CN114874106A - 一种氨基脂质及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因治疗技术领域，具体涉及一种氨基脂质及其制备方法和应用。本发明提供的具有式（I）结构的化合物，可与其它辅助脂质共同制备复合载体以递送药物，包括核酸药物、蛋白药物、小分子药物等。在构建氨基脂质的过程中反应条件温和，不需要保护和脱保护，原子经济性高。在体外、体内的递送研究中，显示了优良的递送核酸至细胞中的能力。上述氨基脂质化合物引入的两个酯键显著增强了氨基脂质的降解能力，大幅度降低了细胞毒性。所述氨基脂质化合物的制备方法具有原料易得、反应条件温和、反应选择性好、反应产率高、仪器设备要求低和操作简单的优点。

Description

一种氨基脂质及其制备方法和应用
技术领域
本发明医药化学技术领域，特别涉及一种氨基脂质及其制备方法和应用。
背景技术
现如今，基因治疗已成为一种非常有前景的能够治疗人类多种通常无法通过常规方法进行疾病治疗的方法。基因治疗，就是通过改变特定内源基因的表达或将外源性治疗性基因导入病理细胞，以控制疾病发展或治愈相关疾病的一种治疗疾病的方式。
基因治疗的载体分为病毒类载体和非病毒类载体，病毒载体具有较高的转染效率，但是病毒载体缺乏靶向性，存在较大的安全顾虑，且载体容量小，生产成本较高。非病毒载体具有安全性较高，载体分子容易修饰，适合大量生产等优点，具有广阔的应用前景。目前应用于基因治疗的非病毒载体绝大多数是脂质纳米颗粒（lipid nanoparticles, LNP），其基本结构是一个可离子化头部基团连接在一个疏水基团上，头部基团一般是带有一个或数个氨基的长链胺类基团；疏水基团则主要有两类：脂肪酰链和胆固醇环。脂质纳米颗粒介导的基因转染过程通常被分为三步：首先是脂质纳米颗粒与核酸通过静电作用相结合，构成LNP/核酸复合体；其次是LNP/核酸复合体通过某种机制进入细胞内，在细胞内分解并释放核酸；最后是核酸进入细胞核并在相应位点整合，使转染基因得以表达，或在细胞质内表达为相应的蛋白质。
脂质纳米颗粒因其灵活性高、制备方便等优点备受关注。但其转染的效率低、内涵体/溶酶体逃逸能力低等问题仍待解决，因此设计具有良好包载核酸能力，同时又具有较高的内涵体/溶酶体逃逸能力的氨基脂质，以解决核酸递送问题，具有重大的研究意义和现实需求。
发明内容
针对现有技术中阳离子脂质体的转染的效率低、正电荷所导致的细胞毒性等技术问题，本发明提供了一种氨基脂质及其制备方法和应用。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现：
一种氨基脂质，其结构如式（I）所示：
Figure 733176DEST_PATH_IMAGE001
其中，L1为C1-C6亚烷基、C2-C6亚烯基、C2-C6亚炔基、C3-C6亚环烷基、C3-C6亚环烯基；
L2为C1-C6亚烷基、C2-C6亚烯基、C2-C6亚炔基、C3-C6亚环烷基、C3-C6亚环烯基；
R1和R2相同或不同，并且各自独立地选自取代或未取代的C1-20烷基、C2-C20烯基、C2-C20炔基、C3-C20环烷基、C3-C20环烯基、C3-C20环炔基，所述C1-C20烷基、C2-C20烯基、C2-C20炔基、C3-C20环烷基、C3-C20环烯基、C3-C20环炔基的取代基选自C1-C6烃基；
R3为C1-C14烷基、C2-C14烯基、C2-C14炔基、C1-C14氟代烷基、C2-C14氟代烯基、C2-C14氟代炔基，所述C1-C14烷基、C2-C14烯基、C2-C14炔基、C1-C14氟代烷基、C2-C14氟代烯基、C2-C14氟代炔基的取代基选自C1-C6烃基或C1-C6氟代烃基；
R4和R5彼此相同或不同，并且各自独立地选自H，取代或未取代的C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基，所述C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基的取代基为C1-C6烃基；
或R4和R5相连接形成4～10元杂环，其中，多元杂环包含1～6个杂原子，所述杂原子选自氮、硫或氧。
优选地，L1为-CH2-，即所述氨基脂质为：
Figure 523277DEST_PATH_IMAGE002
所述R1、R2彼此相同或不同，并且各自独立地选自C1-C16烷基、C2-C16烯基、C2-C16炔基、C3-C16环烷基、C3-C16环烯基、C3-C16环炔基，所述C1-C16烷基、C2-C16烯基、C2-C16炔基、C3-C16环烷基、C3-C16环烯基、C3-C16环炔基的取代基选自C1-C6烃基。
优选地，R1、R2和L1形成
Figure 887394DEST_PATH_IMAGE003
的取代基结构选自A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10、A11、A12、A13、A14、A15、A16、A17、A18、A19、A20、A21、A22、A23、A24、A25、A26、A27、A28、A29、A30、A31、A32、A33、A34、A35、A36、A37、A38、A39、A40、A41、A42、A43、A44、A45、A46、A47、A48、A49、A50、A51、A52中的一种：
Figure 93247DEST_PATH_IMAGE004
Figure 413370DEST_PATH_IMAGE005
。
更优选地，R1、R2和L1形成
Figure 187422DEST_PATH_IMAGE006
的取代基结构A18、A20、A33、A42、A43、A44、A45、A46、A51、A52中的一个。
优选地，所述R3选自取代或未取代的C4-C18烷基、C4-C18烯基、C4-C18炔基、C4-C18氟代烷基、C4-C18氟代烯基、C4-C18氟代炔基，所述C4-C18烷基、C4-C18烯基、C4-C18炔基、C4-C18氟代烷基、C4-C18氟代烯基、C4-C18氟代炔基的取代基选自C1-C6烃基或C1-C6氟代烃基。
