CN114886849B - 一种蒙花苷脂质体纳米胶束及其制备方法、滴眼液 - Google Patents

一种蒙花苷脂质体纳米胶束及其制备方法、滴眼液 Download PDF

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Abstract

本发明属于药物技术领域，具体涉及一种蒙花苷脂质体纳米胶束及其制备方法、滴眼液。本发明提供的蒙花苷脂质体纳米胶束，以蒙花苷、磷脂酰胆碱、透明质酸‑二硬脂酰磷脂酰乙醇胺复合物、阳离子脂质DOTAP、胆固醇为原料采用水合、挤压、纯化工艺制备得到；以质量份数计，每1份蒙花苷对应其他原料的质量份数分别为：磷脂酰胆碱10～50份、透明质酸‑二硬脂酰磷脂酰乙醇胺复合物10～50份、阳离子脂质DOTAP 10～15份、胆固醇5～10份。本发明采用上述组分协同作用，能够提高脂质体的生物利用度和靶向性，有效延长药物半衰期，改善药物对眼部的抗炎作用。

Description

一种蒙花苷脂质体纳米胶束及其制备方法、滴眼液
技术领域
本发明属于药物技术领域，具体涉及一种蒙花苷脂质体纳米胶束及其制备方法、滴眼液。
背景技术
目前市场上较为成熟的抗炎眼药水主要有两种，一种含有地塞米松等肾上腺皮质激素；另一种含有非甾体抗炎药，如溴芬酸、双氯芬酸、普洛芬。前者为激素类药物，长期使用眼激素对人体存在一定危害，如导致眼压升高、青光眼、视神经损伤、视力下降、视野缺损、后囊膜白内障形成等。同样地，非甾体抗炎药也存在副作用，如导致角膜溃疡、角膜穿孔等。因此，开发更为安全、有效的天然植物性抗炎滴眼液迫在眉睫。
蒙花苷(acacetin-7-O-β-D-rutinoside)是一种天然黄酮类化合物，主要存在于菊花、茱萸、银耳和薄荷中，具有抗菌、抗炎、镇静、解热、抗过敏、抑制磷酸二酯酶和醛糖还原酶等多种生理药理作用。蒙花苷通过抑制炎症介质NO、炎症细胞因子TNF-α、IL-1和IL-63的分泌，通过磷酸化erK1/2、JNK、P38、IκBα和P65蛋白抑制MAPK和NF-κB信号通路而发挥抗炎作用。
基于蒙花苷的安全性和抗炎作用，可考虑将其用于滴眼液的制备。但是，蒙花苷在水和油中的溶解性都很差，这严重妨碍了它在溶液型滴眼液中的使用。近年来，脂质体作为一种功能性成分药物载体，已成功用于治疗眼病的天然植物性药物传递。针对蒙花苷及其脂质体在滴眼液中的应用，现有技术中，申请公布号为CN110251465A的发明专利申请公开了一种纳米脂质体组合物及滴眼剂，其采用15-30份的胆固醇、70-85份的卵磷脂作为包材，将蒙花苷有效负载于纳米脂质体上，从而提高了蒙花苷的溶解度和稳定性。然而，上述现有技术中提供的蒙花苷纳米脂质体组合物，采用的是磷脂酰胆碱和胆固醇为膜材，属于普通的脂质体，没有进行修饰，虽然可以提高蒙花苷的溶解度和稳定性，但是没有主动靶向性，并且半衰期短，抗炎作用较弱，仅能够使蒙花苷活性成分的体外释放时间延长至8h，生物利用度低，无法满足更长时间的眼部抗炎作用。
因此，在保证脂质体安全性、稳定性、有效性的基础上，如何构建一种具有主动靶向性、半衰期长、抗炎效果好，能够维持较长时间有效药物浓度的纳米脂质体体系，成为亟待解决的技术问题。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的之一在于提供一种蒙花苷脂质体纳米胶束，其具有主动靶向性，且能够进一步提高生物利用度，延长药物半衰期，提高药物与眼黏膜的粘附，改善体内抗炎作用。
本发明的目的还在于提供一种蒙花苷脂质体纳米胶束的制备方法，其能够制备得到长期稳定性良好、持续释放时间较长的脂质体纳米胶束。
本发明的目的还在于提供一种滴眼液，其持续释放时间长、体内抗炎作用时间持久，使得用药次数更少，病人顺应性好，具有良好的临床应用前景。
本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
