CN114869883A - Esi-09在防治svcv感染中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了ESI‑09在防治鱼类鲤春病毒血症病毒（Spring viraemia of carp virus，SVCV）感染中的应用，细胞感染模型的建立显示，ESI‑09能够对SVCV感染细胞起到显著的保护作用，结合qPCR实验及Western Blot实验结果显示，ESI‑09处理后SVCV在转录及蛋白表达水平均被清除。此外，ESI‑09处理使被SVCV诱导表达的宿主免疫基因恢复至正常水平。因此，ESI‑09能够作为防治SVCV感染的药物或添加剂，并具有使用剂量小，保护效果佳的优点。

Description

ESI-09在防治SVCV感染中的应用
技术领域
本发明属于水产养殖技术领域，具体涉及ESI-09的用途，可用于制备预防和治疗SVCV感染的药物或添加剂。
背景技术
ESI-09是一种特定的环腺苷酸结合蛋白(exchange protein directlyactivated by cAMP，EPAC)抑制剂。EPAC是细胞内重要第二信使cAMP的效应分子，能够通过EPAC-Rap1信号通路介导cAMP传递的信号，调节细胞增殖、炎症反应、离子转运、基因表达或者细胞粘附和迁移等多种生理活动。目前，研究表明EPAC在促进肿瘤细胞的增殖、粘附、转移的过程中发挥重要功能，ESI-09则作为EPAC的特异性拮抗剂，能够特异性阻断EPAC介导的Rap1活化和Akt磷酸化，起到抑制肿瘤细胞增殖的作用。目前，对于ESI-09的研究多集中于抗癌及抗细菌功能，而其在抗病毒方面的功能尚未见报道，尚未见有将ESI-09应用于水生病毒防治的实例。
鲤春病毒血症病毒(Spring viraemia of carp virus，SVCV)属弹状病毒科，水疱病毒属，是一种单股负义链RNA病毒。SVCV引起的鲤春病毒血症(SVC)是一种具高传染性，高致死性的水产疾病，能够造成鲤科鱼类大量死亡，形成巨大的经济损失。目前，SVCV的结构及遗传多样性已有较多研究和报道。同样地，SVCV的致病机理被发现包括影响细胞凋亡，造成氧化应激损伤，针对免疫系统实现免疫逃逸等。
尽管SVCV的研究较为丰富，药物研究较多，仍然缺乏行之有效的防治手段，尚无商品化的特效药。目前，研究人员尝试使用新手段治疗SVCV的感染，例如利用RNA干扰诱导病毒基因表达的沉默，但是，该方式具有成本较高，干扰RNA保存困难的缺点。另外，SVCV的疫苗开发目前尚处于探索阶段，包括灭活疫苗、弱毒疫苗、核酸疫苗和亚单位疫苗等。但尚未研发出保护率、成本、接种方式三项均满足规模化生产，能够实现市场投放的疫苗。因此，在当前的研究背景下，寻找高效安全的药物作为SVCV的防治手段仍然是首选。
发明内容
本发明的目的在于提供ESI-09在防治SVCV感染中的应用，ESI-09能够显著抑制鱼类离体培养细胞中SVCV病毒相关基因(包括g，l，m，n，p)的转录，抗病毒实验证实ESI-09对于SVCV感染起到保护作用，ESI-09能够用于制备防治SVCV感染的药物或添加剂。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
ESI-09在防治SVCV病毒感染中的应用：在本发明的具体实施例中，感染SVCV的EPC细胞系在加入20μM ESI-09处理后，病毒造成的细胞病变效应被显著抑制。进一步检测细胞中病毒相关基因扩增情况显示，ESI-09处理之后，EPC细胞中病毒相关基因(包括g，l，m，n，p)的表达被显著抑制，SVCV在转录及蛋白表达水平均被清除，同时细胞系中抗病毒免疫相关基因(包括epcifn,epcisg15,epcvig1)表达量基本恢复正常水平。
本发明实施例中选取鱼类细胞系源于SVCV重要宿主，因此通过建立细胞感染病毒的疾病模型，以及对病毒相关基因表达的检测，可知ESI-09适用于SVCV的病毒防治。
ESI-09作为预防或治疗SVCV感染的药物或添加剂，药物可以以注射剂或口服剂形式使用，具有给药剂量低，成分单一，抗病毒效果佳的优点。ESI-09的结构式如下：
Figure BDA0003707927800000021
附图说明
图1为ESI-09对SVCV感染细胞的影响。
图2为ESI-09对细胞中SVCV病毒基因转录水平的影响。
图3为ESI-09对细胞中SVCV病毒蛋白表达水平的影响。
图4为ESI-09对感染SVCV的细胞中抗病毒免疫相关因子转录水平的影响。
具体实施方式
实施例1：ESI-09对SVCV感染细胞的影响
