CN114854765A

CN114854765A - 一种水稻抗病基因lbrg1、重组载体、重组工程菌、应用及功能鉴定方法

Info

Publication number: CN114854765A
Application number: CN202210507296.0A
Authority: CN
Inventors: 马世伟; 何华勤; 梁康迳
Original assignee: Putian University
Current assignee: Putian University
Priority date: 2022-05-11
Filing date: 2022-05-11
Publication date: 2022-08-05

Abstract

本发明提供一种水稻抗病基因LBRG1、重组载体、重组工程菌、应用及功能鉴定方法，涉及基因工程技术领域。该水稻抗病基因LBRG1具有如SEQ ID NO：1所述的编码区序列，如SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列。该基因的CDS序列长2580bp，编码长859氨基酸的蛋白。该蛋白具有NB‑ARC和LRR结构域。本发明的水稻抗病基因LBRG1可弥补现有水稻抗稻瘟病基因的不足，将其应用于水稻中可提高水稻抗病性，从而能够为抗稻瘟病水稻新品种的选育积累宝贵的基因资源和理论基础。

Description

一种水稻抗病基因LBRG1、重组载体、重组工程菌、应用及功能鉴定方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，且特别涉及一种水稻抗病基因LBRG1、重组载体、重组工程菌、应用及功能鉴定方法。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)是世界上最重要的粮食作物之一，全球超过1/2的人口以稻米为主食。水稻真菌性疾病严重威胁水稻的安全生产，其可导致水稻产量下降和种植成本增加。其中，由稻瘟菌(Magnaporthe grisea)侵染引起的稻瘟病被称为水稻的癌症，可导致水稻减产，严重时甚至颗粒无收。目前，在大面积种植抗病品种的情况下，由稻瘟病引起的水稻年产量损失仍能占到世界水稻年产量损失的10％～30％。因此，改善和增强水稻稻瘟病抗性、培育广谱抗稻瘟病新品种对我国水稻安全生产和保障国家粮食安全具有重要意义。

培育和应用广谱抗病水稻新品种是最经济、最安全、最有效的稻瘟病防治手段。培育抗病水稻新品种的前提是发掘抗病新基因。通过遗传学试验研究，水稻基因组中已定位的稻瘟病抗性位点超过100个。然而，仅有35个水稻抗稻瘟病基因被克隆。而且稻瘟菌遗传上的复杂性和多样性，导致不同稻瘟菌生理小种对水稻的致病性具有较大差异，多数抗病基因只对某一种稻瘟菌生理小种具有抗性；加之稻瘟菌菌株变异快，常常导致新推广的抗病品种在大面积种植3～5年后抗性降低或丧失，成为感病品种。因此，不断发掘水稻广谱抗病新基因，能够为抗稻瘟病水稻新品种的选育积累宝贵的基因资源。

发明内容

本发明的目的在于提供一种水稻抗病基因LBRG1、重组载体、重组工程菌、应用及功能鉴定方法，以弥补现有水稻抗稻瘟病基因的不足，将其应用于水稻中可提高水稻抗病性，从而能够为抗稻瘟病水稻新品种的选育积累宝贵的基因资源。

本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

一种水稻抗病基因LBRG1，所述水稻抗病基因LBRG1的编码区序列如SEQ ID NO：1所示。

含有上述的水稻抗病基因LBRG1的重组载体。

含有上述的水稻抗病基因LBRG1的重组工程菌。

一种所述的水稻抗病基因LBRG1在提高水稻稻瘟病抗性中的应用。

一种上述水稻抗病基因LBRG1的功能鉴定方法，包括以下步骤：

S1、将所述水稻抗病基因LBRG1克隆到pYLCRISPR/Cas9P_ubi-H载体中，得到表达载体；

S2、将所述表达载体用农杆菌转化法侵染水稻，得到基因敲除的突变体植株；

S3、取适量所述基因敲除的突变体植株的种子，培养至三叶一心后接种稻瘟菌的孢子悬液，培养7d后，观察、记录、分析叶片病斑面积。

本发明实施例的水稻抗病基因LBRG1、重组载体、重组工程菌、应用及功能鉴定方法的有益效果是：

本发明的水稻抗病基因LBRG1是首次从水稻中克隆得到的，其CDS长2580bp，编码859氨基酸的蛋白。用CDD在线程序分析预测可知，该蛋白具有NB-ARC和LRR结构域。通过比较水稻Cas9敲除突变体和野生型水稻对稻瘟菌的耐受性，发现LBRG1基因可以提高水稻的抗稻瘟病能力，将其应用于基因工程领域具有重要的经济价值和应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1的LBRG1的PCR产物在琼脂糖凝胶上的电泳图；

