CN103154250A - 具有改变的类胡萝卜素含量的生物体以及制备其的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于改变类胡萝卜素生物合成路径中组分的表达以改变朝向八氢番茄红素、六氢番茄红素、ζ胡萝卜素或其组合中的至少一种的积累而产生类胡萝卜素的手段和方法。本发明进一步涉及具有提高含量的这些类胡萝卜素的基因改变的生物体。本发明进一步涉及具有提高含量的这些类胡萝卜素的基因改变的生物体，特别是在包含色质体的细胞中。

Description

具有改变的类胡萝卜素含量的生物体以及制备其的方法

技术领域

本发明涉及基因改变的生物体（有机体）以及制备其的手段和方法，所述生物体产生提高含量的类胡萝卜素八氢番茄红素、六氢番茄红素、ζ-胡萝卜素（zeta carotene）或它们的组合。

背景技术

类胡萝卜素是40-碳的类异戊二烯色素，其由所有植物、藻类和蓝细菌以及由几种非光合作用的细菌和真菌合成。在植物中，类胡萝卜素是在质体内合成的。质体中类异戊二烯生物合成的主要途径是从产生异戊基二磷酸酯（IPP）开始的，异戊基二磷酸酯是一种C₅分子，其为在2-C-甲基-d-赤藓糖醇-4-磷酸（MEP）途径中阻止来自丙酮酸盐和甘油醛3-磷酸的所有长链类异戊二烯的构造。在IPP异构化成二甲基烯丙基二磷酸酯（DMAPP）之后，使三个另外的IPP分子结合以获得C₂₀分子，香叶基香叶基焦磷酸酯（GGPP）。这些1'-4缩合反应是由异戊烯基转移酶-型酶GGPP合酶催化的。有证据表明在植物中，同样的酶，GGPP合酶，进行从DMAPP到GGPP的所有反应。

类胡萝卜素的聚烯链可以从3延伸至15个共轭双键，其是引起类胡萝卜素特征吸收光谱的原因并且赋予特定光化学性质。由于这些性质，类胡萝卜素在所有光合生物中是必要组分，其中它们实现光合作用中不可缺少的功能。类胡萝卜素在植物繁殖中也发挥作用，通过向花和果实提供特定的着色，以吸引动物并增强授粉和种子的散播。在这些器官中发现的许多橙色、黄色或红色是通过高浓度的类胡萝卜素在色质体（色素体，chromoplasts）中积累产生的。此外，类胡萝卜素的降解产物包括芳香和风味化合物，并且它们在果实中的存在吸引动物。

在过去的十年中，已经在分子水平上描述了植物中类胡萝卜素的生物合成（例如，在Lu,S.和Li,L.2008.J.Integr.Plant Biol.50:778-785中综述）。类胡萝卜素途径中的第一个关键步骤是两个GGDP分子的头对头缩合以产生八氢番茄红素，第一种C40类胡萝卜素，其是由酶八氢番茄红素合酶（PSY）催化的。

向八氢番茄红素的C40链中插入共轭双键（胡萝卜素脱饱和）导致形成可见的聚烯生色团（发色团）。植物胡萝卜素脱饱和是膜结合的复杂反应次序。通过两种酶，即八氢番茄红素脱饱和酶（PDS）和ζ-胡萝卜素脱饱和酶（ZDS）向八氢番茄红素中引入四个双键，各自分别催化两个对称的脱饱和步骤以获得ζ-胡萝卜素和番茄红素（图1）。最近建立了在途径的该部分中的所有中间体都是顺式构型的，并且特定的异构酶，即CRTISO，与ZDS联合作用以产生全反式番茄红素（Isaacson,T.et al.2002.Plant Cell 14:333-342;Isaacson,T.et al.2004.Plant Physiol.136:4246-4255;Park,H.et al.2002.Plant Cell 14:321-332）。此外，已预期了其他酶和辅因子对该过程是必要的，包括指定的Z-ISO因子，其参与15-顺-ζ-胡萝卜素的异构化（Li F.et al.2007.Plant Physiol.144:1181-1189）。胡萝卜素脱饱和是氧化还原反应，与延长的氧化还原链有关，采用醌类作为中间体以及氧作为最终电子受体。通过质体“末端”（“交替”）氧化酶来还原分子氧。由于这种复杂性和涉及的酶的膜结合的拓扑结构，PDS-ZDS脱饱和系统从未用纯化的蛋白质在体外重建。在本发明的优先权之后公开的Chen Y等人的论文描述了Z-ISO基因的分离和特征，并且提出编码的蛋白质在PDS产物中存在的15-顺式键的异构化中发挥作用，9,15,9'-三-顺-ζ-胡萝卜素以形成ZDS底物9,9'-二-顺-ζ-胡萝卜素。

通过番茄红素β-环化酶（Lcy-b）或番茄红素ε-环化酶（Lcy-e）使番茄红素环化，分别产生了β-胡萝卜素和α-胡萝卜素。环状胡萝卜素的氧化产生叶黄素。在细菌中，单独的八氢番茄红素脱饱和酶，CrtI，进行八氢番茄红素向反式番茄红素的转化。出乎意料地，转基因的CrtI脱饱和酶在植物中是活性的。

在植物中，类胡萝卜素也是生长调节子和发育信号的前体。激素脱落酸（ABA）是由叶黄素紫黄质和新黄质产生的。最近已发现，β-胡萝卜素的裂解衍生物，可能为13-阿朴-β-胡萝卜素酮，充当拟南芥中侧芽分枝的嫁接转移抑制剂。

全世界正日益关注农作物中维生素和其他功能性养分的含量的增加（DellaPenna,D.1999.Science 285:375-379;Lindsay,D.G.2000.Trends inFood Sci.Technol.11:145-151）。类胡萝卜素在确定果实和蔬菜的质量参数中发挥着重要的作用（在van den Berg,H.et al.2000.J.Sci.Food Agric.80:880-912中综述）。含有β-环的所有类胡萝卜素物质可以转化成视黄醇，因而是维生素A的前体（前维生素A）。尽管人类营养中类胡萝卜素至关重要，但是另外的健康益处归因于它们在体内的抗氧化剂活性（Stahl,W.and Sies,H.2003.Mol.Aspects Med.24:345-351）。叶黄素（特别是黄体素）的消耗与预防年龄相关的黄斑变性有关。

流行病学研究已经将类胡萝卜素与降低人类中癌症和其它疾病的风险相关联（Cooper，D.A.2004.J Nutr.134:221S-224S）。特定的健康益处已经归因于类胡萝卜素八氢番茄红素和六氢番茄红素（Shaish,A.et al.2008.Plant Foods Hum.Nutr.63:83-86）。已报道了在人类中从基于番茄的产物中对八氢番茄红素和六氢番茄红素的重要吸收（Aust,O.et al.2005），并且发现了正常的和前列腺肿瘤细胞容易吸收它们（Campbell,J.K.et al.2007.Nutr.Res.27:794-801）。在动物模型中证实了八氢番茄红素作为有效的防晒霜（Mathews-Roth,M.M.and Pathak,M.A.1975.Photochem.Photobiol.21:261-263）。

八氢番茄红素和六氢番茄红素吸收紫外线波长范围内的光。八氢番茄红素的吸收光谱是276-297nm（主峰为285-287nm），并且六氢番茄红素的是331-367（主峰为348nm）。ζ-胡萝卜素的吸收光谱是374-425nm（主峰为395-400nm）。因此，这些类胡萝卜素可以用作防晒霜以保护皮肤防止紫处线（UV）光线造成的损伤。实际上，在食用基于番茄的食物或提取物的人类中证实了保护皮肤免于UV光线（Stahl,W.et al.2001.J.Nutr.131:1449-1451），并且这种效果归因于八氢番茄红素和六氢番茄红素（Aust,O.et al.2005.Int.J.Vitam.Nutr.Res.75:54-60）。基于这些研究，已经提示了饮食的类胡萝卜素可以有助于终身防止有害的UV辐射（Stahl,W.et al.2006.Photochem.Photobiol.Sci.5:238-242）。之前的研究支持了使用八氢番茄红素和六氢番茄红素作为防晒霜的潜力，这些研究显示除了口服补充之外结合用类胡萝卜素局部治疗的益处（Palombo,P.et al.2007.SkinPharmacol.Physiol.20:199-210）。已经报道了在向杜氏藻的生长培养基中加入达草灭（4-氯-5(甲氨基)-2-(3-(三氟甲基)苯基)-3(2H)-哒嗪酮）之后，八氢番茄红素和在一定程度上六氢番茄红素的积累（Ben Amotz,A.et al.1987 J.Phycol.,23:176-181）。然而，使用这种化学品仅在培养生长的生物体中是可能的。

作为类胡萝卜素途径中的第一种成分的八氢番茄红素和六氢番茄红素的量在包含类胡萝卜素的生物体中是相对较低的。考虑到对于八氢番茄红素和六氢番茄红素报道的有益效果，具有高的量的八氢番茄红素和六氢番茄红素的产生类胡萝卜素的生物体是公认需要的并且将是高度有利的。