一种蒙花苷脂质体纳米胶束，以蒙花苷、磷脂酰胆碱、透明质酸-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺复合物、阳离子脂质DOTAP、胆固醇为原料采用水合、挤压、纯化工艺制备得到；其中，以质量份数计，每1份蒙花苷对应其他原料的质量份数分别为：磷脂酰胆碱10～50份、透明质酸-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺复合物10～50份、阳离子脂质DOTAP 10～15份、胆固醇5～10份。
本发明的蒙花苷脂质体纳米胶束，在以蒙花苷、磷脂酰胆碱、胆固醇为原料的基础上，还额外添加有特定用量的透明质酸-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺复合物和阳离子脂质DOTAP。本发明研究发现，采用透明质酸共价修饰二硬脂酰磷脂酰乙醇胺制备脂质体，相较于其他修饰手段更能有效靶向于眼巨噬细胞受体，有利于维持更长释放时间下药物的抗炎作用。同时，在添加透明质酸-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺复合物的基础上，进一步引入阳离子脂质DOTAP(溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵)，使脂质体带正电，其能够与透明质酸-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺复合物有效配合、协同作用，从而更容易粘附带负电的粘蛋白，显著提高脂质体与粘膜的亲和力，明显地延长药物与黏膜作用的时间，延长药物半衰期，改善体内抗炎作用。
因此，本发明的脂质体采用磷脂酰胆碱、透明质酸-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺复合物、阳离子脂质DOTAP、胆固醇作为膜材，具有更好的靶向性，生物利用度更高，效果更显著持久。
蒙花苷脂质体纳米胶束各原料组分的用量不同，整个胶束体系的稳定性、粒径、流动性、包封率均会发生改变。基于上述基本属性的要求，各原料组分的用量可在上述范围内进行调整。进一步优选地，基于最大幅度保证药物释放时间和抗炎效果的考虑，可采用以下典型配比，以质量份数计，每1份蒙花苷对应其他原料的质量份数分别为：磷脂酰胆碱50份、透明质酸-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺复合物30份、阳离子脂质DOTAP 10份、胆固醇10份。
蒙花苷脂质体纳米胶束在应用时，适当的粒径和较小的粒径范围是确保高度稳定性、足够的生物利用度和良好的眼组织相容性的关键因素。基于纳米胶束稳定性和后续使用效果的考虑，优选地，蒙花苷脂质体纳米胶束的粒径为130～230nm。
为了改善药物靶向性，提高抗炎作用，进一步地，所述透明质酸的分子量为50～300kDa，更优选地，所述透明质酸的分子量为50～100kDa。
透明质酸与二硬脂酰磷脂酰乙醇胺通过共价键结合形成复合物，合成过程采用现有的制备工艺即可。优选地，透明质酸-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺复合物在制备时，是以透明质酸(HA)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-氨基(DSPE-NH2)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)为原料，进行室温反应、透析、冷冻干燥得到。
本发明的蒙花苷脂质体纳米胶束的制备方法，所采用的的技术方案是：
一种蒙花苷脂质体纳米胶束的制备方法，包括以下步骤：
1)将蒙花苷、磷脂酰胆碱、透明质酸-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺复合物、阳离子脂质DOTAP、胆固醇按配比溶解于有机溶剂中，形成共混液；
2)去除共混液中的有机溶剂以形成复合薄膜；
3)将复合薄膜重新分散到PBS溶液中进行超声水合得到脂质体，然后将脂质体挤压纯化得到蒙花苷脂质体纳米胶束。
本发明的蒙花苷脂质体纳米胶束的制备方法，制备工艺简单，方便实现大规模工业化生产，同时，通过水合、挤压工艺，能够制备得到具有靶向性，并且长期稳定性良好、持续释放时间较长的脂质体纳米胶束。
