CN114867842A - 嗜酸乳杆菌kbl409菌株及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)KBL409菌株及其用途。根据本发明的嗜酸乳杆菌KBL409菌株(登记号KCTC 13518BP)减轻肾炎症和血液中尿毒症物质(例如血尿素氮、肌酐和对甲酚等)的浓度以保护肾，并表现出蛋白尿减轻、肾线粒体功能恢复和肾纤维化抑制的作用，并且因此可有效应用于肾功能改善以及肾病(包括慢性肾病)的预防和治疗。

Description

嗜酸乳杆菌KBL409菌株及其用途

技术领域

本发明涉及嗜酸乳杆菌KBL409菌株及其用途，并且更具体地，涉及新的益生菌嗜酸乳杆菌KBL409菌株，以及包含选自该菌株、其培养物、裂解物和提取物中的至少一种的用于预防或治疗肾病的药物组合物、食品组合物和动物饲料组合物。

背景技术

慢性肾病(Chronic kidney disease，CKD)是已成为全球健康问题的疾病，并且据报道，在美国，整个研究群体的13％以在世界十分之一的频率表现出慢性肾衰竭。慢性肾衰竭难以轻易地预期可逆的恢复，并且如果肾功能逐渐降低并进入慢性肾衰竭的5个阶段，就必须在终末期肾衰竭状态下准备透析或移植。

迄今为止已知的肾衰竭的治疗仅集中于肾功能丧失导致的并发症的治疗，并且没有可从根本上恢复肾衰竭的药物。近数十年来，已经尝试了数种药物来阻止肾衰竭的进展，但仅阻断肾素-血管紧张素系统(Renin-angiotensin system，RAS)的药物的程度仅在一定程度上缓解肾衰竭，并且至今尚无明确的在临床上可用于恢复肾衰竭的药物。

随着肾衰竭的进展，随着尿毒症毒素在体内积聚，会出现多种并发症。这些尿毒症毒素被认为是主要并发症的原因，例如在体内诱导炎性应答和氧化应激，以及促进血管老化(Cachofeiro V et al.Oxidative stress and inflammation,a link betweenchronic kidney disease and cardiovascular disease.Kidney Int Suppl 2008:S4-9；Wu J et al.The role of oxidative stress and inflammation in cardiovascularaging.Biomed Res Int 2014；2014:615312)。尿物质包括硫酸对甲酚(p-cresyl sulfate，PCS)、硫酸吲哚酚(indoxyl sulfate，IS)和三甲胺-N-氧化物(trimethylamine-N-oxide，TMAO)，并且已报道，对于患有慢性肾衰竭的患者，在血清和尿中PCS、IS、TMAO的水平高于正常水平(Ramezani A et al.,Role of the Gut Microbiome in Uremia:A PotentialTherapeutic Target.Am J Kidney Dis.2016 67:483-498)。这些是在摄入对甲酚、吲哚、三甲胺(trimethylamine，TMA)之后在肝中代谢的次级代谢物，其是由肠微生物区系(microbiota)通过上皮细胞降解食品在肠中的酪氨酸(或苯丙氨酸)、色氨酸和胆碱而产生的代谢物(见下图25)。

这些尿毒症毒素在体内积聚的最重要的原因是肾排泄降低。然而，尿毒症毒素的很大一部分是食品被经口吸收之后在肠中产生的氮废物产物，并且其受肠环境和微生物的影响很大。出于这个原因，引入了“肠透析”的概念，并且肠黏膜充当半透膜将一些废物排泄到肠中。事实上，为抑制在肠中发生的尿毒症毒素吸收而开发的药物正在用于临床实践，并且诸如磷结合剂和钾降低抑制剂的药物是诱导特定物质例如磷或钾在肠中不被吸收的药物。另外，AST-120(

Kureha-Chemical Co.,Tokyo,Japan)是由碳微球构成的经口吸附剂，并且其是通过吸附基于吲哚的物质(其是在肠中产生的代表性的尿毒症毒素)来诱导通过粪便排泄的药物。然而，这些药物大部分具有消化系统的副作用，例如消化不良、恶心、呕吐和便秘，因此对药物的依从性低于其他一般药物。因此，除透析或移植之外，仍没有有效的去除尿毒症的方法。

益生菌是指具有抗菌活性和酶活性帮助平衡肠微生物组的微生物以及由该微生物产生的产物。另外，益生菌被定义为以干的细胞或发酵产物的形式提供给人或动物以改善肠微生物组的作为单一或联合形式的活细菌。益生菌应具备的特性是以人的肠为栖息地，具有非致病性和非毒性特性，并且必须在进入肠时存活。此外，其必须在递送的食品中消耗之前保持存活率和活性，对用于预防感染的抗生素敏感，并且不具有抗生素抗性质粒。另外，其必须对肠环境中的酸、酶和胆汁具有抗性。最近，益生菌作为可替代现有的基于化合物的治疗剂的主要治疗性物质已经受到关注，因为已报道了改善健康功能的多种作用。

通过多种最近的研究，健康的肠微生物群在调节营养和代谢、免疫应答方面发挥重要的作用，并且已报道肠微生物的失衡与多种疾病例如肥胖、2型糖尿病、炎性肠病、心血管并发症等有关。在慢性肾衰竭的情况下，在患者的十二指肠和空肠中也观察到了在正常人中未见的菌株的生长，并且特别是见到需氧菌株的过度增殖，一些报道已报道了诸如肠杆菌(Enterobacteria)或肠球菌(Enterococci)的菌株在血液透析患者中提高了超过100倍(Simenhoff ML et al.Biomodulation of the toxic and nutritional effects ofsmall bowel bacterial overgrowth in end-stage kidney disease using freeze-dried Lactobacillus acidophilus.Miner Electrolyte Metab 1996；22:92-96；Hida Met al.,Inhibition of the accumulation of uremic toxins in the blood and theirprecursors in the feces after oral administration of Lebenin,alactic acidbacteria preparation,to uremic patients undergoing hemodialysis.Nephron 1996；74:349-355)。也有报道称，在患有慢性肾衰竭的患者中，已知平衡肠微生物环境的适当平衡，产生短链脂肪酸以抑制酵母菌、真菌和有害细菌感染，以及分泌多种代谢物的乳杆菌(Lactobacillus)或双歧杆菌(Bifidobacteria)菌株减少，最终导致肠失衡(Koppe L etal.,Probiotics and chronic kidney disease.Kidney Int 2015；88:958-966；RamezaniA &Raj DS.The gut microbiome,kidney disease,and targeted interventions.J AmSoc Nephrol 2014；25:657-670；Ranganathan N et al.Pilot study of probioticdietary supplementation for promoting healthy kidney function in patientswith chronic kidney disease.Adv Ther 2010；27:634-647)。

因此，最近已报道通过在患有慢性肾衰竭的患者中将不平衡的肠细菌环境转变为健康环境来减轻由于尿毒症疾病引起的并发症并改善肾功能的尝试。特别地，当在使用Sprague Dawley大鼠的5/6肾切除模型中实验性地施用包含乳杆菌和双歧杆菌菌株的益生菌16周时，血液中的氮水平降低并且预期了使用益生菌改善肾功能的效果(Ranganathan Net al.Probiotic amelioration of azotemia in 5/6th nephrectomized Sprague-Dawley rats.ScientificWorldJournal 2005；5:652-660)。患者在临床研究中也显示出积极的结果，并且在1996年已显示出，当通过将乳杆菌菌株经口施用于正在接受8次透析的患有终末期肾衰竭的患者而在患有慢性肾衰竭的患者(因为他们报告出血液二甲胺(DMA)和亚硝基二甲胺)中施用益生菌时，其降低了血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)(其是肾衰竭的一个指标)水平(Ranganathan N et al.Pilot study of probiotic dietarysupplementation for promoting healthy kidney function in patients withchronic kidney disease.Adv Ther 2010；27:634-647；Ranganathan N et al.Probioticdietary supplementation in patients with stage 3and 4chronic kidney disease:a6-month pilot scale trial in Canada.Curr Med Res Opin 2009；25:1919-1930)。在其中首次对患有慢性肾衰竭的患者进行的随机、双盲研究中，观察到制备其中将益生菌和益生元混合的肠溶包衣胶囊并施用于处于慢性肾功能不全4期的患者显著地降低对甲酚血液水平，这是重要的肠发育尿毒症，尽管未在整个患者的血液中降低硫酸吲哚酚水平，但在未暴露于抗生素的患者中显著降低了硫酸吲哚酚水平。另外，据报道，在肠细菌分析中双歧杆菌菌株显著提高，这可改善肠环境(Rossi M et al.Synbiotics Easing Renal Failureby Improving Gut Microbiology(SYNERGY):A Randomized Trial.Clin J Am SocNephrol 2016；11:223-231)。

发明内容

技术问题

因此，本发明人通过确认以下完成了本发明：新的嗜酸乳杆菌菌株在抑制肾炎症、降低尿毒症毒素、减轻蛋白尿、恢复肾线粒体功能以及抑制肾纤维化方面具有优异的作用，并且可用于改善肾功能以及治疗或预防肾病以用于肾病治疗，并且作为结果，已经研究益生菌用于肾病，包括慢性肾衰竭，其在过去是不令人满意的治疗。