发明内容

本发明涉及用于改变类胡萝卜素生物合成途径中组分的表达的生物技术手段（途径，方式，means）和方法，从而朝向八氢番茄红素、六氢番茄红素、ζ-胡萝卜素或其组合中的至少一种的积累而减少类胡萝卜素的产生。本发明进一步涉及具有提高的含量的这些类胡萝卜素的基因改变的生物体以及生产其的方法。

本发明部分地基于以下预料不到的发现，即与相应的野生型番茄相比，包含ζ-突变体的番茄植物（番茄植株）产生具有提高量的类胡萝卜素八氢番茄红素、六氢番茄红素和ζ-胡萝卜素的果实。在ζ-番茄植物的花、根和黄叶中也测得了提高含量的这些类胡萝卜素。在本发明中第一次表征了ζ-突变和编码的蛋白质，以及野生型番茄基因和蛋白质的序列。

不希望受到任何特定理论或作用机制的约束，需要蛋白质（指定为Ziso）使ζ-胡萝卜素适当的异构化。如在番茄植物中证明的，在ζ-突变体中，特别是在包含色质体的细胞中其活性的缺少或缺乏，在产生ζ-胡萝卜素产生之后阻断了类胡萝卜素的生物合成途径，导致前述组分的积累，主要是八氢番茄红素和六氢番茄红素。

因而本发明提供了用于抑制Ziso蛋白表达和/或功能的手段（方式，途径）和方法。结果，阻止或削弱了在ζ-胡萝卜素异构化远侧的类胡萝卜素生物合成途径，从而导致八氢番茄红素和六氢番茄红素的积累。在一些实施方式中，至今积累的八氢番茄红素和六氢番茄红素没有离开总类胡萝卜素含量的至少15%的六氢番茄红素和25%的八氢番茄红素的量。本发明进一步提供了基因改变的生物体，特别是高等植物，与未改变的生物体相比，具有降低的Ziso表达或活性以及提高含量的八氢番茄红素、六氢番茄红素以及可选地另外的ζ-胡萝卜素中的至少一种。

根据一个方面，本发明提供了基因改变的产生类胡萝卜素的生物体，相比于相应未改变的生物体，其包含具有降低的Ziso表达或活性的至少一种细胞，其中，与相应未改变的生物体相比，该基因改变的生物体具有提高含量的至少一种类胡萝卜素，其选自由八氢番茄红素、六氢番茄红素、ζ-胡萝卜素和它们的组合组成的组。

根据某些实施方式，与相应未改变的生物体相比，基因改变的生物体含有提高含量的八氢番茄红素。根据另外的实施方式，与相应未改变的生物体相比，基因改变的生物含有提高含量的六氢番茄红素。根据又一实施方式，与相应未改变的生物体相比，基因改变的生物含有提高含量的八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合。

根据某些实施方式，具有降低的Ziso表达或活性的细胞是包含色质体的细胞。根据其他实施方式，具有降低的Ziso表达或活性的细胞是非光合的组织。每一种可能性代表本发明的单独实施方式。

根据某些实施方式，产生类胡萝卜素的生物体选自由植物、藻类和藻青菌组成的组。根据某些典型的实施方式，产生类胡萝卜素的生物体是植物。根据其他典型的实施方式，植物是番茄植物。当生物体是植物时，提高含量的八氢番茄红素、六氢番茄红素、ζ-胡萝卜素或其组合存在于植物的至少一种器官中。根据典型的实施方式，器官选自由果实和根组成的组。根据另外典型的实施方式，提高含量的八氢番茄红素、六氢番茄红素和ζ-胡萝卜素中的至少一种存在于肉质果实组织中。每一种可能性代表本发明的单独实施方式。

抑制Ziso蛋白的表达或活性可以通过各种手段实现，所有这些手段明确地包含在本发明的范围内。根据某些实施方式，使用各种干扰Ziso基因转录和/或翻译的分子（例如反义、siRNA、核酶、或DNA酶），可以在基因和/或转录水平上影响抑制Ziso的表达。也可以使用向Ziso基因中插入突变，包括缺失、插入、部位特异性突变、由锌指核酸酶介导的突变等，只要突变导致基因表达的下调或非功能性蛋白质。可替换地，可以在蛋白质水平上抑制表达，例如使用裂解多肽的拮抗物、酶，等等。

根据某些实施方式，生物体的野生型未改变的Ziso蛋白包含以下氨基酸序列，其至少55%，典型地至少60%、70%、75%，更典型地至少80%、85%、95%以上同源于在SEQ ID NO:3中给出的氨基酸序列。根据典型的实施方式，未改变的Ziso蛋白包含在SEQ ID NO:3中给出的氨基酸序列。每一种可能性代表本发明的单独实施方式。

根据另外的实施方式，野生型未改变的Ziso基因包含以下核酸序列，其至少55%，典型地至少60%、70%、75%，更典型地至少80%、85%、95%以上同源于在SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中的任一个中给出的核酸序列。根据典型的实施方式，未改变的Ziso基因包含在SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中的任一个中给出的核酸序列。每一种可能性代表本发明的单独实施方式。

根据某些实施方式，基因改变的生物体含有突变的Ziso基因。通过如本领域已知的任何方法，包括应用诱变性化学品或辐射，可以将突变施加在多种生物体中。然后对多种生物体筛选出类胡萝卜素生物合成阻断在ζ-胡萝卜素，特别是积累9,15,9'-三-顺-ζ-胡萝卜素的阶段的特定表型。也可以通过分子tilling（定向诱导基因组局部突变）的方法对多种生物体筛选出Ziso基因中的特定突变体（McCallum,C.M.et al.2000.Nat Biotechnol.18:455-457）。任何对具有期望表型的生物体进一步筛选出相比于未改变的生物体具有提高含量的八氢番茄红素和/或六氢番茄红素。根据一些实施方式，突变基因编码非功能性Ziso蛋白。根据某些典型的实施方式，突变基因包含在SEQ ID NO:4（指定的ZETA⁰⁰⁸⁹）中给出的核酸序列，其编码具有SEQ ID NO:5的非功能性Ziso蛋白。根据另外典型的实施方式，突变基因包含在SEQ ID NO:6（指定的ZETA²⁸⁰³）中给出的核酸序列，其编码具有SEQ ID NO:7的非功能性Ziso蛋白。

根据另外的实施方式，基因改变的生物体是转基因的生物体，其包含至少一个含有Ziso沉默分子的细胞，该Ziso沉默分子选自由RNA干扰分子、反义分子和编码核酶的分子组成的组。

如本领域技术人员已知的，可以设计Ziso沉默分子。根据某些实施方式，沉默分子包含具有基本上与表达的Ziso基因的区域互补的核酸序列的多核苷酸。根据某些实施方式，Ziso基因包含以下核酸序列，其至少55%，典型地至少60%、70%、75%，更典型地至少80%、85%、95%以上同源于在SEQ ID NO:2中给出的核酸序列。根据其他实施方式，Ziso基因包含在SEQ ID NO:2中给出的核酸序列。每一种可能性代表本发明的单独实施方式。

根据某些实施方式，互补区域的长度为20-500个核苷酸。根据一些实施方式，互补区域的长度为20-50个核苷酸，典型地20-30个核苷酸。根据其他实施方式，互补区域的长度为100-400个核苷酸，典型地200-300个核苷酸。

根据某些实施方式，沉默分子是反义RNA。根据其他实施方式，沉默分子是RNA干扰（RNAi）分子。根据另外的实施方式，RNAi分子被设计成产生靶向Ziso基因的dsRNA，该Ziso基因具有以下核酸序列，其至少55%，典型地至少60%、70%、75%，更典型地至少80%、85%、95%以上同源于在SEQ ID NO:2中给出的核酸序列。根据其他实施方式，Ziso基因具有在SEQ ID NO:2中给出的核酸序列。每一种可能性代表本发明的单独实施方式。

根据一些实施方式，本发明的沉默分子被合并到DNA构建体中，使得它们在生物体的细胞中表达。根据某些实施方式，细胞是包含色质体的细胞。根据其他实施方式，细胞在非光合的组织内。本领域的技术人员已知DNA构建体适于特定生物体，包括植物、藻类和蓝细菌。根据一个实施方式，DNA构建体包含至少一个表达调节元件，该表达调节元件选自由启动子、增强子、复制起始子、转录终止序列、多聚腺苷酸化信号等组成的组。典型地，启动子是组织特异性启动子。根据某些实施方式，组织是包含色质体的组织。根据其他实施方式，组织是非光合的组织。当生物体是植物时，启动子典型地特异于选自由根、块茎、果实、花和种子组成的组中的组织。每一种可能性代表本发明的单独实施方式。

根据某些实施方式，本发明的基因改变的生物体具有基因改变的细胞的总类胡萝卜素含量的至少25%（w／w）的八氢番茄红素含量。根据某些典型的实施方式，八氢番茄红素含量为基因改变的细胞的类胡萝卜素（w／w）总量的至少30%，更典型地至少35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%。每一种可能性代表本发明的单独实施方式。

