CN114828864A - 蛋类过敏的预防剂等和含有其的食品组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供能够预防或治疗婴幼儿的蛋类过敏的有效性和安全性高的手段。本发明的用于预防或治疗蛋类过敏的经口免疫耐受剂或食品组合物含有加热变性蛋清的利用天冬氨酸蛋白酶(例如胃蛋白酶)或金属蛋白酶(例如嗜热菌蛋白酶)的分解产物。

Description

蛋类过敏的预防剂等和含有其的食品组合物
技术领域
本发明涉及能够用于预防和治疗蛋类过敏的经口免疫耐受剂和含有其的食品组合物。
背景技术
食物过敏患者中，婴幼儿占绝大多数，其中蛋类(鸡蛋)过敏对于婴幼儿而言是患病率高的食物过敏之一。婴幼儿的食物过敏原因已经研究了很多年，报道了若患有特应性皮炎则容易被食物致敏(非专利文献1)，被指出了皮肤屏障功能的障碍和抗原的经皮侵入成为食物过敏的原因之一的可能性(非专利文献2)。还有如下报道：鸡蛋过敏原从所有的儿童床都能被检测到，其量显著多于螨虫过敏原(非专利文献3)，由于鸡蛋过敏原在环境中到处都存在，因此存在婴幼儿的蛋类过敏患者也增加的可能性。
为了预防蛋类过敏，在治疗特应性皮炎以防止过敏原从炎症皮肤处侵入方面，启示了从例如出生后6个月等早期少量食用加热的全蛋的方法的有效性(非专利文献4～6)。但是，也有出生后6个月内已被蛋类致敏(体内已出现蛋类的抗体)的婴幼儿，在摄取生蛋粉末的临床试验中常常发生过敏性休克(非专利文献7)，另外，据报道，即使是加热蛋类(加热蛋黄或加热蛋清)也未必安全，发生过敏反应的婴幼儿也较多(非专利文献8)。
作为用于预防或治疗蛋类过敏的更具体的方法，例如提出了如下所述的方法。
非专利文献9中记载了，在蛋清致敏之前，在一定期间对小鼠经口给予未加热卵白蛋白的胃蛋白酶分解产物，由此可抑制给予蛋清时的过敏性休克。但是，非专利文献9的方法仅教导通过经口免疫耐受能够预防由未加热卵白蛋白或含有其的未加热蛋清或全蛋(生蛋)引起的过敏。非专利文献9中没有记载用于预防由加热蛋清、特别是其中包含的即使加热也不易丧失过敏原性的卵类粘蛋白引起的过敏的方法。
专利文献1记载了下述发明：“一种天然过敏原的纯化提取物的制造方法，其包括下述步骤：a)提取含有过敏原蛋白的过敏原的天然源，生成提取物；b)纯化上述提取物，除去非蛋白质成分，生成纯化提取物；c)使上述纯化提取物变性，生成纯化变性提取物，上述纯化变性提取物含有蛋白质，共同构成总蛋白质的至少60％(w/w)的最丰富的(w/w)蛋白质组为至少2种蛋白质，总蛋白质相当于上述纯化变性提取物的干燥重量的至少60％(w/w)。”(权利要求1)；“一种天然过敏原的纯化提取物的制造方法，其包括下述步骤：a)水解变性过敏原而生成过敏原水解物；b)纯化上述过敏原水解物，除去具有超过10000Da的分子量的肽和具有小于1000Da的分子量的肽，得到70％、更优选80％的肽为10000Da～1000Da的纯化水解物。”(权利要求8)。还记载了该发明中的“水解”优选使用“胃蛋白酶、胰蛋白酶或糜蛋白酶”进行等。另外还记载了“在水解之前使未变性过敏原变性而生成变性过敏原”、该变性“在离液剂、还原剂和这些的混合物存在下进行”等。此外，还记载了通过这样的方法得到的“天然过敏原的纯化变性提取物”和“纯化过敏原水解物”可用于“制备用于诱导免疫耐受的药物组合物和/或食品组合物”、“免疫耐受的诱导可用于治疗或预防过敏反应”。作为“过敏原”，在多种食品之中还例示出“蛋类过敏原”。但是，专利文献1中，关于蛋类过敏原的实施方式并未记载一般性记载以外的事项，也没有以实施例形式公开。特别是，作为蛋类过敏原，不是提取例如蛋清中所含的卵白蛋白、卵类粘蛋白等并纯化来使用，而是将蛋清整体通过加热使其变性后使用，对此以及由此发挥的作用效果也没有记载和教导。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表2010-504278号公报
非专利文献
非专利文献1：Flohr et al.J Invest Dermatol.2014Feb；134(2):345-350.doi:10.1038/jid.2013.298.Epub 2013Jul 18.
非专利文献2：Kubo etal.J Clin Invest.2012Feb；122(2):440-7.doi:10.1172/JCI57416.Epub 2012Feb 1.
非专利文献3：Kitagawa H et al.Allergology Int.2019
非专利文献4：福家等.鶏卵アレルギー発症予防に関する提言(关于预防鸡蛋过敏发病的建议).2017
非专利文献5：Natsume et al.Lancet.2017Jan21；389(10066):276-286.doi:10.1016/S0140-6736(16)31418-0.Epub 2016Dec 9.
