CN114848556A - 绞股蓝提取物与杜仲提取物协同用于制备促黑发/防白发的头发洗护用品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了绞股蓝提取物与杜仲提取物协同用于制备促黑发/防白发的头发洗护用品中的应用，本发明首次发现绞股蓝提取物和杜仲提取物组合可以显著促进黑色素细胞产生黑色素的浓度，并促进络氨酸酶的活性，本发明为将来绞股蓝提取物和杜仲提取物组合应用于人的促黑发/防白发奠定了理论基础和应用参考，股蓝提取物和杜仲提取物组合有望成为促黑发/防白发最有效的手段。
Description
技术领域
本发明涉及绞股蓝提取物与杜仲提取物协同用于制备促黑发/防白发的头发洗护用品中的应用，具体涉及绞股蓝提取物与杜仲提取物协同用于制备促黑发/ 防白发的头发洗护用品中的应用、用于促黑发/防白发的组合物及头发洗护用品。
背景技术
毛发是机体重要的外征之一，中国人健康的头发应是乌黑浓密的，但年龄增长、生活压力和外部环境会让头发变白，不仅影响个人形象，对生活、工作也有诸多阻碍。
黑色素的形成是酪氨酸在酪氨酸酶的作用下形成多巴，进而氧化成黑色素。在所有研究过的哺乳动物中，毛发颜色均起源于黑素细胞，这些细胞类似于沿皮肤上皮基底膜发现的黑素细胞，黑素细胞可以产生黑色素，并包装成特殊的黑素体细胞器。黑素体通常为椭圆形，黑色素包括真黑色素和类黑色素两种类型。黑色素的产生和转换受到来自真皮乳头的信号的调节，这一过程涉及到许多基因、转录因子和其他小分子。
随着白发人群的日益增多，促黑发/防白发具有广阔的理论研究和市场发展的前景。毛发颜色与黑色素细胞的生长密切相关，而黑色素细胞的活性与络氨酸酶等具有相关性。
目前市面上尚无有效可靠的白发转黑药物，但是中药用于治疗脱发已经有很长的历史，中草药治疗白发的偏方和验方很丰富，但仅限于临床疗效的观察。现有技术中虽然公开了许多促黑发/防白发的中药组合物，但是这些中药组合物大多都是通过滋养头发，促进头部的血液循环来实现促黑发的功能。
发明内容
本发明的目的在于提供绞股蓝提取物与杜仲提取物协同用于制备促黑发/防白发的头发洗护用品中的应用，经实验验证绞股蓝提取物与杜仲提取物能够协同促进黑色素细胞产生黑色素及促进络氨酸酶的活性，以达到促黑发/防白发的功效。
本发明的目的还在于提供一种用于促黑发/防白发的组合物及头发洗护用品，以特定量的绞股蓝提取物与杜仲提取物作为有效成分以实现促黑发/防白发。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
绞股蓝提取物与杜仲提取物协同用于制备促黑发/防白发的头发洗护用品中的应用。绞股蓝提取物与杜仲提取物能够协同促进黑色素细胞产生黑色素及促进络氨酸酶的活性。
本发明提供的一种用于促黑发/防白发的组合物，所述组合物中绞股蓝提取物与杜仲提取物的质量比为0.04-0.2：0.02-0.10，优选为0.1：0.06。
本发明提供的一种促黑发/防白发的头发洗护用品，所述头发洗护用品中含有0.04-0.2wt％绞股蓝提取物及0.02-0.10wt％的杜仲提取物，优选为含有0.1wt％绞股蓝提取物及0.06wt％的杜仲提取物。
所述洗护用品为洗发水、护发素、头皮精华液、头皮营养液中的一种。所述头发洗护用为水剂、乳液或固体。
本发明首次发现绞股蓝提取物和杜仲提取物组合可以显著促进黑色素细胞产生黑色素的浓度，并促进络氨酸酶的活性。为了进一步探索其活性机理和浓度筛选，本发明研究了绞股蓝提取物和杜仲提取物组合对于黑色素相关因子的促进关系。本发明为将来绞股蓝提取物和杜仲提取物组合应用于人的促黑发/防白发奠定理论基础和应用参考，股蓝提取物和杜仲提取物组合有望成为促黑发/ 防白发最有效的手段。
虽然本发明针对黑色素转换和黑素生成调节的研究主要是针对小鼠进行的，但一般的结论可以适用于所有的头发。为了探究白发转黑的解决方法，本发明采用小鼠B16黑色素细胞，发现绞股蓝提取物和杜仲提取物的组合物不会促进黑素细胞的增殖进而保证了其安全性，但可以提高黑素细胞的活性以提高黑色素的生成，并促进络氨酸酶的活性，且二者的组合比单个成分的效果更佳。
