CN114853856A

CN114853856A - ClZISO基因在制备黄瓤西瓜中的应用以及在鉴定黄瓤西瓜中的应用

Info

Publication number: CN114853856A
Application number: CN202110147999.2A
Authority: CN
Inventors: 许勇; 张洁; 宫国义; 张海英; 郭绍贵; 任毅; 李茂营
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2021-02-03
Filing date: 2021-02-03
Publication date: 2022-08-05
Anticipated expiration: 2041-02-03
Also published as: CN114853856B

Abstract

本发明公开了ClZISO基因在制备黄瓤西瓜中的应用以及在鉴定黄瓤西瓜中的应用。本发明提供了一种蛋白质(ClZISO蛋白)，是序列表的序列4所示的蛋白质。编码ClZISO蛋白的基因也属于本发明的保护范围，将其命名为ClZISO基因。本发明还保护一种黄瓤西瓜育种方法，包括如下步骤：抑制红瓤西瓜中ClZISO基因的表达，从而得到黄瓤西瓜。本发明对于西瓜果肉颜色的品种育种具有重大的积极意义。

Description

ClZISO基因在制备黄瓤西瓜中的应用以及在鉴定黄瓤西瓜中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及ClZISO基因在制备黄瓤西瓜中的应用以及在鉴定黄瓤西瓜中的应用。

背景技术

西瓜，拉丁学名为Citrullus lanatus(Thunb.)Matsum.et Nakai。西瓜属于双子叶植物纲、葫芦科西瓜属。西瓜为一年生蔓生藤本，雌雄同株，温带、热带区域均有栽培。

西瓜(Citrullus lanatus)是我国十大水果之一，且我国西瓜产销量位于世界第一。西瓜果实富含类胡萝卜素类物质，红瓤西瓜中番茄红素为主，橙黄瓤瓜中以β-胡萝卜素为主，黄瓤瓜以新黄质和紫黄质类为主。

对于西瓜市场来说，存在人们对多样化、高品质商品西瓜的需求。

发明内容

本发明的目的是提供ClZISO基因在制备黄瓤西瓜中的应用以及在鉴定黄瓤西瓜中的应用。

本发明提供了一种蛋白质(ClZISO蛋白)，获自西瓜(Citrullus lanatus)，是如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)：

(a1)序列表的序列4所示的蛋白质；

(a2)将序列表的序列4所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与西瓜果肉颜色相关的由(a1)所述蛋白质衍生的蛋白质；

(a3)在(a1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；

(a4)来源于西瓜且与(a1)具有98％以上同一性且与西瓜果肉颜色相关的蛋白质。

编码ClZISO蛋白的基因也属于本发明的保护范围，将其命名为ClZISO基因。

ClZISO基因是如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)的DNA分子：

(b1)编码区如序列表的序列3所示的DNA分子；

(b2)序列表的序列1所示的DNA分子；

(b3)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；

(b4)来源于西瓜且与(b1)或(b2)限定的DNA分子至少具有98％同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。

所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5MNaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次；也可为：2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；也可为：0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

本发明还保护ClZISO蛋白在调控西瓜果肉颜色中的应用。

所述应用中，所述ClZISO蛋白表达被抑制，西瓜由红瓤变成黄瓤。

本发明还保护ClZISO基因在制备黄瓤西瓜中的应用。

所述应用中，所述ClZISO基因的表达被抑制，西瓜由红瓤变成黄瓤。

本发明还保护用于抑制ClZISO基因表达的物质在制备黄瓤西瓜中的应用。用于抑制ClZISO基因表达的物质可为通过基因编辑抑制ClZISO基因表达的物质。通过基因编辑抑制ClZISO基因表达的物质具体可为通过CRISPR/Cas9抑制ClZISO基因表达的物质。通过CRISPR/Cas9抑制ClZISO基因表达的物质可包括两个sgRNA，其中一个如序列表的序列6所述，另一个如序列表的序列7所示。通过CRISPR/Cas9抑制ClZISO基因表达的物质可包括Cas9蛋白。通过CRISPR/Cas9抑制ClZISO基因表达的物质可为具有所述两个sgRNA的编码基因和Cas9蛋白的编码基因的重组质粒。所述重组质粒具体可为在PBSE401载体的BsaI酶切位点插入序列表的序列5所示的DNA分子得到的重组质粒。

本发明还保护一种黄瓤西瓜育种方法，包括如下步骤：对红瓤西瓜基因组中的ClZISO基因进行基因编辑，从而得到黄瓤西瓜。所述对红瓤西瓜基因组中的ClZISO基因进行基因编辑抑制ClZISO基因表达。所述抑制ClZISO基因表达具体可为通过CRISPR/Cas9抑制ClZISO基因表达。通过CRISPR/Cas9抑制ClZISO基因表达时可同时利用两个sgRNA，其中一个如序列表的序列6所述，另一个如序列表的序列7所示。通过CRISPR/Cas9抑制ClZISO基因表达可通过导入具有所述两个sgRNA的编码基因和Cas9蛋白的编码基因的重组质粒实现。所述重组质粒具体可为在PBSE401载体的BsaI酶切位点插入序列表的序列5所示的DNA分子得到的重组质粒。

