CN114836359A - 一种微生物发酵剂 - Google Patents

Abstract

本发明适用于微生物应用技术领域，提供了一种微生物发酵剂，所述微生物发酵剂包括质量比为（1‑3）:（3‑6）:（2‑5）:（1‑4）的粪肠球菌、凝结芽孢杆菌、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌；其中，所述凝结芽孢杆菌的菌株保藏编号为CCTCC NO：M 2022228，所述粪肠球菌的菌株保藏编号为CCTCC NO：M 2022227，所述枯草芽孢杆菌的菌株保藏编号为CCTCC NO：M 2022226。本申请解决了棕榈粕抗营养因子含量高，难发酵的问题，生产成本低，且具有非淀粉多糖降解效果好，酸度高，菌体代谢产物丰富的优点。

Description

一种微生物发酵剂

技术领域

本发明属于微生物应用技术领域，尤其涉及一种微生物发酵剂。

背景技术

棕榈粕具有无黄曲霉毒素污染、含VE抗氧化、适口性好等优点，已在反刍动物中广泛使用。棕榈粕中甘露聚糖是主要的抗营养因子，而甘露聚糖降解产生的甘露寡糖是一种益生物质，其在动物肠道中主要具有三大功能：一、能调节动物肠道微生物生态系统，甘露寡糖进入肠道能被双歧杆菌等益生菌选择性利用，促进肠道益生菌增殖，改善肠道菌群结构，同时甘露寡糖还能改善肠道黏膜结构，增加大小肠吸收面积；二、能增强动物体的免疫功能，甘露寡糖能够吸附一些病毒和病原微生物，从而阻止其在肠道中定植，达到增强免疫的作用，甘露寡糖还能提高血清中特异性免疫因子的浓度；三、通过节动物肠道微生物生态系统，增强动物体的免疫功能，提高了动物生长性能。

然而，棕榈粕粗蛋白14-17%，粗脂肪8-10%，通常作为能量原料或蛋白补充原料；棕榈仁粕中总碳水化合物（木质素除外）含量约50%，其中淀粉含量为1.1%，低分子物质含量为2.4%，而剩余约42%为非淀粉多糖，非淀粉多糖能在畜禽消化道（尤其是单胃动物）中形成粘性环境，阻碍消化道对营养物质的吸收，降低了棕榈粕的消化率，因此，改善其营养性能，提高其适用范围是当前研究热点。现有生物技术手段主要是通过发酵制剂结合豆粕、麸皮和棕榈粕等进行混合，虽然发酵料营养价值明显提高，但发酵制剂组合不当，发酵过程控制不足，不同原料抗营养因子降解难以兼顾，棕榈粕中非淀粉多糖降解针对性不足，降解效果差以及生产成本高。

由此可见，现有的棕榈粕发酵方法存在抗营养因子分解不彻底、综合利用价值较低以及生产成本高的问题。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种微生物发酵剂，旨在解决现有的棕榈粕发酵方法存在抗营养因子分解不彻底、综合利用价值较低以及生产成本高的问题。

本发明实施例是这样实现的，一种微生物发酵剂，所述微生物发酵剂包括质量比为（1-3）:（3-6）:（2-5）:（1-4）的粪肠球菌、凝结芽孢杆菌、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌；其中，所述凝结芽孢杆菌的菌株保藏编号为CCTCC NO：M 2022228，所述粪肠球菌的菌株保藏编号为CCTCC NO：M 2022227，所述枯草芽孢杆菌的菌株保藏编号为CCTCC NO：M 2022226。

本发明实施例提供的微生物发酵剂以消除棕榈粕抗营养因子，提高寡糖含量为主，意在扩大棕榈粕在单胃动物中的应用范围和添加量。本申请通过对制剂组分种类及配比进行优化，利用菌酶协同发酵技术，建立了高温酶解，低温发酵的菌酶协同发酵体系，高温期间棕榈粕中非淀粉多糖等大分子物质被酶解，释放出来的营养物质供应低温期间菌体代谢产酸，解决棕榈粕抗营养因子含量高，难发酵的问题，生产成本低。另外，本申请具有非淀粉多糖降解效果好，酸度高，菌体代谢产物丰富的优点。

附图说明

图1是本申请实施例提供的棕榈粕酶解实验结果图；

图2是本申请实施例提供的纤维素对棕榈粕酶解效果影响的曲线图；

图3是本申请实施例提供的不同多糖酶对棕榈粕酶解效果的影响曲线图；

图4是本申请实施例提供的木聚糖酶在棕榈粕酶解实验结果图；

图5是本申请实施例提供的不同温度对棕榈粕酶解效果的影响图；

图6是本申请实施例提供的不同水分对棕榈粕酶解效果的影响图；

图7是本申请实施例提供的脂肪酶添加量对棕榈粕中粗脂肪的酶解效果的影响图；

图8是本申请实施例提供的复合蛋白酶添加量对棕榈粕中粗脂肪的酶解效果的影响图；

图9是本申请实施例提供的复合酶添加量对棕榈粕中粗脂肪的酶解效果的影响图；

图10是本申请实施例提供的粪肠球菌生长曲线图；

图11是本申请实施例提供的酶活力水解圈示意图；

图12是本申请实施例提供的凝结芽孢杆菌产酸菌株初筛结果图；

图13是本申请实施例提供的凝结芽孢杆菌产酸菌株复筛结果图；

图14是本申请实施例提供的芽孢杆菌添加量对寡糖含量影响结果图；

图15是本申请实施例提供的不同酵母菌添加量情况下0-24h堆体温度随发酵时间变化曲线图；

图16是本申请实施例提供的车厢内物料温度随发酵时间变化结果图；

图17是本申请实施例提供的7月和12月的棕榈粕发酵寡糖浓度变化结果图；

图18是本申请实施例提供的7月和12月的棕榈粕发酵酸度变化结果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

当前，通过菌酶协同发酵技术降低抗营养因子浓度，提升棕榈粕营养价值，具有重大的意义。然而，棕榈粕发酵所需菌和酶种类多，发酵工艺复杂，同时，棕榈粕抗营养因子含量高，难分解，而且营养单一，菌体难发酵，如何控制成本，提高棕榈粕发酵效果，是棕榈粕发酵物能否推广的关键。为适应棕榈粕发酵条件，本申请将基于固态发酵工艺对复合菌和复合酶进行种类筛选及配比优化研究，建立高温酶解，低温发酵的固态发酵工艺体系，通过提高菌酶协同发酵工艺技术水平，解决这一关键问题。