根据其他实施方式，本发明的基因改变的生物体具有基因改变的细胞的总类胡萝卜素含量的至少15%（w／w）的六氢番茄红素含量。根据某些典型的实施方式，六氢番茄红素的含量为基因改变的细胞的类胡萝卜素（w／w）总量的至少20%，更典型地至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%。每一种可能性代表本发明的单独实施方式。

根据还另外的实施方式，本发明的基因改变的生物具有总的类胡萝卜素含量的至少30%（w／w）的结合水平（组合水平，合并水平）的八氢番茄红素和六氢番茄红素。根据某些典型的实施方式，组合水平的八氢番茄红素和六氢番茄红素是基因改变的细胞的类胡萝卜素（w／w）总量的至少35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%。每一种可能性代表本发明的单独实施方式。

明显地应理解，当生物体是植物时，八氢番茄红素、六氢番茄红素或它们的组合的百分比是指它们在至少一个植物器官中的百分比。根据典型的实施方式，植物器官选自根、块茎、果实、花和种子。

源于基因改变的细胞或生物体的基因改变的细胞和组织培养物的悬浮液也包含在本发明的范围内。细胞悬浮液和组织培养物可以用于产生八氢番茄红素、六氢番茄红素、ζ-胡萝卜素或它们的组合中的至少一种，然后其从细胞或生长培养基中提取。可替换地，基因改变的细胞和/或组织培养物用于重新生成生物体，该生物体具有降低的Ziso蛋白表达，从而具有如在本文中披露的提高含量的八氢番茄红素、六氢番茄红素、ζ-胡萝卜素或它们的组合中的至少一种。

在其中生物是植物的实施方式中，本发明也包括基因改变的植物的种子，其中由所述种子生长的植物相比于由相应未改变的种子生长的植物具有降低的Ziso表达，从而具有如在本文中披露的提高含量的八氢番茄红素、六氢番茄红素、ζ-胡萝卜素或它们的组合中的至少一种。由本发明的基因改变的植物产生的包括果实和块茎（分别具有总类胡萝卜素含量的至少25%和15%的八氢番茄红素和六氢番茄红素含量）的可食用部分也明确地包括在本发明的范围内。

根据另外的方面，本发明提供了在生物体的至少一个细胞中提高八氢番茄红素、六氢番茄红素、ζ-胡萝卜素或其组合中的至少一种的含量的方法，包括在至少一个细胞中抑制Ziso蛋白的表达，从而产生具有提高量的八氢番茄红素、六氢番茄红素、ζ-胡萝卜素或其组合的生物体。

根据某些实施方式，抑制Ziso表达包括在Ziso编码基因中引入突变，其中突变导致Ziso基因降低的表达或非功能性Ziso蛋白的产生。根据本发明的教导，可以使用如在本文中披露的以及如本领域已知的任何用于在Ziso基因中引入突变的方法。

根据一些实施方式，抑制Ziso表达包括用设计成沉默Ziso基因的表达的分子转化生物体的至少一个细胞。根据某些实施方式，Ziso基因包含以下核酸序列，其至少55%，典型地至少60%、70%、75%，更典型地至少80%、85%、95%以上同源于在SEQ ID NO:2中给出的核酸序列。根据其他实施方式，Ziso基因包含SEQ ID NO:2中给出的核酸序列。每一种可能性代表本发明的单独实施方式。根据某些实施方式，沉默分子选自由反义分子、RNAi分子、编码核酶的多核苷酸等组成的组。

根据某些实施方式，由本发明的方法产生的生物体具有总类胡萝卜素的至少25%（w／w）的八氢番茄红素含量，或总类胡萝卜素含量的至少15%（w／w）的六氢番茄红素含量，或总类胡萝卜素含量的至少30%（w／w）的结合水平的八氢番茄红素和六氢番茄红素。

根据其他实施方式，生物体是植物，在其至少一个器官中具有提高的类胡萝卜素含量。

根据另外的方面，本发明提供了编码非功能性Ziso蛋白的分离的多核苷酸，该非功能性Ziso蛋白具有选自由SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7组成的组中的氨基酸序列。根据一些实施方式，分离的多核苷酸包括分别在SEQ ID NO:4和6中给出的核酸序列。

从以下描述和附图，本发明的其他目的、特点和优势将变得清楚。

附图说明

图1示出了在植物中从香叶基香叶基二磷酸酯到β-胡萝卜素的类胡萝卜素生物合成途径的示意图。CRTISO，胡萝卜素异构酶；CYC-B，色质体特异性番茄红素β-环化酶；GGPP，香叶基香叶基二磷酸酯；LCY-B，番茄红素β-环化酶；LCY-E，番茄红素ε-环化酶；PDS，八氢番茄红素脱饱和酶；PSY，八氢番茄红素合酶；ZDS，ζ-胡萝卜素脱饱和酶；ZISO，ζ-胡萝卜素异构酶。

图2是番茄在基因座ζ（ZETA）附近的区域中的染色体#12上的基因图的示意图。Z（ZETA）位于标记CT80B和At1g48300之间。表明了含有覆盖这些标记的番茄基因组序列的BAC克隆。

图3示出了来自番茄的基因Ziso的基因组序列（用粗字体表示预期的外显子序列）。

图4示出了来自番茄（cv M82）的基因Ziso的cDNA序列。标记了起始密码子（ATG）和终止密码子。

图5示出了来自番茄ζ-突变体等位基因z⁰⁰⁸⁹的基因Ziso的cDNA序列，表明了突变产生新终止密码子（图5A）；来自番茄ζ突变体等位基因z²⁰⁸³的基因Ziso的cDNA序列，表明了突变产生新终止密码子（图5B）；以及来自野生型番茄（CV M82）和ζ突变体（等位基因z²⁰⁸³和z⁰⁰⁸⁹）的多肽ZISO的氨基酸序列的排列，如由cDNA序列推断的（图5C）。

图6示出了携带突变ζ的六个F2繁殖系的果实中类胡萝卜素的组成[μg/g FW]。

图7给出了来自野生型番茄（CV M82）的多肽ZISO以及来自细长聚球藻PCC7942的Synpcc7942_1979（ZISO 7942）的ζ样基因产物的氨基酸序列的排列。用黑色背景上的白色字体标记同一性；用灰色背景上的黑色字体标记相似性。

具体实施方式

本发明涉及在类胡萝卜素合成生物体中，用于产生八氢番茄红素、六氢番茄红素、ζ-胡萝卜素或其组合中的至少一种的手段和方法。特别地，本发明涉及通过生物技术手段（方法，途径）而基因改变的生物体，其中抑制了Ziso蛋白的表达或活性，使得在产生9,15,9'-三-顺-ζ-胡萝卜素之后阻断类胡萝卜素生物合成途径，并且在基因改变的细胞中八氢番茄红素和/或六氢番茄红素分别积累至总类胡萝卜素水平的至少25%和15%（w／w）的水平。根据某些典型的实施方式，生物体是植物，典型地是番茄植物。

定义

术语“产生类胡萝卜素的生物体”指的是能够天然产生类胡萝卜素的生物体，其中类胡萝卜素生物合成途径包括ζ-胡萝卜素异构化的步骤。根据本发明的某些实施方式，生物体选自由植物、藻类和蓝细菌组成的组。

术语“基因改变的生物体”指的是包含至少一种人为基因改变的细胞的生物体。基因改变包括一个或多个内源基因的改变，例如通过向感兴趣的内源性多核苷酸或基因中引入一个或多个突变、缺失、插入、一个或多个转座因子（转座元件）等。另外或可替换地，基因改变包括用异源多核苷酸转化生物体的细胞以产生转基因生物体。

术语“八氢番茄红素”指的是15Z-7,8,11,12,7',8',11',12'-八氢-ψ,ψ-胡萝卜素。

术语“六氢番茄红素”指的是15Z-7,8,11,12,7',8'-六氢-ψ,ψ-胡萝卜素。

术语“ζ-胡萝卜素”指的是7,8,7',8'-四氢-ψ,ψ-胡萝卜素。

术语“三-顺-ζ-胡萝卜素”指的是9Z,15Z,9'Z-7,8,7',8'-四氢-ψ,ψ-胡萝卜素。

术语“Ziso”和“Ziso蛋白”在本文中交替使用，并且指的是ζ-胡萝卜素的异构化所必需存在的或活性的蛋白质。根据某些实施方式，天然的未改变的Ziso蛋白包括在SEQ ID NO:3中给出的氨基酸序列或同源于其的序列。应明确地理解，具有相同功能的番茄Ziso的同源体，即使与番茄蛋白质共享低的序列同一性，也包含在本发明的教导内。

如在本文中使用的，术语，“顺式类胡萝卜素”指的是具有以顺式方向连接两个碳的至少一个双键的类胡萝卜素。

如在本文中使用的，术语“ζ胡萝卜素异构化”指的是将9,9'-15-顺-ζ-胡萝卜素转变为9,9'-顺-ζ-胡萝卜素。

术语“基因”指的是包含产生RNA或多肽所必需的编码序列的核酸（例如DNA或RNA）序列。多肽可以由全长编码序列或其任何部分编码。当引用基因时使用的术语“其部分”指的是该基因的片段。片段的尺寸可以在几个氨基酸至整个基因序列减去一个核苷酸的范围内。因此，“包含基因的至少一部分的核酸序列”可以包含基因片段或整个基因。