问题的解决方案

本发明的一个目的是提供新的嗜酸乳杆菌菌株及其多种用途，其在改善肾功能或预防和治疗肾病方面表现出优异的作用。

为了实现上述目的，本发明提供了嗜酸乳杆菌KBL409菌株，其保藏号为KCTC13518BP。

本发明还提供了用于预防或治疗肾病的药物组合物，其包含选自以下的至少一种：所述菌株、所述菌株的培养物、所述菌株的裂解物和所述菌株的提取物。

根据本发明的药物组合物可通过减轻肾炎症、降低尿毒症毒素的血液浓度、减轻蛋白尿、恢复肾线粒体功能和/或抑制肾纤维化来预防或治疗肾病。

在本发明中，尿毒症毒素可包含血尿素氮、血液肌酐和/或血液对甲酚。

在本发明中，所述肾病可选自但不限于：尿毒症、慢性肾衰竭、急性肾衰竭、亚急性肾衰竭、肾纤维化、肾小球肾炎、肾盂肾炎、间质性肾炎、蛋白尿、糖尿病肾病、高血压肾病、恶性神经症、狼疮肾炎、血栓性微血管病、移植排斥、肾小球病、肾肥大、肾增生、造影剂诱发性肾病、毒素诱发性肾损伤、氧自由基介导的肾病、多囊肾病和肾炎。

本发明还提供了食品组合物，其包含选自以下的至少一种：所述菌株、所述菌株的培养物、所述菌株的裂解物和所述菌株的提取物。

本发明还提供了动物饲料组合物，其包含选自以下的至少一种：所述菌株、所述菌株的培养物、所述菌株的裂解物和所述菌株的提取物。

本发明的药物组合物可与能够增强本发明嗜酸乳杆菌菌株(KBL409)的肾功能改善作用的另外的益生菌菌株组合施用，所述另外的益生菌菌株例如副干酪乳杆菌和/或植物乳杆菌。优选地，所述另外的益生菌菌株包含副干酪乳杆菌KBL382(保藏号KCTC13509BP)菌株和/或植物乳杆菌KBL396(保藏号KCTC13278BP)。

本发明还提供了用于预防或治疗肾病的方法，其包括向有此需要的个体施用选自所述菌株、所述菌株的培养物、所述菌株的裂解物和所述菌株的提取物中的至少一种。

本发明还提供了组合物用于制备用于预防或治疗肾病的药物的用途，所述组合物包含选自所述菌株、所述菌株的培养物、所述菌株的裂解物和所述菌株的提取物中的至少一种。

附图说明

图1是比较67种乳杆菌菌株和乳球菌菌株的对甲酚降解能力的结果。

图2是比较33种双歧杆菌菌株的对甲酚降解能力的结果。

图3是比较10种显示出高的对甲酚降解能力的乳杆菌候选菌株的对甲酚降解能力的结果。

图4是显示出根据嗜酸乳杆菌KBL409菌株的处理时间的对甲酚降解能力的结果。

图5是确认当处理嗜酸乳杆菌KBL409菌株时PBMC的IL-2、IL-4、IL-13和IL-17A的表达水平的结果。

图6是确认当处理嗜酸乳杆菌KBL409菌株时PBMC的IFN-γ的表达水平的结果。

图7是确认当处理嗜酸乳杆菌KBL409菌株时PBMC的IL-10的表达水平的结果。

图8是鉴定嗜酸乳杆菌KBL409菌株在慢性肾衰竭的动物模型中的肾保护作用的实验的示意图。

图9是显示出通过施用腺嘌呤和嗜酸乳杆菌KBL409菌株引起的肾功能变化的结果。

图10是显示出通过施用腺嘌呤和嗜酸乳杆菌KBL409菌株引起的蛋白尿变化的结果。

图11是显示出通过施用腺嘌呤和嗜酸乳杆菌KBL409菌株引起的肾形态和肾纤维化的变化的结果：(A)对照组，(B)KBL409施用组，(C)腺嘌呤饲料施用组，(D)腺嘌呤饲料和KBL409施用组。

图12是显示出在诱导慢性肾衰竭之后通过施用嗜酸乳杆菌KBL409菌株引起的Procol1a和Acta2的mRNA表达变化的结果。

图13是显示出当施用嗜酸乳杆菌KBL409菌株时与由慢性肾衰竭纤维化诱导的肾相关的蛋白质指标变化的结果。

图14是显示出当施用嗜酸乳杆菌KBL409菌株时肾中巨噬细胞相关指标变化的结果。

图15是通过免疫组织化学检查确认通过施用嗜酸乳杆菌KBL409菌株引起的在慢性肾衰竭诱导的肾组织中巨噬细胞变化的结果：(A)F4/80染色，(B)CD68染色。

图16是显示出通过施用嗜酸乳杆菌KBL409菌株引起的在由慢性肾衰竭诱导的肾中Tlr4、Asc、Nlrp3、IL-18的mRNA表达变化的结果。

图17是通过免疫组织化学检查确认通过施用嗜酸乳杆菌KBL409菌株引起的在慢性肾衰竭诱导的肾组织中NRLP3活性变化的结果。

图18是通过透射电子显微术确认通过施用嗜酸乳杆菌KBL409菌株引起的在由慢性肾衰竭诱导的肾中线粒体的形态变化的结果。

图19是显示出在慢性肾衰竭诱导模型中当施用嗜酸乳杆菌KBL409菌株时全身性炎性应答变化的结果。

图20是显示出根据嗜酸乳杆菌KBL409菌株的施用的血液对甲酚浓度变化的结果：(A)与大肠杆菌的比较(B)嗜酸乳杆菌菌株之间的比较。

图21是显示出根据嗜酸乳杆菌KBL409菌株的施用的血液TMAO浓度变化的结果。

图22是显示出通过嗜酸乳杆菌KBL409菌株单独施用、KBL409和KBL382菌株组合施用、KBL409和KBL396菌株组合施用引起的在由慢性肾衰竭诱导的肾中Nlrp3和Pre-IL18的mRNA表达变化的结果。

图23是显示出通过嗜酸乳杆菌KBL409菌株单独施用、KBL409和KBL382菌株组合施用、KBL409和KBL396菌株组合施用引起的在由慢性肾衰竭诱导的肾中Ppargc1a、Tfam和Mfn1的mRNA表达变化的结果。

图24是显示出通过嗜酸乳杆菌KBL409菌株单独施用、KBL409和KBL382菌株组合施用、KBL409和KBL396菌株组合施用引起的在由慢性肾衰竭诱导的肾中Fn和Procol1的mRNA表达变化和肾中Bax/Bcl2比率变化的结果。

图25是显示出食品中所含的酪氨酸、色氨酸和胆碱通过肠微生物区系和肝而代谢为尿毒症毒素的途径的示意图。

具体实施方式

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。一般而言，本文中使用的术语是本领域公知的并且是常用的术语。

在本发明中，通过确认人来源的微生物的尿毒症作用，选择具有改善肾功能的优异作用的嗜酸乳杆菌KBL409(登记号KCTC 13518BP)菌株，并分析该菌株的16S rDNA以确认该菌株是现有技术中未知的新的菌株。

因此，本发明涉及嗜酸乳杆菌KBL409(保藏号KCTC 13518BP)菌株，其在一方面是新的益生菌，其中所述菌株的特征在于包含由以下SEQ ID NO:1表示的16s rDNA序列。

<SEQ ID NO:1>嗜酸乳杆菌KBL409(保藏号KCTC 13518BP)菌株的16s rDNA序列

因此，在本发明中，对所述菌株进行了效力实验，并且作为结果，确认了所述菌株不仅减轻肾炎症并且在引起慢性肾衰竭的尿毒症毒素的降解作用方面是优异的，还表现出减轻蛋白尿、恢复肾线粒体功能和抑制肾纤维化的作用，并因此对增强肾功能以治疗或预防肾病表现出优异的作用。

具体地，本发明的嗜酸乳杆菌KBL409菌株在慢性肾衰竭的动物模型中显示出显著降低尿毒症毒素(例如血尿素氮、血液肌酐和/或血液对甲酚)的浓度和蛋白尿。

另外，本发明的嗜酸乳杆菌KBL409菌株显著降低了Procol1a和Acta2mRNA(其为肾纤维化的指标)以及胶原蛋白1、纤连蛋白、α-SMA和波形蛋白的表达水平，并且确认了组织病理学检查也减轻了肾小管扩张、肾小管细胞的扁平、肾小管间质的扩张和底物堆积以及肾衰竭特征性肾纤维化的提高。

此外，发现本发明的嗜酸乳杆菌KBL409菌株通过不仅抑制肾小管间质中巨噬细胞的浸润和肾中炎性小体的表达，而且恢复在慢性肾功能不全中发生的线粒体功能障碍并抑制IL-6和TNF-α来在慢性肾衰竭模型中减轻全身性炎性应答。