步骤1)中，采用的有机溶剂只需保证各个原料的溶解即可。优选地，所述有机溶剂为无水乙醇。
为保证复合薄膜的形成质量，去除有机溶剂的过程采用真空旋转蒸发形式进行，蒸发的温度为45～55℃。
为提高超声水合过程所得脂质体的均匀性和稳定性，优选地，步骤3)中，超声水合的工艺为：在100～300W超声功率下声波振动1～5s，然后暂停1～5s，循环10～50次。更优选地，超声水合工艺为：在200W功率下声波振动3s，然后暂停4s，循环30次。
基于提高挤压工作效率并保证脂质体挤压效果的目的，步骤3)中，挤压的工艺为：将脂质体经50～200nm碳酸盐膜挤压10～50次；更优选地，是将脂质体经100nm碳酸盐膜挤压20次。
进一步地，步骤3)中，脂质体纯化是采用交联葡萄糖凝胶Sephadex G50进行纯化。
本发明的滴眼液，所采用的技术方案是：
一种滴眼液，采用上述蒙花苷脂质体纳米胶束制备得到。
利用蒙花苷脂质体纳米胶束制备滴眼液，可采用本领域常规的滴眼液操作步骤。具体地，可将纯化后的纳米胶束分散于PBS中，加入氯化钠调节渗透压，然后采用过滤器过滤即可。
本发明的滴眼液，安全性高，载药性好，同时对眼部巨噬细胞具有主动靶向性，生物利用度高、药物半衰期长，体内抗炎作用时间持久，使得用药次数减少，病人顺应性更好，具有良好的临床应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例1的蒙花苷脂质体纳米胶束的电镜图；
图2为本发明实施例1的蒙花苷脂质体纳米胶束的外观图；
图3为本发明实施例1和对照组脂质体的体外释放效果图；
图4为本发明中不同实验组滴眼液作用于家兔后的抗炎效果图；其中A：0.05％透明质酸空白脂质体，B：0.1％妥布霉素地塞米松滴眼液，C：实施例7对应的蒙花苷脂质体滴眼液；D：蒙花苷溶液；
图5为本发明中不同实验组的体内抗炎作用评分。
具体实施方式
下面结合附图以及具体实施方式对本发明做进一步描述，但不构成对本发明的任何限制。以下实施例和试验例中，所采用的原材料，如无特别说明，均可由常规市售渠道获得。其中，交联葡萄糖凝胶Sephadex G50购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；蒙花苷购自上海麦克林生化科技有限公司；阳离子脂质DOTAP购自西安瑞禧生物科技有限公司。
以下实施例所涉及的透明质酸-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺复合物在制备时，是以透明质酸(HA)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-氨基(DSPE-NH2)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)为原料，进行室温反应、透析、冷冻干燥得到。具体制备过程如下：称取100mgHA(50kDa)溶于10mL甲酰胺中，然后加入DSPE-NH2(1.1eq.)、EDC(1.5eq.)、NHS(2.0eq.)溶解完全，于室温反应12h；反应后将反应液转移至透析袋(截留分子量3500Da)，于纯水中透析24h，最后收集透析液冷冻干燥即得产物。
一、本发明的蒙花苷脂质体纳米胶束的实施例
实施例1
本实施例的蒙花苷脂质体纳米胶束，以蒙花苷、磷脂酰胆碱、透明质酸-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺复合物、阳离子脂质DOTAP、胆固醇为原料采用水合、挤压、纯化工艺制备得到；
其中，以质量份数计，每1份蒙花苷对应其他原料的质量份数分别为：磷脂酰胆碱50份、透明质酸-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺复合物30份、阳离子脂质DOTAP 10份、胆固醇10份。
实施例2
本实施例的蒙花苷脂质体纳米胶束，以蒙花苷、磷脂酰胆碱、透明质酸-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺复合物、阳离子脂质DOTAP、胆固醇为原料采用水合、挤压、纯化工艺制备得到；
