CN1148869A - 在植物中产生细胞质雄性不育性的方法及其在杂种种子生产中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明为植物提供一种细胞质雄性不育性(CMS)系统，它是基于对质体基因组的修饰。该CMS系统包含3种转基因：一种“质体雄性不育性”(pms)基因，受一种“核雄性不育性”(nms)基因调节和一种“雄性可育性恢复系”(rmf)基因。pms基因是一种编码毒性基因产物的灭活基因或一种编码必需基因产物的活性表达基因。nms基因受花药特异性启动子控制，并编码调节pms基因的质体指导的多肽，这种调节是通过激活灭活的毒性pms基因的表达或通过抑制重要pms基因的表达，它引起花药组织中质体和细胞失去能力或死亡，从而阻止活花粉的形成。rmf基因编码阻止nms基因被pms基因调节的一种基因产物。细胞质雄性不育性植物通过用含pms基因的亲本系与含nms基因的亲本系杂交获得。雄性不育性杂种种子从细胞质雄性不育性植物和含rmf基团的第二亲本系间的杂交获得。

Description

在植物中产生细胞质雄性不育性的 方法及其在杂种种子生产中的应用

发明领域

本发明涉及具有农学和商业重要性的植物的改良，特别是涉及供生产细胞质雄性不育性植物的一种新的基于质体的转基因系统，以及这种植物在生产杂种种子中的应用。发明背景

将两种近交植物系杂交产生产量增加的杂种的发现，在发展生产杂种种子的商业方法中引起了植物育种者极大的兴趣。杂种通常趋向于更多产，在利用营养素，如肥料和水方法更有效。F₁杂种还趋向于比亲本杂交系对环境压力表现更强的抗性性，还可表现希望的疾病抗性特性。通过产生两种近交系的杂种，还有可能使以其它途径很难或不可能结合的特性结合在一起。

杂种健壮在植物和动物中是常见现象，并且已在植物育种中被商业地利用了很多年。目前很多有商业重要性的作物物种能得到商购杂种，还在继续努力以提供杂种能稳定地和商业化的产生作物。

为产生两种近交系的杂种后代，必须发生交叉授粉。这对于很多作物性植物的杂种产生是一种障碍，因为在这些植物中，自然地进行恢复系，经常在同一朵花中产生花粉和卵两者。为阻止自我受精，必须去除或破坏一种亲本中的花粉产生器官。这可通过手工去雄实现，即，去除整个雄花，或从在同一朵花中具有有功能的雄性和雌性器官两者的花中去除花药。手工去雄是一种精细的工作，因而也是高花费的工艺。

用于杂种种子生产的雄性不育亲本系也可通过使用阻止形成有活性花粉的化学物质(“杀配子剂”)来产生。这些化学物质也昂贵，并且由于在向植物施用化学物质中的限制而汉森汉不完全可靠。

还可使用种植于产花粉的雄性亲本邻近处的遗传学地雄性不育植物作为雌性亲本产生一致的交叉授粉。使用这种方法，所有从雌性亲本的行收获的种子均为交叉授粉产生的。

植物中花粉产生的缺乏(即，雄性不育)可归因于核突变或细胞质遗传因子。对于生产杂种种子，细胞质雄性不育性优于核遗传学雄性不育性，因为CMS特性不受孟德尔式分离的作用。汉森和西多，Int’l.Rev.Cytol.，94：213-267(1985)。为阐明这一点：核遗传学雄性不育通常由单个隐性基因编码，因而表达纯合雄性不育表型需要。为繁殖核遗传雄性不育植物，必需将纯合的隐性雄性不育株与雄性不育基因杂合的同源雄性可育系杂交。这样的杂交导致形成一定百分比的雄性可育性植物(在单基因系统中为50％)，必须在能识别它们的可育性后立即从田地中去除，以维持所希望的雄性不育群的有效性。类似于手工去雄，将雄性不育植物从田地中去除是精细而高花费的劳动。因此，核基因的分离极大地限制了核遗传学雄性不育性在产生杂种种子方面的用途。

核遗传学雄性不育性受到孟德尔式分离的障碍。与此相反，细胞质雄性不育性在CMS近交糸和雄性可育亲本之间杂交的所有后代中表达。由于此原因，CMS特性是用于杂种种子生产的优选方法。

自然发生的细胞质雄性不育性可归因于线粒体基因组中的突变。这些线粒体突变和细胞质雄不育性的关系随种属不同而不同，并且尚未被很好地解释。在玉米，最具特点的线粒体CMS系统中的一种中，细胞质雄不育性在Texas细胞质中(CMS-T)似乎与一种13-KD多肽的表达有关。汉森遗传学年评，25：461-486(1991)；莱文斯和西多植物分子生物学，19：135-147(1992)。此种多肽显示为一种跨膜蛋白，它增加细胞膜的通透性。该多肽在正常分裂的营养细胞中无明显不利作用，但通过一种迄今未知的机制，引起绒毡层细胞膜的过度通透性并因而妨碍花粉形成。13KD多肽的产生已知与CMS-T玉米对植物病原菌如Bipolaris maydis和Phyllosticta maydis的易感性有关。

在可得到自然发生的CMS细胞质的植物育种计划中，种子生产需要3种近交系：(1)一种具有CMS细胞质的细胞质雄性不育系；(2)一种具有正常细胞质的可育近交系，它与CMS系对于核基因同源(“维持因子系”)；和(3)一种具有正常细胞质，携带可育性恢复基因的可育近交系(“恢复系”系，它不必与该CMS系同源)。此CMS系通过用维持因子系授粉繁殖。这种杂交得到的所有植物都将是雄性不育的，因为CMS细胞质是得自雌性亲本。杂种种子通过用携带可育性恢复系(Rf)基因的第二种近交系授粉生产。如果得不到恢复系基因，不育杂种仍可用于不携带可育性恢复系基因的不同近交系授粉获得。这种杂种可用于营养组织有用的作物(如烟草叶或矮牵牛属植物花)。然而，在大多数作物中，种子是作物有价值的部分，因此在这些作物中杂种的可育性必须被恢复。

虽然细胞质雄性不育性可用于杂种生产，其用途常受与自然发生的细胞质雄性不育性相关的许多实际问题限制。这些问题包括不能鉴定区分CMS细胞质或核恢复系等位基因，以及混杂的不希望的特性如疾病敏感性(如上所述)，降低的可育能力等。这些困难的每一个都是因为对细胞质雄性不育性的线粒体机制和可育性恢复缺乏理解所致。显然，如果开发出一种CMS系统，其组成被充分了解并表征，并能有信心地操纵而不利副作用的危险，则细胞质雄性不育性的价值将大大增加。发明概述

本发明提供一种基于质体基因组而不是线粒体基因组的新的CMS系统，并采用3种转基因：一种质体雄性不育性基因和两种调节此质体雄性不育性基因表达的核基因。

按照本发明的一个方面，提供了一种用于生产细胞质雄性不育性植物的一种方法。首先，选择一种亲本植物系。质体转基因亲本植物通过用雄性不育性基因pms在亲本细胞系的细胞中稳定地转化质体，并再生一株植物而产生。pms基因可受核编码的质体指导的调节物多肽的调节。当那种调节发生在花药组织中时，有活性的花粉的形成被破坏。在一项实施方案中，在本文中称为“花粉杀灭”方法，该pms基因是一种灭活基因，它包含编码一种能灭活或杀灭质体，从而破坏活性花粉形成的物质的编码区，该区可操作地连接于供激活基因表达的靶核苷酸序列。在另一项实施方案中，在本文中称为“花粉饥饿”方法，该pms基因包含质体基因组必需基因，可操作地连接于靶核苷酸序列以阻止基因表达。此基因置换天然质体基因，并阻止引起质体损害或死亡，从而破坏有活性花粉的形成的基因的表达。包含pms基因的质体转基因植物是可育的。下一步，亲本植物系的不同细胞受到一种核雄性不育基因，nms的稳定核转化，该nms包含一种可操作地连接于一个编码核苷酸序列的花药特异性5’调节核苷酸序列，其中所述编码核苷酸序列编码能够进入质体并通过与靶核苷酸序列相互作用调节pms基因的前述质体指导的“调节基因”多肽，可通过激活表达(“花粉杀灭”方法)或阻止表达(“花粉饥饿”方法)实现。从核转化的亲本作物细胞再生一株植物。这种植物也是可育的。细胞质雄性不育植物通过将质体转基因亲本植物与核转基因亲本植物杂交产生，从而提供供花药特异性质体失活或死亡的完整系统，它破坏有活性花粉的形成。

按照本发明的另一方面，提供用于从两种亲本植物系产生雄性可育杂种种子的一种方法，其中一种亲本植物系包含上述细胞质雄性不育性植物系。按照本方法，细胞质雄性不育性亲本植物如上所述被生产。随后选择第二亲本植物系。从此系，一种雄性不育性恢复亲本植物通过将第二亲本植物系的细胞用一种“恢复雄性可育性”(rmf)基因进行稳定的核转化而产生。该rmf基因包含编码能干扰nms基因的一种“恢复系”基因产物的核苷酸序列，这种干扰可以是通过阻断nms基因本身的表达，也可是通过阻断一种可激活的毒性pms基因的表达。从该被稳定地核转化的细胞再生出一株植物。然后将细胞质雄性不育系与可育性恢复系杂交，于是，rmf基因的表达阻止了前述调节因子多肽对pms基因的调节，从而使杂种植物恢复雄性可育性。

按照本发明的其它方面，提供DNA构建物和转基因植物供本发明的实践。提供一种包含nms基因的核转基因植物和一种包含pms基因的，同亲本系的质体转基因植物。还提供一种通过将核转基因植物与质体转基因植物杂交产生的细胞质雄性不育性植物。提供一种第二亲本植物系的核转基因植物，它包含rmf基因。还提供了雄性可育性杂种植物，它们是通过将细胞质雄性不育亲本植物与含rmf基因的第二亲本植物系杂交产生的。附图简述

图1.采用T7 RNA聚合酶/Lac抑制物系统的质体雄性不育性(pms)的“花粉杀灭”方法优选实施方案的图示。(图1A)：不育植物的绒毡层细胞或小孢子中雄性不育基因的表达。在细胞浆核糖体上核nms基因(“Knms”)被转录，编码的蛋白(T7 RNA聚合酶)被翻译，并被引入质体。随后的质体杀伤基因(“Kpms”)从T7lac启动子转录引起细胞的死亡(“+”代表阳性调节子，T7 RNA聚合酶，该酶对T7启动子是特异的) (图1B)：雄性不育基因在可育的杂种植物绒毡层细胞或小孢子中的表达。核可育性恢复系基因(Krmf)的产物lca抑制物结合于质体中的Kpms T7/lac启动子，从而阻止毒性基因通过Knms基因产生转录。(黑圈中的白“X”代表lac抑制物结合于T7/lac，调节序列上的lac操纵基因)。