本发明还保护一种黄瓤西瓜育种方法，包括如下步骤：抑制红瓤西瓜中ClZISO基因的表达，从而得到黄瓤西瓜。抑制红瓤西瓜中ClZISO基因表达具体借助基因编辑实现。抑制红瓤西瓜中ClZISO基因表达具体可为通过CRISPR/Cas9抑制ClZISO基因表达。通过CRISPR/Cas9抑制ClZISO基因表达时可同时利用两个sgRNA，其中一个如序列表的序列6所述，另一个如序列表的序列7所示。通过CRISPR/Cas9抑制ClZISO基因表达可通过导入具有所述两个sgRNA的编码基因和Cas9蛋白的编码基因的重组质粒实现。所述重组质粒具体可为在PBSE401载体的BsaI酶切位点插入序列表的序列5所示的DNA分子得到的重组质粒。

本发明还保护一种黄瓤西瓜育种方法，包括如下步骤：降低红瓤西瓜中ClZISO蛋白的含量和/或活性，从而得到黄瓤西瓜。

本发明还保护一种鉴定或者辅助鉴定黄瓤西瓜种质的方法，包括如下步骤：检测待测西瓜种质是否为ClZISO基因突变纯合型，如果为ClZISO基因突变纯合型、待测西瓜种质为或候选为黄瓤西瓜，如果不为ClZISO基因突变纯合型、待测西瓜种质为或候选为红瓤西瓜。所述ClZISO基因突变为引起编码ClZISO蛋白的基因中发生了引起氨基酸残基差异的突变。ClZISO基因突变为引起编码ClZISO蛋白的基因发生提前终止的突变。所述ClZISO基因突变的突变后编码框具体可如序列表的序列2所示。

检测待测西瓜种质是否为ClZISO基因突变纯合型的方法可为：以待测西瓜种质的基因组DNA为模板，采用特异引物对进行PCR扩增，然后进行测序。

所述特异引物对可为序列表的序列8所示的单链DNA分子和序列表的序列9所示的单链DNA分子组成的引物对。

所述特异引物对可为序列表的序列10所示的单链DNA分子和序列表的序列9所示的单链DNA分子组成的引物对。

待测西瓜种质具体可为红瓤西瓜“302”植株和EMS黄瓤突变株植株的杂交后代。

待测西瓜种质具体可为红瓤西瓜“302”植株(作为母本)和EMS黄瓤突变株植株(作为父本)的杂交后代。

待测西瓜种质具体可为红瓤西瓜“302”植株和EMS黄瓤突变株植株的杂交后代的自交后代。

待测西瓜种质具体可为红瓤西瓜“302”植株(作为母本)和EMS黄瓤突变株植株(作为父本)的杂交后代的自交后代。

示例性的，以上任一所述红瓤西瓜为红瓤西瓜“ZZJM”。

本发明的发明人将红瓤西瓜“302”的种子进行EMS诱变，获得了一株长势正常且瓜瓤为黄色的单株，将其命名为EMS黄瓤突变株。通过将红瓤西瓜“302”和EMS黄瓤突变株杂交并获得F1代群体和F2代群体，对黄瓤西瓜的控制基因进行精细定位，最终获得了控制该性状产生的目的蛋白的编码基因，其位于西瓜7号染色体。由于该基因发生了点突变，使其编码的蛋白质提前终止，从而催化功能丧失，从而产生主要积累了上游类胡萝卜素物质的黄瓤西瓜。

本发明获得的控制西瓜黄瓤性状的蛋白质及其编码基因，丰富了人们对西瓜瓤色形成的分子机理的了解，对深入了解西瓜瓤色形成的分子机理提供了有力支撑。本发明还提供了通过抑制ClZISO基因表达创制黄瓤西瓜种质的方法。本发明对于西瓜果肉颜色的品种育种具有重大的积极意义。

附图说明

图1为红瓤西瓜“302”、EMS黄瓤突变株、F1代部分单株、F2代部分单株的果肉表型照片。

图2示出了西瓜EMS黄瓤突变基因的定位结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

西瓜京欣4号记载于中国种业大数据平台(http://202.127.42.145/bigdataNew/)，登记编号为GPD西瓜(2019)110143，亲本为西瓜T326×西瓜302。西瓜302为红瓤西瓜，又称为红瓤西瓜“302”。

西瓜京研2号记载于中国种业大数据平台(http://202.127.42.145/bigdataNew/)，登记编号为GPD西瓜(2020)110161，亲本为西瓜ZZJM×西瓜98R。西瓜ZZJM为红瓤西瓜，又称为红瓤西瓜“ZZJM”。

实施例1、西瓜黄瓤新材料的获得及候选基因鉴定

一、供试材料的获得

红瓤西瓜“302”为典型的红瓤西瓜栽培种。

红瓤西瓜“302”的种子进行EMS诱变，得到一株纯合单株，该单株的果肉为黄瓤，命名为EMS黄瓤突变株。EMS黄瓤突变株已保存于北京蔬菜种质资源信息服务平台(http://123.127.162.62:9999/Web/index.html)，编号：35600。