其中，以质量份数计，每1份蒙花苷对应其他原料的质量份数分别为：磷脂酰胆碱40份、透明质酸-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺复合物40份、阳离子脂质DOTAP 15份、胆固醇5份。
实施例3
本实施例的蒙花苷脂质体纳米胶束，以蒙花苷、磷脂酰胆碱、透明质酸-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺复合物、阳离子脂质DOTAP、胆固醇为原料采用水合、挤压、纯化工艺制备得到；
其中，以质量份数计，每1份蒙花苷对应其他原料的质量份数分别为：磷脂酰胆碱30份、透明质酸-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺复合物50份、阳离子脂质DOTAP 15份、胆固醇5份。二、本发明的蒙花苷脂质体纳米胶束的制备方法的实施例
实施例4
本实施例的蒙花苷脂质体纳米胶束的制备方法，对实施例1的蒙花苷脂质体纳米胶束的制备进行说明，包括如下步骤：
1)按照实施例1记载的原料配比，将蒙花苷、磷脂酰胆碱、透明质酸-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺复合物、阳离子脂质DOTAP、胆固醇按配比溶解于无水乙醇中，形成共混液；
2)50℃条件下，真空旋转蒸发去除共混液中的有机溶剂以形成复合薄膜；
3)加入PBS，在50℃旋转至复合薄膜完全分散到PBS溶液中，然后再在200W功率下声波振动3s，然后暂停4s，循环30次得到脂质体，然后将脂质体经100nm碳酸盐膜挤压20次后，用交联葡萄糖凝胶Sephadex G50进行纯化得到蒙花苷脂质体纳米胶束。
实施例5
本实施例的蒙花苷脂质体纳米胶束的制备方法，对实施例2的蒙花苷脂质体纳米胶束的制备进行说明，包括如下步骤：
1)按照实施例2记载的原料配比，将蒙花苷、磷脂酰胆碱、透明质酸-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺复合物、阳离子脂质DOTAP、胆固醇按配比溶解于无水乙醇中，形成共混液；
2)50℃条件下，真空旋转蒸发去除共混液中的有机溶剂以形成复合薄膜；
3)加入PBS，在50℃旋转至复合薄膜完全分散到PBS溶液中，然后再在300W功率下声波振动1s，然后暂停5s，循环10次得到脂质体，然后将脂质体经100nm碳酸盐膜挤压50次后，用交联葡萄糖凝胶Sephadex G50进行纯化得到蒙花苷脂质体纳米胶束。
实施例6
本实施例的蒙花苷脂质体纳米胶束的制备方法，对实施例3的蒙花苷脂质体纳米胶束的制备进行说明，包括如下步骤：
1)按照实施例3记载的原料配比，将蒙花苷、磷脂酰胆碱、透明质酸-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺复合物、阳离子脂质DOTAP、胆固醇按配比溶解于无水乙醇中，形成共混液；
2)50℃条件下，真空旋转蒸发去除共混液中的有机溶剂以形成复合薄膜；
3)加入PBS，在50℃旋转至复合薄膜完全分散到PBS溶液中，然后再在100W功率下声波振动5s，然后暂停4s，循环50次得到脂质体，然后将脂质体经100nm碳酸盐膜挤压10次后，用交联葡萄糖凝胶Sephadex G50进行纯化得到蒙花苷脂质体纳米胶束。
三、本发明的滴眼液的实施例
实施例7～9
实施例7～9的滴眼液，分别采用实施例1～3的蒙花苷脂质体纳米胶束的的原料组成、实施例4～6的制备方法制备得到。滴眼液的具体制备过程为：将实施例纯化的蒙花苷脂质体纳米胶束分散于pH7.2的PBS中，然后加入氯化钠调节滴眼液渗透压至308mOsm/kg，再采用0.22μm注射过滤器(Thermo Fisher Scientific)过滤。其中，pH值和渗透性分别用pH计(KEDIDA pH实验室，CT-6020，中国)和渗透性计(AdvancedOsmoTECH PRO，美国)进行测试。
四、对比例
对比例1