图2.质体雄性不育性的“花粉饥饿”方法优选实施方案的图示，此种质体雄性不育性使用一种质体指导的lac抑制物和一种核指导的tet抑制物(图2A)：雄性不育性基因在可育植物的绒毡层细胞或小孢子中的表达。核nms基因(“Snms”)被转录并且编码的lac阻遏物被引入质体中，在质体中它阻断一种重要基因(Spms)的表达，该重要基因的启动子含有一个lac阻遏物结合位点。该重要的Spms基因表达的缺乏引起细胞死亡(黑圈中的白“X”代表lac阻遏物对Spms基因的lac操纵基因序列的特异结合)。(图2B)：雄性不育性基因在可育杂种植物的绒毡层细胞中的表达。可育性恢复系基因(Srmf)编码阻止核Snms基因转录的以核为靶的阻遏物，这种阻止是通过在Snms基因上操纵的阻遏物结合位点，从而使Spms基因不能表达(黑圈中的白“-”表示以核为靶的阻遏物与其在Snms基因上的阻遏物结合位点的特异结合)。

图3.用于“花粉杀灭”方法，在质体中表达Kpms的盒。该DNA序列显示为PTlac1(序列I.D.No.1)和PT7lac2(序列I.D.No.2)启动子和TT7(序列I.D.No.3)和Trps16T7(序列I.D.No.4)转录终止子。RBS代表核糖结合位点，T7噬菌体基因10(φ10)启动子，lac操纵子和相关的限制性位点下面划线。包括在NcoI识别序列中的翻译起始密码子为粗体。

图4.通过连接于壮观霉素抗药性(aadA)基因将Kpms基因整合入质体基因组的转录沉默区。质体pC8的质体寻靶作用区被显示，同时还显示野生型质体基因组(Nt-ptDNA)的同种区，和含整合的杀灭基因的区。aadA和过路基因的整合是通过长线间的两次同源重组事件进行的。简略语：16SrDNA＝16SrRNA基因；V＝trnV基因；B＝ORF70B开放阅读框；PT7＝PT7lacl启动子；TT7＝TT7终止子。限制性位点：E，EcoRI；B，BamHI；Bg，BglII；H，HindIII；RV，EcoRV。

图5.Knms核雄性不育性基因(pZS233：核苷酸序列为序列I.D.No.5，蛋白序列为序列I.D.No.6；pZS243：核苷酸序列为序列I.D.No.7，蛋白序列为序列I.D.No.8)。显示的Knms基因表达为组成基因，带有一个花椰菜花叶病毒35S启动子(P35S；蒂莫曼斯等，生物技术杂志14：333-344，1990)，RuBisCO小亚单位运送肽(TP-SSU；卡那夫斯基和马利格，美国国家科学院院报，91：1969-1973，1994)，T7 RNA聚合酶(T7-RNAP；斯图迪等，酶学方法，185：60-89，1990)和花椰菜花叶病毒转录终止子(T35S；蒂莫曼斯等，1990，上述)。还显示了运送肽的蛋白序列(长线)和与T7RNA聚合酶N-末端融合。加工位点用实心三角标记。当从上面所示pZS233基因表达时前T7 RNAP的加工产生不带附加氨基酸的T7 RNAP，并且当从下面所示的pZS243基因表达时留下融合在N-末端的成熟SSU的5个氨基酸。

图6.雄性可育性基因的Srmf核恢复系(pZS253：核苷酸序列是序列I.D.No.9，蛋白质序列是序列I.D.No.10；pZS263；核苷酸序列是序列I.D.No.11，蛋白质序列是序列I.D.No.12)。一种带有花椰菜花叶病毒35S启动子(P35S；Timmermans等，1960，上述)的组成型测试基因。TP-SSU，RuBisCO小亚单位运送肽(Kanevski和Maliga，1994，上述)；lacI，lac阻遏物编码区(Farabaugh，Nature，274：765-769，1978)；T35S，花椰菜花叶病毒转录终止子(Timmermans等，1990，上述)。还显示了运送肽蛋白序列(长线)和与T7 RNA聚合酶的N-末端融合。加工位点以实心三角标记。当从上面描述的pZS253基因表达时前T7RNAP的加工产生不带有附加氨基酸的T7RNAP，并且当从下面所示pZS263基因表达时留下在N末端融合的成熟SSU的5个氨基酸。

图7.用于为“花粉饥饿”方法转录Spms基因的改变的启动子序列。Prrnlac1(序列I.D.No.13)和Prrlac2(序列I.D.No.14)启动子来自rRNA操纵子启动子，PtrnVlac2(序列I.D.No.15)启动子来自trnV基因。标出下划线的-10和-35启动子元件和lac操纵基因序列(粗体)。数字代表核苷酸在烟草质体基因组中位置(Shinozaki等，EMBO  J.，5：2043-2049，1986)。

图8.用于为“花粉饥饿”方法表达蛋白编码Spms基因的改变的启动子序列。所显示的启动子为rRNA操纵子启动子的衍生物，并具有T7噬菌体基因10前导(PrrnlacL1；序列I.D.No.16)或质体rbcL基因前导(PrrnlacL2；序列I.D.No.17)的前导序列。标出下划线的-10和-35启动子元件和lac操纵序列(粗体)。数字代表核苷酸在烟草质体基因组中的位置(Shinozaki等，1986，上述)。发明详述

本发明的转基因CMS系统所依据的原则是，在发育的花药组织(特别是绒毡层或小孢子)中活性的有功能的叶绿体对于活性花粉的形成是至关重要的。三转基因系统包含受两种核基因调节的质体雄性不育性(pms)基因。两种核调节基因之一是设计为只在花药组织中表达的核雄性不育性(nms)基因。该nms基因编码调节pms基因的质体指导多肽，此种调节是通过激活或灭活pms基因，这可引起被选择的花药组织的转化质体失去活性或死亡，从而阻止有活性的花粉的形成。另一种核基因，雄性可育性恢复(rmf)基因，编码一种阻止nms基因调节pms基因的基因产物。

在下面I-III部分中进行的详述中，阐明了制造并使用本发明的DNA构建物和转基因植物，以及实践本发明方法的优选方法。部分I阐明构建本发明的基于质体的CMS系统的一般方法(在时在本文中称为“质体雄性不育性”或“pms”系统)。部分II和III阐明了质体转基因CMS系统的两种优选实施方案，即“花粉杀灭”方法和“花粉饥饿”方法，并描述了用于实施这两种优选实施方案的每一种有用的DNA构建物和其它组成。未特别描述的任何分子克隆或重组DNA技术按常规方法进行，按照通常所描述的，如，在萨姆布鲁克等“DNA克隆，实验室手册”，冷泉港实验室，1989中。

I.构建质体转基因CMS系统和生产

杂种种子的一般方法

本发明的转基因CMS系统根据为高等植物核和质体转化，维持亲本植物系和产生杂种种子阐述的一般方法制备和使用。

A.用pms基因稳定转化质体并再生质体转基因植物的DNA构

      建物和方法

供稳定高效地转化质体并在质体中表达重组蛋白的方法和DNA构建物在本领域中是公知的。在下列参考文献中描述的方法和构建物为本发明实践所优选：斯威伯等，美国国家科学院院报，87：8526- 30(1990)；斯威伯和马利格，美国国家科学院院报，90：913-17(1993)；凯若等分子基因遗传学，241：49-56(1993)；斯图伯&莫利格，EMBO  J.，12：601-06(1993)；和美国专利申请序列号08/11398和08/189256；所有上述公开内容均描述了在稳定，高效的质体转化和重组基因在质体中表达方面本领域的状态。

下列定义将使对关于本发明中使用的质体转化方法的理解变得容易：

异质的：指在单个质体内或植物细胞和组织中包含的一群质体中存在不同质体基因组的混合群。

同质的：指在质体中或细胞和组织内纯的质体基因组群。

质体转化：将转化DNA稳定地整合将被传送入含转化质体的植物种子后代的质体基因组。

前述供质体转化的优选方法和构建物依赖于使用一种非致死选择方法，它给予含转化质体的细胞一种可选择表型。术语“选择性标记”或“可选择标记”指当编码选择性标记的基因或等位基因包含于用于转化的外源DNA时，确定成功转化的细胞器，细胞或组织的表型。通常使用的选择性标记包括对抗生素，除莠剂或其它化合物的抗性性，当细胞，细胞器或组织不表达抗性性基因或等位基因时将是致死的。转化体的选择是通过将细胞或组织在选择性压力下，即在含抗生素，除莠剂或其它化合物的培养基上培养而完成的。如果选择性标记是“致死的”选择性标记，则表达选择性标记的细胞将存活，而缺乏选择性标记的细胞将死亡。如果选择性标记是“非致死的”，则转化体(即表达选择性标记的细胞)将通过一些方法与非转化体鉴别，但转化体和非转化体两者在选择压力存在下将都存活。

一种选择性标记可以在细胞水平是非致死的，但在细胞器水平是选择的；本文中优选的用于质体转化的选择性标记即是这种情况。例如，抗生菌壮观霉素抑制质体中的翻译，但不抑制细胞质内的。对壮观霉素敏感的质体不能产生包含光合作用装置的蛋白质。在壮观霉素存在下，含这种质体的细胞通过在光异养条件下(即，提供外源性的碳源)生长而保持存活，但其中的质体生长更缓慢，并且细胞或组织变白，而不是成为绿色。与此相反，表达壮观霉素抗性性选择性表型的质体繁殖速度快而且含有这种质体的细胞是绿色的。在含有转化的和非转化的质体的混合细胞群中，敏感的非转化体将在数量上被超过并将在选择压力下在质体/细胞分离过程中被稀释，并且基本上只有转化的质体将组成质体群(同质细胞或组织，如上面所定义)。因此，非致死性选择性标记指在细胞水平非致死，其中敏感细胞或组织可在选择性培养基中生长，但抗性性组织易于从其中被鉴别。

质体转化需要：(1)传送DNA通过双层质体膜的方法；(2)整合异源DNA而不妨碍质体基因组的正常功能(通过在质体基因组中合适位点置换已存在的质体基因或插入附加的基因)；和(3)有效地选择转化的质体基因组，优选通过使用显性型非致死性选择性标记，如上文中成斯伯和马利格，1993，所述(描述了aadA基因作为可选择标记基因用于高效转化烟草叶绿体)。