具体地，本申请提供了一种微生物发酵剂，所述微生物发酵剂包括粪肠球菌、凝结芽孢杆菌、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌。

在一些实施例中，所述粪肠球菌、凝结芽孢杆菌、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌的质量比为（1-3）:（3-6）:（2-5）:（1-4）。复合菌及其菌数：粪肠球菌（1×10⁸ -1×10¹⁰ CFU/g）、凝结芽孢杆菌（1×10⁷ -1×10⁹ CFU/g）、酿酒酵母（1×10⁷ -1×10⁹ CFU/g）和枯草芽孢杆菌（1×10⁸ -1×10¹⁰ CFU/g）。发酵前期通过菌体发酵产热使固态发酵体系升温。通过对复合菌配比的优化，达到高温酶解期升温快，低温厌氧发酵期产酸高的效果。其中，筛选出高产酸凝结芽孢杆菌（菌株保藏编号CCTCC NO：M 2022228，分类命名为Bacillus coagulansABMB2021149，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2022年3月9日）、高耐热高产酸粪肠球菌（菌株保藏编号CCTCC NO：M 2022227，分类命名为Enterococcus faecalis ABML2021245，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2022年3月9日）和具有甘露聚糖酶活性的枯草芽孢杆菌（菌株保藏编号CCTCC NO：M 2022226，分类命名为Bacillus subtilisABMB2021138，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2022年3月9日），所用酿酒酵母可通过市面上任一购得，其具体菌种不会对体系带来明显影响，本申请对其品种不做具体限制。

在一些实施例中，所述微生物发酵剂还包括复合酶；由所述粪肠球菌、凝结芽孢杆菌、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌组成的复合菌以及所述复合酶的质量比为（0.1-0.3）:（0.1-0.3）。

其中，所述复合酶包括β-甘露聚糖酶、纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、脂肪酶、复合蛋白酶和植酸酶。

在一些实施例中，所述β-甘露聚糖酶、纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、脂肪酶、复合蛋白酶、植酸酶的质量比为（3-6）:（2-5）:（1-3）:（1-3）:（2-4）:（1-4）:（1-3）。所述复合蛋白酶是由质量比为（1-3）:（2-5）的碱性蛋白酶和中性蛋白酶复配而成。复合酶及其酶活力：β-甘露聚糖酶（1-3万U/g）、纤维素酶（1-3万U/g）、木聚糖酶（0.5-1.5万U/g）、β-葡聚糖酶（0.2-0.4万U/g）、植酸酶（0.1-0.4万U/g）、脂肪酶（0.4-0.8万U/g）、中性蛋白酶（0.5-2.5万U/g）和碱性蛋白酶（0.5-2.5万U/g）。通过对复合酶的筛选和配比的优化，显著降低甘露聚糖含量的同时，降低了复合酶的使用成本，车厢发酵72h后发酵棕榈粕寡糖浓度达到20-25%。

本申请还提供了一种所述的微生物发酵剂在发酵棕榈粕中的应用方法，包括：

将所述的微生物发酵剂、糖蜜以及水进行混合均匀，得混合液；

将所述混合液喷入经粉碎处理后的棕榈粕和麸皮中进行搅拌混合，投入发酵装置中进行升温发酵2-4天后，采用带有内膜的吨袋进行打包，并放置常温厌氧发酵2-3天，得棕榈粕发酵物。

发酵前期通过菌体发酵产热使固态发酵体系升温，最终温度能维持在50℃左右。本申请所用β-甘露聚糖酶最适酶活温度范围为50-60℃，纤维素酶最适酶活温度范围为45-55℃，木聚糖酶最适酶活温度范围为50-60℃。通过对复合菌和培养物的配比优化，固态发酵体系能够达到几种主要酶的最适酶解温度，使酶解效率最大化。

另外，本申请在高温酶解过程中，棕榈粕中抗营养因子主要是非淀粉多糖，含量高达42%，非淀粉多糖被降解为寡糖后物理性状由非水溶变为水溶，可以用DNS法检测寡糖浓度变化来指示非淀粉多糖的酶解效果；车厢发酵72h后发酵棕榈粕寡糖浓度达到20-25%，非淀粉多糖酶解率为47.6%-59.5%，酸度1.5%-2.0%；

另外，通过研究发现，本申请在低温发酵过程中，棕榈粕在水分较高时容易出现霉变，而高温酶解后的棕榈粕，更容易被菌体利用，产酸更高。发酵棕榈粕采用吨袋打包，通过常温厌氧发酵，3d后酸度达到2.5%-3.5%；对照采用厌氧呼吸袋在常温条件下进行发酵，6d后酸度只有1.0%-1.5%。较高的酸度能有效抑制棕榈粕的霉变，增加了发酵棕榈粕产品质量的稳定性。

具体可选地，采用车阵式固态发酵设备进行箱式固态发酵，箱体容量6吨，装载量4吨，物料初始含水量40%-50%，发酵初始温度即可达36-39℃，发酵15-20h达到45℃，发酵40h达到50℃，达到菌体产热和箱体散热的动态平衡，车厢内发酵温度维持在50℃直至发酵结束。整个发酵周期为72h左右，发酵结束后采用带有内膜的吨袋进行打包，打包完毕，放入仓库进行厌氧常温发酵，吨袋中发酵料温度维持在30-37℃左右。吨袋可重复利用。

其中，通过对菌种、酶的种类配比的优化，使得发酵物温度最终能维持在50℃左右，达到产热与散热的动态平衡，在保证菌剂活性的同时实现了棕榈粕的高温酶解。

以下为该微生物发酵剂在发酵棕榈粕中的应用方法的具体可选实施流程，包括以下步骤：

S1、菌液制备：将粪肠球菌菌粉、凝结芽孢杆菌菌粉和酿酒酵母菌菌粉按比例配制，与发酵完成的枯草芽孢杆菌菌液混合，制成菌液；其中，枯草芽孢杆菌菌液为机械搅拌通风发酵罐扩培发酵而来，发酵培养基为：玉米浆0.3-0.6%、玉米淀粉1-4%、槐树胶0.2-0.8%、豆粕0.5-2%、花生粕0.5-1.5%、硫酸镁0.01-0.04%、硫酸铵0.03-0.08%；发酵条件为：通气量1.5-2.0vvm，转速150-300rpm，培养温度35-37℃。更具体地，发酵培养基为：玉米浆0.5%、玉米淀粉2%、槐树胶0.5%、豆粕1%、花生粕0.5%、硫酸镁0.02%、硫酸铵0.05%；发酵条件为：通气量1.8vvm，转速200rpm，培养温度37℃，罐压0.05MPa，发酵时间24h。

