CN114917180A - 一种复合血小板裂解液的可溶性微针的制备方法及其用途 - Google Patents

一种复合血小板裂解液的可溶性微针的制备方法及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种复合血小板裂解液的可溶性微针的制备方法及其用途。所述可溶性微针包括背衬、位于背衬上可溶性高分子聚合物、血小板裂解液及蛋白保护剂的针体等等。本发明所述的复合血小板裂解液的可溶性微针可用于脱发治疗、伤口愈合等领域，血小板裂解液中富含的生长因子可促进毛囊再生、伤口愈合。将血小板裂解液与高分子聚合物复合制备成具有足够的硬度的可溶性微针，能有效刺穿皮肤表层的角质层，进入皮肤的针体可实现快速溶解，生长因子等活性物质通过微针导入到皮肤真皮层中，吸收效果好，安全可靠，无副作用。

Description

一种复合血小板裂解液的可溶性微针的制备方法及其用途
技术领域
本发明为一种复合血小板裂解液的可溶性微针的制备方法及其用途，属 于生物医用材料领域，尤其适用于脱发治疗和伤口愈合。
背景技术
富血小板血浆(Platelet-rich Plasma,PRP)是从全血离心后获取的富 集大量血小板的血浆。富血小板血浆裂解液(Platelet-rich plasma lysate，PL)是通过进一步的冻融和离心步骤促进血小板裂解而获得的裂解 液，PL已经被证明含有大量的生长因子，如血小板源性生长因子(platelet derived growth factor，PDGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor，VEGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、转化生 长因子(transforming growth factor，TGF)、胰岛素样生长因子(insulin like growth factor，IGF)等。血小板激活后释放的生长因子不仅可促进细 胞募集、增殖、分化，而且可促进血管化，从而促进组织修复和再生。由于 PRP具有促进组织再生和创面愈合的作用，近年来被广泛应用于皮肤科、骨 科、颌面外科及整形外科等诸多领域。
PRP注射作为一种新的秃发治疗的方法，可促进毛发生长，增加毛发密 度，近年来应用也越来越普遍。但是由于采用注射给药这种给药方式时，会 出现很多问题：如将注射针头刺入皮肤组织后，皮肤会受到不同程度的损 伤，某些情况下还会出现注射部位感染的症状。由于对注射过程中疼痛的恐 惧，很多人对注射给药抱有抵触心理。因此找到一种微创甚至无创的给药方 式是一种比较可行的办法。
微针是具有微米级尺寸(通常的长度范围在25μm-2000μm)的针状突 起物，其通常以阵列形式组装到支撑衬底或者贴片上。微针能够刺穿皮肤表 皮但不引起明显出血或者疼痛，可应用于经皮给药、细胞给药或者生物传感 器领域。微针的概念首次在1970年代提出，在1990年代时得到了详细的研 究和论证，三十年来，据文献报道，大量的材料已被证明可以用于微针或者 微针阵列的制备，这包括硅材料、金属材料、有机材料、高分子材料、陶瓷 或玻璃等。其中，高分子材料的微针有着制备简单，易于批量化生产，生物 相容性好等优点被广泛使用。高分子微针材料按照是否具有水溶性，可将其 分为两类；第一种是可溶性微针，制备材料为水溶性高分子材料如聚乙烯 醇、壳聚糖、透明质酸等。另一种是高分子固体微针，通常不含有药物且不 可在皮下溶解。微针给药是经皮给药的一种新的理念、方法。由于微针是在 表皮层和真皮层之间给药，不会触及神经系统，所以病人不会感到疼痛与不 适，这增加了病人的依从性。微针贴片贴于皮肤表面后，药物会被缓慢释放 到体内，不会造成药物局部浓度过高的现象。使用微针贴片进行经皮给药， 能够做到环保、低成本。
将血小板裂解液与微针相结合，可以利用微针经皮给药的无痛优势，解 决现有外用药物副作用大，血小板皮下注射过程痛苦等问题。但也可能存在 微针机械强度不足，微针在体内的溶解时间过长，同时血小板富含的多种生 长因子和蛋白在微针中的活性稳定等问题。
发明内容