更优选地，所述R3选自取代或未取代的C6-C16烷基、C6-C16烯基、C6-C16炔基、C6-C16氟代烷基、C6-C16氟代烯基、C6-C16氟代炔基，所述C6-C16烷基、C6-C16烯基、C6-C16炔基、C6-C16氟代烷基、C6-C16氟代烯基、C6-C16氟代炔基的取代基选自C1-C6烃基或C1-C6氟代烃基。
更优选地，所述R3选自F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7、F8、F9、F10、F11、F12、F13、F14、F15、F16、F17、F18、F19、F20、F21、F22、F23、F24、F25、F26、F27、F28、F29、F30、F31、F32、F33、F34、F35、F36、F37、F38、F39、F40、F41、F42、F43、F44、F45、F46、F47、F48、F49、F50、F51、F52、F53、F54、F55、F56、F57、F58、F59、F60、F61、F62、F63、F64、F65、F66、F67、F68、F69、F70中的一种：
Figure 897889DEST_PATH_IMAGE007
Figure 32067DEST_PATH_IMAGE008
Figure 144380DEST_PATH_IMAGE009
。
更优选地，R3选自F3、F8、F13、F17、F21、F22、F27、F31、F34、F35、F36、F38、F40、F48、F54、F61、F65中的一个。
优选地，R4、R5、L2形成
Figure 27016DEST_PATH_IMAGE010
的结构，选自：C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21、C22、C23、C24、C25、C26、C27、C28、C29、C30、C31、C32、C33、C34、C35、C36、C37、C38、C39、C40中的一种：
Figure 349413DEST_PATH_IMAGE011
Figure 162648DEST_PATH_IMAGE012
。
更优选地，
Figure 205166DEST_PATH_IMAGE013
选自C9、C11、C12、C14、C15、C16、C23、C24、C19、C20、C26、C28、C29、C33中的一个。
更优选地，所述氨基脂质的结构式如下：
Figure 570289DEST_PATH_IMAGE014
Figure 255348DEST_PATH_IMAGE015
。
所述式（I）氨基脂质的制备方法，包括以下步骤：
S1. 化合物R1R2L1OH与3-叔丁基二甲硅氧基戊二酸酐加热搅拌反应；
S2. 在缩合剂存在的条件下，在步骤S1反应体系中加入R3OH；
S3. 在步骤S2反应体系中加入R4R5NL2COOH反应，即得。
具体如下：
（1）90℃下， 3-叔丁基二甲硅氧基戊二酸酐化合物与R1R2L1OH加热搅拌反应，得到第一中间体；
（2）分离第一中间体，在缩合剂的作用下，加入催化量的DMAP，使所述第一中间体与R3OH在常温下进行第二步反应，得到第二中间体；
（3）在Bu4NF的作用下，使第二中间体脱去叔丁基二甲基，得到第三中间体；
（4）分离第三中间体，在缩合剂的作用下，加入催化量的DMAP，使所述第三中间体与R4R5NL2COOH的羧酸在常温下进行第四步反应，得到所述式I的氨基脂质化合物。上述制备方法中使用的缩合剂为EDC·HCl、DCC等。
反应式如下：
Figure 482061DEST_PATH_IMAGE016
所述氨基脂质及其药物可接受的盐在制备纳米药物组合物中的应用。
优选地，所述氨基脂质及其药物可接受的盐在制备核酸药物、基因疫苗、小分子药物、多肽或蛋白质药物中的应用。
进一步，所述氨基脂质及其药物可接受的盐在治疗黑色素瘤药物中的应用。
上述氨基脂质在制备用于遗传疾病的治疗药物中的应用。
上述氨基脂质在用于癌症或遗传疾病的治疗。在制备用于肺癌、胃癌、肝癌、食管癌、结肠癌、胰腺癌、脑癌、淋巴癌、血癌、前列腺癌、过敏、毒性和病原体感药物中的应用。
上述氨基脂质在制备用于核酸转移的药物中的应用。
优选地，所述核酸为RNA，包括但不限于信使RNA (mRNA)、反义寡核苷酸、DNA、质粒、核糖体RNA（rRNA）、微RNA（miRNA）、转移RNA（tRNA）、小干扰RNA（siRNA）和小核RNA（snRNA）。
与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：
本发明公开的式（I）氨基脂，可与其它辅助脂质共同制备复合载体以递送药物，包括核酸药物、蛋白药物、小分子药物等。在构建氨基脂质的过程中反应条件温和，不需要保护和脱保护，原子经济性高。在体外、体内的递送研究中，显示了优良的递送核酸至细胞中的能力。上述氨基脂质化合物引入的两个酯键显著增强了氨基脂质的降解能力，大幅度降低了细胞毒性。所述氨基脂质化合物的制备方法具有原料易得、反应条件温和、反应选择性好、反应产率高、仪器设备要求低和操作简单的优点。
附图说明
图1为实施例10中A33F27C23的1H-NMR图谱；
图2为实施例17中肌肉注射OVA mRNA疫苗后的荷瘤小鼠的肿瘤生长曲线图；
图3为实施例17中肌肉注射OVA mRNA疫苗后的荷瘤小鼠生存曲线图；
图4为实施例17中IgG抗体滴定曲线图；
图5为实施例17中血清中EPO浓度曲线图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
本发明所用的术语“任选地取代的”意指与原子或基团连接的一个或多个氢原子独立地未被取代，或被一个或多个例如一、二、三或四个取代基取代。当一个原子或基团被多个取代基取代时，所述多个取代基可以相同或不同。
文中的缩写：
RNA 核糖核酸
DSPC 二硬脂酰磷脂酰胆碱
DMPC 二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱
DPPC 二棕榈酰磷脂酰胆碱
DOPE 二油酰基磷脂酰乙醇胺
DOPC 二油酰磷脂酰胆碱
DSPE 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺
PEG2000-DMG (1- (单甲氧基聚乙二醇) -2, 3 二肉豆寇酰基甘油