红瓤西瓜“302”植株(作为母本)和EMS黄瓤突变株植株(作为父本)杂交，得到F1代种子。F1代种子长成的植株即为F1代植株。共得到12株F1代单株。

F1代植株自交得到F2代群体，由371株单株组成。

二、果肉颜色表型的统计

红瓤西瓜“302”、EMS黄瓤突变株、F1代部分单株、F2代部分单株的果肉表型照片见图1。红瓤西瓜“302”植株的果肉颜色均为红瓤。EMS黄瓤突变株植株的果肉颜色均为黄瓤。F1代单株的果肉颜色均为红瓤。F2代单株中，有的单株的果肉颜色为红瓤，有的单株的果肉颜色为黄瓤。

通过表型及卡方检测发现，后代群体(F1代群体和F2代群体)果肉颜色的遗传符合单基因控制模型。黄瓤基因Ye隐性控制黄瓤表型。两个亲本以及后代群体的基因型和果肉颜色表型见表1。两个亲本的果肉类胡萝卜素种类及含量见表2。

表1西瓜黄瓤基因定位群体中父本、母本、F1代、F2代群体的表型

世代	基因型	果肉颜色表型	期待的比例	<sup>2</sup>	P
						302(母本)	YeYe	红瓤
EMS黄(父本)	yeye	黄瓤
						F1	Yeve	红瓤12	1∶0	0	1
F2	分离	红瓤278：黄瓤93	3∶1	0.0000	0.9975

表2 302(母本)及EMS黄(父本)的果肉类胡萝卜素的种类及含量

ND＝not detected，未检出。

三、西瓜果肉颜色控制基因的定位和颜色控制基因控制位点的获得

利用BSA测序法对部分F2代群体进行遗传连锁分析，初步定位目标基因区间。通过遗传连锁分析将黄瓤基因定位在西瓜7号染色体上。基于进一步分析，获得了C1ZISO基因，其编码ClZISO蛋白。西瓜EMS黄瓤突变基因的定位结果图见图2。

红瓤西瓜302的基因组DNA中的ClZISO基因如序列表的序列1所示(将该基因命名为野生型ClZISO基因)，cDNA中的编码框如序列表的序列3所示，编码序列表的序列4所示的ClZISO蛋白。红瓤西瓜302携带野生型ClZISO基因，且为纯合型。

EMS黄瓤突变株中，ClZISO基因发生了突变，即编码区818bp处的G变成了A，导致273处编码色氨酸(W)的密码子TGG变成了终止密码子TAG。突变后基因组DNA中相应的起始密码子至终止密码子之间的序列如序列表的序列2所示(将该基因命名为突变型ClZISO基因)。EMS黄瓤突变株携带突变型ClZISO基因，且为纯合型。

F1代单株均同时携带野生型ClZISO基因和突变型ClZISO基因，为杂合型。

F2代单株中：果肉颜色为红瓤的单株，部分携带野生型ClZISO基因且为纯合型，部分同时携带野生型ClZISO基因和突变型ClZISO基因(为杂合型)；果肉颜色为黄瓤的单株，均携带突变型ClZISO基因且为纯合型。

实施例2、通过CRISPR/Cas9系统创制黄瓤西瓜

PBSE401载体(用于双子叶植物的CRISPR/Cas9双元载体)，记载于如下文献：XingH L,Dong L,Wang Z P,et al.A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editingin plants[J].BMC Plant Biology,2014.。

pCBC-DT1T2载体(PCR模板载体)，记载于如下文献：Xing H L,Dong L,Wang Z P,et al.A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants[J].BMCPlant Biology,2014.。

农杆菌EHA105：上海昂羽生物技术有限公司。

一、CRISPR/Cas9载体构建

1、选择靶点

基于预实验，选取的2个靶点如下(靶点1位于编码链，靶点2位于模板链)：

靶点1为：5’-TGCTCACACAGTTTGGATT-3’；

靶点2为：5’-GCGCAGTGATGGATAGATA-3’；

2、设计引物

根据选取的靶点，结合PBSE401载体对引物接头的设计要求，设计引物。

ziso-1-BsF：ATATATGGTCTCGATTGTGCTCACACAGTTTGGATTGTT；

ziso-1-F0：TGTGCTCACACAGTTTGGATTGTTTTAGAGCTAGAAATAGC；

ziso-2-R0：AACTATCTATCCATCACTGCGCCAATCTCTTAGTCGACTCTAC；

ziso-2-BsR：ATTATTGGTCTCGAAACTATCTATCCATCACTGCGCC。

上述4种引物中，下划线部分对应靶点序列，其余部分为接头序列。

3、PCR扩增

以pCBC-DT1T2载体为模板，根据选择的双靶点，进行四引物PCR扩增。

PCR扩增的反应体系(13μL)：1.3μL含15mM MgCl₂的10×EasyTaq PCR Buffer，0.8μL 2.5mM dNTPs溶液，Taq DNA聚合酶(含量为0.4U)，0.5μL引物溶液(含0.5mM ziso-1-BsF和0.5mM ziso-2-BsR)，0.5μL引物溶液(含0.5mM ziso-1-F0和0.5mM ziso-2-R0)，0.1μgpCBC-DT1T2载体，余量为ddH₂O。Taq DNA聚合酶、反应缓冲液及dNTPs均购自北京全式金生物技术有限公司。