本发明的发明目的是针对现有技术存在的问题，提供一种复合血小板裂 解液的可溶性微针的制备方法及其用途。解决现有外用药物副作用大，血小 板皮下注射过程痛苦等问题。并且制备的微针具有足够的机械强度，在体内 能快速溶解，同时血小板富含的多种生长因子和蛋白在微针中能保持稳定活 性。
为了实现上述目的，本发明的具体技术方案为：
一种复合血小板裂解液的可溶性微针，其主要包括背衬、位于背衬上复 合可溶性高分子聚合物，血小板裂解液及蛋白保护剂的针体。
作为优选，所述针体具有良好的机械强度、生物相容性。
作为优选，所述背衬的材料选自聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)、分子量10K-1000KD的透明质酸钠(HA)、羧甲基纤维素中的一种或几 种；所述血小板裂解液由反复冻融或激活剂激活制备得到。
作为优选，所述针体材料的可溶性高分子聚合物选自分子量10K-1000KD 的透明质酸钠、壳聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇中的一种或几种。
作为优选，所述蛋白保护剂选自蔗糖、海藻糖、甘露醇、乳糖、葡萄糖 中的一种或几种。
作为本申请中一种较好的实施方式，所述背衬的材料为聚乙烯醇；所述 血小板裂解液采用反复冻融法制备；所述的可溶性高分子聚合物选自分子量 200KD-400KD的透明质酸钠；蛋白保护剂为蔗糖。
本发明还提供了上述可溶性微针的制备方法，具体步骤如下：
第一步，取血液中心制备的浓缩血小板，反复冻融3次(-80℃冻存、37℃溶 解)裂解，将高分子聚合物溶解在PL中，加入一定量的蛋白保护剂，溶解得 到针体材料；将背衬的材料溶解在超纯水或无水乙醇中得到背衬溶液。
第二步，将针体材料倒入(PDMS)微针模具中，抽真空并维持10min，将模具 放置干燥器，刮去多余药物，25℃干燥2-4h；干燥后倒入背衬材料，将模具 放入干燥器中过夜干燥，待其自然脱模得到微针。
具体地，上述复合血小板裂解液的可溶性微针的制备方法包括如下步骤：
S1.PL的制备：将保存5天的浓缩血小板反复冻融3次(-80℃冻存、37℃溶 解)裂解，在第3次解冻后，室温下以2600g的转速离心30min，去掉下层沉 淀，将上清液(PL)转移到新离心管中，放置在-80℃冰箱中备用。
S2.针体材料的制备：将高分子聚合物透明质酸钠或壳聚糖或聚乙烯吡咯烷酮 等溶解在S1制备得到的PL中，其终浓度为10-50mg/mL；溶解温度为常温溶 解、37℃水浴溶解、4℃溶解等；再加入一定量的蛋白保护剂如蔗糖，其终浓 度为50-500mg/mL；得到微针的针体材料。
S3.背衬材料的制备：将PVA(2488类型)和PVA(＞99.0％)粉末按照质量 比1:1加入到超纯水中，配制成PVA溶液，浓度为200-1000mg/ml。称取一定 量无水乙醇和PVPk-60粉末，加至玻璃瓶内，室温下自然溶胀，直至PVP溶 液呈没有气泡、澄清透明的状态，配制成PVP无水乙醇溶液，浓度为300- 1000mg/mL。称取一定量的HA粉末，加至EP管中，37℃水浴1h后室温下静 置待其自然溶胀，直至HA溶液呈没有气泡、澄清透明的状态；配制成HA溶 液，浓度为100-1000mg/mL。
S4.取S2得到的针体材料倒入微针模具中，抽真空至-0.07MPa，室温下维持 5-30min，取出模具刮去上层多余针体材料，然后将模具放置干燥器中干燥2- 4h，干燥器中温度维持在25±2℃，湿度维持在20％；干燥后倒入背衬材料， 室温下4000rpm离心5-8min，最后将模具放入干燥器中过夜干燥，待其自然 脱模得到血小板裂解液复合微针。
采用以上方法制备得到的血小板裂解液复合微针具有良好的机械强度， 可刺破皮肤屏障，进入小鼠皮肤真皮层，针尖材料在10min溶解，40min后小 鼠皮肤的绝大部分微孔闭合，皮肤在微针作用之后具有良好的恢复能力。血 小板富含的多种生长因子和蛋白在微针中能保持稳定活性。
与现有技术相比，本发明的积极效果体现在：
(一)、本申请采用血小板裂解液与高分子聚合物复合制备微针，一方面 使微针具有足够的机械强度，同时血小板富含的多种生长因子和蛋白在微针 中能保持稳定活性。
(二)、通过筛选背衬材料和针体材料、溶解温度和方式，控制背衬材料及针 体材料的浓度等调控微针的高度和形貌，使微针既能具有足够的机械强度， 又能在体内快速溶解，且小鼠皮肤在微针作用之后具有良好的恢复能力。
附图说明：