S2、菌酶混合液制备：将复合酶按比例称好后投入菌液中，按生产配方加入糖蜜和水，搅拌混合，形成菌酶混合液；

S3、发酵棕榈粕混合：将棕榈粕和麸皮分别从投料口投入进行粉碎，粉碎完转入料仓，按照生产配方将棕榈粕和麸皮投入混合机，同时喷入菌酶混合液，混合机搅拌120-150s，单次混合800-1000kg；

S4、棕榈粕升温发酵：将混合完毕的物料投入发酵箱内，每个发酵箱装4批左右，盖上塑料薄膜，进行升温发酵；

S5、常温发酵：升温发酵2-4天后，采用带有内膜的吨袋进行打包，将袋口扎紧，进行常温发酵；

S6、烘干：常温发酵2-3天后，采用滚筒烘干设备烘干，温度70-80℃，得棕榈粕发酵物，水分10%-15%。

以下给出本申请某些实施方式的实施例，其目的不在于对本申请的范围进行限定。

另外，需要说明的是，以下实施例中所给出的数值是尽可能精确，但是本领域技术人员理解由于不可能避免的测量误差和实验操作问题，每一个数字都应该被理解为约数，而不是绝对准确的数值。

以下实施例以及对比例中微生物发酵剂包括复合菌以及复合酶，其中复合菌中粪肠球菌、凝结芽孢杆菌、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌的质量比为1:3:2:1；复合酶中β-甘露聚糖酶、纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、脂肪酶、复合蛋白酶（质量比为2:3.5的碱性蛋白酶和中性蛋白酶）、植酸酶的质量比为3:3:1:1:3:1:1。

实施例1

将水37份、糖蜜2.5份、复合菌0.3份、复合酶0.1份于菌液罐中混合，制成菌液；输入生产配方，单次投入已粉碎的棕榈粕55份、麸皮5份，进入混合仓混合，同时将菌液喷入混合仓，混合120s左右下料，物料进入发酵箱。循环四次，发酵箱物料装载量为3-4吨，盖上薄膜，自然升温，物料升温至45-50℃时维持平衡，发酵3天后下料，采用带有内膜的吨袋打包，将袋口扎紧，放置室温发酵3天。采用滚筒烘干设备烘干，温度70-80℃，得棕榈粕发酵物。

实施例2

将水40份、糖蜜3.5份、复合菌0.2份、复合酶0.2份于菌液罐中混合，制成菌液；输入生产配方，单次投入已粉碎的棕榈粕52份、麸皮4份，进入混合仓混合，同时将菌液喷入混合仓，混合130s左右下料，物料进入发酵箱。循环四次，发酵箱物料装载量为3-4吨，盖上薄膜，自然升温，物料升温至45-50℃时维持平衡，发酵3天后下料，采用带有内膜的吨袋打包，将袋口扎紧，放置室温发酵3天。采用滚筒烘干设备烘干，温度70-80℃，得棕榈粕发酵物。

实施例3

将水42份、糖蜜5份、复合菌0.1份、复合酶0.3份于菌液罐中混合，制成菌液；输入生产配方，单次投入已粉碎的棕榈粕49份、麸皮3份，进入混合仓混合，同时将菌液喷入混合仓，混合150s左右下料，物料进入发酵箱。循环四次，发酵箱物料装载量为3-4吨，盖上薄膜，自然升温，物料升温至45-50℃时维持平衡，发酵3天后下料，采用带有内膜的吨袋打包，将袋口扎紧，放置室温发酵3天。采用滚筒烘干设备烘干，温度70-80℃，得棕榈粕发酵物。

对实施例1-3所制备得到的棕榈粕发酵物以及棕榈粕原料进行相关参数指标测试，其中，粗蛋白：GB/T 6432-2018饲料中粗蛋白的测定凯氏定氮法；酸溶蛋白：NY/T 3801-2020饲料原料中酸溶蛋白的测定；酸度：GB 5009.239-2016 食品安全国家标准食品酸度的测定；寡糖：3，5-二硝基水杨酸(DNS)法测还原糖含量，测试结果如表1所示。

综上，实施例1-3为不同原料配比的生产工艺，由表1实验结果可知，寡糖浓度20-25%，酸度达到2.5%-3.5%。

对比例1

将水40份、复合菌0.2份、复合酶0.2份于菌液罐中混合，制成菌液；输入生产配方，单次投入已粉碎的棕榈粕52份、麸皮4份，进入混合仓混合，同时将菌液喷入混合仓，混合130s左右下料，物料进入发酵箱。循环四次，发酵箱物料装载量为3-4吨，盖上薄膜，自然升温，物料升温至45-50℃时维持平衡，发酵3天后下料，采用带有内膜的吨袋打包，将袋口扎紧，放置室温发酵3天。采用滚筒烘干设备烘干，温度70-80℃，得棕榈粕发酵物。

对比例2

将水40份、糖蜜3.5份、复合菌0.2份、复合酶0.2份于菌液罐中混合，制成菌液；输入生产配方，单次投入已粉碎的棕榈粕52份，进入混合仓混合，同时将菌液喷入混合仓，混合130s左右下料，物料进入发酵箱。循环四次，发酵箱物料装载量为3-4吨，盖上薄膜，自然升温，物料升温至45-50℃时维持平衡，发酵3天后下料，采用带有内膜的吨袋打包，将袋口扎紧，放置室温发酵3天。采用滚筒烘干设备烘干，温度70-80℃，得棕榈粕发酵物。

对比例3

将水40份、糖蜜3.5份、复合酶0.2份于菌液罐中混合，制成菌液；输入生产配方，单次投入已粉碎的棕榈粕52份、麸皮4份，进入混合仓混合，同时将菌液喷入混合仓，混合130s左右下料，物料进入发酵箱。循环四次，发酵箱物料装载量为3-4吨，盖上薄膜，自然升温，物料升温至45-50℃时维持平衡，发酵3天后下料，采用带有内膜的吨袋打包，将袋口扎紧，放置室温发酵3天。采用滚筒烘干设备烘干，温度70-80℃，得棕榈粕发酵物。

对比例4

将水40份、糖蜜3.5份、复合菌0.2份于菌液罐中混合，制成菌液；输入生产配方，单次投入已粉碎的棕榈粕52份、麸皮4份，进入混合仓混合，同时将菌液喷入混合仓，混合130s左右下料，物料进入发酵箱。循环四次，发酵箱物料装载量为3-4吨，盖上薄膜，自然升温，物料升温至45-50℃时维持平衡，发酵3天后下料，采用带有内膜的吨袋打包，将袋口扎紧，放置室温发酵3天。采用滚筒烘干设备烘干，温度70-80℃，得棕榈粕发酵物。