因此，在另一个方面，本发明涉及用于治疗或预防疾病的药物组合物，所述组合物包含药学有效量的选自以下的至少一种：嗜酸乳杆菌KBL409菌株、所述菌株的培养物、所述菌株的裂解物和所述菌株的提取物。

本发明的药物组合物可作为组合物提供，其中活细胞、干菌株、菌株的培养物、菌株的裂解物、或其组合与可药用载体或介质组合。使用的载体或介质可包含溶剂、分散剂、包衣、吸收增强剂、控制释放剂(即，持续释放剂)和一种或更多种惰性赋形剂(例如，淀粉、多元醇、颗粒、微细纤维素、微晶纤维素、稀释剂、润滑剂、黏合剂、崩解剂等)等。如果期望的话，可通过标准的水性或非水性技术对所公开组合物的片剂制剂进行包衣。可药用载体和赋形剂以及这样的另外成分的实例包括但不限于黏合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、抗微生物剂和包衣剂。

本发明的组合物可使用本领域已知的方法来配制，以在向哺乳动物施用之后提供活性成分的迅速、持续或延迟释放。制剂可以是散剂、颗粒剂、片剂、乳剂、糖浆剂、气雾剂、软或硬明胶胶囊剂、无菌注射溶液剂或无菌散剂的形式。另外，根据本发明的用于预防或治疗肾病的组合物可通过数种途径(包括经口、经皮、皮下、静脉内或肌内)来施用，并且活性成分的剂量可根据多种因素(例如施用途径，患者的年龄、性别和体重，以及患者的严重程度)来适当地选择，并且根据本发明的用于预防或治疗肾病的组合物可与具有改善肾功能或者预防或治疗肾病的作用的已知药剂(例如肾素-血管紧张素系统阻滞剂)组合施用。

本发明的药物组合物可作为肠溶包衣的肠溶制剂提供，特别是作为用于经口使用的单位剂型提供。本文中使用的“肠溶包衣”包括不被胃酸降解以维持包衣，但在小肠中被充分降解以使得活性成分可释放到小肠中的所有已知的可药用包衣。本发明的“肠溶包衣”是指当使之在36℃至38℃下与人工胃液(例如pH 1的HCl溶液)接触时维持原状至少2小时并且优选地随后在人工肠液(例如pH 6.8的KH₂PO₄缓冲溶液)中在30分钟内崩解的包衣。

本发明的肠溶包衣以每核芯约16mg至30mg，优选16mg至20mg或不超过25mg的量进行包衣。当本发明的肠溶包衣的厚度为5μm至100μm，优选20μm至80μm时，作为肠溶包衣可获得令人满意的结果。肠溶包衣的材料适当地选自已知的聚合物材料。在许多已知的出版物(L.Lachman等,The Theory and Practice of Industrial Pharmacy,第3版,1986,pp.365～H；Sucker等,Pharmazeutische Technologie,Thieme,1991,pp.355-359；HagersHandbuchder pharmazeutischen Praxis,第4版,第7卷,pp.739～742和766～778,(Springer Verlag,1971)；和Remington’sPharmaceutical Sciences,第13版,pp.1689～1691(Mack Publ.,Co.,1970))中描述了合适的聚合物材料，其可包括纤维素酯衍生物、纤维素醚、丙烯酸树脂的丙烯酸甲酯共聚物以及马来酸与邻苯二甲酸衍生物的共聚物。

本发明的肠溶包衣可使用其中将肠溶包衣溶液喷涂在核芯上的常规肠溶包衣方法来制备。用于肠溶包衣过程的合适溶剂包括醇，例如乙醇；酮，例如丙酮；和卤代烃溶剂，例如二氯甲烷(CH₂Cl₂)，并且可使用这些溶剂的混合溶剂。向包衣溶液以1:约0.05至约0.3(包衣材料:软化剂)的比率添加软化剂，例如邻苯二甲酸二正丁酯或三乙酸甘油酯。连续进行喷涂过程是合适的，并且可鉴于包衣条件来调节喷涂量。可对喷涂压力进行多种调节，并且通常在约1巴至约1.5巴的喷涂压力下获得令人满意的结果。

在本发明中，肾病是指其中肾不能正常发挥排泄、调节、代谢和内分泌功能，以及其中整体上功能减弱或异常的所有病症，并且包括所有慢性肾病，包括不明显的以及具有降低的底物变化和肾小球滤过功能的所有疾病。由于肾损伤导致的功能下降导致肾及相关结构增大、肾萎缩、体液量变化、电解质失衡、代谢性酸中毒、气体交换障碍、抗感染功能受损和尿毒症毒素积聚。

在本发明中，肾病是指可通过减轻肾炎症、血尿素氮，降低尿毒症毒素(例如血尿素氮、肌酐或对甲酚)的血液浓度，减轻蛋白尿，恢复肾线粒体功能和/或抑制肾纤维化来改善、治疗或预防的疾病。具体地，肾病包括但不限于尿毒症、慢性肾衰竭、急性肾衰竭、亚急性肾衰竭、肾纤维化、肾小球肾炎、肾盂肾炎、间质性肾炎、蛋白尿、糖尿病肾病、高血压肾病、恶性神经症、狼疮肾炎、血栓性微血管病、移植排斥、肾小球病、肾肥大、肾增生、造影剂诱发性肾病、毒素诱发性肾损伤、氧自由基介导的肾病、多囊肾病和肾炎。

在本发明中，除非另有说明，否则术语“治疗”意指逆转、减轻或抑制该术语所适用的疾病或病症的进展，或者该疾病或病症的一种或更多种症状。

此外，在本发明中，术语“预防”涉及避免、延迟、阻碍或妨碍疾病以减轻。

根据本发明的用于预防或治疗肾病的组合物可包含单独的或者与一种或更多种可药用载体、赋形剂或稀释剂一起的药学有效量的嗜酸乳杆菌KBL409菌株。

在本发明中，术语“有效量(或药学有效量)”意指在医学判断范围内非常足以递送期望的作用但是足够低以防止严重副作用的量。鉴于施用途径和施用对象，可适当地调整通过本发明的组合物施用到身体中的微生物的量。

本发明的组合物可以以至少每天一次施用于对象。单位剂量意指适合于人对象和其他哺乳动物的单位剂量的物理上分离的单位，显示出治疗作用的包含适当的药物载体和本发明的嗜酸乳杆菌KBL409的每个单位包含预定量的菌株。用于经口施用于成人患者的剂量单位优选地包含0.001g或更多的本发明微生物，并且本发明组合物的经口剂量为一次0.001g至10g，优选0.01g至5g。例如，本发明的嗜酸乳杆菌KBL409菌株的药学有效量为0.01至10g/天，并且可以以1×10⁸至1×10¹⁰CFU/天施用。然而，剂量将根据患者疾病的严重程度以及微生物和一起使用的辅助活性成分而变化。另外，总每日剂量可根据需要分成数次并连续施用。因此，上述剂量范围不以任何方式限制本发明的范围。

在另一个方面，本发明涉及食品组合物，其包含选自以下的一种或更多种：嗜酸乳杆菌KBL409(保藏号KCTC 13518BP)菌株、菌株的细胞、菌株的培养物、菌株的裂解物和菌株的提取物。

食品组合物可以是用于改善肾功能的食品组合物，优选健康功能性食品。另外，由于肾炎症的减轻、尿毒症毒素的血液浓度的降低、蛋白尿的减轻、肾线粒体功能的恢复和/或肾纤维化的减轻，可实现这样的肾功能改善。

食品组合物可容易地用作对改善肾功能有效的食品，例如，主要原料、辅助原料、食品添加剂、健康功能性食品或功能性食品饮料，但不限于此。

食品组合物意指包含一种或更多种营养物的天然产品或加工产品，并且优选地意指通过一定量的加工过程可直接食用的状态，并且意指在一般意义上的食品，其包括所有食品添加剂、健康功能性食品和功能性饮料。

可添加根据本发明的食品组合物的食品包括，例如，多种食品、饮料、口香糖、茶、维生素复合物、功能性食品等。另外，在本发明中，食品包括但不限于特殊营养食品(例如，配方乳、婴儿食品等)、加工肉制品、鱼肉制品、豆腐、胶冻、面条(例如，拉面、挂面等)、面包、健康补充食品、调味料(例如，酱油、豆瓣酱、红辣椒酱、混合酱等)、酱汁、甜食(例如，小吃)、糖果、巧克力、口香糖、冰淇淋、乳制品(例如，发酵乳、乳酪等)、其他加工食品、泡菜、腌制食品(多种泡菜、咸菜等)、饮料(例如，水果饮料、蔬菜饮料、豆乳、发酵饮料等)、天然调味料(例如，拉面汤等)。食品、饮料或食品添加剂可通过常规的制造方法制备。