图1为PL微针的显微镜和扫描电镜图片。
其中a为高清显微镜，b为扫描电镜，c为对比例2得到的PL微针的显 微镜图片，d为对比例3得到的PL微针的显微镜图片。
图2为微针的封口膜穿刺实验结果；
其中a为不同浓度HA制备的微针的穿刺结果图，b为实施例5和对比例 3制备的PL微针的穿刺结果图
图3为PL微针在小鼠体内溶解情况
图4为PL微针穿刺皮肤染色结果
其中a为在体状态，b为离体皮肤
具体实施方式
为了使申请的发明目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体 实施方式对本发明作进一步的详细描述，但不应将此理解为本发明上述主题 的范围仅限于下述实施例。
本发明实施例中采用的技术及表征手段包括血小板裂解液复合微针的制 备，针体及背衬材料的溶液流动性表征，针体高度与形貌表征，压变实验 (弯折率)、体外模拟皮肤穿刺实验(封口膜穿刺实验)、生长因子含量检 测、小鼠在体皮肤与离体皮肤穿刺实验等表征微针机械强度、体内溶解时间 表征微针溶解情况、微孔愈合时间表征微针皮肤在微针作用之后的恢复能力 等。
实施例1：
一种可溶性微针的制备方法，包括以下步骤：
S1.称取相对分子质量为300kDa左右的透明质酸溶解于去离子水中；将其分 别配制成质量浓度为10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL的澄清溶 液，即针体溶液；
S2.背衬材料的制备：将PVA(2488类型)和PVA(＞99.0％)粉末按照质量 比1:1加入到超纯水中，90℃沸水浴加热并持续缓慢搅拌至PVA充分溶胀， 随后在室温下自然冷却，直至PVA溶液呈没有气泡、澄清透明的状态，将其 配制成200mg/mL的PVA溶液(背衬溶液)；
S3.取200μL S1得到的针体溶液倒入微针模具中，抽真空至-0.07MPa，室 温下维持10min，取出模具刮去上层多余针体材料，然后将模具放置干燥器中 干燥2h，得针体，干燥器中温度维持在25±2℃，湿度维持在20％；
S4.待针体干燥后倒入约300μL S2得到的背衬溶液，室温下4000rpm离心 5min，最后将模具放入干燥器中过夜干燥，待其自然脱模。
实施例2PL的制备
将保存5天的浓缩血小板反复冻融3次(-80℃冻存、37℃溶解)裂解，在第 3次解冻后，室温下以2600g的转速离心30min，去掉下层沉淀，将上清液 (PL)转移到新离心管中，放置在-80℃冰箱中备用。
对比例1PL的制备
在保存5天的浓缩血小板中加入1mol/L CaCl2，使CaCl2终浓度达到23 mmol/L，室温放置2小时后，以10，000g离心10min收集上清，将收 集的上清样品保存于-80℃冰箱中备用。
实施例3PL微针针体材料的溶解
将HA溶解在实施例2得到的PL中，加入一定量的蔗糖，HA的浓度 30mg/mL，蔗糖浓度为100mg/mL，溶解方式依次为常温溶解、37℃水浴溶 解、4℃溶解，结合各种条件下的溶解情况以及动物实验选择最佳溶解方式。 HA于常温下在PL中的溶解性低，通常放置48h后仍然有类似结晶物质析出， 故常温溶解不可取；而将HA与PL放置37℃水浴，发现6h后HA能溶于PL， 但此法制备出的微针用于动物皮肤，发现治疗后的皮肤出现溃烂以及炎性反 应，原因是PL在37℃水浴溶解易长菌，故此法依然不可取；将HA与PL于 4℃条件下溶解，24h后发现HA能溶于PL中且制备出的微针应用于动物皮肤 后不会出现皮肤溃烂等炎性反应，因此选择以4℃溶解方式最为适宜。
实施例4背衬材料的配制以及筛选
S1.将PVA(2488类型)和PVA(＞99.0％)粉末按照质量比1:1加入到超纯水 中，90℃沸水浴加热并持续缓慢搅拌至PVA充分溶胀，随后在室温下自然冷 却，直至PVA溶液呈没有气泡、澄清透明的状态，配制成200mg·mL-1的PVA 溶液。
S2.300mg·mL-1PVPk-60溶液：称取一定量无水乙醇和PVPk-60粉末，加至玻 璃瓶内，室温下自然溶胀，直至PVP溶液呈没有气泡、澄清透明的状态；配 制成300mg·mL-1的PVP溶液
S3.1000mg·mL-1HA溶液：称取一定量的HA粉末，加至EP管中，37℃水浴 1h后室温下静置待其自然溶胀，直至HA溶液呈没有气泡、澄清透明的状态； 配制成1000mg·mL-1的HA溶液