图2为本发明实施例1的LBRG1基因编码的蛋白的保守结构域预测图；

图3所示为本发明实施例2的pYLCRISPR/Cas9P_ubi-H-LBRG1载体构建的电泳图；

图4为本发明实施例3的农杆菌介导的水稻C105TTP-4L-23的遗传转化流程图；

图5所示为实施例3的T0阳性转基因植株幼叶DNA靶位点的突变检测图；

图6为本发明实施例4的野生型C105TTP-4L-23、转基因C105TTP-4L-23和CO39水稻接种稻瘟菌7d后叶片的对比图；

图7为本发明实施例4的野生型C105TTP-4L-23、转基因C105TTP-4L-23和CO39水稻接种稻瘟菌7d后叶片病斑面积的对比图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例的水稻抗病基因LBRG1、重组载体、重组工程菌、应用及功能鉴定方法进行具体说明。

本发明实施例提供的一种水稻抗病基因LBRG1，其特征在于，所述水稻抗病基因LBRG1的编码区序列如SEQ ID NO：1所示。本发明的水稻抗病基因LBRG1的CDS长2580bp，其可编码859氨基酸的蛋白。

进一步地，在本发明较佳实施例中，所述水稻抗病基因LBRG1编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。经蛋白保守结构域预测发现，该蛋白中包含NB-ARC结构域和多个富亮氨酸基序(LRR)保守结构域。

本发明提供含有上述的水稻抗病基因LBRG1的重组载体。

本发明提供含有上述的水稻抗病基因LBRG1的重组工程菌。

本发明提供上述水稻抗病基因LBRG1在提高水稻稻瘟病抗性中的应用。

进一步地，在本发明较佳实施例中，所述水稻的品种为C105TTP-4L-23。

本发明还提供了一种水稻抗病基因LBRG1的功能鉴定方法，包括以下步骤：

进一步地，在本发明较佳实施例中，所述表达载体的构建及转化的具体步骤包括：

参照测序的LBRG1的序列，并利用CRISPR-P在线分析软件预测敲除靶点，设计靶点引物后进行靶点接头的连接反应，然后将靶点接头与Bsa I-HF酶切后的sgRNA克隆载体通过两轮PCR构建sgRNA表达盒，最后将两个所述sgRNA表达盒与Bsa I-HF酶切后的pYLCRISPR/Cas9P_ubi-H载体进行infusion连接反应，构建pYLCRISPR/Cas9P_ubi-H-LBRG1表达载体并转化大肠杆菌DH5α；其中，靶点引物包括LBRG1-T₁-F(GCCGCTTGTCAGCGGTCCGAGGAA)、LBRG1-T₁-R(AAACTTCCTCGGACCGCTGACAAG)、LBRG1-T₂-F(GTTGGTCACCCGGACTTACGAAA)、LBRG1-T₂-R(AAACTTTCGTAAGTCCGGGTGAC)，sgRNA克隆载体包括pYLgRNA-OsU6a/LacZ和pYLgRNA-OsU6b。

S2、将所述表达载体用农杆菌转化法侵染水稻，得到基因敲除的突变体植株；优选地，农杆菌采用农杆菌EHA105，水稻选用C105TTP-4L-23。

进一步地，在本发明较佳实施例中，步骤S2之后还包括对所述基因敲除的突变体植株的DNA进行分子鉴定，所述分子鉴定包括以下步骤：

设计潮霉素引物hygF(CCGGAAGTGCTTGACATTGG)和hygR(GCCGAATTAATTCGGGG)并对所述基因敲除的突变体植株的潮霉素基因的一段进行扩增，能扩增出1035bp大小的片段为阳性植株；收集所述阳性植株的种子，播种后取幼叶提取DNA进行靶位点的突变检测，设计包含靶位点片段PCR的引物LBRG1-TC-F(CTCTCACAGCTAGAGGAG)、LBRG1-TC-R(GCTCAACCAAGATGGCG)，扩增出517bp大小的片段进行测序分析，测序结果为移码突变的植株即为纯合敲除植株，后代即为纯合Cas9敲除突变体植株。