pSar 聚肌氨酸
DODAP 1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷
kD 千道尔顿
PBS 磷酸盐缓冲溶液。
以下实施例中如无特别说明，氨基脂质结构通式如式(Ⅰ)所示
Figure 896862DEST_PATH_IMAGE017
编号指代的氨基脂质结构中，A1～A52为上述定义的
Figure 308252DEST_PATH_IMAGE018
基团、F1～F42为上述定义的R3取代基、C1～C40为上述定义的
Figure 90394DEST_PATH_IMAGE019
基团。如A33F27C9的结构式为
Figure 979852DEST_PATH_IMAGE020
。
实施例1：A33F27Cy系列氨基脂质化合物库的平行合成与表征
Figure 249160DEST_PATH_IMAGE021
在25mL的反应管中依次加入3-叔丁基二甲硅氧基戊二酸酐（244 mg，1mmol）、2-辛基十二醇（428μL，1.2 mmol），90℃下加热搅拌反应6h，得 Step I。接着加入全氟己基乙基醇（232μL，1.05 mmol），EDC·HCl（383 mg，2 mmol），DIPEA（384μL，2mmol），DMAP （6 mg，0.05 mmol），4 mL THF，常温下反应12h，得Step Ⅱ。然后加入Bu4NF（946 mg，3 mmol），常温下反应8h，得Step Ⅲ（1mmol）再加入6mL的DCM，配成0.1 M的Step Ⅲ溶液。
用移液枪将Step I溶液分别转移至1.5 mL的96孔板中（每个0.1 mL，0.01mmol），每孔中各加入带三级胺的羧酸的DCM溶液（0.1 mL，0.02 mmol，0.2M）、DIPEA和EDC·HCl的DCM溶液（0.2 mL，0.04 mmol，0.2 M），DMAP的DCM溶液（0.1 mL，0.005 mmol，0.05 M）常温搅拌6h，TLC检测无Step Ⅲ 原料。反应结束后，常温挥法至干，即得到14个氨基脂质化合物A33F27Cy。进行质谱检测，结果见下面的表1。
表1：A33F27Cy系列氨基胺基脂质化合物库的MW/z值
Figure 706817DEST_PATH_IMAGE022
实施例2：3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5-((2-己基癸基)氧基)-5-氧代戊酸
Figure 100889DEST_PATH_IMAGE023
在25mL的反应管中依次加入3-叔丁基二甲硅氧基戊二酸酐（1.2 g，5mmol）、2-己基-1-癸醇（1.7 mL，6 mmol），90℃下加热搅拌反应6h，使用柱层析纯化（hexane：EA=20：1至5：1）得3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5-((2-己基癸基)氧基)-5-氧代戊酸（2.3 g，95%）。1H NMR (400 MHz，CDCl3)：δ 0.22（s，6H），0.88（t，6H），0.98（s，9H），1.26-1.45（m，24H），1.89（m，1H），2.44-2.64（m，4H），4.24-4.79（m，2H），4.55（m，1H），12.02（s，1H）。ESI-MScalculated for C27H55O5Si+ [M+H]+487.4, found 487.6。
实施例3：1-(2-己基癸基) 5-(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-十三氟辛基) 3-羟基戊二酸酯
Figure 918673DEST_PATH_IMAGE024
在25mL的反应管中依次加入EDC·HCl（1.2 g，6 mmol），DIPEA（1 mL，6 mmol），DMAP （18 mg，0.15 mmol），全氟己基乙基醇（695 μL，3.15 mmol），3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5-((2-己基癸基)氧基)-5-氧代戊酸（1.5 g，3 mmol），6 mL THF。室温下搅拌9h后加入Bu4NF（1.3 g，4 mmol），4 mL THF，室温下搅拌反应过夜，使用柱层析纯化（hexane：EA=20：1至10：1）得1-(2-己基癸基) 5-(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-十三氟辛基) 3-羟基戊二酸酯（1.4 g，98%）。1H NMR (400 MHz，CDCl3)：δ 0.88 （t，6H），1.26-1.45 （m，24H），1.88（m，3H），2.44-2.63（m，4H），4.15（t，2H），4.23-4.58（m，2H），4.87（m，1H）。ESI-MScalculated for C29H44F13O5 + [M+H]+ 719.3, found 719.5。
实施例4：1-（十五烷基-7-基）5-(6,6,6-三氟己基)3-((1-甲基吡咯烷-3-羰基)氧基)戊二酸酯1-(2-己基癸基) 5-(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-十三氟辛基) 3-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基 )戊二酸
Figure 714590DEST_PATH_IMAGE025