本对比例的蒙花苷脂质体纳米胶束，原料同实施例1，制备过程同实施例4，区别仅在于：制备原料中同时省去透明质酸-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺复合物和阳离子脂质DOTAP，同时将磷脂酰胆碱的用量调整至80份，将胆固醇的用量调整至20份。
对比例2
本对比例的蒙花苷脂质体纳米胶束，原料同实施例1，制备过程同实施例4，区别仅在于：制备原料中仅省去透明质酸-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺复合物，同时将磷脂酰胆碱的用量调整至80份。
对比例3
本对比例的蒙花苷脂质体纳米胶束，原料同实施例1，制备过程同实施例4，区别仅在于：制备原料中仅省去阳离子脂质DOTAP，同时将胆固醇的用量调整至20份。
对比例4
本对比例的蒙花苷脂质体纳米胶束，原料同实施例1，制备过程同实施例4，区别仅在于：采用阳离子脂质DOTMA(氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基铵)代替原料阳离子脂质DOTAP。
对比例5
本对比例的蒙花苷脂质体纳米胶束，原料同实施例1，制备过程同实施例4，区别仅在于：采用聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-酸复合物(DSPE-PEG2000-FA)代替原料透明质酸-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺复合物。DSPE-PEG2000-FA的制备过程参见专利申请CN113116819A。
五、实验例
实验例1
脂质体物理化学性质测试：脂质体的电荷、粒径、物理形态、包封率都是稳定性的指标。
其中，采用动态光散射(Nano-ZS90激光纳米颗粒粒径分析仪，Malvern,UK)测定实施1～3和对比例1～5的平均粒径、分散性指数(PDI)和Zeta电位。然后采用透射电镜(HT7700,120kV，日立高科技公司，日本)观察实施例1脂质体的形貌。
包封率测试过程如下：采用破乳法测定脂质体中药物的浓度，首先加入一定量的甲醇，超声溶解30min，采用高效液相色谱法测定脂质体中总药物浓度。高效液相色谱仪的型号为waters e2695，色谱柱为Waters Symmetry C18色谱柱(4.6mm×200mm,5μm)。流动相为乙腈-0.1％磷酸水溶液(V:V＝30:70)，柱温30℃。紫外检测波长为326nm，流速1.0mL/min。进样量为20μL。包封率(EE)％的计算公式如下：EE(％)＝(包裹在脂质体中的药物量/药物的总量)×100％。测试结果见表1和图1、图2所示。
表1脂质体纳米胶束的稳定性测试结果
Figure BDA0003656265260000071
由表1可知，透明质酸-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺复合物、阳离子脂质DOTAP的添加对脂质体的粒径和包封率均有较为明显的影响。实施例1～3中随着透明质酸-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺复合物添加量的提高，会导致脂质体的膜流动性降低，从而使得脂质体粒径增大，进而影响脂质体的物理稳定性和包封率。因此为了获得良好的巨噬细胞靶向作用和较好的包封率，应该严格控制各原料的配比。进一步由对比例1～5记载可知，改变脂质体配方后，同样对脂质体粒径和包封率有一定影响。此外，由图1、2可知，本发明提供的脂质体纳米胶束，外观澄清均一、形貌规整、分布均匀。
实验例2
稳定性测试：将实施例1的脂质体纳米胶束在室温下分散于pH7.2的PBS中，进行加速稳定性试验(40℃，75％湿度)4周。每周末测定颗粒大小和包封效率。结果如表2所示。
表2脂质体纳米胶束稳定性测试结果
Figure BDA0003656265260000081
由表2可知，本发明的脂质体纳米胶束在40℃、75％湿度保存28天后，其粒径、包封率变化均小于10％，颗粒尺寸增加小于10％，表明该纳米胶束具有良好的长期稳定性。
实验例3