可采用几种方法将DNA导入开花植物的质体，包括，但不限于，土壤杆菌属载体，聚乙二醇(PEG)处理原生质，用质体转化DNA包被的微弹轰击细胞或组织(有时在本文中称为“biolistic DNA传送”)和通过UV激光微光束切割的临时孔。其它方法包括使用双病毒载体，钙磷酸盐处理原生质，分离的原生质的电穿孔和用转化DNA包被的微珠的细胞悬溶液的搅拌。如上述由斯威伯和马利格，1993描述的biolistic方法优选用于质体转化，因为它可用于其中许多植物和组织，包括不经细胞或原生质培养或再生处理的种或属。在一项替代的实施方案中，在原生质可被获得并再生入完整植物的植物系统中有用，可在转化DNA存在下通过聚乙二醇(PEG)处理原生质获得质体转化。在PEG-处理的原生质中稳定的质体转化的方法由Gold等，Bio/Teehnology，11：95-97(1993)在烟草中举例说明。

用于用pms基因进行稳定的质体转化的DNA构建物(在本文中有时称为“转化DNA”或“插入载体”)包含下列元件：(1)与被转化的质体基因组的一个区同源的一段DNA序列(在本文中有时称为“靶节段”或“靶片段”)，具有足够的长度以确保为将转化DNA整合质体基因组所需的同源重组事件能发生，(2)一种非致死性可选择标记基因，如aadA基因，和(3)pms基因，两种基因分别可操作地连接于5’和3’调节区以供在质体中表达。这种载体被方便地装配为嵌合基因，其中每个编码区(即，可选择标记基因编码区和pms基因编码区)侧翼排列有适当的5’和3’调节序列。选择可选择标记编码节段的5’和3’调节节段以便可选择标记基因被有效表达，从而传递非致死性可选择表型。如上所述选择pms基因5’和3’调节节段，以便基因能在核nms和rmf基因控制下被激活和灭活。这种嵌合基因在两侧带有部分靶节段。

插入载体的靶节段应足够大以保证在转化DNA和质体基因组之间的同源重组。为实现这一点，靶节段应至少约50碱基对长，并优选在将要插入质体基因组中的DNA的每一侧为500～1500碱基。

选择靶节段应使转化DNA不破坏附近质体基因的表达。本领域技术人员可确定有用的靶节段，其原因是可得到数种质体基因组的大量基因图谱信息和序列信息，以及由于质体基因组中具有高度保守性而可将这种信息用于其它质体基因组(帕尔默，遗传学动向，6：115-120，1990；苏格里亚，植物分子生物学，19：149-168，1992)。

对于本发明的“花粉-饥饿”方法，靶节段包含要置换的基因，并且完全置换该基因而不妨碍质体基因组上的临近基因。置换的完成是通过连接可选择标记基因于置换质体基因的下游，并选择表现可选择表型的转化体(见马利格等，Phil.Trans.R.Soc.Lond.B，342：203-208(1993))。

对于“花粉杀灭”方法，选择靶节段使转化DNA在转录寂静位点插入质体基因组，而不破坏质体基因。已知质体基因的3’区不能有效终止转录(格瑞珊和托金，植物学关键回顾，12：19-55，1993)，在转化DNA插入质体基因组的几乎任何位点时，均可预期到一定程度的连读转录。考虑到这一点，在trnV基因和rps12/7操纵子之间的反向重复区的插入位点特别有用，因为当取向于rps12/7操纵子时，转化DNA被转录而不伴随显著的连读转录。在trnV-rps12/7插入位点缺乏连读转录可能是由于侧翼质体基因或操纵子被逆向转录(即，从对面的链，以相反方向转录)。因此，指向其它逆向转录基因间位点的靶节段在本发明的实践中可能也有用。这些包括，但不限于，在反向重复区trnL和ORF2280间的位点，在大单拷贝区trnS和ORF168和trnW和petG之间。另外，任何两个tRNA基因间的插入位点也可能有用，因为tRNA基因是转录的相对有效的终止子(斯腾和格瑞珊，细胞，51：1145-57，1987)。在插入位点两翼加入转录终止子也可获得相同结果，这些转录终止子可被合成或从源基因切下并被克隆。

可选择标记基因和pms基因可在供插入至靶节段的表达盒中提供。本文中使用的表达盒包含5’和3’调节基因节段，优选应适合通过常规重组DNA技术方便地混合和配对。表达合用于为插入载体的装配产生嵌合pms基因和可选择标记基因。因此供用pms基因转化质体的插入载体包含至少一种其它基因，它提供非致死性可选择表型。

表达载体包含5’和3’调节节段以控制多种编码片断的表达。5’调节节段控制质体中表达的总量和特异性。3’调节节段提供mRNA稳定性。优选5’和3’调节节段得自内源性质体基因的5’和3’调节区，它可被进一步修饰。其它5’和3’调节区也可被使用，特别是得自大肠埃希杆菌、草蓝藻细菌，光合细菌，噬菌体和植物病毒的这种调节区。

为获得可选择标记基因和主要pms基因在其它花药质体中的高水平蛋白表达，经修饰的非光合作用启动子可用于5’调节节段中。这一类中的强启动子是斯威伯和马利格描述16S核糖体RNA操纵子启动子，Prrn，1993年上文。

除了为指导转录而具有启动子元件外，为调节翻译5’调节节段可含附加的表达启动元件，如在质体基因的5’非翻译区(UTRs)中的核糖体结合位点，以及编码质体基因的几种N-末端氨基酸的序列。

被操纵用于表达壮观霉素抗性性基因的一种rrn操纵子启动子实例aadA由Svab和Maliga公开于1993年，上文。这种5’调节节段包含rrn操纵子5’-区的一个节段，包括- 10和-35启动子元件，与包括GGGUGGG核糖体结合位点的高表达rbcL非翻译区的18氨基酸融合。这种5’调节节段能够指导uidA基因在转化质体中的构建物表达。作为另一实例，Carrer等，1993年，上文，描述的同样的启动子能够指导kan基因的表达。

还发现通过在5’调节节段中包括进相对于翻译起始位点从-16至+18的整个rbcL前导序列，可提高表达。假设对于高水平蛋白表达而言mRNA前导序列(即，5’UTRs和N末端编码区)是重要的，其它有用的前导序列可得自其它高表达基因，特别是高表达病毒基因(如，烟草花叶病毒(TMV)包被蛋白的omega序列，苜蓿花叶病毒(AMV)RNA4或雀麦花叶病毒(BMV)RNA3的非翻译前导，和噬菌体T7前导序列(见图8和实施例4))。

适合本发明实践的3’调节节段的一项实施例由Staub和Maliga，1993年，在上文公开，并也公开在实施例1中(图3)。这些片段得自各种质体基因和T7噬菌体基因10的3’非翻译区。

使用上文描述的构建物，可如下获得包含pms；基因的稳定质体转化多细胞植物：

(1)在包含非致死性可选择的标记基因和合适靶节段的插入载体中提供pms基因；

(2)传送转化DNA进入质体(优选通过biolistic方法)，从而能够整合转化DNA而不妨碍质体基因组的正常功能；

(3)在合适的选择性培养基上培养经处理的细胞或组织并重复亚克隆直至获得同质细胞；

(4)通过可选择表型的表达鉴定同质细胞或组织；并

(5)使经鉴定的转化体生长为成熟植物并评价它们的后代保持可选择表型和存在pms基因的情况。

B.获得包含nms基因或rmf基因

的核转基因植物的方法

植物核转化可按照为质体转化描述的同样方法完成。这些包括，但不限于，土壤杆菌属载体，原生质的PEG处理，biolistic DNA传送，UV激光微光束，二价染色体病毒载体，原生质的磷酸钙处理，分离的原生质的电穿孔，以转化DNA包被的微珠细胞悬液的搅拌，直接DNA摄取，脂质体介导的DNA摄取，等等。这些方法已在本领域中公开，参见，植物分子生物学方法，威斯巴赫和威斯巴赫编，学术出版公司(1988)；植物分子生物学中的方法，舒勒和泽利斯基编，学术出版公司(1989)；植物分子生物学手册，葛文施普劳特，沃玛编，克鲁夫学术出版社，道瑞兹(1993)和植物分子生物学方法-实验室手册，马利格、克莱斯格、凯施莫、格瑞赛姆和沃纳编，冷泉港出版社。

转化的方法取决于被转化的植物。biolistic DNA传送方法已被描述用于转化质粒并也可用于核转化。在本发明的另一实施方案中，土壤杆菌属载体被用于帮助植物核的有效转化。

在一项优选实施方案中，nms基因(及下述rmf基因)被导入土壤杆菌属双元载体中的植物核中。这种核包括，但不限于，BIN19(贝万，核酸研究，12：8711-8721，1984)和其衍生物，pBI载体系列(杰弗逊等，EMBO.J.，6：3901-3907，1987)，和双元载体pGA482和pGA492(安，植物生理，81：86-91，1986)。本发明的实践优选一种新的土壤杆菌属双元载体系列，pPZP族。斯威伯等描述了此载体族在植物转化中的应用，见植物分子生物学方法-实验室手册，马利格、达莱斯格、凯施莫、格瑞赛姆和沃纳编，冷泉港出版社(1994，在印刷中)。

使用土壤杆菌属双元载体系统用于转化，nms或rmf基因被连接至一种核药物抗性性标记，如卡那霉素或庆霉素抗性性。nms基因和rmf基因优选连接至不同药物抗性性标记，以便两种基因能分别被独立选择。土壤杆菌属介导的植物核转化按照下列步骤完成：

(1)nms基因或rmf基因被插入被选择的土壤杆菌属双元载体；

(2)通过将植物组织(如叶盘)与重组土壤杆菌属悬液共培养，随后在不存在用作选择性培养基的药物情况下在培养基上培养(如2天)而完全转化(见，赫赛等，科学227：1229-1231，1985)；

(3)然后将植物组织转至选择性培养基上以鉴定转化的组织；并且

(4)被确定的转化体再生为完整植物。

应认识到表达量以及nms或rmf基因在转化植物中表达的组织特异性可能根据它们插入核基因组的位置而不同。这种位置效应在本领域中是熟知的；见Weising等，Ann.Rev.Genet.，22：421-477(1988)。为此原因，应再生数种核转化体并与质体转化A^P系(或者一种其pms基因为报导基因如uidA，编码β-葡萄糖醛酸酶(GUS)的A^P“检测”系)杂交检测以确定转化体适当地表达了核转基因。

C.亲本系的制备和维持及杂种种子的生产

按照上述方法，三种转基因被导入如下选择的植物系。一种亲本系，亲本A，被选择。亲本A植物的质体用pms基因稳定地转化，并再生质体转基因植物(A^P)。另一亲本植物的核用nms基因稳定地转化并再生核转基因植物(A^N)。选择第2种亲本系，亲本B。亲本B系的核用rmf基因转化，并再生核转基因植物(B^R)。