附图说明
图1为实施例1中的CCK-8法测定的B16细胞增殖率结果；
图2为实施例2中不同浓度的植物提取物处理B16细胞后黑色素含量测定结果；
图3为实施例3中不同浓度的植物提取物对酪氨酸酶活性的影响的测定结果；
图4为实施例4中RT-PCR定量检测B16细胞中tyr基因的mRNA表达水平的结果。
具体实施方式
本发明所使用的各原材料来源或组成如下：
小鼠B16黑色素细胞：上海中乔信舟生物科技有限公司；
绞股蓝提取物：购买自南京道斯夫生物科技有限公司，其制备方法为：将绞股蓝全株粉碎完成，称重后投入多功能提取罐中，每个提取罐按投料量的6倍量加入生产用水，开启蒸汽加热，从微沸起开始计时，保持微沸提取2小时后提取液经双联过滤器过滤后放入提取液贮罐中；按以上操作再提取两次，总共提取三次，提取完成后，将提取液通过管道转至浓缩器中，保持压力-0.08± 0.02Mpa，温度58度至92度之间，比重为1.08-1.10为浓缩终点，浓缩完毕后，将料液通过管道打入喷雾干燥干燥塔的冷热缸中，进行喷雾干燥，进风温度 160-170℃，出风温度85-100℃，喷雾压力10-15MPa，完成干燥，并装80目筛进行物料过筛；
杜仲蓝提取物：购买自南京道斯夫生物科技有限公司，其制备方法同绞股蓝提取物，只是将上述制备方法中的绞股蓝全株替换为杜仲皮；
CCK-8：上海汉恒生物上海汉恒生物科技有限公司；
曲拉通X-100：合肥博美生物科技有限责任公司；
L-dopa：合肥博美生物科技有限责任公司；
Monzol Reagent：莫纳生物科技有限公司；
MonScript RTIII All-in-One Mix with dsDNase：莫纳生物科技有限公司；
MonScript RTIII Super Mix with dsDNase：莫纳生物科技有限公司；
细胞培养液：Gibco RPMI Medium 1640basic(1X)细胞培养基，添加双抗和胎牛血清。
下面结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
CCK-8法测定绞股蓝提取物、杜仲提取物对B16细胞增殖率的影响
实验过程：
①细胞种板：取小鼠B16黑色素细胞长至80％培养皿，PBS洗后，加入胰酶消化3min，加入培养液8mL终止消化，取96孔板，每孔加入100uL细胞，种板后放入培养箱培养24h；
②药物配制：使用细胞培养液分别将绞股蓝提取物配制成0.02％、0.04％、0.08％、0.16％的质量浓度，将杜仲提取物配制成0.16％的质量浓度；使用细胞培养液配制绞股蓝提取物和杜仲提取物的混合液，混合液中绞股蓝提取物、杜仲提取物的质量浓度分别为0.10％、0.06％。以细胞培养液为阴性对照CK。
③CCK测定：细胞种板培养24h后，吸去培养液，用PBS洗后，每孔加入180uL培养液，再把对应药物加入相应孔位，每个样为1mL，过滤后每个样取10uL加到90uL细胞培养液中，即稀释10倍，培养24h后，加入CCK8试剂 10uL，培养箱孵育4h后，置于450nm测定吸光度；
细胞活力含量计算方法：(A加药/A空白)*100。
结果如图1所示，由于黑色素细胞过度增殖会导致体系紊乱，所以在筛选促进黑色素活性的物质时，不能过度促细胞增殖，如图所示，绞股蓝提取物在 0.02-0.16％浓度时都不会导致黑色素细胞的过度增殖，绞股蓝提取物与杜仲提取物的混合物对黑色素细胞的增殖与对照相比较持平，说明绞股蓝、杜仲、绞股蓝与杜仲的混合物对于黑色素细胞均没有毒性，且不会显著促进黑素细胞的增殖，性质温和、健康安全。
实施例2
绞股蓝提取物、杜仲提取物对B16细胞产生的黑色素含量的测定
实验过程：
①细胞种板：同实施例1
②药物配制：同实施例1
③黑色素测定：细胞种板培养24h后，吸去培养液，用PBS洗后，每孔加入180uL培养液，再把对应药物加入相应孔位，每个样为1mL，过滤后每个样取10uL加到90uL细胞培养液中，即稀释10倍，培养48h后，弃培养液，PBS 清洗1-2次，加入NaOH每孔100uL，水浴60℃孵育1h，擦干后于475nm测定吸光度；