对比例5

将水40份、糖蜜3.5份、复合菌0.2份、复合酶0.2份于菌液罐中混合，制成菌液；输入生产配方，单次投入已粉碎的棕榈粕52份、麸皮4份，进入混合仓混合，同时将菌液喷入混合仓，混合130s左右下料，物料进入发酵箱。循环四次，发酵箱物料装载量为3-4吨，盖上薄膜，自然升温，物料升温至45-50℃时维持平衡，发酵3天后下料，采用滚筒烘干设备烘干，温度70-80℃，得棕榈粕发酵物。

对比例6

将水40份、糖蜜3.5份、复合菌0.2份、复合酶0.2份于菌液罐中混合，制成菌液；输入生产配方，单次投入已粉碎的棕榈粕52份、麸皮4份，进入混合仓混合，同时将菌液喷入混合仓，混合130s左右下料，物料采用带有内膜的吨袋打包，将袋口扎紧，放置室温发酵3天。采用滚筒烘干设备烘干，温度70-80℃，得棕榈粕发酵物。

对对比例1-6所制备得到的棕榈粕发酵物进行相关参数指标测试，测试结果如表2所示。

综上，对比例1-4为以实施例2为对照，分别缺少糖蜜、麸皮、复合菌和复合酶，验证其对棕榈粕发酵物的影响，将酸度和寡糖浓度大小进行排序，酸度为：对比例1＞对比例2＞对比例4＞对比例3；寡糖为：对比例1＞对比例2＞对比例3＞对比例4。由实验结果可知，复合菌和复合酶对发酵效果的影响最大，其中对比例3不添加复合菌酸度最低，由于缺少微生物代谢产热提高物料温度，复合酶活性受影响，棕榈粕发酵物寡糖浓度偏低，发酵期间还出现长霉现象；对比例4不添加复合酶寡糖含量最低，棕榈粕中大分子物质无法被有效酶解导致微生物利用困难，发酵酸度也不高。对比例2由于没有添加麸皮，其粗蛋白含量低于其他几组，对比例3和对比例4粗蛋白含量相差不大，而对比例1粗蛋白、酸度和寡糖含量均最高，说明所选四个影响因素，糖蜜对棕榈粕发酵物的影响最小。

对比例5-6为以实施例2为对照，分别只进行高温酶解和常温发酵过程。由实验结果可知，对比例5只在发酵车厢进行3天高温酶解过程，其寡糖浓度基本达到对照（实施例2）水平，由于没有常温菌体发酵过程，其酸度明显低于对照，粗蛋白含量也略低于对照，而只进行常温发酵3天（对比例6）的棕榈粕由于复合酶活性不够，寡糖含量只有7.81%，由于酶解效果不好，大分子物质降解不足，菌体缺少营养，导致微生物发酵产酸不高，其酸度和粗蛋白均低于对比例5。

由上述结果可知，复合菌和复合酶是棕榈粕发酵的基础，高温酶解，低温发酵的工艺体系是保证棕榈粕发酵成功的关键。

此外，本申请在前期研发过程中，对棕榈粕酶解初步研究如下：

酶解方法：培养基组成：棕榈粕，水。酶解温度：45℃；酶添加量：甘露聚糖酶：1%，纤维素酶：0.5%，水分50%。称取甘露聚糖酶和纤维素酶加入盛有蒸馏水的三角瓶中，于摇床上180r/min震荡培养5min，使其充分混匀，倒入称量好的棕榈粕中，充分混合，置于45℃培养箱中培养。

寡糖检测：定时取样测定酶解过程还原糖变化：取棕榈粕酶解样品105℃烘干测水分，取烘干后样品10g加入90 mL水中，加入玻璃珠20g，摇床振荡15 min，取上清液，采用DNS法检测还原糖含量。

在45℃条件下进行了棕榈粕酶解实验，实验结果如图1所示，由于棕榈粕中甘露聚糖等非淀粉多糖转化为甘露寡糖后可溶于水，同时具有还原性末端，所以通过检测还原糖浓度来指示甘露寡糖的浓度变化，初始浓度为22.62g/L，25h为76.37g/L，浓度提高了2.38倍。假设还原糖浓度提高全部来自甘露聚糖，则理论上甘露聚糖降解率为20.5%。

（1）纤维素酶在棕榈粕酶解中的作用：

酶添加组合：

1组：只添加β-甘露聚糖酶；2组：添加纤维素酶和β-甘露聚糖酶；3组：只添加纤维素酶。在酶解0、4、9、18、31、37、47h时对三组实验分别取样，用自封袋分装，测定其中甘露寡糖含量。

寡糖浓度随酶解时间变化如图2所示。实验组3只添加纤维素酶的酶解实验其甘露寡糖浓度在初始浓度上下波动，没有明显增加；实验组1只添加甘露聚糖酶，其甘露寡糖浓度随酶解时间逐渐升高，47h时甘露寡糖含量为21.92%；实验组2同时添加纤维素酶和甘露聚糖酶，47h其甘露寡糖含量为27.89%，高于实验组1，说明纤维素酶对甘露聚糖酶酶解棕榈粕有促进作用。

根据资料显示，棕榈粕初始甘露寡糖含量为3.16%，其甘露聚糖含量为35-38%，以此计算甘露聚糖降解率为68.13%-73.97%。

结论：

1.通过不同酶对棕榈粕酶解的研究，发现添加纤维素酶不会增加还原糖浓度，说明棕榈粕中纤维素没有被酶解为小分子物质，可以将还原糖增加归结到甘露聚糖酶解为甘露寡糖；

2.纤维素酶将棕榈粕中缠绕的大分子纤维素断开，使得甘露聚糖酶与甘露聚糖接触更加充分，甘露聚糖降解率较未添加纤维素酶提高了27%；

3.若棕榈粕初始甘露寡糖含量以3.16%计算，其甘露聚糖含量为35-38%，以此计算甘露聚糖降解率为68.13%-73.97%。

（2）木聚糖等多糖酶对棕榈粕酶解效果的影响：

不同多糖酶对棕榈粕酶解效果的影响

酶添加剂组合：1组：木聚糖酶（0.2%）；2组：纤维素酶（0.5%）+木聚糖酶（0.2%）；3组：β-甘露聚糖酶（1%）+木聚糖酶（0.2%）；4组：β-甘露聚糖酶（1%）+葡聚糖酶（0.2%）；5组：β-甘露聚糖酶（1%）+半乳糖苷酶（0.2%）；6组：β-甘露聚糖酶（1%）+植酸酶（0.2%）。