术语“基因”也包含结构基因的编码区域，并且包含位于5'和3'端的编码区域附近的序列，在任意端的长度为约1kb，使得该基因相当于全长mRNA的长度。位于编码区域的5'并存在于mRNA上的序列被称作5'非翻译序列。位于编码区域的3'或下游并存在于mRNA上的序列被称作3'非翻译序列。

术语“Ziso”和“Ziso基因”在本文中可互换使用，并且指的是编码Ziso蛋白的多核苷酸。根据本发明的某些典型的实施方式，Ziso基因包括在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或同源于其的序列中给出的核酸序列。

如涉及多肽或蛋白质的术语“同一”或“同源”在本文中用来指具有任何插入、缺失和取代的多肽，其不影响如在本文中描述的多肽的生物活性。使用National Center of Biotechnology Information（NCBI）的BlastP或TBlastN软件，并使用默认参数可以测定多肽与Ziso蛋白的同一性，可选地和优选包括以下：过滤“打开”（该选项使用Seg（蛋白质）程序从质疑物（query）中过滤重复的或低复杂性的序列），蛋白质的记分矩阵是BLOSUM62，字号是3，E值是10，并且缺失代价（间隙成本，gap costs）是11，1（初始化和扩展）。

当涉及多核苷酸时，术语“同一”或“同源”意指编码具有如在本文中描述的Ziso生物活性的多肽或蛋白质的多核苷酸。根据某些实施方式，使用National Center of Biotechnology Information（NCBI）的BlastN软件，使用默认参数，其优选包括使用DUST过滤程序，并且还优选包括E值为10、过滤低复杂性序列以及字号为11，来测定核酸序列的同源性/同一性。

术语“多核苷酸”、“多核苷酸序列”、“核酸序列”和“分离的多核苷酸”在本文中可互换使用。这些术语包含核苷酸序列等。多核苷酸可以是RNA或DNA或其杂交体的聚合物，其为单链的或双链的、直链的或支链的，并且可选地包括合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。术语也包含RNA／DNA杂交体。

术语“互补的”或“其补体”在本文中是指多核苷酸的序列，其能够与遍及整个互补区域的另一特定多核苷酸形成Waston&Crick碱基对。该术语仅基于它们的序列应用至多核苷酸对，而不是任何特定的条件集合，在所述条件下两种多核苷酸将实际结合。

如在本文中使用的术语“构建体”指的是人为组装的或分离的核酸分子，其包括感兴趣的多核苷酸。通常，构建体可以包括感兴趣的一个多核苷酸或多个多核苷酸、标记基因，在某些情况下其也可以是感兴趣的基因和适当的调控基因。应当理解在构建体中含入调节序列是可选的，例如，在要使用宿主细胞的调节序列的情况下可以不需要这样的序列。术语构建体包括载体，但是不应当视为限制于此。

如在本文中使用的，术语“表达”指的是功能性终产物，例如mRNA或蛋白质的产生。

根据本发明的教导，当引用生物体（例如“转基因生物体”）使用时，术语“转基因”指的是在一种或多种其细胞中包含至少一种异源的可转录的多核苷酸的生物体。术语“转基因材料”宽泛地指的是植物、藻类、藻青菌或其一部分，包括在至少一个细胞中包含至少一种异源性多核苷酸的细胞或组织。

术语“转化体”或“转化的细胞”包括源于所述细胞的一次转化的细胞和培养物，不考虑转化的数量。所有后代的DNA含量可以不精确地相同；然而，与原始转化的细胞具有相同功能性的所有后代包括在转化体的定义中。

细胞的转化可以是稳定的或瞬时的。术语“瞬时转化”或“瞬时转化的”指的是在不存在外源多核苷酸整合到宿主细胞的基因组中的情况下，向细胞中引入一种或多种外源多核苷酸。相反，术语“稳定的转化”或“稳定转化的”指的是向细胞的基因组中引入和整合一种或多种外源多核苷酸。术语“稳定的转化体”指的是向基因组DNA或器官DNA中稳定地整合一种或多种外源多核苷酸的细胞。应理解，用本发明的核酸、构建体和/或载体转化的生物体或其细胞可以是瞬时以及稳定转化的。

用于进行本发明的优选模式

在研究类胡萝卜素生物合成途径的过程中，特别是将八氢番茄红素转化成反式番茄红素的脱饱和及异构化步骤中，本发明的发明人已经使用了同基因番茄“变异库”，该变异库是在由本发明的发明人之一和合作者处理番茄的先天变异体M82的基因背景下产生的（Menda,N.et al.2004.Plant J.38:861-872）。为了产生库，在场条件下使源于甲基磺酸乙酯（EMS）化学处理和快中子诱变的种子的总共13,000个M2家族显型。基于表型，将家族分成包括15个主类和48个子类的形态种类。已鉴别了多于3000种突变，其中一些表示之前描述的来自The Tomato Genetics Resource Center（TGRC：http://tgrc.ucdavis.edu）的单基因突变体集合的表型的新等位基因。许多突变落入多个单独的种类，因此对植物生长具有多效性的效果。在Solanaceae Genome Network（SGN）中和在名为“The Genes That MakeTomatoes”（http://zamir.sgn.cornell.edu/mutants/）的地址上可搜索和访问突变体。已鉴别了具有改变颜色的果实或花的许多突变体（参见，例如，Galpaz,N.et al.2008.Plant J.53:717-730）。

番茄突变体ζ

筛选上述库的甲基磺酸乙酯（EMS）诱变的植物，该植物具有改变颜色的果实或花，揭示了至今番茄中还没有表征的隐性突变（番茄cvM82），命名为ζ。携带ζ的植物的果实是橙黄色的，而不是典型的红色。本发明现在披露了，代替红色的色素番茄红素，ζ（ZETA）的果实积累八氢番茄红素、六氢番茄红素和9,15,9'-三-顺-ζ-胡萝卜素。在携带ζ突变的植物的黄化的子叶和花中，也积累八氢番茄红素、六氢番茄红素和9,15,9'-三-顺-ζ-胡萝卜素。子叶和其他生长中的叶片暴露于光使表型转变为正常。ζ（ZETA）的新叶是淡绿的，而随着它们的生长变成绿色。不希望受到任何特定的理论或作用机制的约束，在修复叶绿体中的损伤时可以涉及光合活性。

八氢番茄红素、六氢番茄红素和9,15,9'-三-顺-ζ-胡萝卜素的积累，表明在携带ZETA的生物体中，在类胡萝卜素生物合成途径中，ζ-胡萝卜素向下游类胡萝卜素的代谢损害了类胡萝卜素的生物合成。本发明现在表明ZETA与ZDS或CRTISO不是等位的。因此，该突变显示了新的功能（酶），该功能对植物和其他产生类胡萝卜素的生物体中ζ-胡萝卜素的代谢是必要的。因为发现该突变涉及ζ胡萝卜素的异构化，所以该基因指定为Ziso。

将番茄栽培品种M82的突变ζ遗传绘制至与基因渗入株IL12-4中的潘那利番茄染色体区段重叠的染色体12。通过筛选约3000株ZETA和IL12-4之间的杂交F2植株进行良好的基因绘图。结果表明基因座ZETA的绘图非常接近（<0.8cm）遗传标记At1g48300（图2）。

因此，根据一个方面，本发明提供了基因改变的产生类胡萝卜素的生物体，该生物体与相应未改变的生物体相比包括至少一个具有降低的Ziso表达或活性的细胞，其中与相应未改变的生物体相比，该基因改变的生物体具有提高含量的至少一种类胡萝卜素，所述类胡萝卜素选自由八氢番茄红素、六氢番茄红素、ζ-胡萝卜素和其组合组成的组。

根据某些实施方式，与相应未改变的生物体相比，基因改变的生物体包含提高含量的八氢番茄红素。根据另外的实施方式，与相应未改变的生物体相比，基因改变的生物体包含提高含量的六氢番茄红素。根据还进一步的实施方式，与相应未改变的生物体相比，基因改变的生物体包含提高含量的八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合。

根据某些实施方式，具有降低的Ziso表达或活性的细胞是包含色质体的细胞。根据某些实施方式，在基因改变的生物体中，提高含量的八氢番茄红素、六氢番茄红素和ζ-胡萝卜素中的至少一种类胡萝卜素存在于肉质果实组织中。

根据某些实施方式，产生类胡萝卜素的生物体选自由植物、藻类和藻青菌组成的组。根据典型的实施方式，生物体是植物。

根据某些实施方式，如在下文中例证的，天然未改变的Ziso基因包含至少55%，典型地至少60%、70%、75%，更典型地至少80%、85%、95%以上同源于在SEQ ID NO:2中给出的核酸序列的核酸序列。根据其他实施方式，Ziso基因包含在SEQ ID NO:2中给出的核酸序列。每一种可能性都表示本发明的单独实施方式。