为了考察材料的成型性，筛选出制备微针的最佳背衬材料，以背衬平整性、 背衬气泡量、揭膜难易程度和针型为指标对背衬材料的成型性进行综合打 分。评分标准如表1所示，评分结果如表2所示。结果显示，300mg·mL-1 PVP作为微针背衬材料，平整性好，无气泡，易揭膜，针形好，无空针和断 裂，总体评分最高。
表1微针背衬材料筛选评分标准
Figure BDA0003603231620000081
Figure BDA0003603231620000091
表2不同背衬材料的评分结果(分)
单项评分指标
背衬材料 背衬平整性 背衬气泡量 揭膜难易程度 针型 总分
20mg·mL<sup>-1</sup>PVA 1 2 1 2 6
300mg·mL<sup>-1</sup>PVP 2 3 1 2 8
1000mg·mL<sup>-1</sup>HA 0 1 1 1 3
实施例5一种复合PL的可溶性微针的制备
S1.针体材料的制备：将高分子聚合物透明质酸钠和蔗糖溶解在实施例2制备 得到的PL中，4℃溶解，HA浓度为30mg/mL，蔗糖浓度为100mg/mL；得到 微针的针体材料。
S2.背衬材料的制备：称取一定量无水乙醇和PVPk-60粉末，加至玻璃瓶 内，室温下自然溶胀，直至PVP溶液呈没有气泡、澄清透明的状态，配制成 PVP无水乙醇溶液，浓度为300mg/mL。
S3.取S2得到的针体材料倒入微针模具中，抽真空至-0.07MPa，室温下维持10min，取出模具刮去上层多余针体材料，然后将模具放置干燥器中干燥2h， 干燥器中温度维持在25±2℃，湿度维持在20％；干燥后倒入背衬材料，室温 下4000rpm离心5min，最后将模具放入干燥器中过夜干燥，待其自然脱模得 到血小板裂解液复合微针。
S4.用高清显微镜和扫描电镜观察针体形貌与针体高度，如图1a和b所示，PL微针阵列整齐、针型完好，针体高度约为553.00±5.96μm。
对比例2PL微针的制备
S1.针体材料的制备：将高分子聚合物透明质酸钠和蔗糖溶解在对比例1制备 得到的PL中，4℃溶解，HA浓度为30mg/mL，蔗糖浓度为100mg/mL；得到 微针的针体材料。
S2.背衬材料的制备同实施例4的S1。
S3.取S1得到的针体材料倒入微针模具中，抽真空至-0.07MPa，室温下维持10min，取出模具刮去上层多余针体材料，倒入约400μL的背衬材料将模具 放置干燥器中干燥过夜。
S4.用高清显微镜和扫描电镜观察针体形貌与针体高度，如图1c所示，所得 到的针型欠佳且存在空针。
对比例3PL微针的制备
S1.针体材料的制备：将高分子聚合物壳聚糖溶解在对比例1制备得到的PL 中，PVP浓度为30mg/mL；得到微针的针体材料。
S2.背衬材料的制备同实施例4的S1。
S3.取S1得到的针体材料倒入微针模具中，抽真空至-0.07MPa，室温下维持10min，取出模具刮去上层多余针体材料，倒入约400μL的背衬材料将模具 放置干燥器中干燥过夜。
S4.用高清显微镜和扫描电镜观察针体形貌与针体高度，如图1d所示，所得 到的针型欠佳且存在较多空针。
实施例6压变实验
将实施例1采用不同浓度的HA制备的微针通过压变实验考察微针的机械性 能。具体操作步骤如下：
针体朝下，放置在光滑载玻片平面上，然后在微针背面再放置一片光滑载玻 片使其受力均匀，再放置一定重量的砝码并逐渐增加砝码重量，每个砝码作 用1min后显微镜下观察其整体微针的变化，随机选择10根针来计算其高度 平均值和压变前后针的弯折率；结果如表3所示，当HA质量浓度大于 40mg·mL-1时，溶液流动性差且不易倒模，制作的微针存在针型差高度低 (417.17±6.57μm)等问题。HA质量浓度分别为10mg·mL-1、20mg·mL-1、30mg·mL-1时，溶液流动性好，且制备的微针形貌好，无弯曲变形。
Figure BDA0003603231620000111
表3不同浓度微针压变性能研究(x±s，n＝10)
Figure BDA0003603231620000112
实施例7体外模拟皮肤穿刺实验(封口膜实验)