S3、取适量所述基因敲除的突变体植株的种子，培养至三叶一心后接种稻瘟菌(GUY11)的孢子悬液，培养7d后，观察、记录、分析叶片病斑面积。接种稻瘟菌的孢子悬液，培养7d后，观察、记录、分析叶片病斑面积的步骤为：采用高压雾化器喷雾接种1.0×10⁵～2.0×10⁵个/mL的稻瘟菌的孢子悬液，在接种室培养7d，然后观察叶片病斑(以第二片幼叶为准)，拍照记录，并用ImageJ软件分析病斑面积。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

在下述各实施例中，将水稻抗病基因LBRG1简称为LBRG1。

实施例1

本实施例提供水稻抗病基因LBRG1的克隆，包括以下步骤：

(1)材料的准备

水稻品种C105TTP-4L-23和大肠杆菌DH5α(Takara 9057)。其中，水稻品种C105TTP-4L-23可用于RNA提取，其由福建农林大学作物遗传育种与综合利用省部共建教育部重点实验室提供。

(2)水稻抗病基因LBRG1的克隆及转化

根据LBRG1的注释信息(NCBI Reference Sequence:XM_015764352.2)，其CDS全长2580bp，编码859个氨基酸，用Primer 5.0设计一对特异性引物LBRG1-F(ATGGAGAGGCTGTTCGAGGAGCT)和LBRG1-R(TCAGTCTACAAGCCAGTCCAGG)。

取C105TTP-4L-23三叶期的水稻幼苗，利用Trizol试剂法提取总RNA，反转录成cDNA，作为PCR反应模板。扩增LBRG1基因的PCR反应体系如表1所示，其总体积为50μL。PCR反应程序为：98℃2min→(98℃10s→58℃15s→72℃3min)30个循环→72℃10min→4℃保存。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测并纯化(如图1所示)，然后用DNA A-Tailing Kit(Takara 6109)处理后进行TA克隆，载体为pMD18-T，挑选3个阳性克隆菌液测序。

克隆得到的水稻抗病基因LBRG1的CDS长2580bp，编码859氨基酸的蛋白。利用NCBI的CDD工具对LBRG1蛋白的结构进行分析，其保守结构域预测图如图2所示。从图2可以看出，该蛋白包含NB-ARC结构域和多个富亮氨酸基序(LRR)保守结构域。

表1扩增LBRG1基因的PCR反应体系

实施例2

本实施例提供pYLCRISPR/Cas9P_ubi-H-LBRG1载体构建，如图3所示为本发明实施例2的pYLCRISPR/Cas9P_ubi-H-LBRG1载体构建中的电泳图，包括以下步骤：

(1)材料准备：水稻品种C105TTP-4L-23，CO39(作为接种稻瘟菌的发病对照)，Cas9敲除载体：pYLCRISPR/Cas9P_ubi-H，sgRNA克隆载体：pYLgRNA-OsU6a/LacZ和pYLgRNA-OsU6b，农杆菌EHA105，上述载体均由华南农业大学刘耀光院士惠赠，农杆菌EHA105可购于上海唯地生物技术有限公司。

(2)参照测序的LBRG1的序列，利用CRISPR-P(http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR)在线分析软件预测敲除靶点，设计靶点引物LBRG1-T₁-F(GCCGCTTGTCAGCGGTCCGAGGAA)、LBRG1-T₁-R(AAACTTCCTCGGACCGCTGACAAG)、LBRG1-T₂-F(GTTGGTCACCCGGACTTACGAAA)、LBRG1-T₂-R(AAACTTTCGTAAGTCCGGGTGAC)，随后进行靶点接头的连接反应。其中，靶点接头连接反应条件为95℃，3min，自然冷却至室温，连接反应体系如表2所示：

表2靶点接头连接反应体系

(3)sgRNA克隆载体酶切：分别取pYLgRNA-OsU6a/LacZ和pYLgRNA-OsU6b，用Bsa I-HF酶切，酶切反应条件为37℃、20min，之后将反应液分装保存于-20℃冰箱。酶切反应体系如表3所示：

表3 sgRNA克隆载体酶切反应体系

(4)pYLCRISPR/Cas9表达载体酶切，取pYLCRISPR/Cas9P_ubi-H质粒载体，用Bsa I-HF酶切，酶切反应条件为37℃、30min，回收载体片段(图3a所示)。反应体系如表4所示：