产生亲本系A^P，A^N，和B^R后，种子繁殖和杂种种子生产可容易地完成。所有核转化亲本系被近交为纯合。质体转化的A^P系是同质的。所有亲本系是雄性不育的并能无限维持。为获得细胞质雄性不育子代，将A^N(花粉亲本)与A^P(雄性亲本)杂交，使用各种技术(如去除A^P的雄性部分和使用A^N作为雄性亲本)以保证获得杂交的而非自交的种子。这些子代由于具有pms基因和nms调节基因两者而成为雄性不育，此两种基因导致被选择的花药组织中质体或细胞无能力或死亡从而不能形成有活性的花粉。通过用A^N重复回交获得稳定A^S系它在A^P细胞浆中产生A^N纯合子。

通过将A^S植物与核转化的亲本A^N回交可繁殖雄性不育A^S植物的种子。为繁殖A^S种子，A^S植物可在交替行中种植在A^N植物边上，并按行分别收获种子。从A^S行的种子生长的植物为雄性不育的。由于雄性不育是在质体水平通过转基因质体产生的，因此雄性不育特性是一致地经细胞质地遗传，而不会由于核基因的分离产生不希望的雄性可育性。

第二亲本系，亲本B被用于产生杂种种子。如果雄性可育性杂种植物是不需要的，则进行简单的A^S×B杂交，并且A^SB子代将遗传CMS特性以产生也是雄性不育性的植物，因为子代将携带至少一份拷贝nms基因，但无rmf基因。如果，在另一方面，希望杂种种子生长为雄性可育性植物，则使用核转基因亲本B^R。为产生雄性可育杂种种子，A^S植物不具有可育花粉。由A^S植物产生的所有种子都是用B^R花粉受精的结果。由于rmf基因的表达阻断nms基因产物对pms基因的调节活性，A^S与B^R的杂交导致形成将生长为雄性可育性植物的杂种种子。

    II.“花粉杀灭”方法

在本发明的一项实施方案(在本文中称为“花粉杀灭”方法)中，pms基因是一种被改变的无活性基因，它能被选择激活或失活。当被激活时，pms基因表达一种对质体毒性或致死性的基因产物。nms基因是编码质体指导的激活物多肽的花药特异性核基因，这种激活物多肽能够进入质体和激活毒性pms基因，从而杀灭被选择花药组织的质体或使其失活。B亲本的rmf基因编码一种“恢复系”基因产物，此基因产物能妨碍激活物多肽的作用，从而阻止致死性pms基因产物的形成。在一项优选实施方案中，rmf基因编码一种质体指导的多肽，此多肽能进入质体并妨碍在那里的激活物多肽(例如，通过与pms基因的灭活位点相互作用，从而去除激活物多肽的作用)。在另一项实施方案中，rmf基因编码一种细胞质基因产物，此基因产物在激活前体多肽进入质体前妨碍它(例如，以核为靶并抑制nms基因的表达)。

“花粉杀灭”方法通过下述系统举例说明，该系统使用T7 RNA聚合酶作为激活物多肽，lac阻遏物作为恢复系多肽，以及可操作地连接于T7/lac启动子的质体毒性“杀灭”基因。在此实施方案中，pms基因产物包含与质体转送肽(如RuBisCo小亚单位)融合的高度特异性T7噬菌体RNA聚合酶以引导聚合酶进入质体基质区域。T7 RNA聚合酶是相对简单的聚合酶，包含一种约100KD的单体酶，聚合物特异地结合于短(23bp)启动子序列，具有特异性而阻止妨碍宿主基因的表达。质体指导的T7 RNA聚合酶的编码区可操作地连接于绒毡层特异性启动子，从而该基因只会在绒毡层细胞中被转录而诱导细胞死亡。T7聚合酶-T7/lac启动子系统用于本发明特别有利，在于不论聚合酶的表达多高都不会引起对植物细胞的任何副作用(已发现高至总细胞蛋白的1％的水平的T7聚合酶表达不有害地影响酵母生长(陈等，细胞，50：1047-1055，1987))。

因此，本实施方案中，A^N亲本系表达T7 RNA聚合酶，A^P亲本系含有质体中的失活pms基因，并且A^N×A^P的子代由于T7聚合酶对T7/lac启动子的作用从而激活pms基因而成为细胞质雄性不育的。这些雄性不育性子代，A^S系，被用于杂种种子生产，如上所述，为生产雄性可育性杂种，将A^S亲本与B^R亲本杂交，它表达rmf基因产物，一种以质体为靶的lac阻遏物。lac阻遏物进入质体单元并结合于包括在T7/lac启动子中的lac操纵序列，从而阻止pms；基因被T7 RNA聚合酶转录(见杜本德夫和斯图迭，分子生物学杂志219：45-49，1991)。因此，杂种A^SB^R子代将为雄性可育的，该可育性由rmf基因的表达所恢复。

本文描述的T7/lac系统在实施例1-3中更进一步地阐明并图示于图1。鉴于对T7/lac系统的上述描述，应认识到其它激活物和阻遏物系统也可被使用以获得相同效果。例如，T7 RNA聚合酶/lac阻遏物系统的替代物是T3聚合酶/lac阻遏物系统，由Deuschle等描述，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：5400-5404(1989)。

对本发明的实践有用的另一种系统是四环素阻遏物和操纵子系统，见下述，它为哺乳动物和植物系统两者所采用(见高森等，生物技术学趋势，12：58-62，1994)。

A.“花粉杀灭”方法的质体雄性不育基因

根据本发明的“花粉杀灭”方法，pms基因作为在靶序列的控制下失活基因的导入质体，此靶序列只在存在由CMS系其它亲本组成部分的nms基因编码的激活物多肽时使基因能够表达。在此实施例中，pms基因编码区编码一种对质体有毒性的基因产物(RNA或蛋白)，它正是在这种质体中被产生的。由于质体是植物的很多重要的代谢和生化过程的位点，这些代谢和生化过程包括光合作用(在叶绿体中)，淀粉合成和积累(在叶绿体和造粉质体中)和氨基酸和脂质合成(一般在质体中)，在质体中有质体毒性基因产物作用的许多靶位点。可能的质体毒性系统的实例包括，但不限于：特定质体基因产物的过度表达，针对编码重要质体基因产物的mRNAs的反义RNA或核糖体的表达，活力蛋白的转录后修饰，如ADP核糖基化(尤达和海拉什，生物化学年评54：73-100，1985)异源DNA酶，RNA酶，蛋白酶，和使质体膜可通透或破坏质体膜系统的孔形成蛋白。应指出毒性基因产物也可渗漏(或转位)至细胞质，在那里发生毒性作用。有用的致死性多肽的具体实例包括，但不限于：

来自CMS-T玉米线粒体基因组的T-urf13。如在背景部分中所讨论的，由urf13基因编码的13KDa多肽增加生物膜的通透性，它导致了自然发生的系统中的CMS表型。见Hanson，Ann.Rev.Genet.，25：461-86(1991)。其它有用的膜破坏蛋白包括得自酵母，细菌或哺乳动物的各种膜转运蛋白(见科提兹等.，EMBO J.，11：3491-3499，1992；古兰卡等.，FASEBJ.，3：2583-2592，1989)。

得自苏云金杆菌的CytA毒素基因，它编码一种杀死蚊子的溶血蛋白。该基因在植物细胞中表达由于破坏细胞膜而引起细胞死亡(Mclean等.，J.Bacteriol.，169：1017-1023，1987；Ellar等，美国专利第4918006号，1990)，这种生物活性也可应用于细胞器膜，如质体膜。

得自噬菌体P1和Cre-lox的系统的Cre重组酶，用于产生可导致丧失细胞活性的位点特异性重组和重排(范华仁和欧，Plant Mol.Biol.23：525-533，1933)。

在本发明的实施方案中，pms基因的编码区能够编码抑制重要质体功能从而引起质体失能或死亡的RNA。这些可包括反义分子或核糖基酶(ribozyme)，此酶的构建和使用在本领域是公知的。反义分子通常被设计以结合至基因或mRNA的重要区，从而阻止转录或翻译或引起靶DNA的降解。ribozyme包含一个核苷酸序列与靶DNA的一部分互补的杂交区和一个在特定位点剪切靶DNA的催化区。

在“花粉杀灭”方法中，pms基因的可调节靶序列包含一个被nms基因的质体指导基因产物特异激活的非质体启动子。在优选实施方案中，pms基因的可调节靶序列包含一个位于相对于启动子处的阻遏物结合位点，因而特异性阻遏物对阻遏物结合位点的结合阻止基因的转录，即使是在存在激活物多肽时(关于此启动子和pms编码区，称为“控制位置”)。本发明的实践优选的是上文所述由Dubendorff和Studier在J.Mol.Biol.，219：45-49(1991)中所述的T7/lac启动子构建物。使用这种启动子/阻遏物序列能够通过质体指导的T7 RNA聚合酶激活pms基因，并用质体指导的lac阻遏物使该基因失活以恢复雄性可育性。

实践本实施方案有用的另一种可调节靶序列是tet阻遏物结合位点(tet操纵基因)，也已在上面讨论过并在下文与“花粉饥饿”方法有关。lac操纵基因或其它阻遏物结合位点类似地可用于采用由阻遏物结合区和异源激活区组成的嵌合激活物多肽的系统。

B.用于“花粉杀灭”方法的核雄性不育性基因

本发明的核雄性不育性基因包含3种元件：(1)编码调节物多肽的编码区，通过翻译融合于(2)使调节物多肽能够转位入质体的质体送运肽，嵌合基因的转录在(3)花药特异启动子的控制下。

通过将nms基因的编码区置于花药特异性启动子控制下而使花药特异性被传送至本发明的CMS系统。花药特异性启动子指导相关编码序列的转录从而使相应的信息RNA以至少约为在其它组织中观察到的浓度的约100倍存在于花药组织中。