在10 mL的反应管中依次加入EDC·HCl（192 mg，1 mmol），DIPEA（174μL，1 mmol），DMAP （3 mg，0.025 mmol），1-(2-己基癸基) 5-(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-十三氟辛基) 3-羟基戊二酸酯（359 mg，0.5 mmol），4-(二甲氨基)丁酸（79 mg，0.6 mmol），4 mLDCM。室温下搅拌3 h得到化合物A20F27C9（354 mg，85%）。1H NMR (400 MHz，CDCl3)：δ 0.88（t，6H），1.26-1.45 （m，24H），1.88（m，5H），2.15（s，6H），2.44-2.63（m，6H），3.14（t，2H），4.15（t，2H），4.23-4.58（m，2H），4.87（m，1H）。13C NMR (400 MHz，CDCl3)：δ 14.04，14.07，22.64，23.43，27.39，27.43，29.23，29.59，31.68，31.85，31.87，37.42，38.14，47.39，47.43，51.84，61.48，65.78，67.98，109.89，112.41，118.54，119.67，172.98，173.15，174.23。ESI-MS calculated for C35H55F13NO6 + [M+H]+ 832.4, found 832.6。
实施例5：3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5-((4-乙基-2-(庚烷-3-基)辛基)氧基)-5-氧代戊酸
Figure 346079DEST_PATH_IMAGE026
在25mL的反应管中依次加入3-叔丁基二甲硅氧基戊二酸酐（1.2 g，5mmol）、4-乙基-2-(庚烷-3-基)-1-辛醇（1.5 g，6 mmol），90℃下加热搅拌反应6h，使用柱层析纯化（hexane：EA=20：1至5：1）得3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5-((4-乙基-2-(庚烷-3-基)辛基)氧基)-5-氧代戊酸（2.4 g，95%）。1H NMR (400 MHz，CDCl3)：δ 0.22（s，6H），0.88（t，12H），0.98（s，9H），1.26-1.45（m，21H），1.79（m，1H），2.44-2.64（m，4H），4.48-4.57（m，2H），12.02（s，1H）。ESI-MS calculated for C28H57O5Si+ [M+H]+501.4, found 501.6。
实施例6：1-(4-乙基-2-(庚烷-3-基)辛基) 5-(5,5,6,6,6-五氟己基) 3-羟基戊二酸酯
Figure 555343DEST_PATH_IMAGE027
在25mL的反应管中依次加入EDC·HCl（1.2 g，6 mmol），DIPEA（1 mL，6 mmol），DMAP （18 mg，0.15 mmol），5,5,6,6,6-五氟己烷-1-醇（605 mg，3.15 mmol），3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5-((4-乙基-2-(庚烷-3-基)辛基)氧基)-5-氧代戊酸（1.5 g，3mmol），6 mL THF。室温下搅拌9 h后加入Bu4NF（1.3 g，4 mmol），4 mL THF，室温下搅拌反应过夜，使用柱层析纯化（hexane：EA=20：1至10：1）得1-(4-乙基-2-(庚烷-3-基)辛基) 5-(5,5,6,6,6-五氟己基) 3-羟基戊二酸酯（1.1 g，98%）。1H NMR (400 MHz，CDCl3)：δ 0.88 （t，12H），1.26-1.45 （m，24H），1.57（m，2H），1.63（m，2H），1.79（m，1H），2.46-2.64（m，4H），4.25（t，2H），4.56（m，1H），4.88（m，1H）。ESI-MS calculated for C28H50F5O5 + [M+H]+ 561.4,found 561.5。
实施例7：1-(4-乙基-2-(庚烷-3-基)辛基) 5-(5,5,6,6,6-五氟己基) 3-((3-(哌啶-1-基)丙酰基)氧基) 戊二酸酯
Figure 52183DEST_PATH_IMAGE028
在10 mL的反应管中依次加入EDC·HCl（192 mg，1 mmol），DIPEA（174μL，1 mmol），DMAP （3 mg，0.025 mmol），1-(4-乙基-2-(庚烷-3-基)辛基) 5-(5,5,6,6,6-五氟己基) 3-羟基戊二酸酯（280 mg，0.5 mmol），3-(哌啶-1-基)丙酸（94 mg，0.6 mmol），4 mL DCM。室温下搅拌3 h得到化合物A45F8C24（298 mg，85%）。1H NMR (400 MHz，CDCl3)：δ 0.88 （t，12H），1.26-1.45 （m，30H），1.57（m，2H），1.63（m，2H），1.79（m，1H），2.35（t，2H），2.46-2.64（m，7H），3.76（t，2H），4.25（t，2H），4.56（m，1H），4.88（m，1H）。13C NMR (400 MHz，CDCl3)：δ11.93，14.04，14.07，18.03，22.95，25.11，25.93，27.59，28.83，29.59，30.79，33.37，37.12，38.14，38.42，45.59，52.82，56.84，65.28，65.81，73.51，123.34，133.73，172.98，173.12，176.23。ESI-MS calculated for C36H63F5NO6 + [M+H]+ 700.4, found 700.6。
实施例8：3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5-((2-辛基十二烷基)氧基)-5-氧代戊酸
Figure 577974DEST_PATH_IMAGE029
在25mL的反应管中依次加入3-叔丁基二甲硅氧基戊二酸酐（1.2 g，5mmol）、2-辛基十二醇（2.1 mL，6 mmol），90℃下加热搅拌反应6h，使用柱层析纯化（hexane：EA=20：1至5：1）得3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5-((2-辛基十二烷基)氧基)-5-氧代戊酸（2.6g，95%）。1H NMR (400 MHz，CDCl3)：δ 0.22（s，6H），0.88（t，6H），0.98（s，9H），1.26-1.45（m，32H），1.89（m，1H），2.44-2.64（m，4H），4.24-4.79（m，2H），4.55（m，1H），12.02（s，1H）。ESI-MScalculated for C31H63O5Si+ [M+H]+543.4, found 543.6。