PCR扩增的反应程序：

阶段1：94℃预变性5min；

阶段2：94℃15s，55℃20s，72℃20s，共34个循环；

阶段3：72℃延伸4min；

阶段4：4℃保存。

PCR扩增采用Applied Biosystems公司的Veriti 96well Thermal Cycler。

4、完成步骤3后，纯化回收PCR扩增产物，进行测序。

PCR扩增产物大小为626bp，如序列表的序列5所示。

5、进行酶切-连接反应。

酶切-连接的反应体系和反应条件见表3。

表3酶切-连接的反应体系和反应条件

得到重组质粒PBSE401-sgRNA1-2。经测序验证，重组质粒PBSE401-sgRNA1-2中具有编码sgRNA1的DNA分子和编码sgRNA2的DNA分子，因此表达sgRNA1和sgRNA2。sgRNA1如序列表的序列6所示，sgRNA2如序列表的序列7所示。

二、农杆菌介导的西瓜子叶转化及阳性株鉴定

1、将重组质粒PBSE401-sgRNA1-2导入农杆菌EHA105，得到重组农杆菌；用MS液体培养基悬浮重组农杆菌，得到OD_600nm值为0.8-1.0的菌液，即为侵染液。

2、将红瓤西瓜“ZZJM”的种子小心剥去种皮(尽量避免伤及种仁)，用3％(质量百分含量)次氯酸钠水溶液消毒15min，用水清洗3次，然后放置于MS固体培养基平板，28℃暗培养3天。本步骤的目的为促使西瓜种子萌动。

3、完成步骤2后，切取健康萌动的西瓜种子的种仁，自子叶近轴端，切成1.5mm×1.5mm的外植体，将外植体置于装有10mL MS液体培养基的9cm培养皿中，然后加入50μL侵染液，混匀，浸泡10min，然后取出外植体，吸干表面菌液，然后将外植体转移至共培养培养基中，28℃培养4天。

共培养培养基(pH5.8)：含1.5mg/L 6-BA的MS固体培养基。

4、完成步骤3后，将外植体转移至筛选培养基上培养4周，可观察到筛选阳性的绿色幼芽从子叶块边缘长出。每个平板上放25个左右的外植体，每周更换一次培养基。培养条件：28℃，16h光照/8h黑暗。

筛选培养基(pH5.8)：含1.5mg/L 6-BA、100mg/L特美汀和2mg/L草铵膦的MS固体培养基。特美汀(Timentin)：北京酷来搏科技有限公司。草铵膦(BASTA)：西格玛奥德里奇中国公司)。

5、完成步骤4后，切取生长良好的绿色幼芽，转移至芽伸长培养基培养4-6周，此时幼芽生长成为幼苗(即，具有完整地上部分的植株，包含茎、叶及顶端生长点)。培养条件：28℃，16h光照/8h黑暗。

芽伸长培养基(pH5.8)：含0.1mg/L 6-BA、0.01mg/L NAA、100mg/L特美汀和2mg/L草铵膦的MS固体培养基。

6、完成步骤5后，将幼苗转移至生根培养基进行培养，每瓶2个幼苗，至幼苗生根长成完整的生根植株(即，西瓜植株)。培养条件：28℃，16h光照/8h黑暗。

生根培养基(pH5.8)：含1mg/L IBA和100mg/L特美汀的MS固体培养基。

7、完成步骤6后，将生根植株移栽至育苗钵，放入培养箱驯化培养培养1周。驯化培养条件：温度26℃、16小时光照，温度24℃、8小时黑暗。

在驯化培养过程中进行阳性株的鉴定：

(1)将植株编号，然后采用BASTA(草铵膦)抗性试纸条测试(北京奥创金标生物技术有限公司生产的转基因BAR快速检测试条，按说明书操作)筛选抗性阳性株。

(2)步骤(1)的抗性阳性株，取叶片，提取基因组DNA(作为模板DNA)，采用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物并测序。分析PCR扩增产物与野生型ClZISO基因的序列差异，发现上述两个靶点的至少一处(即，序列表中序列1的2152-2170bp、2378-2396bp处中的至少一处)出现了特异突变的植株被确认为基因编辑阳性株。特异突变即引起编码氨基酸的变化的突变。

F1(上游引物，序列8)：5’-CTTTCAGACTAACACAAAAGAAG-3’；

R1(下游引物，序列9)：5’-TTACCAATGAAGCCTAAAACTAG-3’。

PCR扩增的反应体系(13μL)：1.3μL含15mM MgCl₂的10×EasyTaq PCR Buffer，0.8μL 2.5mM dNTPs溶液，Taq DNA聚合酶(含量为0.4U)，0.5μL 10mM上游引物溶液，0.5μL10mM下游引物溶液，20ng模板DNA，余量为ddH₂O。Taq DNA聚合酶、反应缓冲液及dNTPs均购自北京全式金生物技术有限公司。