根据某些实施方式，如在下文中例证的，生物体的天然未改变的Ziso蛋白包含至少55%，典型地至少60%、70%、75%，更典型地至少80%、85%、95%以上同源于在SEQ ID NO:3中给出氨基酸序列的氨基酸序列。根据典型的实施方式，未改变的Ziso蛋白包含在SEQ ID NO:3中给出的氨基酸序列。每一种可能性都表示本发明的单独实施方式。

如技术人员已知的用于下调Ziso表达和/或活性的任何方法可以用于产生本发明的基因改变的生物体。根据某些实施方式，可以在基因和/或转录水平上影响Ziso表达的抑制。根据其他实施方式，使用例如，拮抗物、裂解多肽的酶等可以在蛋白质水平上抑制表达。

根据某些实施方式，基因改变的生物体包含突变的Ziso基因。

诱变

使用例如，定点突变，可以向Ziso基因中引入突变体（参见，例如Zhengm L.et al.2004 Nucleic Acid Res.10:32(14):e115）。这种诱变可以用于引入特定的、期望的氨基酸插入、缺失或取代。可以采用使用诸如甲基磺酸乙酯（EMS）的试剂的化学诱变，以获得大量点突变，并筛选Ziso基因可以变得沉默或下调的突变体。在植物中，可以使用从天然或突变群体传递基因的基因渗入的方法。重复杂交培养的和野生物种，使得分离包含野生的给定区段或突变染色体的植物。特定的植物种，例如玉蜀黍（玉米）或金鱼草具有天然的转座子（转位子）。这些转座子是自主性的（即转座酶（易位酶，transposas）位于转座子序列内）或非自主性的，没有转座酶（transposas）。技术人员可以引起转座子“跳跃”并且产生突变。可替换地，可以合成在一个或多个预定的位置具有随机核苷酸的核酸序列，以产生随机的氨基酸替换。

根据一些实施方式，突变基因编码非功能性Ziso蛋白。根据特定典型的实施方式，突变基因包含在SEQ ID NO:4中给出的核酸序列（指定为ζ⁰⁰⁸⁹（ZETA⁰⁰⁸⁹）），该核酸序列编码具有SEQ ID NO:5的非功能性Ziso蛋白。根据另外典型的实施方式，突变基因包含在SEQ ID NO:6中给出的核酸序列（指定为ζ²⁸⁰³（ZETA²⁸⁰³）），该核酸序列编码具有SEQ ID NO:7的非功能性Ziso蛋白。

根据另外的实施方式，基因改变的生物体是转基因生物体，该转基因生物体包括至少一个含有Ziso沉默分子的细胞，该沉默分子选自由RNA干扰分子、反义分子和编码核酶的分子组成的组。

RNA干扰（RNAi）分子

RNAi指的是引入同源的双链RNA（dsRNA），以靶向特定的基因产物，导致所述基因的转录后沉默。首先由Guo和Kemphues（1995.Cell,81(4):611-620）报道了在秀丽隐杆线虫中的该现象，随后Fire等人（1998.Nature 391:806-811）发现了dsRNA的存在致使产生了干扰活性，这些dsRNA是由存在于体外RNA制剂中的正义和反义链的退火形成的。

本发明预期了RNA干扰（RNAi）下调Ziso的表达以提高产生类胡萝卜素的生物体中八氢番茄红素、六氢番茄红素和ζ-胡萝卜素的水平的应用。在植物和动物中，RNAi是由RNA诱导的沉默复合体（RISC）、破坏同源于沉默触发物（trigger）的信使RNA的序列特异性多组分核酸酶介导的。已知RISC包括源于双链RNA触发物的短RNA（约22个核苷酸）。短的核苷酸RNA序列同源于被抑制的靶基因。因此，短的核苷酸序列似乎充当指导序列以指示多组分的核酸酶RISC破坏特异性mRNA。

用于引发RNAi的dsRNA可以从天然来源分离或通过已知的手段产生，例如从DNA转录。现在用于产生针对靶序列的RNAi分子的质粒和载体是容易获得的。

可以从载体以两条独立的链来转录dsRNA。在其他实施方式中，用于形成dsRNA的DNA的两条链可以属于相同的或两个不同的二倍体，其中，它们各自由至少部分互补序列的DNA链形成。当因而产生dsRNA时，用两个启动子与要转录的DNA序列侧连，一个控制一条链的转录，而另一个控制互补链的转录。这两个启动子可以是相同的或不同的。可替换地，单个启动子可以得到单链发夹多核苷酸的转录物，其具有自我互补的正义和反义区（其退火以产生dsRNA）。

抑制是序列特异性的，因为对应于RNA的二倍体区的核苷酸序列是靶向基因抑制的。优选包含与靶基因的一部分相同的核苷酸序列的RNA分子是用于抑制的。发现了相对于靶序列具有插入、缺失和单点突变的RNA序列对抑制也是有效的。因此，可以通过本领域已知的序列比较和排列算法来优化序列的同一性（参见，例如Gribskov and Devereux,Sequence Analysis Primer,Stockton Press,1991，和其中引用的文献），并通过例如，如在BESTFIT软件程序中使用默认参数进行的Smith-Waterman算法计算核苷酸序列之间的百分差（例如University of Wisconsin GeneticComputing Group）。优选抑制性RNA和靶基因的一部分之间具有大于90%的序列同一性，甚至100%的序列同一性。可替换地，RNA的二倍体区可以从功能上定义为能够与靶基因转录的一部分杂交的核苷酸序列。相同的核苷酸序列的长度可以是至少20、25、50、100、200、300或400个碱基。可以使用的dsRNA的长度没有上限。例如，相对于基因的全长，dsRNA可以在基因的约21个碱基对（bp）以上的范围内。

根据双链RNA分子，包括具有至少90%的序列同一于Ziso基因的一部分的第一多核苷酸，以及具有与第一核酸互补的核酸序列的第二多核苷酸。根据某些实施方式，Ziso基因是包含在SEQ ID NO:2中给出的多核苷酸序列的番茄基因。根据其他实施方式，Ziso基因是番茄基因的同源体。

反义分子

反义技术是一种其中反义RNA或DNA分子与靶正义DNA或RNA链相互作用的过程。正义链是5'至3'mRNA分子或DNA分子。正义的互补链或镜像链称为反义。当反义链与正义mRNA链相互作用时，认为双螺旋是细胞的外源物并且将被降解，导致降低的或没有蛋白质产生。虽然DNA已经是双链分子，但是可以对其应用反义技术，建立三倍体形成。

RNA反义链可以是催化的或者非催化的。也称为核酶的催化反义链在特定的序列处裂解RNA分子。非催化的RNA反义链阻止进一步的RNA处理。

通过用至少一种反义化合物转化生物体的细胞或组织可以影响细胞和组织中Ziso水平的反义调节，所述反义化合物包括反义DNA、反义RNA、核酶、DNA酶、锁核酸（LNA）和适体。在一些实施方式中，分子是化学改变的。在其他实施方式中，反义分子是反义DNA或反义DNA类似物。根据某些实施方式，Ziso基因是包含在SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2中的任一个中给出的多核苷酸序列的番茄基因。根据其他实施方式，Ziso基因是番茄基因的同源体。

DNA酶分子

另一种能够下调Ziso表达的试剂是DNA酶分子，其特别是能够裂解mRNA转录物或Ziso的DNA序列。DNA酶是单链多核苷酸，其能够裂解单链和双链靶序列。已经提出了DNA酶的一般模型（“10-23”模型）。“10-23”DNA酶具有15个脱氧核苷酸的催化域，各自用7至9个脱氧核苷酸的底物识别域与其两侧相连。这种DNA酶可以有效地在嘌呤:嘧啶连接点裂解其底物RNA（对于DNA酶的综述，参见：Khachigian,L.M.2002.Curr Opin Mol Ther 4:119-121）。

在美国专利号6,326,174中披露了构建和扩增识别单链和双链靶裂解部位的合成的、设计的DNA酶的实例。

酶促寡核苷酸（Enzymatic oligonucleotide）

术语“酶促核酸分子”或“酶促寡核苷酸”指的是在底物结合区与特定的基因靶中具有互补性，并且也具有酶活性的核酸分子，特别地，其对裂解靶Ziso RNA是活性的，从而沉默Ziso。互补区使得酶促核酸分子与靶RNA充分杂交，随后裂解。术语酶促核酸与例如以下互换使用：核酶（ribozymes）、催化RNA、酶促RNA、催化DNA、适配酶或结合适体的核酶、催化寡核苷酸、核酶（nucleozyme）、DNA酶和RNA酶。根据本发明的教导，可以使用如在本领域中已知的任何酶促核酸分子，只要其具有特异性的底物结合部位，该部位与一个或多个靶核酸区互补，并且其在该底物结合部位内或在其周围具有核苷酸序列，其对分子施加核酸裂解和/或结合活性。美国专利号4,987,071披露了这种分子的实例。