实施例9：1-(2-辛基十二烷基) 5-(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-十三氟辛基)3-羟基戊二酸酯
Figure 502067DEST_PATH_IMAGE030
在25mL的反应管中依次加入EDC·HCl（1.2 g，6 mmol），DIPEA（1 mL，6 mmol），DMAP （18 mg，0.15 mmol），全氟己基乙基醇（695 μL，3.15 mmol），3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5-((2-辛基十二烷基)氧基)-5-氧代戊酸（1.6 g，3 mmol），6 mL THF。室温下搅拌9 h后加入Bu4NF（1.3 g，4 mmol），4 mL THF，室温下搅拌反应过夜，使用柱层析纯化（hexane：EA=20：1至10：1）得1-(2-辛基十二烷基) 5-(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-十三氟辛基) 3-羟基戊二酸酯（1.5 g，98%）。1H NMR (400 MHz，CDCl3)：δ 0.88 （t，6H），1.26-1.45 （m，32H），1.88（m，3H），2.44-2.63（m，4H），4.15（t，2H），4.23-4.58（m，2H），4.87（m，1H）。ESI-MS calculated for C33H52F13O5 + [M+H]+ 774.4, found 774.5。
实施例10：1-(2-辛基十二烷基) 5-(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-十三氟辛基)3-((1-甲基哌啶-4-羰基) 氧）戊二酸酯
Figure 198628DEST_PATH_IMAGE031
在10 mL的反应管中依次加入EDC·HCl（192 mg，1 mmol），DIPEA（174μL，1 mmol），DMAP （3 mg，0.025 mmol），1-(2-辛基十二烷基) 5-(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-十三氟辛基) 3-羟基戊二酸酯（387 mg，0.5 mmol），1-甲基哌啶-4-羧酸（86 mg，0.6 mmol），4 mLDCM。室温下搅拌3 h得到化合物A33F27C23（382 mg，85%）。1H NMR (400 MHz，CDCl3)：δ 0.88（t，6H），1.26-1.29（m，32H），1.61（m，1H），1.76（m，2H），1.89（m，2H），2.09（m，3H），2.30（s，3H），2.46（m，2H），2.70（m，4H），2.83（m，2H），3.99（m，2H），4.37（m，2H），5.50（m，1H）(见附图1) 。13C NMR (400 MHz，CDCl3)：δ 14.04，14.07，22.59， 27.13，27.54，29.29，29.59，29.89， 31.42，31.87，37.46，38.18，38.37，41.43，46.89， 51.64，66.18，67.51，109.52，111.71，111.93，118.53，119.23，172.98，176.23。ESI-MS calculated for C40H63F13NO6 + [M+H]+ 890.4, found 890.6。
实施例11：33-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5-氧代-5-((2-(2-(2,2,6-三甲基环己基)乙基)戊基)氧基)戊酸
Figure 108946DEST_PATH_IMAGE032
在25mL的反应管中依次加入3-叔丁基二甲硅氧基戊二酸酐（1.2 g，5mmol）、2-(2-(2,2,6-三甲基环己基)乙基)-1-戊醇（1.6 mL，6 mmol），90℃下加热搅拌反应6h，使用柱层析纯化（hexane：EA=20：1至5：1）得3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5-氧代-5-((2-(2-(2,2,6-三甲基环己基)乙基)戊基)氧基)戊酸（2.3 g，95%）。1H NMR (400 MHz，CDCl3)：δ0.22（s，6H），0.88（t，12H），0.98（s，9H），1.26-1.49（m，18H），2.44-2.64（m，4H），4.47（m，1H），4.55（m，1H），12.02（s，1H）。ESI-MS calculated for C27H53O5Si+ [M+H]+485.4，found485.5。
实施例12：1-己基 5-(1-(2,2,6-三甲基环己基)己-3-基) 3-羟基戊二酸酯
Figure 145035DEST_PATH_IMAGE033
在25mL的反应管中依次加入EDC·HCl（1.2 g，6 mmol），DIPEA（1 mL，6 mmol），DMAP （18 mg，0.15 mmol），正己醇（395 μL，3.15 mmol），3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5-氧代-5-((2-(2-(2,2,6-三甲基环己基)乙基)戊基)氧基)戊酸（1.5 g，3 mmol），6mL THF。室温下搅拌9 h后加入Bu4NF（1.3 g，4 mmol），4 mL THF，室温下搅拌反应过夜，使用柱层析纯化（hexane：EA=20：1至10：1）得1-己基 5-(2-(2-(2,2,6-三甲基环己基)乙基)戊基) 3-羟基戊二酸酯（891 mg，98%）。1H NMR (400 MHz，CDCl3)：δ 0.88（t，15H），1.25-1.47（m，26H），2.46-2.63（m，4H），4.17（t，2H），4.49（m，1H），4.85（m，1H）。ESI-MScalculated for C27H51O5 + [M+H]+ 455.4, found 455.6。