术语“健康食品”是指其中通过使用物理、生物化学、生物技术等赋予食品产品附加价值以针对特定目的发挥该食品产品的功能或表达该食品产品的功能的食品群，以及经设计和加工以使其充分表现出与食品组合物所具有的体内防御节律的调节、疾病的预防、恢复等有关的体内调节功能的食品产品。功能性食品可包含食品相关的食品补充剂添加剂，并且还可包含通常用于制造营养剂的合适的载体、赋形剂和稀释剂。

在本发明中，功能性饮料是为了解决口渴或享受味道而饮用的通用术语，并且除了以指定比率包含上述用于改善肾功能的组合物作为基本成分之外，对其他成分没有特别限制，并且其可包含多种香料或天然碳水化合物等作为另外的成分，例如常规饮料。

此外，除上述那些之外，包含本发明的食品组合物的食品包括多种营养物、维生素、矿物质(电解质)、矫味剂(例如合成的和天然的矫味剂)、着色剂和填充剂(乳酪、巧克力等)、果胶酸及其盐、藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇、用于碳酸饮料中的碳酸化剂等，其中组分独立或可组合使用。

在包含本发明的食品组合物的食品中，根据本发明的组合物的量可包括总食品重量的按重量计0.001％至100％，优选按重量计1％至99％，并且在饮料的情况下，其可以以基于100mL的0.001g至10g，优选0.01g至1g的比例包含在内。然而，在为了健康和卫生或为了健康控制而长期摄入的情况下，其可不超过上述范围，并且活性成分由于在安全性方面没有问题而可以以不低于该范围的量使用，并且因此不限于该范围。

本发明的食品组合物可通过将嗜酸乳杆菌KBL409菌株单独添加或添加至可接受的载体来制备，或者以适合于人或动物摄入的组合物的形式制备。即，其可添加至不包含其他益生菌的食品和已经包含一些益生菌的食品。例如，在制备本发明的食品时，可与本发明的菌株一起使用的其他微生物是适合于人或动物摄入并且具有能够在摄入后抑制病原性有害细菌或改善哺乳动物肠道中的微生物平衡的益生菌活性的那些，没有特别的限制。这样的益生微生物的实例包括：酵母，其包含酵母属(Saccharomyces)、假丝酵母属(Candida)，毕赤酵母属(Pichia)和球拟酵母属(Torulopsis)；真菌，例如曲霉属(Aspergillus)、根霉属(Rhizopus)、毛霉属(Mucor)、青霉属(Penicillium)；以及属于以下属的细菌：乳杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、明串珠菌属(Leuconostoc)、乳球菌属(Lactococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、链球菌属(Streptococcus)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、片球菌属(Pediococcus)。合适的益生微生物的具体实例包括酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、两岐双岐杆菌(Bifidobacteriumbifidum)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、嗜酸乳杆菌、消化乳杆菌(Lactobacillus alimentarius)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbruckii)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminus)、格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)等。优选地，通过在本发明的食品组合物中进一步包含在具有优异的益生菌活性的同时还具有优异的改善肾功能作用的益生菌微生物，可进一步增强该作用。可用于本发明的食品组合物中的载体的实例可以是增量剂、高纤维添加剂、包封剂、脂质等，并且这样的载体的实例是本领域公知的。本发明的嗜酸乳杆菌KBL409菌株可以是冻干或包封的形式，或者是培养悬浮液或干粉的形式。

本发明的组合物还可以以包含该菌株的动物饲料添加剂或包含该菌株的动物饲料组合物的形式提供。

本发明的动物饲料添加剂可以是干燥或液体制剂的形式，并且除嗜酸乳杆菌KBL409菌株之外，还可包含其他非病原性微生物。可添加的微生物包括，例如，可在厌氧条件下(例如在牛的胃)产生具有生理活性和有机物降解能力的蛋白水解酶、脂肪分解酶和乳糖糖转化酶的枯草芽孢杆菌。乳杆菌菌株、显示出提高牲畜体重、提高乳的酸流量以及提高饲料的消化吸收率的作用的丝状真菌，例如米曲霉(Aspergillus oryzae)(Slyter,L.L.J.Animal Sci.1976,43.910-926)，以及酵母，例如酿酒酵母(Johnson,D.E etal.J.Anim.Sci.,1983,56,735-739；Williams,P.E.V.et al,1990,211)等。

本发明的动物饲料添加剂除嗜酸乳杆菌KBL409菌株之外，还可包含一种或更多种酶制剂。添加的酶制剂可以是干燥状态或液体状态，并且作为酶制剂，可使用脂肪分解酶(例如脂肪酶)，分解植酸以形成磷酸和磷酸肌醇的植酸酶，使包含在淀粉、糖原等中的α-1,4-糖苷键水解的淀粉酶，作为水解有机磷酸酯的酶的磷酸酶，分解纤维素的羧甲基纤维素酶，分解木糖的木糖酶，使麦芽糖水解成两个葡萄糖分子的麦芽糖酶，水解蔗糖以形成葡萄糖-果糖混合物的转化酶等。

在使用本发明的嗜酸乳杆菌KBL409菌株作为动物饲料添加剂时，作为用于饲料的原材料，可使用花生、包括多种谷物和大豆蛋白质、豌豆、甜菜、果肉、谷物副产品、动物内脏粉、鱼粉等，并且这些原材料可以是未加工的或加工的，其不受限制。加工方法是，但不必要限于，例如，其中装载饲料材料并在压力下将其压缩到恒定排放口的方法，并且在蛋白质的情况下，优选地使用挤压成型，其中由于变性，利用率提高。挤压具有这样的优点，例如通过热处理过程使蛋白质变性和破坏抗酶因子。另外，在大豆蛋白质的情况下，可通过挤压成型增强蛋白质的消化率、使抗营养物(例如胰蛋白酶抑制剂，其是存在于大豆中的蛋白酶抑制剂之一)失活以及提高蛋白酶诱导的消化率改善来提高大豆蛋白质的营养价值。

在另一个方面，本发明的药物、食品或动物饲料组合物还可包含能够增强KBL409菌株的肾功能改善作用的另外的益生菌菌株，或者该组合物可与包含另外的益生菌菌株的单独组合物同时或顺序地共施用。

能够增强KBL409菌株的肾功能改善作用的另外的益生菌菌株优选地包括副干酪乳杆菌和植物乳杆菌，更优选地，另外的益生菌菌株可以是具有以下SEQ ID NO:2的16srDNA序列的副干酪乳杆菌KBL382(保藏号KCTC13509BP)菌株和/或具有以下SEQ ID NO:3的16s rDNA序列的植物乳杆菌KBL396(保藏号KCTC13278BP)。

<SEQ ID NO:2>副干酪乳杆菌KBL382(保藏号KCTC13509BP)菌株的16s rDNA序列

<SEQ ID NO:3>植物乳杆菌KBL396(保藏号KCTC13278BP)菌株的16s rDNA序列

副干酪乳杆菌KBL382和植物乳杆菌KBL396可分别以0.001至10g/天，优选0.01至5g/天的剂量每天一次至数次施用。

从一种或更多种益生菌菌株在单一组合物中作为混合物施用，或者一种或更多种益生菌菌株在不同组合物中分开施用的观点来看，可使用任何合适的菌株比例，只要菌株的协同益生菌作用仍然有用即可。这些比例可由本领域技术人员容易地确定。例如，可使用1:10、1:5、1:1、5:1或10:1比例或这些界限(例如1:1)之间的任何比例的两种菌株(例如KBL409:KBL382)。

在另一个方面中，本发明提供了所述菌株或组合物用于预防或治疗肾病的用途，以及所述菌株或组合物用于制备治疗剂的用途。

在另一个方面中，本发明提供了用于预防或治疗疾病的方法，其包括向需要预防或治疗肾病的对象施用药学有效量的菌株或组合物。

由于上文已经描述了在用于预防或治疗疾病的方法中使用的药物组合物和施用方法，因此省略了对两者之间的共同内容的描述以避免本说明书的过度复杂性。

在另一个方面，可向其施用用于预防或治疗疾病的组合物的对象包括所有动物，包括人。例如，对象可以是动物，例如狗、猫或小鼠。

在下文中，将通过实施例更详细地描述本发明。这些实施例仅用于举例说明本发明，并且对于本领域普通技术人员将明显的是，本发明的范围不应被解释为受这些实施例限制。

实施例1.具有对甲酚降解能力的乳酸菌的选择

作为主要的肾尿毒症毒素的硫酸对甲酚(p-cresol sulfate，PCS)、硫酸吲哚(indole sulfate，IS)和三甲胺N-氧化物(trimethylamine N-oxide，TMAO)的前体分别是对甲酚、吲哚、三甲胺(TMA)和三甲胺，并且是肠微生物产生的苯丙氨酸(或酪氨酸)、色氨酸和胆碱的废物产物。本发明集中于鉴定能够代谢/分解肾尿毒症毒素前体的微生物，并且本发明发明人力图通过选择对甲酚分解作为主要选择对象来通过尿毒症毒素的降解选择表现出治疗肾病的作用的益生菌菌株。为此，评价了总共67种人来源的乳杆菌和乳球菌菌株以及总共33种双歧杆菌菌株的对甲酚降解能力。所有菌株都对低pH和胆汁盐具有抗性，因此它们在整个过程期间都可在胃肠道中存活。在含有对甲酚的MRS培养基中培养菌株之后，通过气相色谱通过测量残余对甲酚浓度来确定对甲酚降解能力。