PCR扩增的反应程序：

阶段1：94℃预变性5min；

阶段2：94℃15s，55℃20s，72℃2min，共34个循环；

阶段3：72℃延伸10min；

阶段4：4℃保存。

PCR扩增采用Applied Biosystems公司的Veriti 96well Thermal Cycler。

得到4株基因编辑阳性株。

8、将步骤7得到的基因编辑阳性株(T0代植株)定植到田间，T0代植株自交获得后代，即为T1代植株。

9、从T1代植株中筛选与亲本发生相同的突变(即所述特异突变)且为基于该突变为纯合型的植株，发现这些植株的果肉均为黄瓤。

实施例3、通过ClZISO基因突变鉴定或者辅助鉴定西瓜果肉颜色

1、基因组DNA提取

提取西瓜材料的基因组DNA。

2、PCR扩增

以步骤1提取的基因组DNA为模板，采用ClZISO-F和ClZISO-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

ClZISO-F(上游引物，序列10)：5’-ATGGCGGTTGCCTCCGCCACTC-3’；

ClZISO-R(下游引物，序列9)：5’-TTACCAATGAAGCCTAAAACTAG-3’。

PCR扩增的反应体系：2μL含15mM MgCl₂的10×Buffer，2μL 2.5mM dNTPs，1U TaqDNA聚合酶，1μL 10mM上游引物溶液，1μL 10mM下游引物溶液，50ng模板DNA，ddH₂O补足到20μL。Taq DNA聚合酶及反应缓冲液购自TaKaRa公司。dNTPs购自北京全式金生物技术有限公司。

PCR扩增的反应程序：

阶段1：94℃预变性5min；

阶段2：94℃20s，56℃20s，72℃30s，共循环34次；

阶段3：72℃延伸5min；

阶段4：4℃保持。

PCR扩增采用Applied Biosystems公司的Veriti 96well Thermal Cycler。

3、将PCR扩增产物进行测序。

测序结果表明：

ClZISO基因发生了突变且为纯合型的西瓜材料为黄瓤西瓜。

ClZISO基因发生了突变即编码序列表的序列4所示的ClZISO蛋白的基因发生了引起氨基酸残基改变的突变。

由此可见，可以通过如下方法鉴定或辅助鉴定待测西瓜是否为黄瓤品种：使用用于扩增西瓜ClZISO基因的引物对(可为序列表的序列10所示的单链DNA分子和序列表的序列9所示的单链DNA分子)，对待测西瓜材料的基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；然后对PCR扩增产物进行测序；如果ClZISO基因发生了突变且为纯合型，该西瓜材料为或候选为黄瓤西瓜。ClZISO基因发生了突变即编码序列表的序列4所示的ClZISO蛋白的基因发生了引起氨基酸残基改变的突变。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 北京市农林科学院