实施例13：5-(2-(2-(2,2,6-三甲基环己基)乙基)戊基)3-((5-(二甲基氨基)戊酰基)氧基)戊二酸1-己酯
Figure 567927DEST_PATH_IMAGE034
在10 mL的反应管中依次加入EDC·HCl（192 mg，1 mmol），DIPEA（174μL，1 mmol），DMAP （3.0 mg，0.025 mmol），1-己基 5-(2-(2-(2,2,6-三甲基环己基)乙基)戊基) 3-羟基戊二酸酯（227 mg，0.5 mmol），5-(二甲氨基)戊酸（87mg，0.6 mmol），4 mL DCM。室温下搅拌3 h得到化合物A52F38C11（247mg，85%）。1H NMR (400 MHz，CDCl3)：δ 0.88（t，15H），1.25-1.47（m，30H），2.17（s，6H），2.35（t，2H），2.46-2.63（m，6H），4.17（m，2H），4.49（m，1H），4.85（m，1H）。13C NMR (400 MHz，CDCl3)：δ 14.04，19.13，20.82，22.69，25.51，27.13，27.64，27.83，28.92，31.42，33.37，35.46，38.18，38.37，41.63，46.89，59.24，61.18，65.21，65.83，74.58，172.98，176.23。ESI-MS calculated for C34H64NO6 + [M+H]+ 582.5, found582.6。
实施例14：氨基脂质化合物作为mRNA载体的体外评价
细胞系：HeLa细胞系 (ATCC)
培养基：补充了10%胎牛血清的1640 (Invitrogen)
筛选形式：96孔板细胞转染
检测：使用多功能酶标仪检测荧光强度。根据制造商的说明，Lipofectamine3000(Invitrogen) 用作阳性对照组。
方法：使用8通道移液管加样。所示的含量为96孔平板的单孔。
1. 参考实施例1中所述中路线合成得到一系列氨基脂质化合物，将其与二硬脂酰磷脂酰胆碱（DSPC）, 胆固醇， PEG2000-DMG按摩尔比为50：10：38.5：1.5的比例混合溶解在无水乙醇中；Luc-mRNA (TriLink)溶解在醋酸钠溶液（25 nM，pH = 5.0）中，使用排枪取出上述的混合脂质溶液，加入至Luc-mRNA溶液中，充分混合，控制其配比为乙醇溶液与醋酸钠溶液（25nM， pH = 5.0）的比例为1:3，制得脂质纳米颗粒溶液。氨基脂质化合物与荧光素酶mRNA(Luc mRNA)的质量比约为10:1，每孔mRNA的用量为100 ng。
2. 脂质纳米颗粒溶液在室温下孵育30min后，于96孔全白酶标板中每孔加入100μL新鲜重悬浮的HeLa细胞（1×104细胞），再用移液管将脂质纳米颗粒溶液加入到96孔板中（每孔10 μL）。置于37℃的含有5% CO2的培养箱中孵育。
3. 细胞初始转染后16至20小时，将底物ONE-GloTMLuciferase以100 μL/孔加入细胞中，2 min后用多功能酶标仪（Biorek SynergyH1）进行检测。
4.相对转染效率如下计算：
Figure 299253DEST_PATH_IMAGE035
结果：部分化合物对HeLa细胞的Luc-mRNA的转染效率示于表2中。
表2：2380种化合物对HeLa细胞的mRNA相对转染效率
Figure 465792DEST_PATH_IMAGE036
Figure 825230DEST_PATH_IMAGE037
Figure 963562DEST_PATH_IMAGE038
Figure 306819DEST_PATH_IMAGE039
实施例15：氨基脂质化合物制备的脂质纳米颗粒在BMDC原代细胞上的转染
制剂方法：同实施例14。
动物准备：选取6周龄的雌性C57BL/6小鼠，体重在20 g左右，饲养环境为SPF级的饲养室，动物试验严格按照国家健康机构的指南以及动物伦理要求进行。
细胞获取：把C57BL/6小鼠进行脱颈臼处死，并置于75%酒精中浸泡5分钟进行消毒，解剖获取小鼠大腿及小腿胫骨，并把附着的肌肉剔除露出骨质，然后用1ml吸有PBS的注射器把胫骨中的骨髓吹出，把所得骨髓吹散后通过50um滤网滤去杂质，向所得过滤物中加入红细胞裂解液（3~4 mL）后放置5分钟后进行800g、5分钟的离心除去上清液，将所得细胞置于1640培养基（含10%胎牛血清、20ng/ml GMCSF、10ng/ml IL4）中重悬，并接种于6孔板中，接种密度为100000个细胞/毫升培养基，放置于37℃、5%CO2细胞培养箱中，每2天进行半换液一次，于第七天收集悬浮细胞和松散贴壁的细胞，并接种到96孔全白酶标板接种密度为每孔20000个细胞，培养基体积为100uL。
细胞转染：向铺有原代细胞的96孔全白酶标板中加入包裹萤光素酶mRNA的脂质纳米颗粒，控制每孔中的mRNA脂质纳米颗粒加入体积为10μL。随后放置在37℃、5%CO2浓度的培养箱中16小时。
转染效率检测：往96孔全白酶标板中每孔加入20 uL底物ONE-GloTMLuciferase，1min后用多功能酶标仪（Biorek SynergyH1）进行检测。代表性氨基脂质化合物在BMDC上转染LucmRNA的表达强度见表3。DLin-MC3作为对照,所述的氨基脂质多个与MC3表达强度相似，并有多个显著优于阳性对照。
表3 139个氨基脂质化合物在BMDC上的转染的表达强度
Figure 277049DEST_PATH_IMAGE040
Figure 631938DEST_PATH_IMAGE041
Figure 662211DEST_PATH_IMAGE042
实施例16：氨基脂质化合物制备的脂质纳米颗粒的萤光素酶mRNA体内递送性能评价
1. 脂质纳米颗粒的制备