转基因生物体

通过如本领域的技术人员已知的任何方法可以进行编码Ziso沉默分子的多核苷酸的克隆。各种DNA构建体可以用于在期望的生物体中表达靶向Ziso的沉默分子。

根据某些实施方式，本发明提供了包含所有用于表达沉默分子的必要元件的表达载体。根据某些实施方式，沉默分子的表达是通过构成型启动子控制的。根据目前典型的实施方式，生物体是植物，并且构成型启动子是组织特异性的。根据这些实施方式，特异性启动子选自由根特异性启动子和果实特异性启动子组成的组。描述了根特异性启动子，例如在Martinez,E.et al.2003.Curr.Biol.13:1435-1441中。尤其是在Estornell L.H et al.2009.Plant Biotechnol.J.7:298-309和Fernandez A.I.Et al.2009 Plant Physiol.151:1729-1740中描述了果实特异性启动子。

根据某些实施方式，表达载体进一步在3'非编码序列包含调节元件。如在本文中使用的，“3'非编码序列”指的是位于编码序列下游的DNA序列，并且包含多聚腺苷酸化识别序列和编码能够影响mRNA处理或基因表达的调节信号的其他序列。通常多聚腺苷酸化信号的特征为影响多腺苷酸添加至mRNA前体的3'端。Ingelbrecht I L等人（1989.Plant Cell1:671-680）说明了不同的3'非编码序列的应用。

本领域的技术人员将理解，在本发明中描述的核酸序列和转化载体的各种组分是效力上相关的，从而导致所述核酸或核酸片段的表达。本领域的技术人员已知用于使本发明的构建体和载体的组分有效相关的技术。这种技术包括使用连接子，如合成的连接子，例如，包含一个或多个限制酶部位的连接子。

本领域的技术人员已知用于转化产生类胡萝卜素的生物体的方法，这些生物体选自由植物、藻类和藻青菌组成的组。如在本文中使用的，术语“转化”或“转变”描述了以下过程，通过其包括表达载体的外源DNA，如DNA构建体，进入受体细胞并将受体细胞变为转化的、遗传改变的或转基因的细胞。转化可以是稳定的（其中核酸序列被整合到生物体基因组中，并且这代表稳定的和遗传的特征）或瞬时的（其中通过转化的细胞表达核酸序列，但是不整合到基因组中，并且这代表瞬时特征）。根据优选的实施方式，本发明的核酸序列稳定地转化到生物体细胞中。

根据另外的方面，本发明提供了在生物体的至少一个细胞中提高八氢番茄红素、六氢番茄红素、ζ-胡萝卜素或其组合中的至少一种的含量的方法，包括在至少一个细胞中抑制Ziso表达，从而与具有未抑制的Ziso表达的相应细胞相比，产生在所述至少一个细胞中具有提高量的八氢番茄红素、六氢番茄红素、ζ-胡萝卜素或其组合的生物体。

根据某些实施方式，抑制Ziso表达包括在编码Ziso的基因中引入突变，其中突变导致Ziso基因降低的表达或导致非功能性Ziso蛋白的产生。根据本发明的教导，可以使用如在本文中披露的以及如在本领域已知的用于在Ziso基因中引入突变的任何方法。

根据一些实施方式，抑制Ziso表达包括，用指定为沉默Ziso基因表达的分子转化生物体的至少一个细胞，该基因具有在SEQ ID NO:1、SEQID NO:2或其同源体的任一个中给出的核酸序列。根据某些实施方式，沉默分子选自由反义分子、RNAi分子、编码多核苷酸的核酶等组成的组。

根据本发明的教导，基于Ziso基因或蛋白的表达，典型地首先选择具有提高含量的期望的一种或多种类胡萝卜素的基因改变的生物体。然后分析Ziso表达异常的生物体的八氢番茄红素、六氢番茄红素、ζ-或其组合的含量。

采用本领域的普通技术人员已知的分子遗传的标准方法来进行检测突变的Ziso和/或Ziso沉默分子的存在和/或非功能性Ziso蛋白的存在。

为了测定Ziso基因或沉默分子的表达，应当从表达核酸的器官中获得cDNA或mRNA。在检测步骤之前可以进一步处理样品。例如，细胞或组织样品中的多核苷酸可以与样品的其他组分分离，可以使其扩增等。认为从生物体获得的所有样品，包括经受任何种类的进一步处理的那些，都是从生物体获得的。

典型地，Ziso基因或沉默分子的检测需要扩增取自待改变的生物体的多核苷酸。本领域的技术人员已知用于DNA扩增的方法。最常用的用于DNA扩增的方法是PCR（聚合酶链反应；参见，例如，PCR Basics:frombackground to Bench,Springer Verlag,2000；Eckert et al.,1991.PCRMethods and Applications 1:17）。另外的适宜的扩增方法包括连接酶链反应（LCR）、转录扩增和自持式序列复制以及基于核酸的序列扩增（NASBA）。

根据某些实施方式，包含Ziso沉默分子的核酸序列进一步包含编码选择性标记的核酸序列。根据某些实施方式，选择性标记对抗菌素，或在植物和藻类的情况下，对除草剂赋予耐性；在这些实施方式中，根据转基因生物体对抗菌素或除草剂的耐性来选择它们。

通过本领域已知的标准方法来测定类胡萝卜素以及八氢番茄红素、六氢番茄红素和ζ-胡萝卜素中的每一种的总含量（参见，例如，Schiedt K andLiaaen-Jensen S.1995.Carotenoids:Isolation and analysis.In CarotenoidsVolume 1A:Isolation and Analysis,G.Britton,S.Liaaen-Jensen,and H.Pfander,Eds(Basel:Birkhauser),pp.81-108）。

根据某些实施方式，本发明的基因改变的生物体具有的八氢番茄红素的含量为基因改变的细胞的总类胡萝卜素含量的至少25%（w／w）。根据某些典型的实施方式，八氢番茄红素含量为基因改变的细胞的类胡萝卜素（w／w）的总量的至少30%，更典型地至少35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%。每一种可能性代表本发明的单独实施方式。

根据其他实施方式，本发明的基因改变的生物体具有的六氢番茄红素的含量为总类胡萝卜素含量的至少15%（w／w）。根据某些典型的实施方式，六氢番茄红素的含量为基因改变的细胞的类胡萝卜素（w／w）的总量的至少20%，更典型地至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%。每一种可能性代表本发明的单独实施方式。

根据还另外的实施方式，本发明的基因改变的生物体具有总类胡萝卜素含量的至少30%（w／w）的八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合水平。根据某些典型的实施方式，八氢番茄红素和六氢番茄红素的组合水平为基因改变的细胞的类胡萝卜素（w／w）的总量的至少35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%。每一种可能性代表本发明的单独实施方式。

提供了以下实施例，以便更充分地说明本发明的一些实施方式。然而，决不应当将它们视为限制本发明的广泛范围。在不背离本发明的范围的情况下，本领域的技术人员可以容易地作出本文中披露的原则的许多改变和变型。

实施例

材料和方法

核酸的分离和分析

来自植物的DNA提取

如描述的（Bernatzky R.and Tanksley S.1986.Plant Mol.Biol.Reporter4:37-41），从叶子中提取基因组DNA。为了对ζ等位基因测序，根据制造商推荐的方案（Molecular Research Center,Inc.,Cincinnati,Ohio,USA），通过

ES试剂从0.1-0.2g的叶子组织中制备基因组DNA。

来自植物的RNA提取和cDNA的生产

根据制造商推荐的方案，通过使用TRI-REAGENT从0.1g的叶子组织或1.0g的果实组织中提取总RNA（Molecular Research Center,Inc.,Cincinnati,Ohio,USA；购自Sigma）。根据制造商的指导，通过使用寡聚-dT作为引物以及SUPERSCRIPT^TM II RNase-反转录酶（GibcoBRL）或ImProm-II^TM反转录系统试剂盒（Promega）进行总RNA的反转录。

突变分析

对于cDNA模板，使用Taq聚合酶DynaZyme II DNA聚合酶（重组体，FinnZymes Oy,Espo,Finland）。对于基因组DNA，也使用Taq聚合酶

（QIAGEN Group）。根据制造商推荐的方案使用。

使用下列引物对以对每一个ζ等位基因扩增Ziso的cDNA序列：

1）5’-ACTTAGAGCTCACATAACCTTGTA-3’（Z1-正向，SEQ ID NO:9）

2）5’-TGTATGGAAACGAGTTATGTAACA-3’（Z1-反向，SEQ ID NO:10）

对PCR产物进行测序，并解决与野生型序列的差异。

DNA序列分析

用ABI Prism 377 DNA测序仪（Perkin Elmer）测定DNA序列并用ABI序列分析软件处理。载体NTI Suit软件（InforMax,North Bethesda,MDUSA）用于序列分析。

类胡萝卜素分析

为了使类胡萝卜素的降解和异构化最小化，所有操作都在非常暗的光下进行，当可能时，将类胡萝卜素样品保存在厌氧条件下、在冰上或在-20°C下。

来自果实的类胡萝卜素提取

从0.2-0.6g的新鲜组织中提取果实色素。在1ml的丙酮中研磨组织，并收集和过滤溶剂。在1ml的二氯甲烷中再次研磨剩余的组织碎片，过滤溶剂并与丙酮滤液汇合。重复研磨和收集溶剂，直至组织失去其所有颜色。通过针对等体积的二乙醚和0.2体积的12%w／v的NaCl／H₂O分开溶剂混合物而提取色素。收集带有颜色的醚部分（上面的相），在N₂流下使其干燥，并且将经干燥的脂质提取物再次溶解在70μl的丙酮中，用于进一步分析。