1-1.菌株培养和样品制备

将本实验中使用的菌株在含有200μM对甲酚的MRS培养基中培养24小时。将2.5μL浓硫酸添加至50μL的每个样品，在90℃下加热30分钟，添加2.5μL制备的内标(0.2mg/mL 2,6-二甲苯酚，Sigma-Aldrich)，并添加50μL乙酸乙酯作为分析溶剂，并在涡旋下混合1分钟。在以15,000rpm离心2分钟之后，将上清液置于GC小瓶(带有250μL玻璃插入物)中。

1-2.通过测量对甲酚浓度来选择菌株

使用气相色谱来确定培养上清液中对甲酚的量。分析设备为GC-EI-MS(Agilent5985)，流量为1.3mL/分钟，并通过将烘箱温度从最初的75℃提高至150℃(速率20℃)和250℃(速率25℃)进行分析(后运行75℃持续3分钟)。DB-5毛细管柱30m×0.25mm，df＝0.25(Agilent)用作柱。

作为结果，虽然大多数乳杆菌和乳球菌菌株不具有高降解能力，但首先选择了显示出一些优异的对甲酚降解能力的10种菌株(图1)。确定了大多数双歧杆菌菌株不降解对甲酚(图2)。

1-3.菌株的二次选择

作为在实施例1-2中确定了其对甲酚降解能力的10种乳杆菌菌株进行二次对甲酚降解评价实验的结果，确定了属于嗜酸乳杆菌种的KBL402和KBL409具有最高的对甲酚降解能力(图3)。两种菌株被判断为在16SrDNA序列上几乎相似，并选择KBL409菌株并进行进一步实验。

1-4.KBL409菌株的对甲酚降解能力的测量

作为以与实施例1-2中相同的方式测量KBL409的随时间推移对甲酚降解能力的结果，确定了KBL409在处理12小时之后可将培养基中的对甲酚降低95％，并且在36小时之后降低85％(图4)。作为结果，发现特别是KBL409表现出优异的对甲酚降解能力，有效减轻了由对甲酚过度积累而引起的肾病。

实施例2.KBL409抗炎作用的确定

由于细胞焦亡(肾病中细胞死亡的重要机制之一)与炎性应答一起发生，因此有必要通过炎性应答的改善来验证肾保护作用。为了确定KBL409的抗炎作用和对甲酚降解能力，使用外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)来确定炎性和抗炎性标志物的表达水平。

2-1.PBMC的制备和菌株的处理

将人来源PBMC(Zen-Bio,Inc.,Research Triangle Park,NC,USA)在含有1％青霉素/链霉素、1％庆大霉素和10％FBS的RPMI-1640培养基(Gibco,Paisley UK)中培养。将培养的PBMC(2×10⁵个细胞)置于96孔板中，并用1μg/mL活化T细胞的抗CD3抗体(OKT3；ThermoFisher Scientific,Inc.,Waltham,MA,USA)处理，并随后以1:100的比例添加KBL409菌株或大肠杆菌并在37℃下培养72小时。

2-2.炎性和抗炎性细胞因子的测量

在菌株处理之后，只获得培养的PBMC细胞的上清液，并测量各细胞因子的量。使用BD Cytometric Bead Array(CBA)人Th1/Th2/Th17细胞因子试剂盒(BD Biosciences)来测量IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ和IL-17A，以及对于IL-13测量，使用IL-13人酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(BMS231-3；Thermo Fisher Scientific)来测量IL-13。

作为结果，在KBL409处理组(CD3/KBL409)中，确定了Th1炎性细胞因子IL-2、Th2炎性细胞因子IL-4和IL-13，以及Th17炎性细胞因子IL-17A保持显著低于大肠杆菌处理组(CD3/大肠杆菌)和PBS处理组(CD3/PBS)(图5)。另一方面，IFN-γ(另一种Th1炎性细胞因子)与PBS处理组(CD3/PBS)没有显著不同，但确定了其保持显著低于大肠杆菌处理组(CD3/大肠杆菌)(图6)。另外，作为确定用KBL409在PBMC中处理之后抗炎细胞因子IL-10的表达水平的结果，确定了KBL409处理组(CD3/KBL409)中的IL-10表达显著高于PBS处理组(CD3/PBS)中的IL-10表达(图7)。因此，发现KBL409可通过显著抑制T细胞中炎性细胞因子的总体表达和提高抗炎性细胞因子IL-10的表达来抑制伴随慢性肾衰竭的肾和全身性炎性应答。

实施例3.KBL409在慢性肾衰竭诱导的小鼠模型中的作用的确定

用于通过饲喂含有腺嘌呤(0.2％腺嘌呤)的饲料诱导肾衰竭的方法被广泛用作肾衰竭诱导模型，因为其不需要手术、不造成死亡、相对容易摄取饲料、可观察长的时间段、免于对肾切除术的需求、可观察到双肾的所有肾衰竭、并且可获得足够的组织(Jia T etal.A new model of adenine-induced tubulointerstitial nephropathy in mice.BMCNephrol 2013；14:116)。在本发明中，使用腺嘌呤诱导的肾衰竭模型，确定了在施用KBL409之后改善肾功能变化、肾纤维化等以及炎症的作用。另外，还确定了降低由于肾功能下降血液中尿毒症毒素的作用。

3-1.慢性肾衰竭诱导的小鼠的模型产生和菌株的施用

在本实验中，将平均体重为约20g的7周龄C57BL/6小鼠分为对照组和实验组。如图8中所示，对照组进一步分为两组，施用KBL409菌株的组(Con+KBL409；n＝10)和不施用的组(Con；n＝10)。对实验组施用腺嘌呤饲料以诱导慢性肾衰竭，并将其分为施用KBL409菌株的组(CKD+KBL409；n＝10)和不施用的组(CKD；n＝10)，并且使用共4组小鼠进行实验。将腺嘌呤饲料制成其中将0.2％腺嘌呤添加至常规饲料的膳食，并且每天经口施用1×10⁹CFU的KBL409菌株。在饲养6周之后处死所有组中的小鼠并取出肾(图8)。

3-2.检查肾功能的变化

血尿素氮(BUN)是通过测量血液中尿素中所含的氮而获得的值，肌酐是体内过滤“记录”

其是肌酸(一种类型的蛋白质)的废物产物，并通过肾小球过滤，而白蛋白尿(也称为蛋白尿)是尿中蛋白质的混合物。高白蛋白尿、BUN和肌酐含量表明肾功能受损。因此，为了确定KBL409对慢性肾衰竭的作用，使用生物化学分析仪(AutomatedChemistry Analyzer,Roche，HITACHI7600)在每组小鼠处死之前收集的尿和血液中测量白蛋白尿、BUN和肌酐的量。

作为结果，如在图9中可看出，与对照组(Con)相比，腺嘌呤饲料施用组(CKD)显示出BUN和肌酐浓度显著提高，确定了成功诱导了慢性肾衰竭。另外，与仅接受腺嘌呤饲料的组相比，腺嘌呤饲料和KBL409施用组(CKD+KBL409)显示出显著较低的BUN和肌酐浓度(图9)。在白蛋白尿的情况下，与对照组(Con)相比，在腺嘌呤饲料施用组(CKD)中白蛋白尿的量显著提高，而与之相比，腺嘌呤饲料和KBL409施用组(CKD+KBL409)显著降低了白蛋白尿的量(图10)。因此，确定了本发明的KBL409的施用通过降低作为肾衰竭的代表性指标的白蛋白尿的量、BUN和肌酐浓度而表现出改善肾功能的作用。

3-3.检查肾纤维化的变化

肾纤维化是指其中由于在肾组织中发生的多种原因(例如过度炎性反应、氧化应激和上皮纤维化)导致的肾组织纤维化引起的肾功能损失的症状。其是肾病的重要标志物，并且是终末期肾衰竭最常见的症状之一。因此，为了确定KBL409对根据慢性肾衰竭的肾纤维化的作用，对在实施例3-1中获得的各组肾组织样品进行组织病理学检查，对Procol1a和Acta2mRNA的表达水平，以及胶原蛋白1、纤连蛋白、α-SMA和波形蛋白的表达水平进行了分析。

3-3-1.组织病理学检查

将实施例3-1中获得的肾组织样品通过常规的福尔马林固定和石蜡包埋(formalin fixed paraffin embedded，FFPE)制备为4μm厚的组织切片。进行了针对肾组织中血管间质扩张和肾小球肥大的高碘酸-希夫(Periodic acid-Schiff，PAS)染色以及针对间质纤维化的马森三色(Masson’strichrome)染色。在染色之后，在光学显微镜下观察各组的组织切片。

