CN114868617A - 一种利用共生菌进行独蒜兰直播育苗的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种利用共生菌进行独蒜兰直播育苗的方法，包括如下步骤：在培养基质中混入印度梨形孢，播种独蒜兰种子共生培养，得共生独蒜兰幼苗。该方法操作简便，首次利用共生菌与独蒜兰种子直接播种育苗，10～15天后，绝大部分种子现绿，30天后，大量原球茎出现原生分生组织，45天后，原球茎长出第一片叶，2个月后，幼苗形成2～3片叶，发育出根，可移栽至苗圃。
Description
技术领域
本发明属于兰科植物培育技术领域，具体涉及一种利用共生菌进行独蒜兰直播育苗的方法。
背景技术
独蒜兰(Pleione bulbocodioides)是我国特有的花卉资源，被列为国家二级保护植物，多分布于西南山地森林中。在野外，该种类可附生于多种树木的枝干上，花色绚丽，花期较长，具有较高的观赏价值。该物种的假鳞茎被收入药典，作为“山慈菇”或“冰球子”使用，具有治疗痈肿疔毒、瘰疬痰核、淋巴结结核和蛇虫咬伤的作用。
兰科植物可通过自然分蘖和组织培养等方式进行繁殖，但自然分蘖繁殖系数低，组织培养技术尚不成熟。基于对不同物种所需营养条件的摸索，目前多种兰科植物已能通过无菌播种获得小苗，但无菌萌发育苗生产成本高、步骤繁琐，比如在种子萌发、原球茎分化、幼苗继代和生根壮苗阶段通常需要不同的培养基，且无菌苗出瓶后生长慢，易感病。独蒜兰的人工栽培尚处于起步阶段，主要依赖种子无菌萌发技术获得小苗，需要在实验室条件下-无菌玻璃瓶中的培养基上进行，操作复杂且条件要求苛刻、成本高。虽然共生萌发技术可以提高种子的萌发率、原球茎分化速度及幼苗成活率，但是目前已经报道与兰科种类共生的菌种屈指可数，且有的共生培养也仅局限在培养瓶中。因此，亟需开发更为高效、低成本的育苗技术，推进独蒜兰的人工繁育，促进野生种群资源的保护。
发明内容
本发明提供了一种利用共生菌进行独蒜兰直播育苗的方法，该方法操作简便，成本低，可有效培育出独蒜兰幼苗。
为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供一种利用共生菌进行独蒜兰直播育苗的方法，在培养基质中混入印度梨形孢，播种独蒜兰种子共生培养，得共生独蒜兰幼苗。
优选的，所述培养基质由重量比为0.5～2:0.5～2的椰糠与砂砾组成。
优选的，所述印度梨形孢为印度梨形孢悬浮液或印度梨形孢菌块。
优选的，所述印度梨形孢悬浮液是将印度梨形孢接种至PDA液体培养基中，室温振荡培养得到。
优选的，所述播种独蒜兰种子的方式为将独蒜兰种子制备成悬浮液播种或直接播撒。
优选的，所述共生培养的条件为光照10～18h/黑暗10～18h、光强2000～3000Lx、温度20～28℃。
优选的，独蒜兰种子播种后需定期喷水，保持基质表面潮湿。
优选的，当独蒜兰种子出现原生分生组织后，定期喷施无糖的1/2MS营养液、生长激素IAA和6-BA的水溶液。
优选的，所述生长激素IAA和6-BA的水溶液浓度为0.3～1mg/L。
优选的，当独蒜兰原球茎形成后，可将培养温度调至20～22℃进行共生培养。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明首次选用印度梨形孢与独蒜兰共生直接播种方法，可用于苗圃育苗或者野外露地种子直播，相对于无菌播种或组织培养具有成本低廉，野外成活率高，无组织退化问题等优点，具有代替组织培养获得种苗的应用价值。
(3)本发明操作简便、成本低，种子萌发及成苗快，适于推广应用，在兰科药用植物的仿生栽培、珍稀濒危植物的回归、解决独蒜兰栽培产业种苗来源瓶颈问题等方面都具有较大的推广价值。
附图说明
图1印度梨形孢与独蒜兰种子在燕麦培养基上的共生萌发结果(B图为A图在解剖镜下拍摄的放大图)。
图2 Y75、Y43菌株、无菌琼脂块与独蒜兰种子在燕麦培养基上的共生萌发结果。
图3独蒜兰种子纯沙直播结果(A图为播种后15天、B图为播种后30天)。
图4解剖镜下观察的独蒜兰种子。
图5播种后15天独蒜兰在椰糠和砂砾混合基质上共生萌发形成原球茎。
图6播种后30天共生萌发的独蒜兰原球茎分化出原生分生组织(图B为显微观察原球茎横切面，图C为图B的放大图)。
图7直播两个月的独蒜兰幼苗。
图8直播三个月的独蒜兰幼苗。
具体实施方式
本发明提供了一种利用共生菌进行独蒜兰直播育苗的方法，包括如下步骤：在培养基质中混入印度梨形孢，播种独蒜兰种子共生培养，得共生独蒜兰幼苗。在本发明中，所述印度梨形孢菌株隶属担子菌门伞菌纲蜡壳耳目蜡壳耳科(Serendipitaceae)，购买自中国科学院微生物研究所中国普通微生物菌种保藏管理中心(China GeneralMicrobiological Culture Collection Center)，保藏编号为CGMCC No.3.17686，ITS序列的GenBank索取号为KF061284。