采用5层Parafilm封口膜叠加来模拟不同厚度的皮肤，考察实施例1不同浓 度HA制备的微针和实施例5及对比例3制备的PL微针的穿刺性能。将微针 垂直按在封口膜上1min之后拔出，用显微镜观察封口膜穿透层数以及留下的 孔洞数，计算每层的穿透率。结果如图2a所示，实施例1中30mg·mL-1HA 制备的微针对3层封口膜的穿刺率(＞60％)明显高于其他两个浓度HA制备 的微针(＞30％)。与纯HA微针相比(图2a)，实施例5制备的PL微针(图 2b)能够穿破4层封口膜，前3层的穿刺率达到85％以上，其机械性能优于纯 HA微针和对比例3制备得到的PL微针，表明针体材料不同、背衬材料不同、 蛋白保护剂的添加与否都可能影响PL微针的机械性能。
Figure BDA0003603231620000121
实施例8生长因子含量检测
将实施例5制备的PL微针放置不同时间后，放入0.5mL PBS溶液中， 待微针完全溶解后采用ELISA试剂盒检测溶液的生长因子含量，结果如表4 所示：室温保存1d的PL微针的PDGF-BB和TGF-β1的含量与血小板裂解液 的含量相近，说明微针制备过程及室温保存1d对生长因子影响不大；室温 保存7d后，TGF-β1的含量为PL裂解液的50％左右，而PDGF-BB的含量变 化不大。
表4PL裂解液及PL微针的生长因子含量
PL裂解液 PL微针(1d) PL微针(7d)
TGF-β1(ng/mL) 105.95±2.16<sup>*</sup> 98.89±1.68<sup>*</sup> 56.26±1.53
PDGF-BB(ng/mL) 17.67±1.23 17.25±1.15 15.48±2.12
实施例9小鼠在体皮肤与离体皮肤穿刺实验
S1.在实验前一天，首先用1％戊巴比妥钠按照50mg·kg-1的剂量麻醉小鼠， 然后用剃毛刀剃去小鼠背部皮肤毛发，再将脱毛膏涂抹背部剃毛部位维持 5min，擦去脱毛膏后用0.9％生理盐水清洗背部皮肤，得到光滑粉嫩的背部皮 肤；
S2.褪毛后一天将实施例5制备的PL微针用约5N的力按压在小鼠背部皮 肤，分别维持0、2、5、10min，微针体内溶解情况如图3所示，PL微针针尖 材料可在10min内溶解；
S3.按照S1脱毛方式脱去小鼠背部毛发，用拇指按压约5N的力于脱 毛部位，停留3min，取出微针，立即用2％的亚甲基蓝溶液染色5-10min， 然后用0.9％的生理盐水清洗染色部位，观察穿刺部位是否有蓝色孔 洞留下，结果如图4所示；
S4.实验前按照上述麻醉方式麻醉小鼠，颈椎脱臼法处死，剥离背部 脱毛皮肤，用0.9％生理盐水清洗干净后用滤纸吸干多余水分，然后 在重复上述按压以及染色步骤，观察穿刺部位是否有蓝色孔洞留下， 结果如图4所示。
图4显示，无论是小鼠在体还是离体皮肤，PL微针能够顺利穿破小鼠皮肤， 留下细微孔道供药物(亚甲蓝)进入，说明微针有一定机械性能能够刺破皮 肤屏障。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发 明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发 明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种复合血小板裂解液的可溶性微针，其特征在于包括背衬、位于背衬上复合可溶性高分子聚合物、血小板裂解液及蛋白保护剂的针体；所述背衬所用的材料选自聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、分子量10K-1000KD的透明质酸钠、羧甲基纤维素中的一种或几种的混合物；所述血小板裂解液由反复冻融或激活剂激活制备得到；所述可溶性高分子聚合物选自分子量10K-1000KD的透明质酸钠、壳聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇中的一种或几种；蛋白保护剂选自蔗糖、海藻糖、甘露醇、乳糖、葡萄糖中的一种或几种。
2.如权利要求1所述的复合血小板裂解液的可溶性微针，其特征在于：所述背衬的材料为聚乙烯醇；所述血小板裂解液采用反复冻融法制备；所述的可溶性高分子聚合物选自分子量200KD-400KD的透明质酸钠；蛋白保护剂为蔗糖。
3.如权利要求1或2所述复合血小板裂解液的可溶性微针的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