不同多糖酶对棕榈粕酶解效果的影响如图3所示。由图3可知，木聚糖酶，纤维素酶和葡聚糖酶对甘露聚糖酶酶解棕榈粕具有明显促进作用，半乳糖苷酶和植酸酶对甘露聚糖酶酶解棕榈粕无作用。

（3）木聚糖酶在棕榈粕酶解中的作用

为进一步研究木聚糖酶在棕榈粕酶解中的作用，进行了木聚糖酶酶解的一系列实验，实验结果如图4所示，木聚糖酶单独作用于棕榈粕时，无法起到酶解作用，当其与纤维素酶或甘露聚糖酶共同作用时，能将棕榈粕中一部分大分子多糖转化为还原糖，说明木聚糖酶在纤维素酶或甘露聚糖酶等将大分子断开后，才能与棕榈粕中木聚糖充分接触进行酶解。

甘露聚糖酶、纤维素酶和木聚糖酶共同作用时，还原糖浓度最高，说明甘露聚糖酶、纤维素酶和木聚糖酶对棕榈粕多糖的酶解具有协同作用。葡聚糖酶能打开棕榈粕中甘露聚糖侧链，进一步提高发酵棕榈粕寡糖含量。

（4）复合酶配比正交优化实验

β-甘露聚糖酶、纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、酸性植酸酶、脂肪酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。

为提高发酵棕榈粕寡糖含量，节约生产成本，通过4因素3水平的正交试验，对β-甘露聚糖酶、纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶四种酶进行配比优化。

正交实验结果如上表所示，甘露聚糖酶的极差达到了65，说明甘露聚糖酶对棕榈粕酶解影响最大，β-甘露聚糖酶添加量为水平3时寡糖浓度最高，添加量为水平2时寡糖浓度低于水平3，但显著高于水平1，为节约成本，保证棕榈粕酶解效果，选择β-甘露聚糖酶添加量为水平2；纤维素酶的极差为21，虽然棕榈粕中纤维素含量并不高，但纤维素酶通过对纤维素的酶解，将甘露聚糖暴露出来，促进了甘露聚糖的酶解，选择纤维素酶为水平2；木聚糖酶和β-葡聚糖酶不同添加量对棕榈粕寡糖浓度影响较小，选择木聚糖酶添加量为水平1，β-葡聚糖酶添加量为水平1。

确定β-甘露聚糖酶、纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶配比为5:3:1:1，此配比为复合酶A。

（5）不同温度对棕榈粕酶解效果的影响

1组：培养温度30℃；2组：培养温度35℃；3组：培养温度40℃；4组：培养温度45℃；5组：培养温度50℃，复合酶A的添加量为0.1%。在酶解0、18、46、65、78、91h时对三组实验分别取样，用自封袋分装，测定其中寡糖含量。

对棕榈粕酶解进行了0h-91h寡糖浓度变化的跟踪检测，实验结果如图5所示，30℃-45℃温度梯度条件下寡糖浓度随酶解温度逐渐升高，说明30℃-45℃时温度能显著影响酶活大小，当酶解温度在45℃-50℃时，寡糖浓度相差不大，说明这个温度梯度对复合酶活力影响较小，查文献可知，甘露聚糖酶和纤维素酶等酶的最适酶活力温度为45℃-50℃，确定后续生产酶解温度为45℃-50℃。

在没有接入微生物菌剂的情况下，45℃-50℃酶解24h寡糖浓度为24%左右，酶解48h寡糖浓度能达到31%左右。实际生产过程中，高温酶解阶段发酵棕榈粕物料温度应至少24h保持在45℃以上，寡糖浓度才能达到20%以上。

（6）不同水分对棕榈粕酶解效果的影响

1组：含水量40%；2组：含水量42.5%；3组：含水量45%；4组：含水量47.5%；5组：含水量50%。复合酶A添加量为0.1%，温度为50℃。

不同水分条件下，寡糖浓度随酶解时间变化如图6所示。由图6可知，不同水分对棕榈粕酶解效果的影响有显著差异，随着酶解时间延长，这种差异越加明显，但水分过高会影响菌体生长，增加烘干成本，结合以往发酵经验，选择棕榈粕初始含水量为45%。

（7）植酸酶、脂肪酶、复合蛋白酶的添加量实验

脂肪酶可有效降低脂肪酸的分子量，降低其发生酸败的风险，同时长链脂肪酸分解后产生的甘油和短链脂肪酸能够给微生物生长提供营养，通过对甘油含量的检测可知道脂肪酶解程度。在复合酶A的基础上额外添加脂肪酶，研究不同脂肪酶添加量对棕榈粕中粗脂肪的酶解效果，采用甘油分析试剂盒（比色法）检测酶解后甘油含量。实验结果如图7所示。

脂肪酶添加量梯度为0%、0.01%、0.02%、0.03%和0.4%共5个梯度，酶解温度为50℃，脂肪酶添加量为0%-0.04%时，甘油浓度随脂肪酶添加量增加逐渐增加。考虑生产成本，选择0.03%作为复合酶配比，β-甘露聚糖酶、纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶和脂肪酶配比为5:3:1:1:3。

蛋白酶主要有酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶三种，其中碱性蛋白酶最便宜，本次采用碱性蛋白酶与中性蛋白酶1:1进行复配，形成复合蛋白酶，总酶活20万，进行0.01%、0.03%和0.05%三个浓度梯度的酶解实验，研究其对棕榈粕中粗蛋白的酶解效果，酶解温度45℃。

实验结果如图8所示，酸溶蛋白含量在0-12h快速上升，12h后酶解效率显著降低。当添加量为0.05%时，复合酶在0-12h酶解效率更高，36h酸溶蛋白含量为23.15%，添加量为0.03%时，36h酸溶蛋白含量为21.71%，添加量为0.01%时，0-12h酶解效率虽然不高，但后续仍在持续酶解，36h酸溶蛋白含量为20.16%，只比0.05%添加量实验组少了12.9%，具有明显的成本优势，后续复合蛋白酶添加量选择0.01%。β-甘露聚糖酶、纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、脂肪酶和复合蛋白酶配比为5:3:1:1:3:1。

棕榈粕中植酸含量不高，根据经验，酸性植酸酶添加量为0.005%。β-甘露聚糖酶、纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、脂肪酶、复合蛋白酶和植酸酶添加量分别为0.05%、0.03%、0.01%、0.01%、0.03%、0.01%和0.005%，此配比为复合酶B。