表4 pYLCRISPR/Cas9表达载体酶切反应体系

(5)取靶点接头与相应的酶切后的sgRNA连接，连接反应条件为23℃、18min。反应体系如表5所示：

表5靶点接头与酶切后的sgRNA连接的反应体系

(6)sgRNA表达盒构建：以上述步骤(4)中的连接反应液为模板，通过两轮PCR克隆sgRNA表达盒。第一轮PCR反应条件为：94℃30s→(94℃10s→60℃15s→68℃20s)27个循环→4℃保存。每一靶点对应两个第一轮PCR反应，分别用引物对U-F(CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG)、LBRG1-T1-R与LBRG1-T1-F、gR-R(CGGAGGAAAATTCCATCCAC)，第一轮PCR反应体系如表6所示：

表6第一轮PCR反应体系

分别取同一靶点两个第一轮PCR反应产物1μL，与18μL无菌水混合均匀，作为第二轮PCR反应模板，用表达盒T1和T2对应的PCR反应引物对infusion-F(GGCGCGCCGTAGTGCTCGACTAGTATGGAATCGGCAGC)、infusion-R1(TCAGGGTCCATCCACTCC)与infusion-F1(GGAGTGGATGGACCCTGACACTGGAATCGGCAGC)、infusion-R(GGCGCGCCAATGATACCGACCGACGCGTATCCATCCAC)进行第二轮PCR，反应条件为：94℃30s→(94℃10s→58℃15s→68℃20s)20个循环→4℃保存，之后进行琼脂糖电泳胶回收PCR反应产物，U6a/Lac-T1-sgRNA和U6b-T2-sgRNA表达盒如图3b所示，分别长约800bp和500bp。第二轮PCR反应体系如表7所示：

表7第二轮PCR反应体系

(7)将上述克隆获得的两个sgRNA表达盒与酶切后的表达载体片段连接(infusion)，构建pYLCRISPR/Cas9P_ubi-H-LBRG1。连接反应条件为50℃，18min。sgRNA表达盒与酶切后的表达载体片段连接的反应体系如表8所示：

表8 sgRNA表达盒与酶切后的表达载体片段连接的反应体系

(8)将上述infusion反应连接液转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取菌液进行鉴定。如图3c所示，两个sgRNA表达盒均成功连入pYLCRISPR/Cas9P_ubi-H载体。以TakaraMiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0(9760)提取阳性菌液的质粒，进行AscⅠ的酶切鉴定。如图3d所示，酶切后获得一个长约16000bp的载体骨架片段和一个长约1300bp相连的表达盒片段。将pYLCRISPR/Cas9P_ubi-H-LBRG1质粒转化农杆菌EHA105，挑选阳性克隆保存于-80℃冰箱备用。

实施例3

本实施例提供农杆菌介导的水稻C105TTP-4L-23的遗传转化，如图4所示为本发明的水稻遗传转化流程图，包括以下步骤：

取成熟的C105TTP-4L-23水稻种子1000粒，剥去颖壳，以2.5％次氯酸钠浸泡消毒30min，无菌水清洗5次，将消毒后的种子接种于愈伤组织诱导培养基(如图4a)，28℃光照培养7d；以YEB(50mg/L卡那霉素，50mg/L利福平)培养基培养活化后的含目的载体(pYLCRISPR/Cas9P_ubi-H-LBRG1)的农杆菌EHA105至OD600＝0.5，4000rpm离心10min收集菌体沉淀，以AAM(100μM乙酰丁香酮)培养基重悬菌体，制成OD600＝0.2的工程菌液，冰上放置1h；将水稻愈伤组织浸入工程菌菌液10min，用无菌滤纸吸干表面菌液，接种于共培养培养基，25℃暗培养3d(如图4b)；将侵染后的愈伤组织浸入500mg/L的羧苄青霉素溶液中浸泡15min，重复两次，用滤纸吸干愈伤组织表面水分，接种于筛选培养基(如图4c)，28℃光照培养；将新长出的抗性愈伤组织块继代于芽诱导培养基，30℃光照培养(1～2周)至不定芽长出(如图4d)；将不定芽继代于生根培养基，30℃光照培养(1～2周)至幼苗长出大部分不定根(如图4e)；取出生根的幼苗，洗净培养基，将幼苗根部浸入无菌水炼苗3-7d后，移栽于大田或温室。