第一步，取血液中心制备的浓缩血小板，反复冻融裂解，将高分子聚合物溶解在PL中，加入一定量的蛋白保护剂，溶解得到针体材料；背衬材料溶解在超纯水或无水乙醇中得到背衬溶液；
第二步，将针体材料倒入微针模具中，抽真空，将模具放置干燥器中干燥；干燥后倒入背衬溶液，室温下离心，将模具放入干燥器中过夜干燥，待其自然脱模得到微针。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于包括以下具体步骤：
S1.PL的制备：将保存5天的浓缩血小板反复冻融3次裂解，每次为-80℃冻存、37℃溶解，在第3次解冻后，室温下以2600g的转速离心30min，去掉下层沉淀，将上清液PL转移到新离心管中，放置在-80℃冰箱中备用；
S2.针体材料的制备：将高分子聚合物溶解在S1中，再加入蛋白保护剂，制备得到的PL中得到微针的针体材料；
S3.背衬材料的制备：将2488类型PVA和PVA粉末按照质量比1:1加入到超纯水中，配制成PVA溶液，浓度为200-1000mg/mL；称取一定量无水乙醇和PVPk-60粉末，加至玻璃瓶内，室温下自然溶胀，直至PVP溶液呈没有气泡、澄清透明的状态，配制成PVP无水乙醇溶液，浓度为300-1000mg/mL；称取一定量的HA粉末，加至EP管中，37℃水浴1h后室温下静置待其自然溶胀，直至HA溶液呈没有气泡、澄清透明的状态；配制成HA溶液，浓度为100-1000mg/mL；
S4.取S2得到的针体材料倒入微针模具中，抽真空，室温下维持一段时间，取出模具刮去上层多余针体材料，然后将模具放置干燥器中干燥；干燥后倒入背衬材料，室温下离心，最后将模具放入干燥器中过夜干燥，待其自然脱模得到血小板裂解液复合微针。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于：S1步骤，PL的制备，将保存5天的浓缩血小板反复冻融3次裂解，冻融条件为-80℃冻存、37℃溶解；在第3次解冻后，室温下以2600g的转速离心30min，去掉下层沉淀，将上清液PL转移到新离心管中，放置在-80℃冰箱中备用。
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于：S2步骤，将高分子聚合物溶解在S1制备得到的PL中，其终浓度为10-50mg/mL；再加入蛋白保护剂到PL中，其终浓度为50-200mg/mL；溶解温度为常温溶解、37℃水浴溶解、4℃溶解，得到微针的针体材料。
7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于：S3步骤中，背衬材料的制备，将2488类型PVA和＞99.0％的PVA粉末按照质量比1:1加入到超纯水中，配制成PVA溶液，浓度为200-1000mg/mL；称取一定量无水乙醇和PVPk-60粉末，加至玻璃瓶内，室温下自然溶胀，直至PVP溶液呈没有气泡、澄清透明的状态，配制成PVP无水乙醇溶液，浓度为300-1000mg/mL；称取一定量的HA粉末，加至EP管中，37℃水浴1h后室温下静置待其自然溶胀，直至HA溶液呈没有气泡、澄清透明的状态；配制成HA溶液，浓度为100-1000mg/mL。
8.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于：S4步骤中，取S2得到的针体材料倒入微针模具中，抽真空至-0.07MPa，室温下维持5-30min；模具放置干燥器中，干燥时间为2-4h，干燥器中温度维持在25±2℃，湿度维持在20％±5％。
9.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于：S4步骤中，干燥后倒入背衬材料，室温下4000rpm离心5-8min。
10.利用如权利要求3-9中任一方法制备得到的血小板裂解液复合微针，其特征在于：采用以上方法制备得到的血小板裂解液复合微针具有良好的机械强度，可刺破皮肤屏障，进入小鼠皮肤真皮层，针尖材料在10min溶解，40min后小鼠皮肤的绝大部分微孔闭合，皮肤在微针作用之后具有良好的恢复能力；血小板富含的多种生长因子和蛋白在微针中能保持稳定活性。
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