黑色素含量计算方法：(A加药/A空白)*100。
结果如图2所示，不同浓度的绞股蓝提取物以及绞股蓝提取物与杜仲提取物的混合物，均能提高黑色素的生成，但是绞股蓝提取物与杜仲提取物的混合物具有协同作用，效果更优。
实施例3
绞股蓝提取物、杜仲提取物对酪氨酸酶活性的影响的测定
实验过程：
①B16细胞种板：同实施例1
②药物配制：同实施例1
③黑色素测定：细胞种板培养24h后，吸去培养液，用PBS洗后，每孔加入180uL培养液，再把对应药物加入相应孔位，培养48h后，弃培养液，PBS 清洗1-2次，加入Tritonx-100每孔100uL，-80℃冰箱冷冻1h，室温融化后加入 1％L-DOPA每孔20uL，放入培养箱孵育1h，擦干后于492nm测定吸光度；
酪氨酸酶含量计算方法：(A加药/A空白)*100。
络氨酸酶的活性是黑色素活性的重要指标，结果如图3所示，不同浓度的绞股蓝提取物以及绞股蓝提取物与杜仲提取物的混合物，均能提高络氨酸酶的活性，但绞股蓝提取物与杜仲提取物的混合物具有协同作用，效果更优。
实施例4
用RT-PCR定量检测B16细胞中tyr基因的mRNA
实验过程：
①将B16细胞以10个细胞/孔的密度接种在12孔组织培养板中培养过夜；
②药物配制：使用细胞培养液分别将绞股蓝提取物、杜仲提取物均配制成 0.16％的质量浓度，使用细胞培养液配制绞股蓝提取物和杜仲提取物的混合液，混合液中绞股蓝提取物、杜仲提取物的质量浓度分别为0.10％、0.06％。
③用不同浓度的植物提取物与细胞均匀混合48小时后，设置空白对照，用 PCR仪用两步RT-PCR试剂盒从40纳克总RNA合成cDNA，通过凝胶记录和系统分析机器测量RT-PCR反应产物密度。
如果结果是药物处理组的tyr基因的表达水平增加，表明药物的活性机理是其对应因子的活性变化，进而促进毛乳头细胞的分化和增殖，并导致早期生长期的诱导。
络氨酸酶的活性是黑色素活性的重要指标，络氨酸酶由tyr等基因编码，tyr 基因的mRNA活性则从分子角度证明了络氨酸酶的活性是否提高。如图4所示，不同浓度的绞股蓝提取物以及绞股蓝提取物与杜仲提取物的混合物，均能提高络氨酸酶的活性，但绞股蓝提取物与杜仲提取物的混合物具有协同作用，效果更优。
综上可见，绞股蓝提取物与杜仲提取物配合使用时，能显著提高黑色素细胞的活性，且其机理是其可使络氨酸酶的活性显著提高。这些实验可以证明绞股蓝提取物和杜仲提取物的混合物在促黑发/防白发领域的应用潜力，两者的组合物可制备成洗发水、护发素、头皮精华液、头皮营养液中的一种进行使用，以实现促黑发/防白发的效果。
上述参照实施例对绞股蓝提取物与杜仲提取物协同用于制备促黑发/防白发的头发洗护用品中的应用进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.绞股蓝提取物与杜仲提取物协同用于制备促黑发/防白发的头发洗护用品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，绞股蓝提取物与杜仲提取物能够协同促进黑色素细胞产生黑色素。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，绞股蓝提取物与杜仲提取物能够协同促进络氨酸酶的活性。
4.一种用于促黑发/防白发的组合物，其特征在于，所述组合物中绞股蓝提取物与杜仲提取物的质量比为0.04-0.2：0.02-0.10。
5.一种促黑发/防白发的头发洗护用品，其特征在于，所述头发洗护用品中含有0.04-0.2wt％绞股蓝提取物及0.02-0.10wt％的杜仲提取物。
6.根据权利要求5所述的促黑发/防白发的头发洗护用品，其特征在于，所述洗护用品为洗发水、护发素、头皮精华液、头皮营养液、洗发皂中的一种。
7.根据权利要求5所述的促黑发/防白发的头发洗护用品，其特征在于，所述头发洗护用为水剂、乳液或固体。
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