来自花的类胡萝卜素提取

从新鲜的单种花的花瓣或花药中提取花色素。在1ml丙酮中研磨组织，并收集和过滤丙酮。重复该过程，直至从组织中提取了所有色素。在N₂流下干燥丙酮，并且将经干燥的部分溶解在450μl的乙醇中。加入50μl的60%KOH（w／v），并且在4°C下孵育样品16小时用于皂化。通过针对等体积的二乙醚和0.2体积的12%w／v的NaCl／H₂O分开混合物而提取类胡萝卜素。收集上面的相（醚），在N₂流下使其干燥，并且将经干燥的类胡萝卜素溶解在丙酮中，用于进一步分析。

来自子叶的类胡萝卜素提取

从黑暗或光照生长的秧苗的30-100mg新鲜子叶（来自5-12棵秧苗）中提取叶子色素。在丙酮中切碎新鲜组织并过滤。在氮流下干燥溶剂，并溶解在70μl的丙酮中，用于通过HPLC进一步分析。

高效液相色谱（HPLC）分析

使用由Waters 600泵、Waters 996光电二极管阵列检测器和Waters 717plus自动取样器（Waters,Milford,MA）组成的Waters系统，通过高效液相色谱（HPLC）来分离类胡萝卜素。使用两个ODS2 C18反相柱：一个来自Phenomenex（硅土5μm，3.2mm×250mm）（

Torrance,CA USA），且一个来自Waters（5μm，4.6×250mm）（Waters,Milford,MA）。两个柱都连接至保护外壳系统SecurityGuard^TM（

Torrance,CA USA）。

在用于制备用途的HPLC系统1中，以1.6ml/min的恒定流速使用乙腈作为洗脱液（使用Waters柱）。

用于分析目的的HPLC系统2是基于溶剂的梯度。使用乙腈:水（9:1；A）和乙酸乙酯（B），对于Phenomenex柱或Waters柱分别以1ml/min或1.6ml/min的恒定流速。梯度是：100%至80%的A持续8分钟；80%至65%的A持续4分钟，之后65%至45%的A持续14分钟，并且最后一段为100%的B。记录HPLC洗脱溶剂在250-600nm的波长范围下的光谱并检测吸收峰。通过它们的吸收谱和保留时间，并且在某些情况下，通过与可信的参照物质相比来确定胡萝卜素。从携带质粒pACCRT-EIB（Cunningham,F.X.Jr.et al.1993.FEBS Lett.328:130-138）、pBCAR（Lotan,T.and Hirschberg,J.1995.FEBS Lett.364:125-128）以及pAC-NEUR（Cunningham F.X.Jr.et al.1994.Plant Cell 6:1107-1121）的大肠杆菌细胞中，通过类胡萝卜素提取来获得标准的全反式番茄红素、全反式β-胡萝卜素和全反式链孢红素。从CaroteNature GmbH购买标准的反式ζ-胡萝卜素（Lupsingen,Switzerland）。使用Millennium层析软件（Waters），通过积分峰面积进行定量。

类胡萝卜素定量

利用光谱法来测定总类胡萝卜素含量。对于绿色组织，根据（Lichtenthaler,H.K.1987.Methods Enzymol.148:350-382）进行定量。将色素提取物在丙酮中稀释10倍，并且在661.6nm、644.8nm和470nm下测定样品的吸光度。叶绿素和总类胡萝卜素的含量如下计算：

Chl_a（μg／ml丙酮）=11.24×A_661.6-2.04×A_644.8

Chl_b（μg／ml丙酮）=20.13×A_644.8-4.19×A_661.6

类胡萝卜素（μg/ml丙酮）=（1000×A₄₇₀-1.9×Chl_a-63.14×Chl_b）/214

其中Ax表示在给定的（x）波长下，1ml的样品在1cm路径长度的小皿中的吸光度。

对于带有颜色的组织，按照Schiedt和Liaaen-Jensen对类胡萝卜素定量（Schiedt K.and Liaaen-Jensen S.1995.Carotenoids:Isolation and analysis.In Carotenoids Volume 1A:Isolation and Analysis,G.Britton,S.Liaaen-Jensen,and H.Pfander,Eds(Basel:Birkhauser),pp.81-108.）。

其中，A表示在特定的波长（对于叶黄素或反式番茄红素为470nm，而对于番茄红素原为440nm）下，1ml的样品在1cm路径长度的小皿中的吸光度，并且

是特定的吸光系数（对于叶黄素、反式番茄红素或番茄红素原分别为2400、3400或1920），其定义为在1cm路径长度的小皿中1%浓度的溶液的理论吸光度。

根据ζ-胡萝卜素、六氢番茄红素和八氢番茄红素与在组织中的叶黄素、反式番茄红素或番茄红素原的相对比例，计算它们的含量。

实施例1：ζ突变的表征

将番茄栽培品种M82中的突变ζ遗传绘制至与基因渗入株IL12-4中的潘那利番茄染色体区段重叠的染色体12。通过筛选约3000株ζ和IL12-4之间的杂交F2植株进行良好的基因绘图。结果表明基因座ζ的绘图非常接近（<0.8cm）遗传标记At1g48300（图2）。

基于与拟南芥基因At1G10830的同源性，克隆名为Ziso的编码ζ的基因，该拟南芥基因At1G10830已经由Elli Wurtzel博士（CUNY，LehmanCollege,personal communication）鉴定。在ζ（ZETA）x醋栗番茄杂交的F2群中建立了At1G10830序列的番茄同源体和ζ突变的完全共分离。

野生型番茄基因Ziso的DNA序列包含在SEQ ID NO:1中给出的核酸序列（图3），并且将其转录至具有在SEQ ID NO:2中给出的核酸序列的Ziso cDNA（图4）。

番茄中的基因Ziso编码具有41.5kDa的经计算的分子量的369个氨基酸的多肽。通过ChloroP程序预测了氨基末端用于质体靶向的80个氨基酸的转运肽序列。预测成熟的多肽的尺寸为32.4kDa并且包含5个跨膜螺旋。生物信息分析揭示了Ziso发生在所有蓝细菌、藻类和植物中。虽然在细菌基因Nnru中存在相关基序，但是其功能已注释为“未知”的。

以下两种ζ等位基因的序列分析揭示了每一个ζ等位基因携带独特的非正义突变：z⁰⁰⁸⁹，具有在SEQ ID NO:4中给出的核酸序列（图5A）；z²⁰⁸³，具有在SEQ ID NO:6中给出的核酸序列（图5B）。两种等位基因的编码蛋白是非功能性的，并且具有分别在SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7中给出的氨基酸序列。在图5C中给出了来自野生型、z²⁰⁸³和z⁰⁰⁸⁹的ZISO多肽的氨基酸序列的排列。

在下表1中给出了携带ζ突变（z²⁰⁸³）的番茄植物的果实和花中的类胡萝卜素的组成与野生型（M82）番茄植物的类胡萝卜素的组成的比较。以每克鲜量μg给出了类胡萝卜素的浓度。结果明确表明，与野生型植物相比，在携带ζ突变的番茄植株中显著提高了八氢番茄红素、六氢番茄红素和ζ胡萝卜素的含量。

表1：野生型和ζ番茄植株的果实和花中的类胡萝卜素组成

实施例2：含有高的八氢番茄红素和六氢番茄红素的番茄系的繁殖

为了提高番茄果实中期望的八氢番茄红素和六氢番茄红素（P&P）的浓度，将源于栽培品种M82的携带ζ突变z⁰⁰⁸⁹的植株与各种繁殖系杂交。在田地中生长F2代植株，并分析果实的类胡萝卜素。类胡萝卜素的组成基本类似于原始的ζ（ZETA），即，它们包含高浓度的八氢番茄红素、六氢番茄红素和ζ胡萝卜素以及非常低量的番茄红素（总类胡萝卜素的0.5%至6%）（图6）。这些系的果实中八氢番茄红素和六氢番茄红素（P&P）的平均浓度是70.8μg/g鲜量（FW），其相当于大约76%的总果实类胡萝卜素（表2）。携带ζ突变的植株指定为“Z”；以数字表示繁殖系。

表2：在携带ζ突变的六种F2繁殖系的果实中总类胡萝卜素的浓度以及八 氢番茄红素加六氢番茄红素的量

实施例3：产生含有增加的P&P和ζ胡萝卜素的藻类

在序列数据库中的生物信息检索揭示了藻类和蓝细菌（蓝绿藻）的基因组包含与Ziso类似的基因。例如，细长聚球藻（Synechococcus elungatus）PCC7942包含基因Synpcc7942_1979，其注释为“未知功能”，含有与番茄Ziso cDNA（SEQ ID NO:2）的核苷酸序列55.8%相似的核苷酸序列。Synpcc7942_1979基因产物（蛋白质ID AAG59994.1，SEQ ID NO:8）的氨基酸序列为54%同一于并且65.5%类似于番茄Ziso蛋白的序列（SEQ IDNO:3）。