提取转化后植株的DNA进行分子鉴定，设计潮霉素引物hygF(CCGGAAGTGCTTGACATTGG)、hygR(GCCGAATTAATTCGGGG)对转基因植株潮霉素基因的一段进行扩增，能扩增出1035bp大小片段为阳性植株。收集T0阳性转基因植株种子，播种后取幼叶提取DNA进行靶位点的突变检测，靶位点PCR的引物为LBRG1-TC-F(CTCTCACAGCTAGAGGAG)、LBRG1-TC-R(GCTCAACCAAGATGGCG)，扩增长517bp的片段进行测序分析。如图5所示为T0阳性转基因植株幼叶DNA靶位点的突变检测图，从图5可知移码突变的植株即为纯合敲除植株，即M-(1-7)水稻的种子为LBRG1基因的纯合Cas9敲除突变体。

实施例4

本实施例提供水稻Cas9敲除突变体的稻瘟病抗性鉴定，包括以下步骤：

(1)取适量实施例3得到的突变体(3个基因型)种子、野生型C105TTP-4L-23水稻种子以及CO39对照水稻种子，浸入水中，于30℃培养箱中催芽2～3d。然后将已催芽的水稻种子播种于装满土壤的小花盆(直径10cm)中，每盆8～10粒，每一处理设置3个重复，将水稻幼苗培养于光照强度10000Lx、光周期为14h光照/10h黑暗、28℃的温室内，直至水稻长到三叶一心或四叶一心。

(2)将活化后的稻瘟菌于米糠培养基暗培养8～10d至菌丝铺满培养皿，刮去培养基表面一层菌丝，于60％光照条件培养3～5d使稻瘟病菌产孢，然后用3～5mL含0.02％吐温-20的灭菌水洗刮产孢后的米糠板，洗刮液用单层擦镜纸过滤，滤液用细胞计数板计数，使孢子悬液终浓度为1.0×10⁵～2.0×10⁵个/mL。将稀释好的孢子悬液用高压雾化器均匀的喷至水稻叶片上，每个重复喷15mL孢子悬液。将接种后的幼苗置于湿度高于90％、26℃的接种室暗培养24h，之后改变光周期为12h光照/12h黑暗，继续培养7d。

如图6所示为野生型C105TTP-4L-23、转基因C105TTP-4L-23和CO39水稻接种稻瘟菌7d后叶片的对比图。从图6可以看出，CO39叶片发病严重，表面出现典型梭状病斑，即具有白色中心点，边缘褐色，外有淡黄色晕圈，部分病斑发展较大。野生型水稻叶片未显示病斑。而LBRG1突变体(M-1，M-2，M-3)均能够被GUY11侵染，且叶片表面出现大量与CO39相同的典型稻瘟病梭状菌斑。

采用ImageJ软件分析野生型C105TTP-4L-23、转基因C105TTP-4L-23和CO39水稻接种稻瘟菌7d后叶片的病斑面积。如图7所示为野生型C105TTP-4L-23、转基因C105TTP-4L-23和CO39水稻接种稻瘟菌7d后叶片病斑面积的对比图。其中，不同大写字母表示在多重比较Tukey-Kramer检验1％差异水平上差异显著。从图7可以看出，CO39叶片病斑面积最大，病斑面积为39.5％，发病等级为4级(感病)。野生型C105TTP-4L-23无明显病斑，且病斑面积最小，病情等级为1(抗病)。三个突变体病斑面积均在20％-40％之间，其中M-2病斑面积最大，虽然M-2与其余两个突变体M-1/3存在显著差异，但发病等级均为4级，说明LBRG1基因突变后导致C105TTP-4L-23从抗病变为感病，确认了LBRG1基因能够增强水稻抗瘟病的能力。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 莆田学院