（8）复合酶添加量

为进一步研究复合酶B对棕榈粕的酶解效果，进行复合酶B不同添加量浓度梯度酶解实验，酶解温度45℃，初始水分45%，酶解时间24h，实验结果如图9所示。

由实验结果可知，复合酶能有效分解棕榈粕中多聚糖，其寡糖浓度随复合酶添加量增加而逐步增加，当复合酶添加量为0.15%时，酶解24h棕榈粕寡糖浓度为22.9%，基本满足生产需求，当复合酶添加量为0.25%时，酶解24h棕榈粕寡糖浓度为26.1%，酶解率达到75%以上，但相应的生产成本也更高；选择复合酶B添加量为0.15%-0.25%。

对优化后复合酶进行棕榈粕酶解效果验证，将水40份、糖蜜3.5份、复合菌0.2份、复合酶0.2份于菌液罐中混合，制成菌液；输入生产配方，单次投入已粉碎的棕榈粕52份、麸皮4份，进入混合仓混合，同时将菌液喷入混合仓，混合130s左右下料，物料进入发酵箱。循环四次，发酵箱物料装载量为3-4吨，盖上薄膜，自然升温，物料升温至45-50℃时维持平衡，发酵3天后下料，采用带有内膜的吨袋打包，将袋口扎紧，放置室温发酵3天。采用滚筒烘干设备烘干，温度70-80℃，得棕榈粕发酵物。

其中实验组复合酶为复合酶B，对照组只添加甘露寡糖，结果如下表5所示：

通过对复合酶配比优化，与只添加甘露寡糖相比，寡糖浓度增加了50.46%，效果显著。

进一步，本申请在前期研发过程中，还对菌株进行了筛选试验：

从土壤中收集粪肠球菌样品，选择其中耐高温性能最好的作为棕榈粕发酵菌剂。采用稀释涂布平板法进行耐高温性能的筛选，实验组培养温度为45℃和50℃，对照组在菌株最适温度条件下培养。

粪肠球菌耐高温性能筛选：采用稀释涂布平板法将菌粉进行稀释涂布，平板培养基为MRS琼脂培养基，将涂布的平板分为3组，每组3个平行，涂布完成后将对照组放入37℃培养，实验组1放入45℃培养，实验组2放入50℃培养。2天后观察菌落情况并计数。实验结果如下表6所示。

MRS液体培养基：牛肉膏1%，酵母粉0.5%，蛋白胨1%，葡萄糖2%，磷酸氢二钾0.2%，醋酸钠0.5%，硫酸镁0.02%，硫酸锰0.005%，吐温80 0.1%，柠檬酸氢二铵0.2%，调pH7.2。

MRS琼脂培养基：MRS液体培养基加1.5%琼脂。

（1）耐温性能检验

选择在50℃存活率较高的粪肠球菌ef-1，ef-4和ef-5，采用MRS液体培养基在不同温度下进行粪肠球菌发酵培养，三角瓶容量250ml，装液量200ml，静置培养，培养温度：对照组37℃，实验组50℃。每3h取样测OD600，结果如下所示：粪肠球菌ef-4在50℃培养18h，OD600为对照的97%，说明50℃高温基本不影响其生长。实验结果如图10所示。

（2）产甘露聚糖酶枯草芽孢杆菌筛选

在魔芋种植园取回4份土样，进行富集和筛选。

富集培养基：魔芋精粉2%、酵母膏0.2%、蛋白胨0.2%、氯化钠0.5%，pH自然。筛选培养基：魔芋精粉2%、蛋白胨0.5%、琼脂粉1.5%、NH₄SO₄ 0.05%、Mg SO₄·7H₂O 0.02%、K₂HPO₄·3H₂O 0.1%，pH 7.0～7.2。发酵培养基：魔芋精粉0.5%、蛋白胨0.5%、KH₂PO₄ 0.1%，MgSO₄0.01%，pH 6.0。

37℃恒温箱中倒置培养24h，在平板上倒一层刚果红水溶液，然后将染液弃掉，检测菌落周围是否产生水解圈及其大小，作为产β-甘露聚糖酶的检测标准。

为筛选出一株产甘露聚糖酶的芽孢杆菌，对土样样品进行了富集和筛选，根据菌落形态挑选芽孢杆菌进行水解圈点样实验，共筛选60个芽孢杆菌菌落，编号为XW3060-XW3120，得到4株具有明显甘露聚糖酶水解圈的菌株。

酶活测定

挑取单菌落接种在发酵培养基中，250mL三角瓶装液量100mL，37℃、180rpm条件下培养24h，离心取上清液，得粗酶液。β-甘露聚糖酶活性分析以槐豆胶为底物，反应混合溶液中含有1mL用0.05mol/L、pH6.4的磷酸盐缓冲溶液配制的槐豆胶溶液(10mg/mL)和1mL经适当稀释的酶液，混匀后于40℃保温反应20min，然后用3，5-二硝基水杨酸(DNS)法测定反应中产生的还原糖。

酶活力单位定义：在上述测定条件下，每分钟分解底物释放1μmol还原糖(相当于甘露糖)所需的酶量为1个酶活力单位(U)。检测结果如下表7所示。

4株菌发酵后甘露聚糖酶活力检测结果所示，XW3101菌株酶活力最高，为203 U/mL，其酶活力水解圈如图11所示。

（3）凝结芽孢杆菌产酸菌株筛选

初筛

平板筛选培养基制备：MRS固体培养基灭菌后，按2%比例加入10%浓度的碳酸钙，摇匀，倒平板；凝结芽孢杆菌活化：取单菌落接种于250ml三角瓶装液量100ml的MRS液体培养基中，置于45℃培养箱48h；平板点样：采用接种针将活化后的凝结芽孢杆菌发酵液在筛选培养基平板上点样4个；置于45℃培养箱中培养48h，观察溶钙圈大小，以水解圈直径/菌落直径表示菌株产酸能力，结果如图12所示。

复筛

将初筛后水解圈直径比大于5的凝结芽孢杆菌进行复筛。取单菌落接种于250ml三角瓶装液量100ml的MRS液体培养基中，置于45℃培养箱48h；将发酵液5000r/min离心5min，取上清液，稀释至适当浓度后，用生物传感仪测定乳酸含量，结果如图13所示。