作为结果，与对照组(Con，图11A)相比，在腺嘌呤饲料施用组(CKD，图11C)中，观察到肾小管扩张(为肾衰竭的特征)、扁平上皮和肾小管间质扩张和基质积累，并且通过马森三色染色观察到肾纤维化提高。在腺嘌呤饲料和KBL409施用组(CKD+KBL409，图11D)中，清楚地观察到上述组织学变化，并且特别地，确定了纤维化显著减轻。

3-3-2.肾纤维化指标的鉴定(1)

为了确定肾组织中作为纤维化指标的Procol1a和Acta2基因的表达程度，从上述实施例3-1中获得的各组肾组织中分离mRNA，并通过定量聚合酶链反应(qPCR)来分析Procol 1a和ACta2基因的mRNA表达水平。

作为结果，确定了与对照组(Con)相比，在腺嘌呤饲料施用组(CKD)中Procol1a和Acta2基因的mRNA表达水平显著提高，而在腺嘌呤饲料和KBL409施用组(CKD+KBL409)中观察到显著降低(图12)。

3-3-3.肾纤维化指标的鉴定(2)

通过western印迹来确定从实施例3-1中获得的各组肾组织中作为肾纤维化相关蛋白指标的胶原蛋白1、纤连蛋白、α-SMA和波形蛋白的表达。

作为结果，确定了胶原蛋白1、纤连蛋白、α-SMA和波形蛋白的表达水平在腺嘌呤饲料施用组(CKD)中显著提高，而在腺嘌呤饲料和KBL409施用组(CKD+KBL409)中显著降低(图13)。

因此，发现本发明的KBL409通过有效地抑制肾纤维化可用于抑制由肾损伤引起的慢性肾衰竭的进展。

3-4.检查肾中巨噬细胞的变化

浸润肾间质的F4/80阳性巨噬细胞的数目用作肾损伤的标志物。因此，为了确定KBL409对作为慢性肾衰竭的代表性标志物的巨噬细胞浸润程度的作用，使用实施例3-1中获得的各组肾组织样品来观察巨噬细胞的变化。

3-4-1.F4/80、Cd68和Mcp1表达水平的分析

通过定量聚合酶链反应(qPCR)分析来确定来自实施例3-1中获得的各组肾组织的作为巨噬细胞浸润程度指标的趋化因子Mcp1、F4/80、Cd68和单核细胞的mRNA在肾中的表达。

作为结果，确定了F4/80、Cd68和Mcp1的mRNA表达水平在腺嘌呤饲料施用组(CKD)中显著提高，但在腺嘌呤饲料和KBL409施用组(CKD+KBL409)中显著降低(图14)。

3-4-3.组织病理学检查

以与实施例3-3-1中相同的方式，在将实施例3-1中获得的肾组织样品通过常规的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)制备成厚度为4μm的组织切片，并使用作为巨噬细胞浸润程度指标的F4/80和CD68的抗体进行免疫组织化学染色之后，用光学显微镜观察。

作为结果，与对照组(Con)相比，巨噬细胞在肾小管间质中的沉积在腺嘌呤饲料施用组(CKD)中显著提高，但在腺嘌呤饲料和KBL409施用组(CKD+KBL409)中，确定了浸润程度显著降低(图15)。

因此，发现在慢性肾衰竭中KBL409的施用具有抑制巨噬细胞浸润的作用。

3-5.肾中炎性小体表达的变化的确定

炎性小体是识别多种炎症诱导刺激物的组合并通过激活胱天蛋白酶-1和细胞焦亡来调节重要的促炎性细胞因子(例如IL-1β和IL-18)的产生的蛋白质复合物，所述细胞焦亡是已知由炎性小体引起的慢性肾衰竭中细胞死亡的关键机制之一。因此，为了确定KBL409对肾中炎性小体表达的作用，使用实施例3-1中获得的各组肾组织样品进行Tlr4、Asc、Nlrp3、IL-18和NRLP3的表达分析以及炎性小体的表达分析。

3-5-1.Tlr4、Asc、Nlrp3和IL-18表达水平的分析

从实施例3-1中获得的各组肾组织中，主要检测脂多糖等，并通过定量聚合酶链反应(qPCR)分析来确定诱导炎性小体激活的Tlr4基因、作为炎性小体组分的Asc和Nlrp3以及作为通过炎性小体的炎性反应过程的主要细胞因子IL-18的mRNA表达。

作为结果，确定了与对照组(Con)相比，Tlr4、Asc、Nlrp3和IL-18的mRNA表达水平在腺嘌呤饲料施用组(CKD)中显著提高，但在腺嘌呤饲料和KBL409施用组(CKD+KBL409)中显著降低(图16)。因此，发现在慢性肾衰竭诱导的肾中，施用本发明的KBL409具有抑制Tlr4、Asc、Nlrp3和IL-18的表达的作用。

3-5-2.组织病理学检查

在将与实施例3-3-1中相同的方式制备的肾组织样品通过常规的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)制备成厚度为4μm的组织切片，并使用NRLP3(炎性小体的组分)的抗体进行免疫组织化学染色之后，用光学显微镜观察。

作为结果，与对照组(Con)相比，在腺嘌呤饲料施用组(CKD)中，在慢性肾衰竭诱导的肾组织中NRLP3的表达显著提高，但确定了其在腺嘌呤饲料和KBL409施用组(CKD+KBL409)中显著降低(图17)。因此，发现施用KBL409具有抑制慢性肾衰竭诱导之后提高的NRLP3表达的作用。

3-6.检查肾中巨噬细胞的变化

线粒体的重要功能之一是进行氧化磷酸化，其将能量从燃料代谢物(例如葡萄糖或脂肪酸)转化成ATP。已知这样的线粒体功能障碍与肾病的发病机制有关。因此，为了确定KBL409在慢性肾衰竭诱导的肾中对线粒体形态变化的作用，用透射电子显微镜观察实施例3-1中获得的各组肾组织样品。

作为结果，从图18可看出，在腺嘌呤饲料施用组(CKD)中，肾中线粒体的尺寸降低并且内膜被破坏，因此可确定嵴损失。另一方面，在腺嘌呤饲料和KBL409施用组(CKD+KBL409)中，确定了线粒体结构得到恢复(图18)。因此，发现施用KBL409具有恢复在慢性肾衰竭发作期间发生的线粒体功能障碍的作用。

3-7.全身性炎性应答的变化

当巨噬细胞和淋巴细胞因肾中的慢性炎症被活化时，会分泌多种细胞因子(例如IL-1βTNF-α)、促进肾纤维化、以及发生胶原蛋白积累，这导致了肾衰竭。因此，为了确定在用慢性肾衰竭诱导的小鼠模型中KBL409对全身性炎性应答的作用，通过酶联免疫沉淀测定(ELISA)来测量诱导全身性炎性应答的细胞因子IL-6和TNF-α的浓度。

作为结果，确定了与对照组(CON)相比，IL-6和TNF-α二者的浓度在腺嘌呤饲料施用组(CKD)中均显著提高，但在腺嘌呤饲料施用组和KBL409施用组(CKD+KBL409)中显著降低(图19)。因此，确定了在慢性肾衰竭模型中，KBL409菌株通过抑制IL-6和TNF-α有效减轻了全身性炎性应答。

实施例4.血液中尿毒症毒素浓度变化的比较实验

4-1.血液中对甲酚浓度变化的比较

发现血液中检出的对甲酚为3至300μM(取决于肾病的严重程度)，并且根据浓度范围得出校准曲线。使用处死之前收集的血液样品测量对甲酚浓度。动物试验。将2.5μL浓硫酸添加至50μL小鼠血清，在90℃下加热30分钟，添加2.5μL制备的内标(0.2mg/mL 2,6-二甲基苯酚，Sigma-Aldrich)，并添加50μL乙酸乙酯作为分析溶剂，并在涡旋下混合1分钟。在以15,000rpm离心2分钟之后，将上清液置于GC小瓶(带有250μL玻璃插入物)中。GC-MS定量以与实施例1中用于菌株选择的分析操作相同的方式进行。

基于校准曲线测量每个样品的对甲酚浓度，并且从图20可看出，发现在正常小鼠(Con+PBS)中，无论是否施用菌株，都检出非常低浓度的对甲酚，而在CKD诱导的小鼠样品(CKD+PBS)中，总对甲酚浓度提高。当在大肠杆菌施用组(CKD+阳性)与KBL409菌株施用组(CKD+KBL409)之间比较对甲酚浓度时，观察到在施用KBL409菌株的组中，测量的对甲酚浓度低(图20A)。当比较施用KBL409菌株和其他两种嗜酸乳杆菌菌株(ATCC832和ATCC4357)的小鼠的血液浓度时，确定了在诱导慢性肾衰竭时，与未施用菌株的组(CKD+PBS)中的对甲酚浓度相比，当施用KBL409菌株(CKD+KBL409)时，血液对甲酚浓度降低，而施用其他两种类型的嗜酸乳杆菌菌株(CKD+ATCC832和CKD+ATCC4357)的小鼠不具有降低血液对甲酚浓度的显著作用：CKD+PBS：19.8μM；CKD+KBL409：15.9μM；CKD+ATCC832；18.2μM；CKD+ATCC4357：23.7μM(图20B)。因此，确定了与其他嗜酸乳杆菌菌株相比，本发明的KBL409菌株在对甲酚降低作用方面显著更优异。