<120> ClZISO基因在制备黄瓤西瓜中的应用以及在鉴定黄瓤西瓜中的应用

<130> GNCYX210634

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2461

<212> DNA

<213> Citrullus lanatus

<400> 1

atggcggttg cctccgccac tcctcctttt tcttctccat gtctctcctc ccgtcgccat 60

cgctgccctg atgcaattac cctccgaccc ttttcaattt cgacccccaa ttgccctctc 120

caacttccat tttccctaaa ttccacaccc atttcccgac gtcctcgatt tgccccccag 180

gcttctattg gagacagcga gagtggtggg tcgacctctg tctccgacga cggcggcttt 240

gtcggcgagg acgctgctgc ttttgatctt tccgagcaga aattgacttc gtgggtttat 300

ttcaccgtaa ttttgggggt tgttctgttc gtgttgaatg ttgtttggat tgataactct 360

gctggggggg ttgggaaggc ctttgtggat gctgtttctg gaatttcgga tagtcatgag 420

gttcactttt gtattacttt cgttctgttt tatttgattt ccaaatagaa ataattcaat 480

tgccaatccc ccgcaccatg aatattttat agaagcattg ttcatagtaa ttctggtgtt 540

ttatagttta tctatagtgt tccgcaaagt aggagagatt ttcttattct cagatgatct 600

ttactggttg gtttggttgc tatggctttt agaatgttta gttttgtcct ccttactttt 660

aattaacttg taatgaatga tggatgttga agttctaaaa ttgtattcat tagtagcatt 720

tttgggctaa gtctatttgg aatatttcca actcagttag taaaatatgt acataattca 780

cggattttaa atttcagtgt cgaagaagat ttgattgaaa aatcttgata cattaaggat 840

tatattgata ctgataaagg tcttgtgtgt cttttgttta tgaacgattg gaattgatga 900

acatagcata aggattatat tgctcatggt ttaatgctga atttcggaat ctcacttgat 960

tatatgaatt gaagtcttga aactttcttt tgcaggttgt gatgttgctc ctcatatgca 1020

tttttgcctt tgtccatagt ggtttggcta gtctccgaga tcagggtgag aagcttgttg 1080

gtgaacgagc ttttcgggtt ttgtttgctg gagtttctct gccattggct gttagcactg 1140

tggtagatac cttacctctt cttttccctt aaacttgatg aagtaaatgc aatgtgcttg 1200

aagttatttc aatgcctatt attcattcaa gttctctgaa tgcaaacgca tattgacttg 1260

tttatactaa ggagttgtat tcaggtgtat ttcattaacc atcgatatga tggagtacag 1320

ttatggcagc tccaaagtgt tcccggactg catcaacttg tgtggctcag ttcgtttatc 1380

tccttcttct tcctctatcc ttcaactttt aatctgctgg aggtcgcagc ggtcgataaa 1440

ccgaaaatgc acctttggga aacaggcatc attagaataa ctaggcatcc acaggtatgt 1500

ttgtgtttca ttatcttgaa tgttcatttc atttcattac actatcaggg ctttattgct 1560

gttagtttgg tggctttttt ttttaaaaaa aagacaaatt tgcaatgtgg caacttgtaa 1620

ttggacactt gggtagggtg cacagagata ggtgcagcct gaaatgcacc aaagtatttt 1680

tctttattgc tgttagtttg gtggctttgg cttgaatcca ttgatgaacc agagtttcca 1740

ttgacttgtt agatcagttg gacacatctt ctgtaccact tgattaatat atttctcata 1800

gacccatttt ttatgtcaag tatccacaga taggtgttga gtcatttttg ttaaatgatt 1860

aacaaaaagt taggccaata aaagtttaga gaccaaaata taggatttta actaactata 1920

tatcgcattg cacaagtgtt tcctcaaaag tcatgtttag tctttcagac taacacaaaa 1980

gaagatttga gacaatggat ttcctcgcta tctgtttcga gatctgatgt taatatttca 2040

tgaagagggg atgaaaaaca ccaccaacca tgaaaagtcg ttttctataa acactgacct 2100

tgcaaatctt ggtttctctt tgaagatggt tggacaggtg atgtggtgcc ttgctcacac 2160

agtttggatt gggaactctg ttgcagtagc agcttccatt ggcttgatag gacatcatct 2220

gtttggagta tggaatgggg acaggaggct agccaagcga tatggggcgg attttgaagc 2280

cgtgaaaagg cgaacaagca tcgtcccatt tgctgccatt gtcaatggtc gtcaaaagtt 2340

gcctgatgat tactacaagg aattcgttcg cttgccatat ctatccatca ctgcgctgac 2400

aataggtgct tacgttgctc acccccttat gcaagctgct agttttaggc ttcattggta 2460

a 2461

<210> 2

<211> 2167

<212> DNA

<213> Citrullus lanatus

<400> 2

atggcggttg cctccgccac tcctcctttt tcttctccat gtctctcctc ccgtcgccat 60

cgctgccctg atgcaattac cctccgaccc ttttcaattt cgacccccaa ttgccctctc 120

caacttccat tttccctaaa ttccacaccc atttcccgac gtcctcgatt tgccccccag 180

gcttctattg gagacagcga gagtggtggg tcgacctctg tctccgacga cggcggcttt 240

gtcggcgagg acgctgctgc ttttgatctt tccgagcaga aattgacttc gtgggtttat 300

ttcaccgtaa ttttgggggt tgttctgttc gtgttgaatg ttgtttggat tgataactct 360

gctggggggg ttgggaaggc ctttgtggat gctgtttctg gaatttcgga tagtcatgag 420

gttcactttt gtattacttt cgttctgttt tatttgattt ccaaatagaa ataattcaat 480