<120> 一种水稻抗病基因LBRG1、重组载体、重组工程菌、应用及功能鉴定方法

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2580

<212> DNA

<213> 水稻C105TTP-4L-23

<400> 1

atggagaggc tgttcgagga gctggcgggg gaggcggtga aggagctgct gcgggcggtg 60

agggggacgt tcttctgcag gtcgacggcg gagcggctgc gccggaacgt ggagccgctg 120

ctgccgctgg tgcagccgca ggcggcgcag gggggaggag ggtgggggca cgggcggagc 180

gccggcgagc tggcggagct ggcggcgcag ctgagggagg cgctggagct ggcgcggcgc 240

gccgcgtcgg cgccgcggtg gaacgtgtac cgcaccgccc agctggcccg ccggatggag 300

gccgccgaca ccgccatcgc gcgctggctc tcccgccacg cccccgccca cgtgctcgac 360

ggcgtccgcc gcctccgcga cgaggccgac gcccgcatcg gccgcctcga gcgccgcgtc 420

gaggaggtcg ccgccgcgca gcagcagcag caggccgcgg ccaccgccct tccacccccc 480

gccatctccc tccccttcgc tctcccccca ccacctccgc cgcccaaggc catggcgatg 540

atggccatgg atacgccacc gaccaagggc atggcggtgg ggatggaggt ggagctcccg 600

ttcccggacg acgaggagga cgagagcatg gtcggcggcg gcgtgagggt gggcaaagag 660

aaggtgaagg agatggtgat gagcggcggc ggcggcgggt gggaggccgt cggaatctgc 720

ggcatgggcg gcagcggcaa gaccacgctc gccatggaaa tcttcaagga tcacaaaatc 780

cgaggctact tcagcgatag agtcttcttt gagacgatct cgcagtccgc aaatctggac 840

actatcaaga tgaagctatg ggagcagatc agtggaaacc ttgtgctcgg tgcgtacaac 900

cagatcccag aatggcaact caagttgggg ccaagggaca aaggacctgt tcttgttatc 960

cttgatgatg tctggtctct ctcacagcta gaggagctca tcttcaagtt ccctgggtgc 1020

aagacacttg tagtatcaag gttcaagttc ccctcgttgg tcacccggac ttacgaaatg 1080

gagttgctcg atgaggaggc ggctctttct gtcttctgtc gtgctgcctt tgatcaggag 1140

tccgttcctc ggaccgctga caagaaactg gttcggcagg ttgctgcaga gtgcagagga 1200

cttcctctag cactgaaggt tatcggtgcg tcgttgcggg atcagcctcc taagatatgg 1260

ttgagtgcga agaaccggtt gtcgcgagga gagactatat ctgactctca tgagaccaaa 1320

ctcctggaga ggatggccgc aagcatcgag tgcttgtcag ggaaggttag agaatgtttc 1380

cttgatctgg gttgctttcc ggaggataag aagatcccac tggatgtgtt gatcaatata 1440

tggatggaga ttcatgatct tgatgagccg gatgccttcg ccatcttggt tgagctatca 1500

aacaagaatc ttctcaccct agttaatgat gcacagaaca aagccggcga tttgtacagc 1560

agctaccatg acttctcggt tacacaacat gatgtattga gggatctagc gcttcacatg 1620

agtggtcgtg atgctctgaa caaccggaga cggctggtga tgccaagaag agaagaatca 1680

ctaccgaagg attggcagag gaataaggac actccgttcg aagctcagat agtttccatt 1740

catacaggtg agatgaaaga atctgactgg ttccagatga gcttccccaa ggccgaagtg 1800

cttatcctca acttcgcgtc aagtgtatac tatctcccac cattcattgc aaccatgcag 1860

aacttgaaag ccctggtgct gatcaactat ggcaccatca gtgcaaccct tgataaccta 1920

tccgccttca ccacgctcag tgacctgagg agcctttggc ttgagaagat cacacttcca 1980

ccgctaccaa aaaccacaat cccactgaag aacctgcgca agatatccct tgtcctctgt 2040

gagctgacca acagtctgag aggatcaaag gtggatctct cgatgacatt cccgcgccta 2100

tccaacctca ccattgacca ctgcatagac ctgaaggagc taccatctag catatgtgaa 2160

atcagttccc tggagagcat ctccatctca aactgccatg acctcacaga gcttccatat 2220

gagctgggca agctgcattg cctgagcatc ctaagggtat acgcctgccc ggctctgtgg 2280

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gtcaacctga cggacctccc tgaggagctc ggtcacctga caagcctgga gaagatcgac 2400