花药的代谢活性绒毡层对小孢子，即花粉的原始粒子，起到营养作用。已显示节切除绒毡层细胞能导致核雄性不育。马拉尼等，自然，347：737-741(1990)；马拉尼等，自然，357：384-387(1992)。从而，在本发明的一项优选实施方案中，使用绒毡层特异性启动子。绒毡层特异性启动子在本领域中是公知的，如上文所述，由马拉尼等所举例说明。在另一项实施方案中，使用小孢子特异性启动子。这种启动子在本领域中也是公知的(如，T52和T59，退尔等公开，Genes&Devel.，5：496-507，1991)。

nms基因也可包含其它调节信号。例如，植物核翻译共有序列也可包括在构建物物中，以及用于终止植物核基因转染和翻译的适当信号。

多数质体蛋白在核中被编码，在细胞质中被翻译并在翻译后转运至质体。这种核编码蛋白作为含有被称为运送肽的可剪切N-末端序列的高分子量前体被合成。这种运送肽对于运送前体多肽穿过质体外壳膜是必需和足够的(并且，取决于多肽进入质体各种单元的最后位置)。运送肽能够指导经翻译融合在那里的异源过客蛋白的摄取和内部定位。参见，塞格及斯格特，细胞生物学动向3：186-190(1993)；亦见施耐尔和布洛凯，细胞生物学杂志，120：103-115(1993)；开尼夫斯基等，美国国家科学院院报，91：1969-1973(1994)。

为本发明实践，使用指导核编码调节物多肽转位于质体基质的运送肽，因为含pms基因的质体基因组位于基质中。在优选实施方案中，编码ribulose-1，5-二磷酸盐羧酶/氧化酶(RuBisCo)小亚单位前体的送运肽被整合nms基因，以表达包含经翻译融合于前ss运送肽的调节物多肽的前体多肽。虽然在本文中例举的是前-ss运送肽，本领域中技术人员可知道，任何指导基质定位的核编码蛋白都可用于本发明的实践。

在“花粉杀灭”方法中，nms基因编码一种能够通过可操作地连接于基因的靶核核苷酸序列激活毒性pms基因的质体指导的激活物多肽。本发明的激活物多肽包括，但不限于，聚合酶，DNA结合蛋白，自然产生的和合成的转录激活物，翻译激活物，其它转录后激活物等。使用激活物多肽指导其它核苷酸序列的表达已如上所述以T7 RNA聚合酶为例予以说明。见雷姆等美国专利第5122457号，以及斯图迭等美国专利4,952,496、及斯图迭的综述酶学方法，185：60-89(1990)。

本发明的激活物多肽还可包含对于具体启动子的转录激活所需要的其它DNA结合蛋白(如，噬菌体T3 RNA聚合酶)。另外，一种蛋白的结合区可融合于另一蛋白的转录激活区。这种嵌合蛋白的一个实例是tetR/Vp16转录激活物，在综述中描述，高森等，生物技术动向，12：58-62(1994)。其它嵌合转录激活物的实例包括lex A(结合区)/Ga14转录激活物。布仑特和帕仲等人描述，Cell，43：729- 736(1985)和Ga14/Vp16(盖瑞等，分子生物学杂志209：423-432，1989；克瑞斯等，科学，251：87-90，1991；塞都斯基等.，自然，335：563-564，1988)。

转录激活物也可用于本发明中。指导病毒基因高度表达的前导序列及其特定翻译激活物特别有用。一个实例是花椰菜花叶病毒翻译激活物(TAV)，福彻和洪描述，EMBO J.，10：3887-3896(1991)。在这种系统中，可构建编码双顺反子信息的pms基因，其中，比如，第一个顺反子可以是可选择标记基因而第二个顺反子可以是质体致死性基因，两者在来自相同启动子的相同mRNA中转录。可选择标记mRNA的翻译在未加入其它成分下发生；然而，质体致死性mRNA只在TAV存在下才被翻译。

C.用于“花粉杀灭”方法的雄性

  可育性基因恢复系

rmf基因产物可阻止nms基因在数个位点任意之一作用，包括，但不限于：(1)在质体中在pms基因处，例如通过阻碍质体毒性pms基因的转录或翻译，或通过使被nms编码的阻遏物灭活的重要pms基因去抑制；(2)在质体中，但不必在pms基因处，通过阻碍或破坏成熟调节物多肽；(3)在细胞质中，通过在前体调节物多肽转位入叶绿体阻断或破坏之；和(4)在细胞质或核中，通过阻碍nms基因的表达(例如，通过转录或翻译阻遏物)。

本发明的rmf基因包含至少一种编码恢复系基因产物的编码区，可操作地连接至适当的5’和3’调节序列，以便从核基因组表达。需要包括在rmf基因的调节序列取决于rmf基因产物被设计用来阻碍的调节物多肽作用点，如上所述。

rmf基因产物的花药特异性对本发明的实际不是绝对必要的；rmf基因可在其它组织中表达，只要它也在表达nms基因的花药组织中表达。然而，花药特异性对本发明实践来说是优选的，因为rmf基因在整个植物中系统表达可产生毒性作用，这种毒性作用在涉及在宿主细胞中表达外来基因时经常可观察到。而且，将强的花药特异性启动子包括在rmf中，优选与用于nms基因者相同或类似的启动子，将保证rmf基因的强表达并在nms基因也被表达的位点产生rmf基因产物。因此，本发明的rmf基因包含可操作地连接于花药特异性启动子的恢复多肽编码区，如上文描述的用于nms基因者。

rmf基因也可包含其它调节信号。例如，植物核翻译共有序列也可包括在构建物中，以及用于终止植物核基因转录和翻译的合适信号。

如果rmf基因产物是质体基质区域指定的恢复系多肽，则rmf基因的编码区必须连接于编码质体基质运送肽的DNA序列，如上文中关于nms基因描述的前-ss运送肽。编码其它将蛋白转位至质体基质的运送肽的DNA序列在本领域中也是公知的并可用于本发明这方面的实践中。

在“花粉杀灭”方法的优选实施方案中，rmf基因编码一种质体指导的多肽，此多肽进入质体并通过对pms基因产生压倒性的相反调节而阻碍nms编码的调节物多肽的作用。此实施方案通过编码质体指导的lac阻遏物多肽的rmf基因举例说明。pms基因包含一个位于相对于可激活靶核核苷酸序列的lac阻遏物结合位点和pms编码区，因而lac阻遏物的结合抑制pms基因的转录，而不管nms-编码的激活物多肽的存在(如，T7 RNA聚合酶)。

如上所述，多种转录和翻译抑制系统在本领域中是公知的。这些其它阻遏物蛋白也可被用作rmf编码的恢复系多肽。另外，包含带有得自另一种多肽的阻遏物区的得自一种多肽的DNA结合区嵌合蛋白也可以应用，如上面说明激活物多肽时所述。

在使用质体指导的恢复系多肽的其它实施方案中，恢复系多肽可为能够特异地结合于调节因子多肽从而阻止其对pms基因的作用的蛋白，如质体指导的免疫球蛋白或其片段，或其它与本领域中公知的阻遏物激活物系统有关的特异性配基(如，产生结合于阻遏物并使之变为无活性的小分子诱导物的酶)。

在另一项实施方案中，可用于“花粉杀灭”或“花粉饥饿”方法，rmf基因编码阻止nms编码的调节物多肽前体进入质体的一种细胞质多肽。可用于此实施方案的蛋白包括，但不限于，对前体调节物多肽特异性的免疫球蛋白或其片段，和能够特异性地作用于前体调节物多肽并使之不能穿过质体膜的蛋白酶或其它蛋白修饰酶，或阻止nms编码的mRNA翻译的翻译终止子。

在另一项实施方案中，rmf基因编码一种以核为靶的多肽，如转录或翻译阻遏物，能够进入核并阻止nms基因的表达。为实践本发明的该实施方案，nms基因应包含一个rmf编码的阻遏物的阻遏物结合位点。关于此实施方案，应指出，包括植物细胞核在内的真核生物细胞核包含一系列蛋白，这些蛋白在细胞质中合成开通过包含在这些蛋白中的氨基酸信号序列的操作而转位至核中。这种使靶蛋白进入核的定位信号在本领域中是公知的。见霍尔等，Cell，36：1057-1065(1984)(描述通过得自酵母MAT alpha 2基因的核定位序列使细胞β-半乳糖苷酶定位于酵母核)。

II. 花粉饥饿”方法

在另一项在本文中称为“花粉饥饿”的实施方案中，pms基因是对质体生存至关重要的天然质体基因的同源物，它是活性的但被改变为不可激活的(即，可阻遏的)。天然质体基因通过同源重组被经改变的pms基因置换，因而稳定地质体转化的植物只含基因的经改变形式。本实施方案中的nms基因是编码质体指导的灭活多肽的花药特异性基因。此种灭活多肽能进入质体并阻断重要pms基因的表达从而灭活或杀灭选择的花药组织的质体。B亲本的rmf基因再次编码一种能够妨碍灭活多肽的作用从而使重要pms基因能保持活性的“恢复系”基因产物。在优选实施方案中，rmf基因编码能进入核并妨碍nms基因核指导多肽。在另一实施方案中，rmf基因编码一种能妨碍编码灭活多肽的mRNA翻译或前体向质体中的转位的细胞质基因产物。

“花粉饥饿”方法通过下述系统举例说明，该系统使用以质体为靶的lac阻遏物作为灭活多肽，以核为靶的tet阻遏物作为rmf基因产物，和可操作地连接于为其在质体中的表达所需要的必不可少的5’和3’调节序列的重要质体基因，在至少一种lac阻遏物结合位点的控制下。

在此实施方案中，A^N亲本系表达一种从质体为靶的lac抑制多肽，A^P亲本系含有质体中活性改变的pms基因，并且由于lac阻遏物结合于lac结合位点阻止了重要pms基因的表达，因而A^NXA^P的子代是细胞质雄性不育的。为在此实施方案中产生雄性可育性杂种，A^S亲本与B^R亲本杂交。此B^R亲本表达rmf基因，一种以核为靶的tet阻遏物。

tet抑制系统在植物中应被证实是特别有效的，因为已显示在转基因烟草中四环素阻遏物可抑制从含有3个tet抑制结合位点紧邻启动子TATA盒的花椰菜花叶病毒的转录。此抑制作用被四环素逆转成为数百倍的调节因子，(盖茨等，Plant J.，2：397-402，1992；盖茨和Guail，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：1394-1397，1988)。

上面描述的四环素阻遏物也可在本发明的“花粉饥饿”方法中用作nms基因产物。在此实施方案中，灭活多肽包含以质体为靶的tet阻遏物。pms基因位于相对于内在的5’和3’调节区的至少一种tet阻遏物结合位点，从而tet阻遏物的结合阻断pms基因的表达。如上所述，通过用编码另一种以核为靶的阻遏物，如lac阻遏物或一种不同的ret阻遏物的rmf基因转化B亲本系，雄性可育性在杂合子中被恢复。应指出以质体为靶的阻遏物和以核为靶的阻遏物可选自两种不同的阻遏物族，如上文所述(以质体为靶的lac阻遏物和以核为靶的tet阻遏物，或反过来)。本方法还可使用通过翻译融合于以质体为靶的序列或以核为靶的序列的相同阻遏物进行实践。然而，使用两种不同的阻遏物优选用于本发明的实践。