4-2.血液TMAO浓度变化的比较

发现血液TMAO为1至90μM(取决于肾病的程度)，并根据浓度范围得出校准曲线。使用处死之前收集的血液样品测量血液TMAO浓度。动物试验。将120μL冰冷的MeOH(LC级)添加至30μL的小鼠血清并涡旋1分钟。在以20,000g、4℃离心20分钟之后，将100μL上清液装载到vivaspin 500,3KDa中，并将15,000g、4℃、30分钟离心之后获得的滤液置于总回收小瓶中并用作用于TMAO分析的样品。

将液相色谱用于测量血清中的TMAO。UPLC-qTOF用作分析设备，并以正ESI电离和灵敏模式进行分析。(A)0.045％氢氧化铵、0.025％甲酸(pH8.1)和(B)纯乙腈用作流动相，初始条件为95％(B)，在2.5分钟时45％(B)，在5分钟时再次95％B，并保持95％B直至5.5分钟，并以0.4mL/分钟的流量进行分析。作为分析柱，使用ACQUITY UPLC BEH Amide柱

1.7μm，2.1mm(186004801，waters)。作为MS参数，使用毛细管电压(Capillaryvotage)2KV、采样锥(Sampling cone)15、源偏移(Source offset)10、源温度(Sourcetemperature)150℃去溶剂化温度(Desolvation temperature)200℃00、雾化器7。

在每个受试组中确定血液中TMAO浓度和KBL409的作用。首先，来确定以高浓度和低浓度KBL409施用的动物受试样品的血液TMAO浓度。在诱导慢性肾衰竭之后确定了TMAO浓度的提高(CKD+PBS)，并且特别地，在施用高浓度KBL409(CKD+高KBL409)的小鼠中确定了TMAO的血液浓度显著降低(图21A)。接下来，在施用了包括KBL409在内的三种类型的嗜酸乳杆菌的慢性肾衰竭诱导的小鼠中确定血液中TMAO的浓度。由于慢性肾衰竭的诱导，确定了TMAO浓度的提高，并且在施用了所有三种嗜酸乳杆菌菌株中TMAO浓度降低，但特别地，确定了在施用KBL409菌株的小鼠中血液TMAO浓度降低最多(图21B)。

实施例5.KBL409和另外的益生菌菌株的组合施用

5-1.慢性肾衰竭诱导的小鼠的模型产生和菌株的施用

在本实验中，实验通过以下进行：将各自平均体重为20g的7周龄C57BL/6小鼠分成总共6组，每组10只小鼠，这6组是阳性对照组(对照)、慢性肾衰竭诱导组(CKD)，Renadyl^TM(KIBOW BIOTECH,US)施用阳性对照组(CKD+阳性对照)、KBL409单独施用组(CKD+KBL409)、KBL409+KBL382组合施用组(CKD+KBL409+混合1(382))、KBL409+KBL396组合施用组(CKD+KBL409+混合2(396))。慢性肾衰竭诱导实验组施用腺嘌呤饲料以诱导慢性肾衰竭，并将腺嘌呤饲料制成其中将0.2％腺嘌呤添加至正常膳食的膳食。KBL409菌株每天经口施用1×10⁹CFU。在组合菌株(KBL409+KBL382或KBL409+KBL396)的情况下，KBL409以7×10⁸CFU施用，并且同时以3×10⁸CFU施用KBL382或KBL396，并且每天施用1×10⁹CFU用于细菌的总数。阳性对照Renadyl也作为复合菌株每天经口施用，使细胞总数目为1×10⁹CFU。通过悬浮在含有0.05％L-半胱氨酸的PBS中制备所有施用菌株。在饲养6周之后处死所有组中的小鼠并取出肾。

5-2.肾病标志物的表达变化的确定

5-2-1.Nlrp3、Pre-IL18、Ppargc1a、Tfam和Mfn1表达水平的分析

从实施例5-1中获得的各组肾组织中，通过定量聚合酶链反应(qPCR)来分析对慢性肾衰竭的发作具有主要作用的炎性小体复合物的组分Nlrp3和作为通过炎性小体的炎性应答过程中的主要细胞因子IL-18的前体Pre-IL18的mRNA表达水平。

作为结果，确定了与对照组相比，Nlrp3和Pre-IL18的mRNA表达在慢性肾衰竭诱导组(CKD)中提高，而表达在阳性对照组(CKD+阳性对照)、KBL409单独施用组(CKD+KBL409)、KBL409+KBL382组合施用组(CKD+KBL409+混合1(382))、KBL409+KBL396组合施用组(CKD+KBL409+混合2(396))中降低(图22)。其中，与其他组相比，KBL409+KBL382组合施用组(CKD+KBL409+混合1(382))显示出提高Ppargc1a、Tfam和Mfn1表达的优异作用(图23)。因此，与当单独施用菌株时相比，本发明的KBL409和KBL382的组合施用更有效地提高了在由慢性肾衰竭模型诱导的肾中Ppargc1a、Tfam和Mfn1的表达，并且发现这种协同可有效地预防或治疗由线粒体功能损伤引起的肾病。

5-2-2.Fn和Procol1表达水平和Bax/Bcl2比例的分析

已知凋亡引起缺血性肾功能障碍，并且肾缺血通过激活Bax和降低Bcl2来提高Bax/Bcl2比例而诱导凋亡。即，在肾上皮细胞中，Bax是提高膜通透性的促凋亡蛋白，Bcl-2是拮抗Bax的“膜攻击”的抗凋亡蛋白，而Bax/Bcl2比例是细胞死亡的主要决定因素。在该实验中，通过定量聚合酶链反应(qPCR)来分析和确定来自各组肾组织的Fn(纤连蛋白)和Procol1的mRNA表达水平以及Bax和Bcl2的表达水平，其作为纤维化疾病的代表性生物标志物。

作为结果，确定了与对照组相比，Fn和Procol1的mRNA表达水平以及Bax/Bcl2比例在慢性肾衰竭诱导组(CKD)中提高，而表达在阳性对照组(CKD+阳性对照)、KBL409单独施用组(CKD+KBL409)、KBL409+KBL382组合施用组(CKD+KBL409+混合1(382))、KBL409+KBL396组合施用组(CKD+KBL409+混合2(396))中显著降低。其中，与其他组相比，在KBL409+KBL382组合施用组(CKD+KBL409+混合1(382))中，观察到了优异的Fn、Procol1和Bax/Bcl2抑制作用(图24)。因此，发现在慢性肾衰竭诱导的动物模型中，与当单独施用菌株时相比，本发明的KBL409和KBL382的组合施用更有效地抑制了Fn、Procol1和Bax的表达，并提高了Bcl2的表达，从而通过这种协同有效地预防或治疗肾病。

已经如此详细地描述了本公开内容的某些部分，对于本领域技术人员而言明显的是，这样的具体描述仅是优选的实施方案，并不旨在限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围将由所附权利要求书及其等同方案来限定。

保藏机构名称：韩国生物科学与生物技术研究所

保藏号：KCTC13518BP

保藏日期：20180427

保藏机构名称：韩国生物科学与生物技术研究所

保藏号：KCTC13509BP

保藏日期：20180417

保藏机构名称：韩国生物科学与生物技术研究所

保藏号：KCTC13278BP

保藏日期：20170529

工业实用性

根据本发明的嗜酸乳杆菌KBL409(保藏号KCTC 13518BP)菌株减轻肾炎症、降低尿毒症毒素(例如血尿素氮、肌酐和对甲酚)的浓度以保护肾，并因此可有效地用于肾病的预防性和治疗性应用，包括改善肾功能和慢性肾衰竭。

独立文本的序列表

附上电子文件。

<110> Ko BioLabs, Inc.