抗病毒实验用于检测SVCV病毒在细胞中的滴度。在24孔细胞培养板及96孔细胞培养板中进行。EPC细胞用于检测SVCV病毒滴度。取生长状态良好的EPC细胞传代接入24孔板，28℃培养过夜；接种MOI＝10的SVCV于EPC细胞，同时加入20μM ESI-09处理；接种后继续培养72h，将贴壁细胞使用4％细胞组织固定液固定1h，1％结晶紫染色过夜，次日对染色完成的细胞进行拍照，观察病变效应。固定细胞前收集上清，保存于4℃备测病毒滴度。取生长状态良好的EPC细胞传代接入96孔板，28℃培养过夜；接种收集的上清后，分别使用TCID50方法计算ESI-09未处理组和处理组病毒滴度。结果如图1所示，20μMESI-09处理后的感染病毒细胞中，细胞病变效应明显被抑制，病毒滴度显著降低。
实施例2：ESI-09对SVCV病毒基因转录的影响
检测感染SVCV之后的EPC细胞用20μM ESI-09处理后，细胞中病毒相关基因的转录水平。取生长状态良好的EPC细胞传代接入6孔板，28℃培养过夜；按照实施例1中描述的方法及病毒浓度接种并进行药物处理；继续培养24h后，吸尽细胞培养基，用TRIzol(Invitrogen)裂解细胞沉淀后提取细胞总RNA，由GoScript逆转录试剂盒(Promega)逆转录得到cDNA。通过qPCR检测病毒相关基因(包括g，l，m，n和p)的转录水平，相关方法参照文献[1]。结果表明：20μM ESI-09处理后，细胞中SVCV病毒相关基因(包括g，l，m，n，p)的转录水平显著下降(图2)。
实施例3：ESI-09对SVCV增殖的影响
检测感染SVCV之后的EPC细胞用20μM ESI-09处理后，细胞中病毒相关蛋白的表达情况。取生长状态良好的EPC细胞传代接入6孔板，28℃培养过夜；按照实施例1中描述的方法接种病毒及药物处理；继续培养24h后，吸尽细胞培养基，PBS润洗一遍后放入-80℃冰箱保存；向冰冻保存的细胞沉淀中加入适量RIPA弱裂解液，置于4℃裂解1小时，使细胞充分裂解；吸取细胞裂解物至新的1.5mL离心管中，样品加入1/4体积的5×SDS Sample Buffer，涡旋混匀，100℃沸水浴10min，置于冰上备用。使用Western Blot实验检测ESI-09处理后SVCV蛋白表达水平(核蛋白N、磷酸化蛋白P)，相关方法参照文献[2]。实验结果表明，20μM ESI-09处理后，细胞中SVCV病毒蛋白N、P的表达水平显著降低(图3)。
实施例4：ESI-09对宿主抗病毒免疫相关基因表达水平的影响
感染SVCV之后的EPC细胞用20μM ESI-09处理后，检测细胞中抗病毒免疫相关基因的表达情况。取生长状态良好的细胞传代接入6孔板，28℃培养过夜；按照实施例1中描述的方法及病毒浓度接种病毒并进行药物处理；继续培养24h后，用TRIzol(Invitrogen)裂解贴壁细胞后提取细胞总RNA，由GoScript逆转录试剂盒(Promega)逆转录得到cDNA。使用qPCR检测抗病毒免疫相关因子的转录水平(包括epcifn，epcisg15，epcvig1)，相关方法参照文献[3]。实验结果表明，20μM ESI-09处理后，经SVCV病毒刺激后表达水平较高的抗病毒免疫相关因子(包括epcifn，epcisg15，epcvig1)在ESI-09处理后显著恢复(图4)。
参考文献
[1]ZHOU X Y,LU L F,LI Z C,et al.Temperature effects on SVCVpropagation and the related IFN response in zebrafish[J].Aquaculture,2021,533.
[2]LU L F,ZHANG C,LI Z C,et al.A novel role of Zebrafish TMEM33 innegative regulation of interferon production by two distinct mechanisms[J].PLoS Pathog,2021,17(2):e1009317.
[3]LU L F,ZHANG C,LI Z C,et al.Grass Carp Reovirus VP35 Degrades MAVSThrough the Autophagy Pathway to Inhibit Fish Interferon Production[J].FrontImmunol,2021,12:613145.

Claims (2)

1.ESI-09在制备防治鲤春病毒血症病毒感染的药物中的应用。
2.ESI-09在制备防治鲤春病毒血症病毒感染的添加剂中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2014123680A1 (en) * 2013-02-08 2014-08-14 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Antimicrobial methods using inhibitors of exchange proteins directly activated by camp (epac)

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