A.用于“花粉饥饿”方法的质体雄性不育性基因

在本发明的“花粉饥饿”方法中，一种重要的质体基因被经修饰变为不可激活的同源基因置换。经修饰的基因通过同源重组稳定地整合质体基因组中。用于本发明此项实施方案的重要质体基因包括：核糖体RNA操纵子，rps16核糖体蛋白基因，trnV基因和rpo B基因。因为在此情况下pms基因以活性形式被导入质体，pms基因必须还包含对于pms基因在质体中表达所需要的天然质体启动子和其它调节序列。

在优选的实施方案中，pms基因包含上文描述的lac抑制结合位点。该抑制位点位于相对于控制pms基因转录的天然质体启动子序列处，因而lac阻遏物的结合抑制重要基因的转录，从而导致质体失活或死亡。通过一种阻断以质体为靶的灭活多肽在核或细胞质中的合成的机制可恢复可育性。在本发明的此项实施方案中有用的其它抑制结合位点包括，但不限于，tet阻遏物结合位点，Lex A结合位点(Brent&Ptashue，Cell，43：729-736，1985)，和Gal 4结合位点。

B.用于“花粉饥饿”方法的核雄性不育性基因

在“花粉饥饿”方法中，nms基因编码阻止重要pms基因在质体中表达的以质体为靶的“灭活”多肽。灭活多肽可包含转录或翻译阻遏物，其众多实例在本领域中是公知的。在优选实施方案中，lac阻遏物蛋白由nms基因编码。该蛋白进入叶绿体并结合于lac阻遏物结合位点，以如此方式连接于pms基因，使抑制蛋白对结合位点的结合抑制pms基因的转录，从而引起质体死亡。

其它可用于本发明实践的转录阻遏物蛋白包括，但不限于，上文描述的tet阻遏物。也可使用包含来自一种多肽的DNA结合区和来自另一种多肽的阻物区的嵌合蛋白，如上文为激活物多肽所述。

C.用于“花粉饥饿”方法的雄性可育性基因恢复系

如上所述，rmf基因产物可阻止在nms基因表达和nms编码的多肽对pms基因的作用之间数点的任何一点上nms基因的作用。本发明的雄性可育性基因恢复系包含至少一种编码恢复系基因产物的编码区，可操作地连接于适当的5’和3’调节序列以供从核基因组的表达。需要包括在rmf基因中的调节序列取决于调节物多肽的作用位点，rmf基因被设计为在此位点进行阻断，如上所述。

如前所述，rmf基因产物的花药特异性不是绝对必须的，但在本发明实践中是优选的。相应地，rmf基因包含可操作地连接于花药特异性启动子的恢复多肽编码区，如上文为nms基因所描述的那些。

rmf基因也可包含其它调节信号。例如，植物核转录共有序列也可包括在构建物中，以及终止植物核基因转录和翻译的合适信号。

在“花粉饥饿”方法特别优选的实施方案中，rmf基因编码一种以核为靶的多肽，如一种转录阻遏物，它能够进入核并阻止nms基因表达。为实施本发明的此实施方案，nms基因应包含rmf编码的阻遏物的阻遏物结合位点。与此实施方案有关，应指出真核细胞核，包括植物细胞核，包括一套蛋白，这些蛋白在细胞质中合成开通过包含在那些蛋白中的信号序列的操纵转位至细胞核。这种使蛋白定位在核的定位信号在本领域中是公知的，见，如Hall等，Cell，36：1057-1065(1984)(描述通过得自酵母MAT alpha 2基因的核定位序列使细菌β-半乳糖苷酶定位至酵母核)。

在另一实施方案中，rmf基因编码阻止nms编码的调节物多肽前体进入质体的一种细胞质多肽。可用于此实施方案的蛋白包括，但不限于，对前体调节物多肽特异的免疫球蛋白或其片段，和能够特异地作用于前体调节物多肽并使之不能穿过质体膜的蛋白酶或其它蛋白修饰酶，或阻止nms编码的mRNA翻译的翻译终止子。

在妨碍nms基因表达的实施方案中，本领域技术人员会懂得rmf基因可编码一种能阻止nms基因或mRNA转录或翻译的RNA分子。这种mRNA可为能特异性地结合于nms基因或mRNA的关键区的反义寡核苷酸。另外，RNA分子可为能结合至nms编码的mRNA上的选定区从而剪切mRNA分子并阻止其翻译的核糖酶。

本发明的转基因CMS种子生产系统在构建物上类似于自然发生的和常规的基于CMS的系统。但是本发明的系统比那些系统具有显著的优越性，在于它们用在DNA序列水平完全确定的元件装配和使用质体而不是线粒体作为细胞质雄性不育性的基础。与线粒体和线粒体基因组相反，质体基因组已被很好地确定性质，而且质体的遗传学操纵方法比线粒体者发展得好很多。因而，本发明的基于质体的CMS系统基本没有与基于线粒体的CMS系统相联系的不可预测的有害特性，并可应用于任何可接受核或质体转化技术的作物。当这种转化技术继续扩展而包括新作物种类时，本发明的新CMS方法可应用于那些作物。因此，本发明的系统将使杂种种子生产更降低成本并能在作物中产生那些迄今尚无切实可行的杂种种子生产方法的杂种。这些作用包括美国的主要农艺学作物，包括小麦和棉花。

下述实施例为更详细地描述本发明而提供。这些实施例意在阐明而不限制本发明。

                    实施例1

        质体雄性不育性的花粉杀灭方法：

            Kpms质体雄性不育性基因

本发明的“花粉杀灭”方法用图显于图1。在“花粉杀灭”方法的优选实施方案中，质体“杀灭”基因(Kpms)从含有T7噬菌体基因10启动子和lac I操纵基因的被调节的T7/lac启动子表达，从而转录可被lac阻遏物阻断(Studier等，1990，上文；Dubendorf&Studier，1991，上文)。显示于图3的启动子序列从pET21d表达质体(Novagen)修饰而来。关于图3，PT7lac1具有未翻译的基因10前导序列，包括核糖体结合位点(RBS)。PT7lac2具有质体rbc L基因的前导序列和RBS。两种启动子以可比的效率被转录。但是具有基因10前导序列的mRNAs比含有rbc L前导序列的mRNAs的翻译效率高200倍。在“花粉杀灭”方法中低水平翻译是优选的，以阻止得自来自外来启动子的任何低水平转录的毒性基因产物的致死性积累。这种罕见转录本，如果被有效地翻译，将对非靶组织具有不利效应。

为稳定mRNA，将Kpms基因编码区连接至经修饰的T7基因10终止子(TT7)，或至终止子Trps 16 T7，它包含前后排列的质体rps16核糖体蛋白基因3’尾随序列和T7基因10终止子。

适合阻断质体功能的毒性基因在上面列于详细详述中。为在盒中方便的表达，Kpms基因应具有：(i)一个NcoI限制性位点，包括翻译起始密码子(ATG)和(ii)紧接在编码区下游的Xba I位点。然而，本领域中公知其它克隆策略也可应用。

为尽量减小来自外来启动子的新来的转录本的可能性，应将Kpms基因整合质体基因组的转录沉默区。最适位置在trnV和ORF 70B基因之间，指导杀灭基因向rps12/7操纵子方向的转录，如图4中标为“PC8”的插入载体所图示。质体转化体的转化和选择用常规方法进行(Svab和Maliga，1993，上文)。

                        实施例2

                质体雄性不育性的花粉杀灭方法

                    Knms核雄性不育性基因

质体雄性不育性的“花粉杀灭”方法依赖于Kpms质体基因在绒毡层细胞中的转录。该策略的成功取决于：(1)编码T7 RNA聚合酶的Knms基因表达的发育定时和组织特异性和(ii)被编码的多肽以质体为靶。

Knms基因的发育定时通过使用绒毡层特异性或微孢子特异性启动子获得。适合此目的的是TA29启动子，它在早期花药发育中被短暂地转录。TA29启动子已被用于通过表达嵌合核糖核酸酶获得绒毡层特异性基因表达和随后的雄性不育性(Mariani等，1990，上文)。其它适合表达核nms基因的已进行特征描述的花药特异性启动子可得自数种来源(见Goldberg等综述.，植物细胞，5：1217-1229，1993)。

关于图5，Knms基因中的T7 RNA聚合酶编码区经翻译与核编码的叶绿体蛋白的运送肽即RuBisCo的小亚单位(SSU)融合。当Knms基因在核中表达时，运送肽使蛋白以质体为靶。在进入质体前，运送肽从T7前蛋白(pre T7 RNAP)上被剪切以产生无任何附加氨基酸的T7RNA聚合酶(T7 RNAP)。编码SSU运送肽和T7蛋白融合结合部的DNA序列也显示于图5(上文)。在第2基因中的pre T7aRNAP(图5，下面的序列)在质体中被加工为T7aRNAP。T7aRNAP含有成熟SSU的5个氨基酸。在这两种基因中编码的蛋白就它们被送运进入的特性而言可以不同，并可用于获得以不同水平积累T7 RNA聚合酶的转基因植物。

表达T7 RNA聚合酶的植物不具有与众不同的表型。为易化携带Knms的植物的鉴定，将该基因连接至土壤杆菌属双元载体(例如pBI121载体质体(lonetech)中的可选择性卡那霉素抗性基因。替代地，将携带Knms基因的质体与携带可选择卡那霉素抗性基因的质体混合：如，质体pLGCneo 1103(Czernylowski等，DNA，5：101-103，1986)或质体pFF 19K(Timmermans等，1990，上文)。用混合的DNA进行Biolistic转化，随后进行卡那霉素抗性性选择，被用于在同一遗传学座位获得两种基因的同时整合。卡那霉素抗性性和T7聚合酶基因的共分离证实两种基因在相同遗传学座位被整合。

                        实施例3

            质体雄性不育性的花粉杀灭方法

                雄性可育性的Krmf核恢复系

质体雄性不育性是携带质体Kpms和核Knms基因两者的植物的表型。雄性可育性的恢复取决于第二种核基因Krmf的存在，该可育性恢复系优选用于“花粉杀灭”型质体雄性不育。Krmf通过阻断质体Kpms基因的表达施加其影响(图1)。这种调节通过Kpms基因启动子区介导。

图3中显示的PT7lac1和PT7lac2启动子可被调节：(i)正性地，通过以质体为靶的T7 RNA聚合酶(见上文)和(ii)负性地，通过lac阻遏物。雄性可育性的恢复取决于质体中存在的lac阻遏物浓度足以阻断Knms基因产物的表达。