在本发明中，所述培养基质优选由重量比为0.5～2:0.5～2的椰糠与砂砾组成，更优选为1:1。本发明中，将椰糠与砂砾混合物装入布袋中，在高压灭菌锅中灭菌，然后平铺至育苗盘或扁平塑料盒中，塑料盒顶部留透气孔。
在本发明中，所述印度梨形孢为将印度梨形孢悬浮液或印度梨形孢菌块。本发明所述印度梨形孢悬浮液的制备方法如下：将印度梨形孢接种至PDA液体培养基中，室温振荡培养，经钢筛或纱布或尼龙网过滤培养液，然后加无菌水，即得印度梨形孢悬浮液。本发明所述振荡速度优选为100～300rpm，更优选为150rpm；所述培养时间需超过10天。本发明所述印度梨形孢悬浮液的制备方法可以有效扩繁菌株的菌丝及孢子。本发明所述印度梨形孢菌块的制备方法如下：将印度梨形孢接种至PDA培养基中，20～30℃培养7～10天，即得印度梨形孢菌块。
在本发明中，所述PDA培养基的配制方法为：取削皮后的马铃薯200g煮软，取滤液，加葡萄糖20g，琼脂16g，用蒸馏水定容至1升；所述PDA液体培养基的配制方法为：取削皮后的马铃薯200g煮软，取滤液，加葡萄糖20g，用蒸馏水定容至1升。
在本发明中，所述播种独蒜兰种子的方式为将独蒜兰种子制备成悬浮液播种或直接播撒。本发明所述独蒜兰种子可以用次氯酸钠溶液浸泡消毒。本发明所述次氯酸钠溶液中有效氯离子浓度优选为3～10％，更优选为5％，所述浸泡时间优选为8～15min，更优选为10min。
在本发明中，所述共生培养的方式为光照10～18h/黑暗10～18h、光强为2000～3000Lx的人工气候箱内，20～28℃培养，优选为光照12h/黑暗12h、光强为2500Lx的人工气候箱内，25℃培养。
在本发明中，播撒独蒜兰种子后需定期喷水，保持基质表面潮湿。本发明中所述水优选为无菌水。
在本发明中，当独蒜兰种子出现原生分生组织后，定期喷施无糖的1/2MS营养液、生长激素IAA和6-BA的水溶液。本发明中所述生长激素IAA和6-BA的水溶液浓度均优选为0.3～1mg/L，更优选为0.5mg/L。本发明所述生长激素IAA和6-BA还可混合制备水溶液喷施，总浓度为0.5mg/L，混合质量比为1:1。在本发明若无特殊说明，所有的原料组分均为本领域技术人员熟知的市售商品。
在本发明中，在原球茎形成前，若基质表面有明显的霉菌菌落，可用75％的乙醇消毒液进行局部喷杀，在原球茎形成后，可将培养箱温度调低至20-22℃进行共生培养。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1验证印度梨形孢促进独蒜兰种子共生萌发的有效性
(1)菌株活化和鉴定
公共菌种库和实验室中通常用玻璃试管和斜面培养基在低温下保藏菌种。因此，刚获得的菌种通常处于较低活力的状态，在使用前需要转接至培养平皿中进行活化。为确认菌株的遗传学信息，需提取菌株DNA，扩增菌株的nrDNAITS区间后测序，并与GenBank数据库中的相应真菌序列进行比对。
A.配制PDA培养基：取削皮后的马铃薯200g煮软，取滤液，加葡萄糖20g，琼脂16g，用蒸馏水定容至1升。
B.用三角瓶分装，在高压灭菌锅中灭菌(121℃，20min)。灭菌后，将三角瓶置于超净工作台上稍稍冷却，分装培养基至无菌透明塑料平皿或灭菌的玻璃平皿中，冷却备用。在超净工作台上，从玻璃试管保藏的印度梨形孢菌株斜面上切取较小的菌丝块，转接至PDA培养皿中，25℃培养7～10天。
C.待菌丝长满2/3皿后，在超净工作台上，挑取菌丝体至离心管中，利用CTAB法或试剂盒提取总DNA，利用ITS通用引物进行PCR扩增、扩增产物利用电泳检测纯化后，送至生工生物科技公司测序。所得序列利用Blast工具(Basic LocalAlignment SearchTool)进行比对，比对结果显示所得菌株与KF061284(来自印度梨形孢的模式标本DSM 11827)的相似度高达100％，证实该菌株为印度梨形孢。
(2)燕麦培养基共生萌发实验
A.配制燕麦培养基：称取4g燕麦片，煮沸取滤液，滤液中加12g琼脂粉，定容至1L，分装至三角瓶，高压灭菌后分装至无菌平皿。
B.取步骤(1)中活化并鉴定的印度梨形孢培养皿，在超净台上用1mL无菌枪头打取成若干菌块备用，同时取步骤(1)制备的无菌PDA培养基的琼脂块备用。
C.将独蒜兰种子放入5％的次氯酸钠溶液中浸泡10min，用无菌水浸洗3次，在超净台上取适量的种子置于燕麦培养皿中，同时接种印度梨形孢菌丝块(实验组)、无菌琼脂块(空白对照组)、Y75菌株(对照组1，角担菌科Ceratobasidiaceae，GenBank no.MW231902)和Y43菌株(对照组2，角担菌科Ceratobasidiaceae，GenBankno.MW231930)；光照12h/黑暗12h，光强为2500Lx的人工气候箱内，25℃培养。定期取出观察独蒜兰种子萌发情况。