atgcgagaat gctcgcgact gaggagcctc ccgaggtcgt cctcatcgct caagtccctc 2460

gggcacgtcg tgtgcgacga ggagacggcg ttgctgtgga gggaagctga gcaggtcatc 2520

ccagacctcc gggttcaggt agcagaagag tgttataacc tggactggct tgtagactga 2580

<210> 2

<211> 859

<212> PRT

<213> 水稻C105TTP-4L-23

<400> 2

Met Glu Arg Leu Phe Glu Glu Leu Ala Gly Glu Ala Val Lys Glu Leu

1 5 10 15

Leu Arg Ala Val Arg Gly Thr Phe Phe Cys Arg Ser Thr Ala Glu Arg

20 25 30

Leu Arg Arg Asn Val Glu Pro Leu Leu Pro Leu Val Gln Pro Gln Ala

35 40 45

Ala Gln Gly Gly Gly Gly Trp Gly His Gly Arg Ser Ala Gly Glu Leu

50 55 60

Ala Glu Leu Ala Ala Gln Leu Arg Glu Ala Leu Glu Leu Ala Arg Arg

65 70 75 80

Ala Ala Ser Ala Pro Arg Trp Asn Val Tyr Arg Thr Ala Gln Leu Ala

85 90 95

Arg Arg Met Glu Ala Ala Asp Thr Ala Ile Ala Arg Trp Leu Ser Arg

100 105 110

His Ala Pro Ala His Val Leu Asp Gly Val Arg Arg Leu Arg Asp Glu

115 120 125

Ala Asp Ala Arg Ile Gly Arg Leu Glu Arg Arg Val Glu Glu Val Ala

130 135 140

Ala Ala Gln Gln Gln Gln Gln Ala Ala Ala Thr Ala Leu Pro Pro Pro

145 150 155 160

Ala Ile Ser Leu Pro Phe Ala Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Lys