脂质体的体外释放实验：有效的滴眼液应迅速在眼内起作用，同时保持有效的药物浓度，不需要频繁给药。因此，相关药物应迅速在眼内释放，以达到有效浓度，并在给药期间继续释放，才能达到较好的使用效果。本发明的体外药物释放是在一个模拟的体内环境中进行的。具体是采用动态透析法考察30μg/mL的实施例1的蒙花苷脂质体纳米胶束和蒙花苷混悬液的体外释放。将蒙花苷脂质体和蒙花苷混悬液同时放置在预活化透析袋中，分子量截留值为1000Da。将透析袋分别浸泡在装有60mL人工泪液、pH的7.2PBS或超纯水(加入1％tween80以达到漏槽条件)的烧杯中，在37℃水浴中连续摇晃透析袋。激振器的转速为100转/分。在预定的时间间隔内，取出1.0mL释放液，用相同体积的预热新鲜释放液替换，以保持漏槽状态，计算药物累积释放率。释放结果请参见图3。
由图3可知，由于溶解性差，在蒙花苷悬浮液的释放介质中，在任何时间点均未检测到药物浓度。而本发明实施例1的蒙花苷脂质体纳米胶束药物在前4小时迅速从脂质体中释放，大约50％的药物被释放。在接下来的8个小时里，药物缓慢释放。初速释放可用于药物的快速作用，而连续释放可提供较长时间的有效药物浓度，持续释放时间长达12小时。可见，本发明的蒙花苷脂质体有助于药物的溶解和释放。此外，人工泪液中脂质体的累积释放量小于超纯水，这是由于人工泪液渗透压的增加可能会减缓脂质体中蒙花苷的扩散。
实验例4
角膜前泪液的药代动力学实验：抗炎滴眼液的主要部位是前角膜。角膜前停留时间越长，药物的作用越有利于发挥。泪液分泌对药物的稀释和冲刷作用，因此研究角膜前的药代动力学对抗炎滴眼液的质量控制具有重要意义。根据Schirmer试验，每组5只兔右眼分别加入50μL的实施例1的脂质体(18μg/mL)，左眼加入50μL的蒙花苷溶液(18μg/mL)作为对照。事先准确称取滤纸(5mm长，2mm宽)，于治疗后5min、10min、20min、30min、1小时、2小时、3小时、4小时、8小时插入结膜囊，静置1分钟后立即准确称取。滤纸上加入500μL甲醇，搅拌1min、然后于6000rpm条件下离心，HPLC测定各时间点角膜前泪液中蒙花苷脂质体和蒙花苷溶液的药物浓度，计算药代动力学参数。结果见表3所示。
表3脂质体在角膜前泪液中的药代动力学参数
Figure BDA0003656265260000091
由表3结果可知，体外释放实验结果表明，本发明蒙花苷脂质体的t1/2时间为14.23±0.45min，明显长于蒙花苷溶液(7.76±0.69min)和对比例1～5(8.71±0.23、9.52±0.45、9.28±0.54、9.49±0.54、10.52±1.17min)。说明本发明进一步引入阳离子脂质DOTAP和透明质酸-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺复合物，能够与其他组分有效配合、协同作用，从而明显地延长药物与黏膜作用的时间，延长药物半衰期，改善抗炎作用。
并且，本发明中角膜前泪液中蒙花苷浓度在5min后达到17.96±0.84μg/mL，远高于其有效抑菌浓度(10μg/mL)。脂质体的AUC0-t显著高于其他实验组的脂质体溶液，说明本发明的脂质体中各组分协同作用，由此显著提高了蒙花苷在眼睛中的生物利用度。
实验例5
体内抗炎实验：用非传染性急性结膜炎兔检测蒙花苷脂质体的抗炎作用(分为3组)：分别为实施例7的载药脂质体(18μg/mL)滴眼液组、蒙花苷溶液滴眼液组(18μg/mL)、阳性对照组(妥布霉素地塞米松滴眼液，0.1％)组、阴性对照组(0.05％透明质酸空白脂质体)组。每只眼用30％巴豆油(100uL)处理1分钟，然后用3mL生理盐水冲洗。30min后，用100μL上述滴眼液滴注兔眼30min。每30分钟治疗一次，共5次。2.5h后，给药频率1h，共4次。24h后，给药频率为每日3次，连续3d。用裂隙灯检测眼球在2h、4h、8h、12h、24h、48h和72h的反应。以结膜充血、水肿、分泌物为评分指标。结果如图4～5所示。