将本发明的氨基脂质化合物与中性脂质（如：DSPC、DOPE、胆固醇）、聚乙二醇化脂质（如：PEG2000-DMG、PEG2000-DSPE）按优化后的摩尔比混合并溶解在无水乙醇中。使用微流控制备系统使所得的乙醇溶液和溶解有Luc-mRNA (TriLink)的醋酸钠溶液（25mM, pH =5.0）以1:3的体积比在微流控芯片中混合以制得脂质纳米颗粒的粗溶液，然后将其用透析盒（Fisher，MWCO 20,000）在1X PBS、控温4 ℃下透析6h，在使用前通过0.22 μm的微孔滤膜过滤。氨基脂质化合物与萤光素酶mRNA (Luc mRNA)的质量比约为10 : 1。
脂质纳米颗粒的表征：
粒径的表征：所制备的脂质纳米颗粒的粒径和PDI通过Nano-ZSZEN3600(Malvern)测定。取LNP溶液20uL进行粒径测量，循环三次，每次循环30s。
包封率测定：参照Quant-iT RiboGreen RNA试剂盒标准规程进行测定。
表4：使用代表性氨基脂质化合物制备的LNP的表征数据
Figure 227185DEST_PATH_IMAGE043
Figure 548576DEST_PATH_IMAGE044
注：上表中：
LNP-1～LNP-38的脂质配方为：氨基脂质:DSPC:胆固醇:DMG-PEG2000 = 50:10:38.5:1.5；
LNP-39～LNP-40的脂质配方为：氨基脂质:DOPC:胆固醇: DMG-PEG2000= 48.5:10:40:1.5；
LNP-41和LNP-42的脂质配方为：氨基脂质: DPPC:胆固醇: DMG-PEG2000= 47:12:39.0:2.0；
LNP-43和LNP-44的脂质配方为：氨基脂质:DOPE:胆固醇:DMG-PEG2000 = 48:9:41.5:1.5；
LNP-45和LNP-46的脂质配方为：氨基脂质:DMPC:胆固醇: DSPE-PEG2000=44.2:9.9:44.2:1.7；
LNP-47和LNP-48的脂质配方为：氨基脂质:DSPC: 胆固醇: pSar34 =40:42.5:10:7.5；
LNP-49和LNP-50的脂质配方为：氨基脂质:DOPE: 胆固醇: DMG-PEG2000:DODAP=19:18:38:5:20。
动物实验
动物准备：选取体重约20 g的6周龄的雌性C57BL/6小鼠，于SPF级的饲养室中饲养。动物试验严格按照国家健康机构的指南以及动物伦理要求进行。
体内递送：每组随机选取9只C57BL/6小鼠，按0.5 mg/kg mRNA的用量，分别使用皮下、肌肉和尾静脉注射三种给药方式注射脂质纳米颗粒溶液（每种给药方式3只小鼠）。12小时后，往每只小鼠体内通过尾静脉注射200 μL 10 mg/mL的D-萤光素钾盐，10分钟后，将小鼠放置于活体成像系统(IVIS-200, Xenogen)下，观察每只小鼠总的萤光强度，并拍照记录下来。代表性氨基脂质化合物通过3种给药方式递送的Fluc mRNA的表达强度见表5-7。DLin-MC3作为对照。
表5：代表性氨基脂质化合物LNP皮下给药递送的Luc mRNA的表达强度
Figure 210501DEST_PATH_IMAGE045
表6：代表性氨基脂质化合物LNP肌注给药递送的Luc mRNA的表达强度
Figure 818200DEST_PATH_IMAGE046
表7：代表性氨基脂质化合物LNP尾静脉给药递送的Luc mRNA的表达强度
Figure 11415DEST_PATH_IMAGE047
实施例17：氨基脂质化合物制备的脂质纳米颗粒的体内免疫和肿瘤治疗效果评价
制剂方法：将本发明中所述的氨基脂质化合物与DSPC，胆固醇，PEG2000-DMG的摩尔比为50：10：38.5：1.5的比例混合溶解在无水乙醇中。卵清蛋白mRNA(OVA mRNA)溶解在醋酸钠溶液（50 mM, pH = 4.0）中。使用两个微量注射泵，控制其配比为乙醇溶液与醋酸钠溶液（50 mM, pH = 4.0）的比例为1：3，在微流道芯片中制得脂质纳米颗粒的粗溶液，再使用透析盒（Fisher，MWCO 20,000）在1X PBS、控温4 ℃下透析6h，使用前用0.22 μm的微孔滤膜过滤。氨基脂质化合物与卵清蛋白mRNA(OVA mRNA)的质量比约为8:1。
动物准备：选取5-6周龄的雌性C57BL/6小鼠，体重在18-20 g左右，饲养环境为SPF级的饲养室，动物试验严格按照国家健康机构的指南以及动物伦理要求进行。
体内递送：将 B16-OVA 黑色素瘤细胞 (1.5 × 105 ) 皮下注射到小鼠大腿外侧。当肿瘤大小等于 50 mm3时（约在肿瘤接种后第 6 天或第 7 天）开始接种疫苗。通过肌肉注射含有1 µg OVA-mRNA 的LNP 制剂对动物进行两次免疫，第二针间隔7天。使用数显卡尺每周测量肿瘤生长 3 次，计算公式为 0.5 × 长度 × 宽度。当肿瘤体积达到1500 mm3时对小鼠实施安乐死。A33F40C23和A33F27C9的肿瘤生长速度显著慢于MC3组（如图2所示），且分别有80%（A33F40C23组）。和60%（A33F27C9组）的小鼠达到了完全缓解，显著好于MC3组（如图3所示）。
酶联免疫吸附测定（ELISA）：对平底96孔板（Nunc）进行预涂在50 mM碳酸盐缓冲液中，OVA蛋白的浓度为每孔0.5 µg蛋白（pH 9.6）在4℃过夜，然后用5％甘氨酸封闭。使用PBS-0.05％Tween（PBS-T,pH 7.4）将免疫动物的血清从10-2稀释至10-6，添加到孔中并在37℃下孵育1小时。辣根过氧化物酶（HRP）偶联的山羊抗小鼠IgG在PBS-T-1％BSA中以1：10,000的稀释度进行标记。添加HRP基板后，在一个波长下确定光密度ELISA酶标仪（Bio-Rad）中检测450 nm下的吸光度。如图4所示，A33F40C23和A33F27C9的IgG抗体滴定显著优于MC3对照组。
：通过尾静脉向 C57BL/6 小鼠 (18-24 g) 施用 200 μL EPO mRNA LNP（1 μgmRNA，0.05 mg/kg 或 2 μg mRNA，0.1 mg/kg或6 μg mRNA，0.3 mg/kg）。在6小时和24小时后，从同一只小鼠采集血液（尾静脉取血）到血清分离管（肝素钠抗凝管也可），4度下进行800g*20min离心，收集上层血清，等体积吸取分离到2个1.5ml离心管中，贴好标签后放置于负20冰箱保存。按照说明书使用 ELISA 测定法（碧云天Human EPO ELISA Kit，PE230）对血清中的EPO 水平进行量化。如图5所示，A33F40C23和A33F27C9的血清中EPO浓度显著优于MC3对照组。