液体发酵复筛结果与平板点样结果基本一致，所选5株凝结芽孢杆菌都具有较强的产乳酸能力，其中bc-4产乳酸能力最强。

（4）复合菌的配比优化

通过对棕榈粕酶解优化研究，确定了复合酶的配比，在此基础上，进行棕榈粕发酵试验，研究不同菌剂添加量对棕榈粕发酵效果的影响。

发酵产酸条件优化

以棕榈粕原料为发酵底物，进行发酵棕榈粕产酸研究。复合酶B添加量0.145%，发酵水分45%，发酵温度37℃，采用厌氧呼吸袋打包进行发酵，发酵时间3d。

所选粪肠球菌ef-4和凝结芽孢杆菌bc-4生长速度、耐温性能和产酸性能等菌种特性有较大差异，需要对其在菌种配比和菌剂添加量两方面进行优化，棕榈粕原料中微生物可利用营养物质较少，发酵前期需要补充麸皮和糖蜜等营养物质。对乳酸菌菌种配比、菌剂添加量、麸皮添加量和糖蜜添加量4个因素进行4因素3水平的正交实验，不同水平添加量如下表8所示：

正交实验结果如上表9所示，复合乳酸菌添加量和麸皮添加量对棕榈粕发酵产酸影响显著，根据实验结果，选择最优添加量为：粪肠球菌ef-4和凝结芽孢杆菌bc-4配比为水平2、复合乳酸菌添加量为水平3、麸皮添加量为水平3、糖蜜添加量为水平2，此为发酵方案1。

发酵方案1配比：复合乳酸菌添加量0.03%（粪肠球菌ef-4与凝结芽孢杆菌bc-4配比1:2）、麸皮添加量5%、糖蜜添加量2%，按此条件进行棕榈粕厌氧发酵3d，酸度为1.38%，好于预期。

芽孢杆菌添加量研究

在发酵方案1的基础上，以酶解后棕榈粕为发酵底物，芽孢杆菌添加量为优化条件，进行棕榈粕发酵寡糖变化情况研究，芽孢杆菌接种量为0%、0.1%、0.2%、0.3%和0.4%，培养温度37℃，发酵时间3-6天，复合酶B添加量0.145%，

寡糖含量随芽孢杆菌添加量变化情况如图14所示，其中初始寡糖浓度为24.16%，发酵3天后，只添加乳酸菌发酵时，寡糖浓度降低3%，说明菌体产酸会消耗棕榈粕中寡糖，当芽孢杆菌接种量大于0.2%时，6天后寡糖浓度出现回升，说明3-6天时间段内寡糖积累量大于消耗量，当芽孢杆菌接种量大于0.3%时，发酵6天后寡糖浓度相比初始寡糖浓度提高了0.31%，说明接种芽孢杆菌后，产生的甘露聚糖酶通过分解甘露聚糖，补充菌体产酸消耗的寡糖，起到了维持发酵棕榈粕寡糖浓度的作用。确定芽孢杆菌添加量为0.3%。

菌剂配比：复合乳酸菌：0.02%（粪肠球菌ef-4与凝结芽孢杆菌bc-4配比1:2），芽孢杆菌：0.3%，此为复合菌A。

发酵产热条件优化

固态发酵初始阶段主要依靠酵母菌和芽孢杆菌发酵产热，在枯草芽孢杆菌添加量一定的情况下，以酿酒酵母添加量为优化条件，进行棕榈粕固态发酵产热情况研究，堆体体积0.5m³，温度为堆体中心向下20cm处。复合酶B添加量0.145%，复合菌A添加量为0.32%，麸皮添加量3%，糖蜜添加量2%。酿酒酵母添加量分别为0%、0.01%、0.03%、0.05%和0.07%。检测了不同酵母菌添加量情况下，0-24h堆体温度随发酵时间变化曲线。

实验结果如图15所示，添加酿酒酵母能显著促进0-24h堆体温度的上升，其中酿酒酵母添加量为0.03%时，堆体温度在21h达到45℃，满足工艺要求，选择酿酒酵母添加量为0.03%。

菌剂配比：复合乳酸菌：0.02%（粪肠球菌ef-4与凝结芽孢杆菌配比1:2），芽孢杆菌：0.3%，酿酒酵母：0.03%，此为复合菌B，添加量为0.35%。

（5）发酵棕榈粕生产小试

为验证复合菌和复合酶配比在棕榈粕中的发酵效果，进行车厢发酵生产小试，车厢装载量3.5吨，初始水分45%，麸皮添加量3%、糖蜜添加量2%、复合酶B添加量0.15%、复合菌B添加量0.35%为基础，进行发酵棕榈粕生产小试。

发酵棕榈粕生产实验地址为广东省江门市新会区，分别收集7月和12月的棕榈粕发酵相关指标，7月份自来水水温35℃，发酵初始温度37-38℃；12月份自来水水温20℃（温度太低可适当加热），发酵初始温度25-26℃。车厢内物料温度随发酵时间变化情况如图16所示，7月份时物料在发酵20h即达到45℃，48h后一直维持在50℃；12月份时物料在发酵42h才达到45℃，之后一直维持在46℃。

7月和12月的棕榈粕发酵寡糖浓度变化如图17所示：夏季气温高，物料升温快，前期微生物代谢产热大量利用碳源，寡糖浓度呈现下降趋势，24h后物料核心区域温度达到45℃，菌体代谢被部分抑制，同时温度升高复合酶活性增强，寡糖开始快速积累，68h寡糖浓度达到26.5%，12月份气温相对较低，热交换损耗大，菌体代谢积蓄热量时间长，43h后寡糖浓度才逐步升高，发酵72h时，寡糖浓度为20%左右，已达到目标浓度，若要保持和7月份相同寡糖浓度，则需要将发酵时间延长至96h，此时寡糖浓度为26.1%。

按照高温酶解3d，低温发酵3d的工艺，7月和12月的棕榈粕发酵酸度变化如图18所示：低温发酵阶段酸度均显著提高，由于气温等因素，其中7月份酸度积累高于12月份，整体酸度都在3.0%以上，可保证全年棕榈粕发酵产品质量的稳定性。

为进一步研究所筛选枯草芽孢杆菌在棕榈粕发酵体系中的作用，进行生产小试验证（实施例2），将水40份、糖蜜3.5份、复合菌0.2份、复合酶0.2份于菌液罐中混合，制成菌液；输入生产配方，单次投入已粉碎的棕榈粕52份、麸皮4份，进入混合仓混合，同时将菌液喷入混合仓，混合130s左右下料，物料进入发酵箱。循环四次，发酵箱物料装载量为3-4吨，盖上薄膜，自然升温，物料升温至45-50℃时维持平衡，发酵3天后下料，采用带有内膜的吨袋打包，将袋口扎紧，放置室温发酵3天。采用滚筒烘干设备烘干，温度70-80℃，得棕榈粕发酵物。