Krmf基因在核雄性不育性基因Knms的表达之前或表达过程中表达对雄性不育的完全恢复是重要的。达到这一点最简单有效的方法是通过表达来自组成型的启动子的编码的lac阻遏物蛋白，如在构建物物PTS24中的花药盒包含的花椰菜花叶病毒35S启动子(Van der Meer等，Plant Cell，4：253-262，1992)。另外，转录可受在Knms基因表达前被激活的花药特异性基因的启动子指导。适合驱动核恢复系基因表达的已被描述特征的花药特异性启动子可从数种来源获得，如上文Goldberg等，1993，综述。另外，使用相同(TA29)启动子表达不育性诱导和可育性恢复两种转基因恢复核雄性不育也容易(玛拉尼等，1992)。

为使lac阻遏物以质体为靶，将它融合至RuBisCo小亚单位运送肽。基因设计，关键运送肽和lacI编码区融合的DNA和蛋白序列显示于图6，并且如上文关于Knms基因所讨论的。应指出图6的图解显示从一个组成型的组织非特异性启动子，P35S的表达(蒂莫曼等，1990，上文)。然而，对于花药特异性表达，应使用花药盒包含衍生物(如，PTS24，Van den Meer等，1992，上文)。

当被导入核基因组时，Krmf基因被连接在嵌合aacC1基因中编码的可选择性庆大霉素抗性标记(Carrer等，Plant Mol.Biol.17：301-303，1991)。转化的方法与Knms基因转化方法一致。连接于Krmf基因的庆大霉素抗性基因易于与连接于Knms的卡那霉素抗性基因区分，也易于与连接于质体Kpms基因的壮观霉素抗性基因区分。

                        实施例4

            质体雄性不育性花粉饥饿方法

                Spms质体雄性不育基因

由于需要完整细胞器以维持氨基酸和脂质生物合成，因此在质体中去除蛋白合成导致细胞死亡。因此，阻断质体维持所需的基因表达也可用于去除绒毡层细胞或小孢子。

“花粉饥饿”方法的质体雄性不育性基因(Spms)是从带有参入的lac阻遏物结合位点的嵌合质体启动子表达的内源性质体基因。这些在体细胞中的启动子通过质体RNA聚合酶转录。但是，质体基因在绒毡层细胞中的表达被lac阻遏物所阻止，此lac阻遏物被工程化为只在绒毡层，小孢子或其它花药细胞中表达。rRNA操纵子是“花粉饥饿”方法中优选的用于阻遏的靶。带有lac操纵序列的经修饰的rRNA操纵子启动子和trnV基因启动子显示于图7。这些启动子被用于通过同源重组置换同源的内源性基因启动子。为蛋白表达修饰的rRNA操纵子启动子衍生物显示于图8。两种启动子前导序列(核糖体结合位点)不同。两种启动子中，mRNAs带有基因10前导序列者更易于更有效地被翻译。

内源性基因启动子通过连接于可选择壮观霉素抗性(aadA)基因用Spms启动子置换(Maliga等，1993)。Spms基因在除绒毡层细胞外所有组织中被质体RNA聚合酶转录，在绒毡层细胞中从Snms基因产生以质体为靶的lac阻遏物。以质体为靶的lac阻遏物阻断从Spms启动子的转录，从而引起细胞死亡。

                    实施例5

        质体雄性不育的花粉饥饿方法

            Snms核雄性不育基因

如实施例4中所述，“花粉饥饿”方法中花粉雄性不育通过阻断内源性质体基因的转录而获得。缺乏转录是因为lac阻遏物在质体中积累，以及lac阻遏物结合于Spms基因的嵌合启动子中的lac操纵序列。lac阻遏物的组织特异性表达是通过使用花药特异性启动子获得的，如关于Knms基因所述(实施例2)。然而Snms启动子对四环素(tet)阻遏物敏感，因而Snms基因的表达可被编码以核为靶的tet阻遏物的Srmf基因抑制(见实施例6)。Snms基因被遗传学地连接于卡那霉素抗性标记，如关于Knms基因所述(实施例2)。

                    实施例6

            质体雄性不育性的花粉饥饿方法

                Srmf核雄性不育基因

雄性可育性的恢复需要恢复绒毡层细胞质体中Spms基因的正常活性。这一点可通过阻断核Snms基因的表达而最佳地获得。Snms基因从花粉特异性启动子表达，它也含有数拷贝的19bp pallindromic tet操纵基因。该系统的可育性恢复系基因，Srmf，编码以核为靶的tet阻遏物，下调Snms基因的表达500倍。此系统已由Gatz等描述，Plant，J.，2：397-404(1992)。Srmf基因连接于庆大霉素抗性基因从而它很容易区别于携带Spms基因(连接于壮观霉素抗性性)和Snms基因(连接于卡那霉素抗性性)的植物。

Claims (49)

1.一种产生细胞质雄性不育性植物的方法，所述方法包括：

a)提供一种亲本植物系；

b)通过用质体雄性不育性基因稳定转化所述亲本植物系细胞中的质体并从其再生质体转基因植物，从所述亲本植物系产生质体转基因亲本植物，所述质体雄性不育基因能被一种核编码的质体指导的调节物多肽调节，在花药组织中的所述调节引起活性花粉形成的破坏；

c)通过用核雄性不育性基因稳定转化所述亲本植物系细胞中的核并从其再生核转基因植物，从所述亲本植物系产生核转基因亲本植物，所述核雄性不育性基因包含可操作地连接于编码所述质体指导的调节物多肽的编码核苷酸序列的花药特异性5’调节核苷酸序列，该质体指导的调节物多肽能进入质体并调节所述质体雄性不育性基因；和

d)用所述核转基因植物与所述质体转基因植物杂交以产生一种植物，在此植物中所述质体指导的调节物多肽是花药特异地产生的，该多肽进入所述花药细胞的经转化质体并调节所述质体雄性不育性基因，所述调节引起活性花粉形成的破坏，从而产生所述细胞质雄性不育性植物。

2.按照权利要求1的方法，其中所述花药特异性5’调节核苷酸序列选自含绒毡层特异性启动子和小孢子特异性启动子。

3.按照权利要求1的方法，其中：

a)所述质体雄性不育性基因包含用于激活基因表达的靶核苷酸序列，可操作地与编码当其在花药细胞质体中表达时能破坏所述活性花粉形成的基因产物的编码核苷酸序列连接；和

b)所述核雄性不育性基因编码质体指导的激活物多肽，它进入质体并与所述靶核苷酸序列特异性地相互作用，所述相互作用引起所述质体雄性不育性基因的表达。

4.按照权利要求3的方法，其中所述质体雄性不育性基因编码RNA。

5.按照权利要求4的方法，其中所述RNA选自反义RNA和核糖酶。

6.按照权利要求3的方法，其中所述质体雄性不育性基因编码一种多肽。

7.按照权利要求6的方法，其中所述多肽选自DNA酶，RNA酶，蛋白水解酶重组酶和跨膜孔形成多肽。

8.按照权利要求3的方法，其中所述质体指导的激活物多肽包含转录激活物并且所述靶核苷酸序列包含所述转录激活物与之结合的调节区。

9.按照权利要求8的方法，其中所述转录激活物是一种聚合酶。

10.按照权利要求9的方法，其中所述聚合酶是T7RNA聚合酶并且所述靶核苷酸序列包含T7启动子。

11.按照权利要求8的方法，其中所述转录激活物是包含一个DNA结合域和一个激活物域的一种嵌合蛋白。

12.按照权利要求3的方法，其中所述质体指导的激活物多肽包含翻译激活物并且所述靶核苷酸序列包含所述翻译激活物与之结合的调节区。

13.按照权利要求1的方法，其中：

a)所述质体雄性不育性基因包含阻止基因表达的靶核苷酸序列，它可操作地连接于必需质体基因，所述质体雄性不育性是以质体基因组为靶的基因，从而在转化质体中必需质体植物基因的天然形式被所述质体雄性不育性基因置换，阻止在花药细胞质体中能破坏所述活性花粉形成的所述质体雄性不育性基因的表达；和

b)核雄性不育性基因编码质体指导的灭活多肽，该灭活多肽可进入质体并与所述靶核苷酸序列特异性地相互作用以阻止基因表达，所述相互作用阻止所述质体雄性不育性基因的表达。

14.按照权利要求13的方法，其中所述必需质体基因选自核糖体RNA操纵子，16S核糖体蛋白基因，trnV基因和rpoB基因。

15.按照权利要求13的方法，其中所述质体指导的失活物多肽包含转录阻遏物并且所述靶核苷酸序列包含所述转录阻遏物与之结合的调节区。

16.按照权利要求15的方法，其中所述转录阻遏物是lac阻遏物并且所述靶核苷酸序列包含至少一种lac阻遏物结合位点。

17.按照权利要求1 3的方法，其中所述灭活多肽是包含DNA结合域和阻遏物域的嵌合蛋白。

18.按照权利要求13的方法，其中所述质体指导的灭活多肽包含翻译阻遏物并且所述靶核苷酸序列包含所述翻译阻遏物与之结合的调节区。

19.从两种亲本植物系产生雄性可育性杂种种子的方法，其中一种包含细胞质雄性不育性植物，所述方法包含：

a)从第一亲本植物系产生细胞质雄性不育性植物，通过：

i)通过用质体雄性不育性基因稳定转化在所述亲本植物系细胞中的质体并从其再生质体转基因植物，从所述亲本植物系产生质体转基因亲本植物，所述质体雄性不育性基因能被核编码的质体指导的调节物多肽调节，在花药组织中的所述调节引起活性花粉形成的破坏；

ii)通过用核雄性不育性基因稳定地转化所述亲本植物系细胞中的核并从其再生核转基因植物，从所述亲本植物系产生核转基因亲本植物，所述核雄性不育性基因包含可操作地连接于编码所述质体指导的调节物多肽的编码核苷酸序列的花药特异性5’调节核苷酸序列，所述调节物多肽能进入质体并调节所述质体雄性不育性基因；和

iii)用所述质体转基因植物与所述核转基因植物杂交以产生一株植物，在此植物中所述质体指导的调节物多肽是花药特异性地产生的，进入花药细胞的所述转化质体并调节所述质体雄性不育性基因，所述调节引起活性花粉形成的破坏，从而产生所述细胞质雄性不育性植物；

b)通过用雄性可育性基因的恢复系稳定转化所述第二亲本植物细胞中的核并从其再生一株植物而生产第二亲本植物系的雄性可育性恢复系植物，所述雄性可育性基因的恢复系编码一种恢复系基因产物，该产物能够阻止所述质体雄性不育性基因受所述以质体为靶的调节物多肽的调节，从而使活性花粉能够形成；和