165 170 175

Ala Met Ala Met Met Ala Met Asp Thr Pro Pro Thr Lys Gly Met Ala

180 185 190

Val Gly Met Glu Val Glu Leu Pro Phe Pro Asp Asp Glu Glu Asp Glu

195 200 205

Ser Met Val Gly Gly Gly Val Arg Val Gly Lys Glu Lys Val Lys Glu

210 215 220

Met Val Met Ser Gly Gly Gly Gly Gly Trp Glu Ala Val Gly Ile Cys

225 230 235 240

Gly Met Gly Gly Ser Gly Lys Thr Thr Leu Ala Met Glu Ile Phe Lys

245 250 255

Asp His Lys Ile Arg Gly Tyr Phe Ser Asp Arg Val Phe Phe Glu Thr

260 265 270

Ile Ser Gln Ser Ala Asn Leu Asp Thr Ile Lys Met Lys Leu Trp Glu

275 280 285

Gln Ile Ser Gly Asn Leu Val Leu Gly Ala Tyr Asn Gln Ile Pro Glu

290 295 300

Trp Gln Leu Lys Leu Gly Pro Arg Asp Lys Gly Pro Val Leu Val Ile

305 310 315 320

Leu Asp Asp Val Trp Ser Leu Ser Gln Leu Glu Glu Leu Ile Phe Lys

325 330 335

Phe Pro Gly Cys Lys Thr Leu Val Val Ser Arg Phe Lys Phe Pro Ser

340 345 350

Leu Val Thr Arg Thr Tyr Glu Met Glu Leu Leu Asp Glu Glu Ala Ala

355 360 365

Leu Ser Val Phe Cys Arg Ala Ala Phe Asp Gln Glu Ser Val Pro Arg

370 375 380

Thr Ala Asp Lys Lys Leu Val Arg Gln Val Ala Ala Glu Cys Arg Gly

385 390 395 400

Leu Pro Leu Ala Leu Lys Val Ile Gly Ala Ser Leu Arg Asp Gln Pro

405 410 415

Pro Lys Ile Trp Leu Ser Ala Lys Asn Arg Leu Ser Arg Gly Glu Thr

420 425 430

Ile Ser Asp Ser His Glu Thr Lys Leu Leu Glu Arg Met Ala Ala Ser

435 440 445

Ile Glu Cys Leu Ser Gly Lys Val Arg Glu Cys Phe Leu Asp Leu Gly

450 455 460

Cys Phe Pro Glu Asp Lys Lys Ile Pro Leu Asp Val Leu Ile Asn Ile

465 470 475 480

Trp Met Glu Ile His Asp Leu Asp Glu Pro Asp Ala Phe Ala Ile Leu

485 490 495

Val Glu Leu Ser Asn Lys Asn Leu Leu Thr Leu Val Asn Asp Ala Gln

500 505 510

Asn Lys Ala Gly Asp Leu Tyr Ser Ser Tyr His Asp Phe Ser Val Thr

515 520 525

Gln His Asp Val Leu Arg Asp Leu Ala Leu His Met Ser Gly Arg Asp

530 535 540

Ala Leu Asn Asn Arg Arg Arg Leu Val Met Pro Arg Arg Glu Glu Ser

545 550 555 560

Leu Pro Lys Asp Trp Gln Arg Asn Lys Asp Thr Pro Phe Glu Ala Gln

565 570 575

Ile Val Ser Ile His Thr Gly Glu Met Lys Glu Ser Asp Trp Phe Gln

580 585 590

Met Ser Phe Pro Lys Ala Glu Val Leu Ile Leu Asn Phe Ala Ser Ser

595 600 605

Val Tyr Tyr Leu Pro Pro Phe Ile Ala Thr Met Gln Asn Leu Lys Ala

610 615 620

Leu Val Leu Ile Asn Tyr Gly Thr Ile Ser Ala Thr Leu Asp Asn Leu

625 630 635 640

Ser Ala Phe Thr Thr Leu Ser Asp Leu Arg Ser Leu Trp Leu Glu Lys

645 650 655

Ile Thr Leu Pro Pro Leu Pro Lys Thr Thr Ile Pro Leu Lys Asn Leu

660 665 670

Arg Lys Ile Ser Leu Val Leu Cys Glu Leu Thr Asn Ser Leu Arg Gly

675 680 685

Ser Lys Val Asp Leu Ser Met Thr Phe Pro Arg Leu Ser Asn Leu Thr

690 695 700

Ile Asp His Cys Ile Asp Leu Lys Glu Leu Pro Ser Ser Ile Cys Glu

705 710 715 720

Ile Ser Ser Leu Glu Ser Ile Ser Ile Ser Asn Cys His Asp Leu Thr

725 730 735

Glu Leu Pro Tyr Glu Leu Gly Lys Leu His Cys Leu Ser Ile Leu Arg

740 745 750

Val Tyr Ala Cys Pro Ala Leu Trp Arg Leu Pro Pro Ser Val Cys Ser

755 760 765

Leu Lys Arg Leu Lys Tyr Leu Asp Ile Ser Gln Cys Val Asn Leu Thr

770 775 780

Asp Leu Pro Glu Glu Leu Gly His Leu Thr Ser Leu Glu Lys Ile Asp

785 790 795 800

Met Arg Glu Cys Ser Arg Leu Arg Ser Leu Pro Arg Ser Ser Ser Ser

805 810 815

Leu Lys Ser Leu Gly His Val Val Cys Asp Glu Glu Thr Ala Leu Leu

820 825 830

Trp Arg Glu Ala Glu Gln Val Ile Pro Asp Leu Arg Val Gln Val Ala

835 840 845

Glu Glu Cys Tyr Asn Leu Asp Trp Leu Val Asp

850 855

Claims

1.一种水稻抗病基因LBRG1，其特征在于，所述水稻抗病基因LBRG1的编码区序列如SEQID NO：1所示。

2.如权利要求1所述的水稻抗病基因LBRG1，其特征在于，其编码的氨基酸序列如SEQID NO：2所示。

3.含有如权利要求1所述的水稻抗病基因LBRG1的重组载体。

4.含有如权利要求1所述的水稻抗病基因LBRG1的重组工程菌。

5.一种如权利要求1所述的水稻抗病基因LBRG1在提高水稻稻瘟病抗性中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述水稻的品种为C105TTP-4L-23。

7.一种如权利要求1所述的水稻抗病基因LBRG1的功能鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

8.根据权利要求7所述的功能鉴定方法，其特征在于，步骤S1中，所述表达载体的构建及转化的具体步骤包括：

9.根据权利要求8所述的功能鉴定方法，其特征在于，步骤S2之后还包括对所述基因敲除的突变体植株的DNA进行分子鉴定，所述分子鉴定包括以下步骤：

设计潮霉素引物hygF(CCGGAAGTGCTTGACATTGG)和hygR(GCCGAATTAATTCGGGG)并对所述基因敲除的突变体植株的潮霉素基因的一段进行扩增，能扩增出1035bp大小片段为阳性植株；收集所述阳性植株的种子，播种后取幼叶提取DNA进行靶位点的突变检测，设计包含靶位点片段PCR的引物LBRG1-TC-F(CTCTCACAGCTAGAGGAG)、LBRG1-TC-R(GCTCAACCAAGATGGCG)，扩增出517bp大小的片段进行测序分析，测序结果为移码突变的植株即为纯合敲除植株，后代即为纯合Cas9敲除突变体植株。