图1结果显示，播种70～80天后，接种印度梨形孢可促使独蒜兰种子萌发形成原球茎并分化形成叶片(图1中的A和B)，接种Y75和Y43菌株以及无菌琼脂块，均未观察到独蒜兰种子萌发(图2)。该处播种独蒜兰种子后需70～80天才能分化形成叶片是因为燕麦培养基营养极其贫乏所致。
(3)纯沙直播实验
A.配制PDA培养基和PDA液体培养基：PDA培养基制备方法同实施例1步骤(1)，PDA液体培养基不加入琼脂粉，其余步骤同PDA培养基的制备方法。高压灭菌后，将PDA培养基分装至无菌平皿中，将PDA液体培养基分装至无菌三角瓶中。
B.经步骤(1)活化鉴定后的印度梨形孢菌株转接至无菌PDA平板上培养，同时接种部分至PDA液体培养基的三角瓶中，室温振荡培养(150rpm)10天以上，得印度梨形孢培养液，将培养液用筛子或纱布过滤，去除含有糖分的滤液后，将获得的菌丝体加无菌水重悬，制成印度梨形孢悬浮液。
C.以纯沙作为培养基质，于培养基质中浇入印度梨形孢悬浮液后播撒独蒜兰种子，播种15天可见大量种子萌发形成原球茎，30天后出现原生分生组织。结果见图3。
实施例2利用印度梨形孢进行独蒜兰种子直播育苗
(1)印度梨形孢悬浮液的制备：步骤同实施例1步骤(3)A～B。
(2)椰糠直播育苗
A.将椰糠与砂砾按1:1混匀，装入布袋，在高压灭菌锅中灭菌。冷却后平铺至扁平塑料盒中，塑料盒顶部留透气孔。
B.取印度梨形孢菌悬液浇透砂砾与椰糠的混合基质。取独蒜兰种子(见图4)播撒至基质表面，用喷雾瓶将种子表面喷湿。
C.盖上透明盒盖，将塑料盒置于人工气候箱中，光照12h/黑暗12h、光强2500Lx、25℃条件下培养。
D.定期喷施无菌水，保持基质表面潮湿，10～15天后，绝大部分种子出现绿色，种胚吸水膨大突破种皮，形成原球茎(见图5)；此后，采用无糖1/2MS营养液进行喷雾，并分别喷施IAA和6-BA水溶液(浓度均为0.5mg/L)；第30天，大量原球茎出现原生分生组织，随机选取原球茎，在解剖镜下进行横切，置于显微镜下观察，可见原球茎被共生菌印度梨形孢侵染，原球茎近基部细胞有黄褐色的印度梨形孢菌丝团(见图6)。随机抽取原球茎提取DNA，利用真菌特异性引物对ITS1F/ITS4扩增ITS区间，证实所得序列为印度梨形孢。播种约45天后，原球茎长出第一片叶，进入幼苗发育初期；2～3个月后(图7和图8)，幼苗形成2-3片叶，发育出根，可移栽至苗圃并补充浇灌印度梨形孢菌悬液。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种利用共生菌进行独蒜兰直播育苗的方法，其特征在于，在培养基质中混入印度梨形孢，播种独蒜兰种子共生培养，得共生独蒜兰幼苗。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基质由重量比为0.5～2:0.5～2的椰糠与砂砾组成。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述印度梨形孢为印度梨形孢悬浮液或印度梨形孢菌块。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述印度梨形孢悬浮液是将印度梨形孢接种至PDA液体培养基中，室温振荡培养得到。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述播种独蒜兰种子的方式为将独蒜兰种子制备成悬浮液播种或直接播撒。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述共生培养的条件为光照10～18h/黑暗10～18h、光强2000～3000Lx、温度20～28℃。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，独蒜兰种子播种后需定期喷水，保持基质表面潮湿。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当独蒜兰种子出现原生分生组织后，定期喷施无糖的1/2MS营养液、生长激素IAA和6-BA的水溶液。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述生长激素IAA和6-BA的水溶液浓度均为0.3～1mg/L。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当独蒜兰原球茎形成后，可将培养温度调至20～22℃进行共生培养。
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