tgccaatccc ccgcaccatg aatattttat agaagcattg ttcatagtaa ttctggtgtt 540

ttatagttta tctatagtgt tccgcaaagt aggagagatt ttcttattct cagatgatct 600

ttactggttg gtttggttgc tatggctttt agaatgttta gttttgtcct ccttactttt 660

aattaacttg taatgaatga tggatgttga agttctaaaa ttgtattcat tagtagcatt 720

tttgggctaa gtctatttgg aatatttcca actcagttag taaaatatgt acataattca 780

cggattttaa atttcagtgt cgaagaagat ttgattgaaa aatcttgata cattaaggat 840

tatattgata ctgataaagg tcttgtgtgt cttttgttta tgaacgattg gaattgatga 900

acatagcata aggattatat tgctcatggt ttaatgctga atttcggaat ctcacttgat 960

tatatgaatt gaagtcttga aactttcttt tgcaggttgt gatgttgctc ctcatatgca 1020

tttttgcctt tgtccatagt ggtttggcta gtctccgaga tcagggtgag aagcttgttg 1080

gtgaacgagc ttttcgggtt ttgtttgctg gagtttctct gccattggct gttagcactg 1140

tggtagatac cttacctctt cttttccctt aaacttgatg aagtaaatgc aatgtgcttg 1200

aagttatttc aatgcctatt attcattcaa gttctctgaa tgcaaacgca tattgacttg 1260

tttatactaa ggagttgtat tcaggtgtat ttcattaacc atcgatatga tggagtacag 1320

ttatggcagc tccaaagtgt tcccggactg catcaacttg tgtggctcag ttcgtttatc 1380

tccttcttct tcctctatcc ttcaactttt aatctgctgg aggtcgcagc ggtcgataaa 1440

ccgaaaatgc acctttggga aacaggcatc attagaataa ctaggcatcc acaggtatgt 1500

ttgtgtttca ttatcttgaa tgttcatttc atttcattac actatcaggg ctttattgct 1560

gttagtttgg tggctttttt ttttaaaaaa aagacaaatt tgcaatgtgg caacttgtaa 1620

ttggacactt gggtagggtg cacagagata ggtgcagcct gaaatgcacc aaagtatttt 1680

tctttattgc tgttagtttg gtggctttgg cttgaatcca ttgatgaacc agagtttcca 1740

ttgacttgtt agatcagttg gacacatctt ctgtaccact tgattaatat atttctcata 1800

gacccatttt ttatgtcaag tatccacaga taggtgttga gtcatttttg ttaaatgatt 1860

aacaaaaagt taggccaata aaagtttaga gaccaaaata taggatttta actaactata 1920

tatcgcattg cacaagtgtt tcctcaaaag tcatgtttag tctttcagac taacacaaaa 1980

gaagatttga gacaatggat ttcctcgcta tctgtttcga gatctgatgt taatatttca 2040

tgaagagggg atgaaaaaca ccaccaacca tgaaaagtcg ttttctataa acactgacct 2100

tgcaaatctt ggtttctctt tgaagatggt tggacaggtg atgtggtgcc ttgctcacac 2160

agtttag 2167

<210> 3

<211> 1113

<212> DNA

<213> Citrullus lanatus

<400> 3

atggcggttg cctccgccac tcctcctttt tcttctccat gtctctcctc ccgtcgccat 60

cgctgccctg atgcaattac cctccgaccc ttttcaattt cgacccccaa ttgccctctc 120

caacttccat tttccctaaa ttccacaccc atttcccgac gtcctcgatt tgccccccag 180

gcttctattg gagacagcga gagtggtggg tcgacctctg tctccgacga cggcggcttt 240

gtcggcgagg acgctgctgc ttttgatctt tccgagcaga aattgacttc gtgggtttat 300

ttcaccgtaa ttttgggggt tgttctgttc gtgttgaatg ttgtttggat tgataactct 360

gctggggggg ttgggaaggc ctttgtggat gctgtttctg gaatttcgga tagtcatgag 420

gttgtgatgt tgctcctcat atgcattttt gcctttgtcc atagtggttt ggctagtctc 480

cgagatcagg gtgagaagct tgttggtgaa cgagcttttc gggttttgtt tgctggagtt 540

tctctgccat tggctgttag cactgtggtg tatttcatta accatcgata tgatggagta 600

cagttatggc agctccaaag tgttcccgga ctgcatcaac ttgtgtggct cagttcgttt 660

atctccttct tcttcctcta tccttcaact tttaatctgc tggaggtcgc agcggtcgat 720

aaaccgaaaa tgcacctttg ggaaacaggc atcattagaa taactaggca tccacagatg 780

gttggacagg tgatgtggtg ccttgctcac acagtttgga ttgggaactc tgttgcagta 840

gcagcttcca ttggcttgat aggacatcat ctgtttggag tatggaatgg ggacaggagg 900

ctagccaagc gatatggggc ggattttgaa gccgtgaaaa ggcgaacaag catcgtccca 960

tttgctgcca ttgtcaatgg tcgtcaaaag ttgcctgatg attactacaa ggaattcgtt 1020

cgcttgccat atctatccat cactgcgctg acaataggtg cttacgttgc tcaccccctt 1080

atgcaagctg ctagttttag gcttcattgg taa 1113

<210> 4

<211> 370

<212> PRT

<213> Citrullus lanatus

<400> 4

Met Ala Val Ala Ser Ala Thr Pro Pro Phe Ser Ser Pro Cys Leu Ser

1 5 10 15

Ser Arg Arg His Arg Cys Pro Asp Ala Ile Thr Leu Arg Pro Phe Ser

20 25 30

Ile Ser Thr Pro Asn Cys Pro Leu Gln Leu Pro Phe Ser Leu Asn Ser