c)用所述细胞质雄性不育性植物与所述雄性可育性恢复系植物杂交以从所述两种亲本植物系产生雄性可育性杂种种子。

20.按照权利要求19的方法，其中：

a)所述质体雄性不育性基因包含具有供激活基因表达的位点和供阻止基因表达的位点的靶核苷酸序列，所述供阻止基因表达的位点处于相关于所述供激活基因表达的位点的控制位置，所述靶核苷酸序列可操作地连接于一种编码核苷酸序列，此编码核苷酸序列编码一种当在花药细胞质体中表达时能破坏所述活性花粉形成的基因产物；

b)所述核雄性不育性基因编码一种进入质体并特异性地与供激活基因表达的所述位点相互作用的质体指导的激活物多肽，所述相互作用引起所述质体雄性不育性基因的表达；和

c)所述雄性可育性基因的恢复系编码一种进入质体并特异性地与供阻止基因表达的所述位点相互作用的质体指导的恢复系多肽，所述相互作用阻止所述质体雄性不育性基因的表达。

21.按照权利要求20的方法，其中所述质体指导的激活物多肽包含一种转录激活物并且所述供基因表达的激活的位点包含一种所述转录激活物与之结合的调节区。

22.按照权利要求21的方法，其中所述转录激活物是T7 RNA聚合酶并且所述供激活基因表达的位点包含T7启动子。

23.按照权利要求20的方法，其中所述质体指导的恢复系多肽包含转录阻遏物并且所述供阻止基因表达的位点包含转录阻遏物所与之结合的调节区。

24.按照权利要求23的方法，其中所述转录阻遏物是lac阻遏物并且所述供阻止基因表达的位点包含至少一种lac阻遏物结合位点。

25.按照权利要求19的方法，其中：

a)所述质体雄性不育性基因包含供阻止基因表达的第一靶核苷酸序列，可操作地连接于必需质体基因，所述质体雄性不育性基因以质体基因组为靶，从而转化质体中所述必需质体基因的天然形式被所述质体雄性不育性基因置换，阻止所述质体雄性不育性基因在花药细胞质体中的表达能够破坏所述活性花粉的形成；

b)所述核雄性不育性基因包含供阻止基因表达的第二靶核苷酸序列，可操作地连接于编码进入质体并与所述供阻止基因表达的第一靶核苷酸序列相互作用的质体指导的失活物多肽编码核苷酸序列，所述相互作用阻止所述质体雄性不育性基因的表达；和

c)所述雄性可育性基因恢复系编码一种进入核并与所述供阻止基因表达的第二靶核苷酸序列特异性地相互作用的核指导的恢复系多肽，所述相互作用阻止所述核雄性不育性基因的表达。

26.按照权利要求25的方法，其中所述质体指导的失活物多肽包含转录阻遏物并且所述第一靶核苷酸序列包含所述转录阻遏物结合的调节区。

27.按照权利要求26的方法，其中所述质体指导的转录阻遏物是lac阻遏物并且所述第一靶核苷酸序列包含至少一种lac阻遏物结合位点。

28.按照权利要求26的方法，其中所述质体指导的转录阻遏物是tet阻遏物并且所述第一靶核苷酸序列包含至少一种tet阻遏物结合位点。

29.按照权利要求25的方法，其中所述核指导的恢复系多肽包含转录阻遏物并且所述第二靶核苷酸序列包含所述转录阻遏物结合的调节区。

30.按照权利要求29的方法，其中所述转录阻遏物是tet阻遏物并且所述第二靶核苷酸序列包含至少一种tet阻遏物结合位点。

31.按照权利要求29的方法，其中所述转录阻遏物是lac阻遏物并且所述第二靶核苷酸序列包含至少一种lac阻遏物结合位点。

32.一种具有包括稳定整合的质体雄性不育性基因的质体基因组的植物，这种质体雄性不育性基因能受核编码的质体指导的调节物多肽调节，在花药组织中的所述调节引起活性花粉形成的破坏。

33.按照权利要求32中要求的植物，其中所述质体雄性不育性基因包含具有供激活基因表达的位点和供阻止基因表达的位点的靶核苷酸序列，所述供阻止基因表达的位点位于相关于所述供激活基因表达的位点的控制位置，所述靶核苷酸序列可操作地连接于编码一种基因产物的编码核苷酸序列，该基因产物在花药细胞质体中表达时能破坏活性花粉的形成。

34.按照权利要求33中要求的植物，其中所述靶核苷酸序列包含供激活基因表达的T7启动子和至少一种供阻止基因表达的lac阻遏物。

35.按照权利要求32中要求的植物，其中所述雄性不育性基因包含供阻止基因表达的靶核苷酸序列，可操作地连接于必需质体基因，所述质体雄性不育性基因以质体基因组为靶，从而使所述转化质体中所述必需质体基因的天然形式被所述质体雄性不育性基因置换，阻止在花药细胞质体中所述质体植物雄性不育性基因的表达能破坏所述活性花粉的形成。

36.按照权利要求35中要求的植物，其中所述靶核苷酸序列包含至少一种lac阻遏物结合位点。

37.一种具有包括稳定整合的核雄性不育性基因的核基因组的植物，该核雄性不育性基因包含具有可操作地连接于一种编码能够进入质体并调节质体雄性不育性基因的质体指导的调节因子多肽的，核苷酸序列的花药特异性5’调节区的核苷酸序列，所述调节导致活性花粉形成的破坏。

38.按照权利要求37中要求的植物，其中所述核雄性不育性基因编码进入质体并与包含供激活基因表达的靶核苷酸序列的质体雄性不育性基因特异性地相互作用的质体指导的激活物多肽，所述相互作用引起所述质体雄性不育性基因的表达，所述表达导致活性花粉形成的破坏。

39.按照权利要求38中要求的植物，其中所述激活物多肽是T7RNA聚合酶。

40.按照权利要求37中要求的植物，其中所述核雄性不育性基因进一步包含供阻止基因表达的靶核苷酸序列，可操作地连接于编码质体指导的失活物多肽的核苷酸序列，该失活物多肽进入质体并特异性地与包含供阻止基因表达的另一靶核苷酸序列的质体雄性不育性基因相互作用，所述相互作用阻止所述质体雄性不育性基因的表达，所述表达的阻止导致活性花粉形成的破坏。

41.按照权利要求40中要求的植物，其中所述失活物多肽是lac阻遏物。

42.一种具有包含稳定整合的雄性可育性基因恢复系的核基因组的植物，该雄性可育性基因编码一种恢复系基因产物，该产物能够阻止可调节质体雄性不育性基因受核编码的质体指导的调节因子多肽的调节。

43.按照权利要求42中要求的植物，其中所述雄性可育性基因的恢复系编码进入质体并与阻止基因表达的位点特异性相互作用的质体指导的恢复系多肽，可操作地置于质体雄性不育性基因中，所述相互作用阻止所述质体雄性不育性基因的表达。

44.按照权利要求43中要求的植物，其中所述恢复系多肽选自lac阻遏物和tet阻遏物。

45.按照权利要求42中要求的植物，其中所述雄性可育性基因恢复系编码一种进入核并与供阻止基因表达的靶核苷酸序列特异性地相互作用的核指导的恢复系多肽，可操作地置于核雄性不育性基因中，所述相互作用阻止所述核雄性不育性基因的表达。

46.按照权利要求45中要求的植物，其中所述恢复系多肽选自tet阻遏物和lac阻遏物。

47.一种具有包含稳定整合的质体雄性不育性基因的质体基因组的细胞质雄性不育性植物，该质体雄性不育性基因能被核编码的质体指导的调节因子多肽调节，并具有包含稳定整合的核雄性不育性基因的核基因组，该基因组包含具有与编码质体指导调节物多肽的核苷酸序列可操作地相连的花药特异性5’调节区的核苷酸序列，所述调节物多肽能够进入质体，且调节多肽雄性不育性基因，所述调节导致活性花粉形成的破坏。

48.一种细胞质雄性不育性植物，通过下列方法产生，它包含

a)提供一种亲本植物系；

b)通过用质体雄性不育性基因稳定转化所述亲本植物系细胞中的质体并从其再生一株质体转基因植物，从所述亲本植物系生产质体转基因亲本植物，所述质体雄性不育性基因能被核编码的质体指导的调节因子多肽调节，在花药组织中的所述调节引起活性花粉形成的破坏；

c)通过用核雄性不育性基因稳定转化所述亲本植物系细胞中的核并从其再生一株核转基因植物，从所述亲本植物系生产核转基因亲本植物，所述核雄性不育性基因包含可操作地连接于编码所述质体指导的调节因子多肽的编码核苷酸序列的花药特异性5’调节核苷酸序列，该质体指导的调节因子多肽能进入质体并调节所述质体雄性不育性基因；和

d)用所述核转基因植物与所述质体转基因植物杂交以产生一株植物，在该植物中所述质体指导的调节物多肽被花药特异性地产生，进入花药细胞的所述转化质体并调节所述质体雄性不育性基因，所述调节引起活性花粉形成的破坏。

49.从两种亲本植物系产生的雄性可育性杂种种子，其中一种包含细胞质雄性不育性植物，使用的方法中包含：

a)从第一亲本植物系产生细胞质雄性不育性植物，通过：

i)通过用质体雄性不育性基因稳定转化所述亲本植物系细胞中的质体并从其再生质体转基因植物，而从所述亲本植物系产生质体转基因亲本植物，所述质体雄性不育性基因能被核编码的质体指导的调节因子多肽调节，在花药组织中的所述调节引起活性花粉形成的破坏；

ii)通过用核雄性不育性基因稳定转化所述亲本植物系细胞中的核并从其再生核转基因植物而从所述亲本植物系生产核转基因植物，所述核雄性不育性基因包含可操作地连接于编码所述质体指导的调节因子多肽的编码核苷酸序列的花药特异性5’调节核苷酸序列，该调节因子多肽能进入质体并调节所述质体雄性不育性基因，和

iii)用所述核转基因植物与所述质体转基因植物杂交以产生一株植物，在该植物中所述质体指导的调节因子多肽被花药特异性地产生，进入花药细胞的所述转化质体并调节所述质体雄性不育性基因，所述调节引起活性花粉形成的破坏，从而产生所述细胞质雄性不育性植物；

b)通过用雄性可育性基因的恢复系稳定转化所述第二亲本植物系细胞中的核产生第二亲本植物系的雄性可育性恢复系植物，其中所述雄性可育性基因编码一种能阻止所述质体雄性不育性基因被所述以质体为靶的调节物多肽调节的恢复系基因产物，从而使活性花粉不能形成，并从所述稳定核转化细胞再生一株植物；和

c)用所述雄性可育性恢复系植物与所述细胞质雄性不育性植物杂交以从所述两种亲本植物系产生雄性可育性杂种种子。

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