PC-miR-21处理后的MC3T3-E1细胞的活力。没有纳米颗粒处理的细胞作为对照。如图5A所示，处理组均未检测到细胞活力下降。为了最大限度地发挥核酸的作用，后续实验中UCNPs@PEI@PC-miR-21的浓度设置为0.5mg/mL。
随后，本实施例定位了细胞对UCNPs@PEI@PC-miR-21纳米颗粒的摄取情况。图5B(a)为DAPI激发光照射下DAPI染料发出的蓝色荧光，标记了细胞核位置。由于实验使用双光子激光共聚焦显微镜拍摄，在近红外光激发下，除上转换纳米颗粒发射蓝紫光外，DAPI染料也会受激发而发射蓝色荧光，图5B(b)中为近红外激发光照射下上转换纳米颗粒以及DAPI染料发出的蓝色荧光。DAPI和粒子的合并荧光如图5B(c)所示，这进一步证实了纳米颗粒已经进入并分布在细胞质中，表明本发明提供的UCNPs@PEI@PC-miR-21可将核酸分子递送至胞质。
5、纳米颗粒对体外成骨相关因子光控表达的影响：
为了评价UCNPs@PEI@PC-miR-21纳米颗粒的成骨促进作用，对不同治疗组中ALP、RUNX2和COL1A1在mRNA和蛋白水平上的变化进行分析。实验组在纳米颗粒处理和激光照射后，所有细胞接受相同的机械牵拉24小时。结果(图5C-H)显示，与RME组和RME+UCNPs@PEI@PC-miR-21组相比，RME+UCNPs@PC-miR-21+光照组中ALP、RUNX2和COL1A1的mRNA和蛋白表达均显著升高。RME+UCNPs@PEI@PC-miR-21组中3种成骨相关因子的表达与RME组比较，差异无统计学意义。这些结果表明，纳米颗粒上调了激光活化后MC3T3-E1细胞中成骨相关因子(ALP、RUNX2和COL1A1)的表达，且光活化具有较高的特异性。
6、实验小鼠的一般评价及上颌扩弓装置：
琼脂糖凝胶电泳照片结果显示，敲基因小鼠DNA分子量约为500bp，无杂带，表明实验所用小鼠为纯合子的miR-21敲基因小鼠，如图6A所示。
采用miR-21-/-小鼠建立的RME模型如图6B和图6C所示。实验期间，定期测量实验鼠体重，观察口内扩弓器情况，将扩弓器无脱落、生命体征良好的小鼠纳入统计范围。各组小鼠体重检测结果如图6D所示。三组小鼠体重变化趋势基本一致，没有统计学差异，在扩弓后前3天均有明显下降，后逐渐恢上升，至14天取材时达到最重。
7、光控纳米颗粒对体内骨形成的影响：
图7A表明，RME组和RME+UCNPs@PEI@PC-miR-21组腭中缝的ALP表达相似(p>0.05)，均显著低于RME+UCNPs@PEI@PC-miR-21+光照组(*p<0.05)。此外，RUNX2和OPG的表达也得到了类似的结果，如图7B、图7C所示。因此，体内实验结果证实了体外实验结果，并进一步证实了RME+
UCNPs@PEI@PC-miR-21+光照组早期骨形成的加速。此外，通过TRAP染色评估破骨细胞介导的骨吸收活性。与纳米颗粒处理相关的破骨细胞的形成主要发生在腭中缝两侧骨膜及腭骨骨内膜处。与RME和
RME+UCNPs@PEI@PC-miR-21组相比，RME+UCNPs@PEI@PC-miR-21+光照组中观察到的破骨细胞较少，主要是在两侧腭骨的骨内膜中，如图7D所示。而纳米颗粒上调了OPG的表达(*p<0.05)，这与TRAP染色一致。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种近红外光敏miR-21上转换纳米递送颗粒，其特征是，由UCNPs@PEI和PC-miR-21构成，PC-miR-21通过静电吸附作用吸附在UCNPs@PEI的表面，所述UCNPs@PEI为表面修饰聚醚酰亚胺的上转换纳米颗粒，所述PC-miR-21为miR-21正义链和miR-21反义链互补形成的双链RNA，所述miR-21反义链的5′端磷酸修饰有光敏基团，所述光敏基团的化学结构如下：
2.如权利要求1所述的近红外光敏miR-21上转换纳米递送颗粒，其特征是，所述miR-21正义链如SEQ ID NO.1所示，所述miR-21反义链如SEQ ID NO.2所示。
3.如权利要求1所述的近红外光敏miR-21上转换纳米递送颗粒，其特征是，水合直径为70～500nm；优选地，平均水合直径为90～110nm。
4.一种权利要求1所述的近红外光敏miR-21上转换纳米递送颗粒的制备方法，其特征是，将PC-miR-21的溶液与UCNPs@PEI溶液混合后，室温避光静置，即得。
5.如权利要求4所述的近红外光敏miR-21上转换纳米递送颗粒的制备方法，其特征是，UCNPs@PEI与PC-miR-21的质量比24～26:1。
6.如权利要求4所述的近红外光敏miR-21上转换纳米递送颗粒的制备方法，其特征是，避光静置时间为150～160min。
7.如权利要求4所述的近红外光敏miR-21上转换纳米递送颗粒的制备方法，其特征是，PC-miR-21的溶液的溶剂为无菌RNase-free水。
8.如权利要求4所述的近红外光敏miR-21上转换纳米递送颗粒的制备方法，其特征是，UCNPs@PEI溶液的浓度为1～3mg/mL。
9.一种权利要求1所述的近红外光敏miR-21上转换纳米递送颗粒在制备上颌横向发育不足的药物中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征是，所述药物能够促进上颌快速扩弓时腭中缝局部骨组织形成。
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