以上所述仅为本发明专利的较佳实施例而已，并不用以限制本发明专利，凡在本发明专利的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明专利的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种氨基脂质，其特征在于，其结构如式（I）所示：
Figure 509335DEST_PATH_IMAGE001
其中，L1为C1-C6亚烷基、C2-C6亚烯基、C2-C6亚炔基、C3-C6亚环烷基、C3-C6亚环烯基；
L2为C1-C6亚烷基、C2-C6亚烯基、C2-C6亚炔基、C3-C6亚环烷基、C3-C6亚环烯基；
R1和R2相同或不同，并且各自独立地选自取代或未取代的C1-20烷基、C2-C20烯基、C2-C20炔基、C3-C20环烷基、C3-C20环烯基、C3-C20环炔基，所述C1-C20烷基、C2-C20烯基、C2-C20炔基、C3-C20环烷基、C3-C20环烯基、C3-C20环炔基的取代基选自C1-C6烃基；
R3为C1-C14烷基、C2-C14烯基、C2-C14炔基、C1-C14氟代烷基、C2-C14氟代烯基、C2-C14氟代炔基，所述C1-C14烷基、C2-C14烯基、C2-C14炔基、C1-C14氟代烷基、C2-C14氟代烯基、C2-C14氟代炔基的取代基选自C1-C6烃基或C1-C6氟代烃基；
R4和R5彼此相同或不同，并且各自独立地选自H，取代或未取代的C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基，所述C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基的取代基为C1-C6烃基；
或R4和R5相连接形成4～10元杂环，其中，多元杂环包含1～6个杂原子，所述杂原子选自氮、硫或氧。
2.根据权利要求1所述氨基脂质，其特征在于，L1为-CH2-；所述R1、R2彼此相同或不同，并且各自独立地选自C1-C16烷基、C2-C16烯基、C2-C16炔基、C3-C16环烷基、C3-C16环烯基、C3-C16环炔基，所述C1-C16烷基、C2-C16烯基、C2-C16炔基、C3-C16环烷基、C3-C16环烯基、C3-C16环炔基的取代基选自C1-C6烃基。
3.根据权利要求2所述氨基脂质，其特征在于，R1、R2和L1形成
Figure 19951DEST_PATH_IMAGE002
的取代基结构选自A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10、A11、A12、A13、A14、A15、A16、A17、A18、A19、A20、A21、A22、A23、A24、A25、A26、A27、A28、A29、A30、A31、A32、A33、A34、A35、A36、A37、A38、A39、A40、A41、A42、A43、A44、A45、A46、A47、A48、A49、A50、A51、A52中的一种：
Figure 347158DEST_PATH_IMAGE003
Figure 476788DEST_PATH_IMAGE004
。
4.根据权利要求1所述氨基脂质，其特征在于，所述R3选自取代或未取代的C4-C18烷基、C4-C18烯基、C4-C18炔基、C4-C18氟代烷基、C4-C18氟代烯基、C4-C18氟代炔基，所述C4-C18烷基、C4-C18烯基、C4-C18炔基、C4-C18氟代烷基、C4-C18氟代烯基、C4-C18氟代炔基的取代基选自C1-C6烃基或C1-C6氟代烃基。
5.根据权利要求4所述氨基脂质，其特征在于，所述R3选自F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7、F8、F9、F10、F11、F12、F13、F14、F15、F16、F17、F18、F19、F20、F21、F22、F23、F24、F25、F26、F27、F28、F29、F30、F31、F32、F33、F34、F35、F36、F37、F38、F39、F40、F41、F42、F43、F44、F45、F46、F47、F48、F49、F50、F51、F52、F53、F54、F55、F56、F57、F58、F59、F60、F61、F62、F63、F64、F65、F66、F67、F68、F69、F70中的一种：
Figure 884635DEST_PATH_IMAGE005
Figure 257498DEST_PATH_IMAGE006
Figure 993372DEST_PATH_IMAGE008
。
6.根据权利要求1所述氨基脂质，其特征在于，R4、R5、L2形成
Figure 51327DEST_PATH_IMAGE009
的结构，选自：C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21、C22、C23、C24、C25、C26、C27、C28、C29、C30、C31、C32、C33、C34、C35、C36、C37、C38、C39、C40中的一种：
Figure DEST_PATH_IMAGE010
。
7.根据权利要求1~6任一项所述氨基脂质的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1. 化合物R1R2L1OH与3-叔丁基二甲硅氧基戊二酸酐加热搅拌反应；
S2. 在缩合剂存在的条件下，在步骤S1反应体系中加入R3OH；
S3. 在步骤S2反应体系中加入R4R5NL2COOH反应，即得。
8.权利要求1至6所述氨基脂质及其药物可接受的盐在制备纳米药物组合物中的应用。
9.权利要求1至6所述氨基脂质及其药物可接受的盐在制备核酸药物、基因疫苗、小分子药物、多肽或蛋白质药物中的应用。
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