由图4A可知，采用家兔进行体内抗炎实验，在眼部加入30％巴豆油后，出现闭眼、烦躁、充血、水肿等疼痛，眼睑结膜、球根结膜分泌增多。裂隙灯成像，兔眼结膜炎症模型30分钟后出现大量出血点，结膜严重水肿，白色化脓性分泌物。症状恶化长达8小时。结膜水肿72小时后继续发炎，5天后恢复。
与阴性对照组(空白脂质体)相比，本发明蒙花苷脂质体组(18μg/mL，图4C)和阳性组(妥布霉素地塞米松滴眼液，0.1％，图4B)在8h、12h、48h和72h时均有显著的抗炎作用(P<0.01)。症状基本消失，72小时后结膜恢复正常。蒙花苷脂质体组与阳性对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。
但是，根据炎症反应评分总体标准评价蒙花苷脂质体的疗效，如图5所示。0.1％的妥布霉素地塞米松滴眼液每5mL含妥布霉素15mg和地塞米松5mg。虽然实验条件下，本发明的蒙花苷负载脂质体滴眼液(18μg/mL)在体内与地塞米松(1000μg/mL)具有相当的抗炎作用，但是本发明的有效成分含量远低于地塞米松，说明本发明的滴眼液相较于现有市售常规抗炎药物，在体内具有更强的抗炎作用，可有效改善眼部的抗炎作用。
综上可知，本发明的蒙花苷脂质体纳米胶束，采用蒙花苷、磷脂酰胆碱、胆固醇、透明质酸-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺复合物和阳离子脂质DOTAP复配，能够有效靶向眼巨噬细胞并维持更长释放时间下药物的抗炎作用，显著延长药物半衰期，改善体内抗炎作用，在抗炎滴眼剂制备领域具有广泛的临床应用前景。

Claims (8)

1.一种蒙花苷脂质体纳米胶束，其特征在于，以蒙花苷、磷脂酰胆碱、透明质酸-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺复合物、阳离子脂质DOTAP、胆固醇为原料采用水合、挤压、纯化工艺制备得到；
其中，以质量份数计，每1份蒙花苷对应其他原料的质量份数分别为：磷脂酰胆碱50份、透明质酸-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺复合物30份、阳离子脂质DOTAP 10份、胆固醇10份；
所述透明质酸-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺复合物为透明质酸与二硬脂酰磷脂酰乙醇胺通过共价键结合形成的复合物。
2.如权利要求1所述的蒙花苷脂质体纳米胶束，其特征在于，所述蒙花苷脂质体纳米胶束的粒径为130~230nm。
3.如权利要求1所述的蒙花苷脂质体纳米胶束，其特征在于，所述透明质酸-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺复合物中，透明质酸的分子量为50~300kDa。
4.一种如权利要求1~3任一项所述的蒙花苷脂质体纳米胶束的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）将蒙花苷、磷脂酰胆碱、透明质酸-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺复合物、阳离子脂质DOTAP、胆固醇按配比溶解于有机溶剂中，形成共混液；
2）去除共混液中的有机溶剂以形成复合薄膜；
3）将复合薄膜重新分散到PBS溶液中进行超声水合得到脂质体，然后将脂质体挤压、纯化得到蒙花苷脂质体纳米胶束。
5.如权利要求4所述的蒙花苷脂质体纳米胶束的制备方法，其特征在于，步骤3）中，超声水合的工艺为：在100~300W超声功率下声波振动1~5s，然后暂停1~5s，循环10~50次。
6.如权利要求4所述的蒙花苷脂质体纳米胶束的制备方法，其特征在于，步骤3）中，挤压的工艺为：将脂质体经50~200nm碳酸盐膜挤压10~50次。
7.如权利要求4所述的蒙花苷脂质体纳米胶束的制备方法，其特征在于，步骤3）中，脂质体纯化是采用交联葡萄糖凝胶Sephadex G50进行纯化。
8.一种滴眼液，其特征在于，采用如权利要求1~3任一项所述的蒙花苷脂质体纳米胶束制备得到。
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