35 40 45

Thr Pro Ile Ser Arg Arg Pro Arg Phe Ala Pro Gln Ala Ser Ile Gly

50 55 60

Asp Ser Glu Ser Gly Gly Ser Thr Ser Val Ser Asp Asp Gly Gly Phe

65 70 75 80

Val Gly Glu Asp Ala Ala Ala Phe Asp Leu Ser Glu Gln Lys Leu Thr

85 90 95

Ser Trp Val Tyr Phe Thr Val Ile Leu Gly Val Val Leu Phe Val Leu

100 105 110

Asn Val Val Trp Ile Asp Asn Ser Ala Gly Gly Val Gly Lys Ala Phe

115 120 125

Val Asp Ala Val Ser Gly Ile Ser Asp Ser His Glu Val Val Met Leu

130 135 140

Leu Leu Ile Cys Ile Phe Ala Phe Val His Ser Gly Leu Ala Ser Leu

145 150 155 160

Arg Asp Gln Gly Glu Lys Leu Val Gly Glu Arg Ala Phe Arg Val Leu

165 170 175

Phe Ala Gly Val Ser Leu Pro Leu Ala Val Ser Thr Val Val Tyr Phe

180 185 190

Ile Asn His Arg Tyr Asp Gly Val Gln Leu Trp Gln Leu Gln Ser Val

195 200 205

Pro Gly Leu His Gln Leu Val Trp Leu Ser Ser Phe Ile Ser Phe Phe

210 215 220

Phe Leu Tyr Pro Ser Thr Phe Asn Leu Leu Glu Val Ala Ala Val Asp

225 230 235 240

Lys Pro Lys Met His Leu Trp Glu Thr Gly Ile Ile Arg Ile Thr Arg

245 250 255

His Pro Gln Met Val Gly Gln Val Met Trp Cys Leu Ala His Thr Val

260 265 270

Trp Ile Gly Asn Ser Val Ala Val Ala Ala Ser Ile Gly Leu Ile Gly

275 280 285

His His Leu Phe Gly Val Trp Asn Gly Asp Arg Arg Leu Ala Lys Arg

290 295 300

Tyr Gly Ala Asp Phe Glu Ala Val Lys Arg Arg Thr Ser Ile Val Pro

305 310 315 320

Phe Ala Ala Ile Val Asn Gly Arg Gln Lys Leu Pro Asp Asp Tyr Tyr

325 330 335

Lys Glu Phe Val Arg Leu Pro Tyr Leu Ser Ile Thr Ala Leu Thr Ile

340 345 350

Gly Ala Tyr Val Ala His Pro Leu Met Gln Ala Ala Ser Phe Arg Leu

355 360 365

His Trp

370

<210> 5

<211> 626

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atatatggtc tcgattgtgc tcacacagtt tggattgttt tagagctaga aatagcaagt 60

taaaataagg ctagtccgtt atcaacttga aaaagtggca ccgagtcggt gctttttttt 120

gcaaaatttt ccagatcgat ttcttcttcc tctgttcttc ggcgttcaat ttctggggtt 180

ttctcttcgt tttctgtaac tgaaacctaa aatttgacct aaaaaaaatc tcaaataata 240

tgattcagtg gttttgtact tttcagttag ttgagttttg cagttccgat gagataaacc 300

aatattaatc caaactactg cagcctgaca gacaaatgag gatgcaaaca attttaaagt 360

ttatctaacg ctagctgttt tgtttcttct ctctggtgca ccaacgacgg cgttttctca 420

atcataaaga ggcttgtttt acttaaggcc aataatgttg atggatcgaa agaagagggc 480

ttttaataaa cgagcccgtt taagctgtaa acgatgtcaa aaacatccca catcgttcag 540

ttgaaaatag aagctctgtt tatatattgg tagagtcgac taagagattg gcgcagtgat 600

ggatagatag tttcgagacc aataat 626

<210> 6

<211> 95

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ugcucacaca guuuggauug uuuuagagcu agaaauagca aguuaaaaua aggcuagucc 60

guuaucaacu ugaaaaagug gcaccgaguc ggugc 95

<210> 7

<211> 95

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcgcagugau ggauagauag uuuuagagcu agaaauagca aguuaaaaua aggcuagucc 60

guuaucaacu ugaaaaagug gcaccgaguc ggugc 95

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ctttcagact aacacaaaag aag 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ttaccaatga agcctaaaac tag 23

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atggcggttg cctccgccac tc 22

Claims

1.一种蛋白质，是如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)：

(a1)序列表的序列4所示的蛋白质；

2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因是如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)的DNA分子：

(b1)编码区如序列表的序列3所示的DNA分子；

(b2)序列表的序列1所示的DNA分子；

4.权利要求1所述蛋白质在调控西瓜果肉颜色中的应用。

5.权利要求2或3所述基因在制备黄瓤西瓜中的应用。

6.用于抑制权利要求2或3所述基因表达的物质在制备黄瓤西瓜中的应用。

7.一种黄瓤西瓜育种方法，包括如下步骤：对红瓤西瓜基因组中的权利要求2或3所述基因进行基因编辑，从而得到黄瓤西瓜。

8.一种黄瓤西瓜育种方法，包括如下步骤：抑制红瓤西瓜中权利要求2或3所述基因的表达，从而得到黄瓤西瓜。

9.一种黄瓤西瓜育种方法，包括如下步骤：降低红瓤西瓜中权利要求1中所述蛋白质的含量和/或活性，从而得到黄瓤西瓜。

10.一种鉴定或者辅助鉴定黄瓤西瓜种质的方法，包括如下步骤：检测待测西瓜种质是否为ClZISO基因突变纯合型，如果为ClZISO基因突变纯合型、待测西瓜种质为或候选为黄瓤西瓜，如果不为ClZISO基因突变纯合型、待测西瓜种质为或候选为红瓤西瓜；ClZISO基因突变为编码权利要求1所述蛋白质的基因中发生了引起氨基酸残基差异的突变。