<120> 嗜酸乳杆菌KBL409及其用途

<130> KPCA190833

<160> 3

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 1475

<212> DNA

<213> 嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)

<400> 1

gggaaagttg cggggtgcta tacatgcagt cgagcgagct gaaccaacag attcacttcg 60

gtgatgacgt tgggaacgcg agcggcggat gggtgagtaa cacgtgggga acctgcccca 120

tagtctggga taccacttgg aaacaggtgc taataccgga taagaaagca gatcgcatga 180

tcagcttata aaaggcggcg taagctgtcg ctatgggatg gccccgcggt gcattagcta 240

gttggtaggg taacggccta ccaaggcaat gatgcatagc cgagttgaga gactgatcgg 300

ccacattggg actgagacac ggcccaaact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc 360

acaatggacg aaagtctgat ggagcaacgc cgcgtgagtg aagaaggttt tcggatcgta 420

aagctctgtt gttggtgaag aaggatagag gtagtaactg gcctttattt gacggtaatc 480

aaccagaaag tcacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg 540

ttgtccggat ttattgggcg taaagcgagc gcaggcggaa gaataagtct gatgtgaaag 600

ccctcggctt aaccgaggaa ctgcatcgga aactgttttt cttgagtgca gaagaggaga 660

gtggaactcc atgtgtagcg gtggaatgcg tagatatatg gaagaacacc agtggcgaag 720

gcggctctct ggtctgcaac tgacgctgag gctcgaaagc atgggtagcg aacaggatta 780

gataccctgg tagtccatgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttgggagg tttccgcctc 840

tcagtgctgc agctaacgca ttaagcactc cgcctggggg agtacgaccg caaggttgaa 900

actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca 960

acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc tagtgcaatc cgtagagata cggagttccc 1020

ttcggggaca ctaagacagg tggtgcatgg ctgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg 1080

gttaagtccc gcaacgagcg caacccttgt cattagttgc cagcattaag ttgggcactc 1140

taatgagact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat gacgtcaagt catcatgccc 1200

cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa tggacagtac aacgaggagc aagcctgcga 1260

aggcaagcga atctcttaaa gctgttctca gttcggactg cagtctgcaa ctcgactgca 1320

cgaagctgga atcgctagta atcgcggatc agcacgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc 1380

ttgtacacac cgcccgtcac accatgggag tctgcaatgc ccaaagccgg tggcctaacc 1440

ttcgggaagg agccgtctaa gcagtcaggt gttcc 1475

<210> 2

<211> 1472

<212> DNA

<213> 副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）

<400> 2

gcaggtggcg ggtgctatac atgcagtcga cgagttctcg ttgatgatcg gtgcttgcac 60

cgagattcaa catggaacga gtggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgccctta 120

agtgggggat aacatttgga aacagatgct aataccgcat agatccaaga accgcatggt 180

tcttggctga aagatggcgt aagctatcgc ttttggatgg acccgcggcg tattagctag 240

ttggtgaggt aatggctcac caaggcgatg atacgtagcc gaactgagag gttgatcggc 300

cacattggga ctgagacacg gcccaaactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttcca 360

caatggacgc aagtctgatg gagcaacgcc gcgtgagtga agaaggcttt cgggtcgtaa 420

aactctgttg ttggagaaga atggtcggca gagtaactgt tgtcggcgtg acggtatcca 480

accagaaagc cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt 540

tatccggatt tattgggcgt aaagcgagcg caggcggttt tttaagtctg atgtgaaagc 600

cctcggctta accgaggaag cgcatcggaa actgggaaac ttgagtgcag aagaggacag 660

tggaactcca tgtgtagcgg tgaaatgcgt agatatatgg aagaacacca gtggcgaagg 720

cggctgtctg gtctgtaact gacgctgagg ctcgaaagca tgggtagcga acaggattag 780

ataccctggt agtccatgcc gtaaacgatg aatgctaggt gttggagggt ttccgccctt 840

cagtgccgca gctaacgcat taagcattcc gcctggggag tacgaccgca aggttgaaac 900

tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac 960

gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatctt ttgatcacct gagagatcag gtttcccctt 1020

cgggggcaaa atgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt 1080

taagtcccgc aacgagcgca acccttatga ctagttgcca gcatttagtt gggcactcta 1140

gtaagactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct 1200

tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg gatggtacaa cgagttgcga gaccgcgagg 1260

tcaagctaat ctcttaaagc cattctcagt tcggactgta ggctgcaact cgcctacacg 1320

aagtcggaat cgctagtaat cgcggatcag cacgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt 1380

gtacacaccg cccgtcacac catgagagtt tgtaacaccc gaagccggtg gcgtaaccct 1440

ttagggagcg agcgtctaag tggctcacgc ct 1472

<210> 3

<211> 1492

<212> DNA

<213> 植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）

<400> 3

tatcagtacg tgctataatg cagtcgacga ctctggtatt gattggtgct tgcatcatga 60

tttacatttg agtgagtggc gaactggtga gtaacacgtg ggaaacctgc ccagaagcgg 120

gggataacac ctggaaacag atgctaatac cgcataacaa cttggaccgc atggtccgag 180

cttgaaagat ggcttcggct atcacttttg gatggtcccg cggcgtatta gctagatggt 240

ggggtaacgg ctcaccatgg caatgatacg tagccgacct gagagggtaa tcggccacat 300

tgggactgag acacggccca aactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccacaatg 360

gacgaaagtc tgatggagca acgccgcgtg agtgaagaag ggtttcggct cgtaaaactc 420

tgttgttaaa gaagaacata tctgagagta actgttcagg tattgacggt atttaaccag 480

aaagccacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttgtcc 540

ggatttattg ggcgtaaagc gagcgcaggc ggttttttaa gtctgatgtg aaagccttcg 600

gctcaaccga agaagtgcat cggaaactgg gaaacttgag tgcagaagag gacagtggaa 660

ctccatgtgt agcggtgaaa tgcgtagata tatggaagaa caccagtggc gaaggcggct 720

gtctggtctg taactgacgc tgaggctcga aagtatgggt agcaaacagg attagatacc 780

ctggtagtcc ataccgtaaa cgatgaatgc taagtgttgg agggtttccg cccttcagtg 840

ctgcagctaa cgcattaagc attccgcctg ggggagtacg gcccgcaagg ctgaaactca 900

aaggaattga cggggggccc gcacaagcgg tgggagcatg tgggtttaat tcaaagctac 960

gcgaagaaac cttacccagg ttttgacata ctaatgcaaa ttctaaagag attagaacgt 1020

ttcccttccg gggacatggg ataccgggtg ggtgcatggg ttggtcgtca gcttcgtggt 1080

cgtgagaatg tttgggttta agttccccga aacgagcgca acccttatta tcagttgcca 1140

gcattaagtt gggcactctg gtgagactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga 1200

cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg gatggtacaa 1260

cgagttgcga actcgcgaga gtaagctaat ctcttaaagc cattctcagt tcggattgta 1320

ggctgcaact cgcctacatg aagtcggaat cgctagtaat cgcggatcag catgccgcgg 1380

tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac catgagagtt tgtaacaccc 1440

aaagtcggtg gggtaacctt tagaaccagc cgcctaatgg caccaccatg cg 1492

Claims (15)

1.嗜酸乳杆菌KBL409菌株，其保藏号为KCTC 13518BP。

2.根据权利要求1所述的菌株，其中所述菌株具有SEQ ID NO:1的16s rDNA序列。

3.食品组合物，其包含选自以下的至少一种：权利要求1所述的菌株、所述菌株的培养物、所述菌株的裂解物和所述菌株的提取物。

4.根据权利要求3所述的食品组合物，其中所述食品组合物改善肾功能。

5.根据权利要求4所述的食品组合物，其中肾功能的改善是由于肾炎症的减轻、尿毒症毒素的血液浓度的降低、蛋白尿的减轻、肾线粒体功能的恢复和/或肾纤维化的减轻。

6.动物饲料组合物，其包含选自以下的至少一种：权利要求1所述的菌株、所述菌株的培养物、所述菌株的裂解物和所述菌株的提取物。

7.用于预防或治疗肾病的药物组合物，其包含选自以下的至少一种：权利要求1所述的菌株、所述菌株的培养物、所述菌株的裂解物和所述菌株的提取物。

8.根据权利要求7所述的药物组合物，其中肾病的预防或治疗是由于肾炎症的减轻、尿毒症毒素的血液浓度的降低、蛋白尿的减轻、肾线粒体功能的恢复和/或肾纤维化的抑制。

9.根据权利要求8所述的药物组合物，其中所述尿毒症毒素是血尿素氮、血液肌酐和/或血液对甲酚。

10.根据权利要求7所述的药物组合物，其中所述肾病选自尿毒症、慢性肾衰竭、急性肾衰竭、亚急性肾衰竭、肾纤维化、肾小球肾炎、肾盂肾炎、间质性肾炎、蛋白尿、糖尿病肾病、高血压肾病、恶性神经症、狼疮肾炎、血栓性微血管病、移植排斥、肾小球病、肾肥大、肾增生、造影剂诱发性肾病、毒素诱发性肾损伤、氧自由基介导的肾病、多囊肾病和肾炎。

11.根据权利要求7所述的药物组合物，其还包含选自以下的至少一种：另外的益生菌菌株、所述菌株的培养物、所述菌株的裂解物和所述菌株的提取物。

12.根据权利要求11所述的药物组合物，其中所述另外的益生菌菌株为选自以下的至少一种：副干酪乳杆菌和植物乳杆菌。

13.根据权利要求12所述的药物组合物，其中所述副干酪乳杆菌是副干酪乳杆菌KBL382(保藏号KCTC13509BP)，并且所述植物乳杆菌是植物乳杆菌KBL396(保藏号KCTC13278BP)。

14.用于预防或治疗肾病的方法，其包括向有此需要的个体施用选自以下的至少一种：权利要求1所述的菌株、所述菌株的培养物、所述菌株的裂解物和所述菌株的提取物。

15.组合物用于制备用于预防或治疗肾病的药物的用途，所述组合物包含选自以下的至少一种：权利要求1所述的菌株、所述菌株的培养物、所述菌株的裂解物和所述菌株的提取物。

Images