其中实验组复合菌为复合菌B，对照组添加除枯草芽孢杆菌外的所有菌剂，甘露寡糖，结果如下表10所示：

通过筛选产甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌进行棕榈粕发酵，与不添加枯草芽孢杆菌相比，寡糖浓度增加了14.46%，说明所筛选枯草芽孢杆菌在棕榈粕生产过程中能有效促进甘露聚糖的降解。

因此，确定棕榈粕发酵工艺为：复合酶添加量0.15%、复合菌添加量0.35%、麸皮添加量3%、糖蜜添加量2%，初始水分45%。其中复合酶中β-甘露聚糖酶、纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、脂肪酶、复合蛋白酶和酸性植酸酶配比为5:3:1:1:3:1:0.5；添加量为0.15%-0.25%。复合菌添加量配比：复合乳酸菌：0.02%（粪肠球菌ef-4与凝结芽孢杆菌配比1:2），芽孢杆菌：0.3%，酿酒酵母：0.03%，添加量为0.35%。

综上，本申请的有益效果是：

1、通过筛选有甘露聚糖酶活性的枯草芽孢杆菌，作为复合酶酶解棕榈粕的补充，加入复合菌剂中。以添加没有甘露聚糖酶活性的枯草芽孢杆菌为对照，发现添加有甘露聚糖酶活性的枯草芽孢杆菌后，高温酶解期间寡糖浓度提高了10%，常温厌氧发酵期间，对照组寡糖浓度由于菌体消耗出现下降，而添加枯草芽孢杆菌后寡糖浓度没有下降。

2、棕榈粕中抗营养因子主要是甘露聚糖和纤维素，根据甘露聚糖酶、纤维素酶酶活的最适温度和菌体的高温耐受性，发酵过程最高温度不宜超过50℃。通过调整各菌种添加量，确定发酵箱温度在45-50℃即可达到产热与散热的平衡，保证了棕榈粕发酵效果。

3、采用厌氧呼吸袋在常温条件下进行发酵，5-d后酸度只有1.0%-1.5%，而经过高温酶解，低温发酵的工艺流程后，5-6d酸度达到2.5%-3.0%。说明高温酶解过程中，棕榈粕中纤维素和甘露聚糖等大分子物质被降解，更容易被菌体利用，代谢产物丰富。

4、棕榈粕发酵存在抗营养因子难分解，菌体难发酵的问题，如何控制成本，提高棕榈粕发酵效果，是棕榈粕发酵物能否推广的关键。本申请通过菌酶协同发酵技术，建立棕榈粕高温酶解，低温发酵的生产工艺，基于固态发酵工艺对复合菌和复合酶进行定向筛选，使得棕榈粕抗营养因子得到充分酶解。所筛选的复合菌与复合酶配比与棕榈粕生产工艺高度契合，酶解更彻底，有效节约成本，提高生产效率。

测试例

本实验实例7-10月在中山市草鱼养殖场进行，分为3个实验组，每组2个鱼塘，共选择6个鱼塘进行草鱼投喂实验，每口塘6亩左右，初始鱼苗2万尾，平均重0.28斤/尾。草鱼全价原料包括麸皮、豆粕、菜籽粕等成分，粗蛋白含量28%。对照组投喂草鱼全价原料，试验组是在对照组草鱼配合原料基础上，实验组1将棕榈粕发酵物按照5％比例替代原料配方中3％麸皮0.5％豆粕1.5％菜籽饼；实验组2将棕榈粕发酵物按照10％比例替代原配方中6％麸皮1％豆粕3％菜籽饼。制成草鱼配合实验料，进行60-70天投喂试验。试验结果见下表11。

由表11可知，原料中添加棕榈粕发酵物后，每尾平均投料量明显提高，说明棕榈粕发酵物可以促进草鱼摄食；同时，添加棕榈粕发酵物可提高草鱼肥满度，其中棕榈粕发酵物添加10%对肥满度的促进效果最明显，1斤左右草鱼饵料系数1.25%，低于对照组1.33%。

实验结果表明，棕榈粕通过发酵后，粗蛋白和酸溶蛋白含量均明显提高，酸度和寡糖含量也显著增加，营养价值丰富，可以将其在草鱼配合原料中的添加量增加至10%而不产生任何负面效果，节约了原料成本，另外，添加发酵棕榈粕后，提高了草鱼原料的诱食效果，草鱼摄食量和肥满度均明显提高，饵料系数低于对照，可以为养殖户带来明显的经济价值。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种微生物发酵剂，其特征在于，所述微生物发酵剂包括质量比为（1-3）:（3-6）:（2-5）:（1-4）的粪肠球菌、凝结芽孢杆菌、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌；其中，所述凝结芽孢杆菌的菌株保藏编号为CCTCC NO：M 2022228，所述粪肠球菌的菌株保藏编号为CCTCC NO：M2022227，所述枯草芽孢杆菌的菌株保藏编号为CCTCC NO：M 2022226。

2.根据权利要求1所述的微生物发酵剂，其特征在于，所述微生物发酵剂还包括复合酶；由所述粪肠球菌、凝结芽孢杆菌、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌组成的复合菌以及所述复合酶的质量比为（0.1-0.3）:（0.1-0.3）。

3.根据权利要求2所述的微生物发酵剂，其特征在于，所述复合酶包括β-甘露聚糖酶、纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、脂肪酶、复合蛋白酶和植酸酶。

4.根据权利要求3所述的微生物发酵剂，其特征在于，所述β-甘露聚糖酶、纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、脂肪酶、复合蛋白酶、植酸酶的质量比为（3-6）:（2-5）:（1-3）:（1-3）:（2-4）:（1-4）:（1-3）。

5.根据权利要求4所述的微生物发酵剂，其特征在于，所述复合蛋白酶是由质量比为（1-3）:（2-5）的碱性蛋白酶和中性蛋白酶复配而成。

6.根据权利要求1所述的微生物发酵剂，其特征在于，所述粪肠球菌的菌数为1×10⁸ -1×10¹⁰ CFU/g，所述凝结芽孢杆菌的菌数为1×10⁷ -1×10⁹ CFU/g，所述酿酒酵母的菌数为1×10⁷ -1×10⁹ CFU/g，所述枯草芽孢杆菌的菌数为1×10⁸ -1×10¹⁰ CFU/g。

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