依靠转座子诱发突变，我们已经删除了细长聚球藻PCC7942的野生型株中的基因Synpcc7942_1979（Holtman,C.K.et al.2005.DNA Res.12:103-115）。细长聚球藻PCC7942的突变株称为ΔZiso。在5-10微摩尔光子/平方米/秒的低的光强度下，该突变体的细胞生长缓慢。突变体中的总类胡萝卜素的分析揭示了其积累三-顺-ζ-胡萝卜素至6.5%的程度，其比在野生型中的高>500倍（表3）。该结果表明，Synpcc7942_1979是真正的Ziso同源体。结果进一步证实了，类似于植物，Ziso中的突变在藻类中引起ζ胡萝卜素的积累。根据本发明的教导，含有突变的或沉默的Ziso基因的藻类因此是ζ胡萝卜素并且也可能是八氢番茄红素和六氢番茄红素的潜在来源。

表3：细长聚球藻PCC7942野生型和ΔZiso株中的类胡萝卜素组成（总类 胡萝卜素的百分数）

	β-胡萝卜素	ζ-胡萝卜素	玉米黄质	其它
					野生型	57.5	<0.01	36.5	6
Δziso	32.5	6.5	54.9	6.1

具体实施方式的前述描述将如此充分地揭示本发明的一般本质，以至于通过应用现有知识，在没有过度实验以及不背离一般概念的情况下，其他人可以容易地改变和/或调整各种应用这些具体实施方式，因此在披露的实施方式的等价物的意义和范围内，应当并且旨在理解这些调整和改变。应理解，本文中采用的措词或术语是为了描述而非限制的目的。在不背离本发明的情况下，用于进行各种披露的功能的手段（方法）、材料和步骤可以采取各种替换形式。

Claims (40)

1.一种基因改变的产生类胡萝卜素的生物体，与相应未改变的生物体相比，所述基因改变的生物体包含具有降低的Ziso蛋白的表达或活性的至少一种细胞，其中，与相应未改变的生物体相比，所述基因改变的生物体具有提高含量的选自由八氢番茄红素、六氢番茄红素、ζ胡萝卜素和它们的组合组成的组中的至少一种类胡萝卜素。

2.根据权利要求1所述的基因改变的生物体，其中，具有降低的Ziso蛋白的表达或活性的所述细胞是包含色质体的细胞。

3.根据权利要求1所述的基因改变的生物体，其中，所述Ziso蛋白由具有以下核酸序列的多核苷酸编码：所述核酸序列至少55%、60%、70%、75%、80%、85%或95%同源于在SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的任一个中给出的核酸序列。

4.根据权利要求1所述的基因改变的生物体，其中，所述Ziso蛋白由具有在SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的任一个中给出的核酸序列的多核苷酸编码。

5.根据权利要求1所述的基因改变的生物体，其中，所述Ziso蛋白包含至少55%、60%、70%、75%、80%、85%或95%同源于在SEQ IDNO:3中给出的氨基酸序列的氨基酸序列。

6.根据权利要求1所述的基因改变的生物体，其中，所述Ziso蛋白包括在SEQ ID NO:3中给出的氨基酸序列。

7.根据权利要求3所述的基因改变的生物体，其中，编码所述Ziso蛋白的所述多核苷酸包含形成突变的Ziso多核苷酸的至少一个突变。

8.根据权利要求7所述的基因改变的生物体，其中，所述至少一个突变导致所述Ziso蛋白降低的表达或非功能性Ziso蛋白的产生。

9.根据权利要求7所述的基因改变的生物体，其中，所述突变的Ziso多核苷酸包含在SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6的任一个中给出的核酸序列。

10.根据权利要求9所述的基因改变的生物体，其中，所述突变的Ziso多核苷酸编码具有在SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7的任一个中给出的氨基酸序列的蛋白。

11.根据权利要求3所述的基因改变的生物体，所述生物体是转基因生物体，所述转基因生物体包括含有能够沉默编码所述Ziso蛋白的所述多核苷酸的分子的至少一种细胞。

12.根据权利要求11所述的基因改变的生物体，其中，包含能够沉默编码所述Ziso蛋白的所述多核苷酸的分子的所述细胞是包含色质体的细胞。

13.根据权利要求11所述的转基因生物体，其中，所述沉默分子选自由RNA干扰分子、反义分子和编码核酶的分子组成的组。

14.根据权利要求13所述的转基因生物体，其中，所述沉默分子包含具有基本上互补于至少20个核苷酸的核酸序列的核酸序列的多核苷酸，所述至少20个核苷酸的核酸序列至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%同源于SEQ ID NO:2。

15.根据权利要求14所述的转基因生物体，其中，所述沉默分子包含具有基本上互补于至少20个核苷酸的SEQ ID NO:2的核酸序列的多核苷酸。

16.根据权利要求13所述的转基因生物体，其中，所述沉默分子是RNAi分子。

17.根据权利要求1所述的基因改变的生物体，所述生物体具有基因改变的细胞的总类胡萝卜素含量的至少25%（w／w）的八氢番茄红素含量。

18.根据权利要求1所述的基因改变的生物体，所述生物体具有基因改变的细胞的总类胡萝卜素含量的至少15%（w／w）的六氢番茄红素含量。

19.根据权利要求1所述的基因改变的生物体，所述生物体具有基因改变的细胞的总类胡萝卜素含量的至少30%（w／w）的结合水平的八氢番茄红素和六氢番茄红素。

20.根据权利要求1所述的基因改变的生物体，所述生物体选自由植物、藻类和藻青菌组成的组。

21.根据权利要求20所述的基因改变的生物体，所述生物体是植物。

22.根据权利要求21所述的基因改变的生物体，所述生物体是番茄植物。

23.根据权利要求21所述的基因改变的植物，在所述植物的至少一个器官中具有提高含量的八氢番茄红素、六氢番茄红素、ζ胡萝卜素或它们的组合中的至少一种。

24.根据权利要求23所述的基因改变的植物，其中，所述器官选自由根、块茎、花和果实组成的组。

25.根据权利要求23所述的基因改变的植物，其中，所述果实是肉质果实。

26.一种权利要求21所述的基因改变的植物的种子，其中，由所述种子生长的植物与由相应未改变的种子生长的植物相比具有降低的Ziso表达，从而具有提高含量的八氢番茄红素、六氢番茄红素、ζ胡萝卜素或它们的组合中的至少一种。

27.一种从权利要求1所述的基因改变的生物体分离的细胞悬浮液或组织培养液，其中，所述细胞或组织培养液包含提高含量的八氢番茄红素、六氢番茄红素、ζ胡萝卜素或它们的组合中的至少一种。

28.一种在生物体的至少一个细胞中提高八氢番茄红素、六氢番茄红素、ζ胡萝卜素或它们的组合中的至少一种的含量的方法，包括在所述至少一个细胞中抑制Ziso蛋白的表达，从而产生在所述至少一个细胞中具有提高量的八氢番茄红素、六氢番茄红素、ζ胡萝卜素或它们的组合中的至少一种的生物体。

29.根据权利要求28所述的方法，其中，Ziso蛋白的表达在包含色质体的细胞中被抑制。

30.根据权利要求28所述的方法，其中，抑制所述Ziso蛋白的表达包括在编码所述Ziso蛋白的多核苷酸中引入突变。

31.根据权利要求30所述的方法，其中，所述突变导致编码Ziso蛋白的多核苷酸的降低的表达或非功能性Ziso蛋白的产生。

32.根据权利要求28所述的方法，其中，抑制所述Ziso蛋白的表达包括用指定为沉默编码所述Ziso蛋白的多核苷酸的表达的分子转化所述生物体的至少一个细胞。

33.根据权利要求32所述的方法，其中，编码所述Ziso蛋白的所述多核苷酸包含至少55%、60%、70%、75%、80%、85%或95%同源于在SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的任一个中给出的核酸序列的核酸序列。

34.根据权利要求33所述的方法，其中，编码所述Ziso蛋白的所述多核苷酸包括在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2的任一个中给出的核酸序列。

35.根据权利要求32所述的方法，其中，所述沉默分子选自由反义分子、RNAi分子和编码核酶的多核苷酸组成的组。

36.根据权利要求28所述的方法，其中，所述生物体具有总类胡萝卜素的至少25%（w／w）的八氢番茄红素含量，或总类胡萝卜素含量的至少15%（w／w）的六氢番茄红素含量，或总类胡萝卜素含量的至少30%（w／w）的结合水平的八氢番茄红素和六氢番茄红素。

37.一种编码具有在SEQ ID NO:5中给出的氨基酸序列的非功能性Ziso蛋白的分离的多核苷酸。

38.根据权利要求37所述的分离的多核苷酸，具有在SEQ ID NO:4中给出的核酸序列。

39.一种编码具有在SEQ ID NO:7中给出的氨基酸序列的非功能性Ziso蛋白的分离的多核苷酸。

40.根据权利要求38所述的分离的多核苷酸，具有在SEQ ID NO:6中给出的核酸序列。

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