非专利文献6：du Toitet al.J Allergy Clin Immunol.2018Apr；141(4):1343-1353.doi:10.1016/j.jaci.2017.09.034.Epub 2017Oct 31.
非专利文献7：Matsumotoet al.J Allergy Clin Immunol.2018Jun；141(6):1997-2001.e3.doi:10.1016/j.jaci.2018.02.033.Epub2018 Mar 6.
非专利文献8：池松等,アレルギー(过敏),55(5),p.533-541,2006.
非专利文献9：Lozano-Ojalvo et al.,Clin Exp Allergy,47(10),p.1342-1354,2017.
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的课题在于，提供能够预防或治疗婴幼儿的蛋类过敏的、与以往相比有效性高、危险性低的手段。
用于解决问题的方法
本发明人发现，仅将蛋类中的蛋清加热变性后用特定的食品用蛋白分解酶处理而得到的产物(本说明书中称为“PEW”(protease-digested egg white，经蛋白酶消化的蛋清))在经口摄取时能够预防蛋类过敏、特别是蛋清中所含的卵类粘蛋白和卵白蛋白所致的过敏，并且即使皮肤屏障功能受损也不易发生经皮致敏，能够作为兼顾高有效性和低危险性的制剂来使用，从而完成了本发明。特别是，胃蛋白酶等天冬氨酸蛋白酶和嗜热菌蛋白酶(例如“サモアーゼ(注册商标)PC10F”)等金属蛋白酶与丝氨酸蛋白酶等其他各种食品用蛋白分解酶相比，在经口摄取时预防蛋类过敏等的效果的稳定性优良，对于本发明而言是优选的食品用蛋白分解酶。
即，本发明包括以下事项。
[1]
一种用于预防或治疗蛋类过敏的经口免疫耐受剂，其含有加热变性蛋清的利用天冬氨酸蛋白酶或金属蛋白酶的分解产物。
[2]
根据项1所述的经口免疫耐受剂，其中，上述天冬氨酸蛋白酶为胃蛋白酶。
[3]
根据项1所述的经口免疫耐受剂，其中，上述金属蛋白酶为嗜热菌蛋白酶。
[4]
一种食品组合物，其含有加热变性蛋清的利用天冬氨酸蛋白酶或金属蛋白酶的分解产物。
[5]
根据项4所述的食品组合物，其用于预防或治疗蛋类过敏。
[6]
根据项4或5所述的食品组合物，其中，上述天冬氨酸蛋白酶为胃蛋白酶。
[7]
根据项4或5所述的食品组合物，其中，上述金属蛋白酶为嗜热菌蛋白酶。
[8]
一种用于预防或治疗蛋类过敏的经口免疫耐受剂的制造方法，其包括利用天冬氨酸蛋白酶或金属蛋白酶使加热变性蛋清分解的步骤。
[9]
一种食品组合物的制造方法，其包括向原料中配合加热变性蛋清的利用天冬氨酸蛋白酶或金属蛋白酶的分解产物的步骤。
[10]
根据项9所述的食品组合物的制造方法，其中，上述食品组合物用于预防或治疗蛋类过敏。
[11]
一种加热变性蛋清的利用天冬氨酸蛋白酶或金属蛋白酶的分解产物的应用方法，其中，所述分解产物作为用于通过经口免疫耐受来治疗或预防蛋类过敏的成分而添加到食品中。
上述[1]～[11]的发明可适当地变换为其它类别的发明。例如，本发明在另一侧面提供用于预防或治疗蛋类过敏的PEW和(作为有效成分的)PEW用于预防或治疗蛋类过敏的应用。本发明在另一侧面提供PEW在制造用于预防或治疗蛋类过敏的经口免疫耐受剂或食品组合物中的应用。另外，本发明在另一侧面提供包括给予(经口摄取)有效量的PEW的步骤的、预防、治疗或抑制蛋类过敏的方法。本说明书中记载的事项也可以通过与上述[1]～[11]的关系而根据上述的各发明适当地变换。
发明效果
本发明的经口免疫耐受剂和含有其的食品可以通过使蛋类过敏发病风险高的对象、特别是婴幼儿摄取而稳定地诱导经口免疫耐受、从而预防或治疗蛋类过敏，另一方面不易引起经皮肤侵入所致的经皮致敏，因此作为能够以前所未有的水准兼顾有效性和安全性的制剂和食品极为有用。另外，可以预料本发明的经口免疫耐受剂和含有其的食品即使是对于已被蛋类致敏的幼儿也不易因经口摄取而诱发蛋类过敏症状，因此可以说安全性高。
需要说明的是，本发明中，通过使用“特定的食品用蛋白分解酶”(天冬氨酸蛋白酶、金属蛋白酶等)，可以得到适合用于预防蛋类过敏等的制剂，认为其理由在于，例如通过对加热变性蛋清进行“特定的食品用蛋白分解酶”处理而得到的分解产物(PEW)含有合适分子量的肽或者含有具有合适的分子量分布的、所生成的各种肽的混合物。即，可认为PEW中所含的肽(混合物)成为适合对Treg细胞(调节性T细胞)诱导免疫耐受的抗原(具有T细胞表位)，另一方面，不会成为使B细胞产生抗体的抗原，能够防止经皮致敏，另外也不会成为针对S-IgE(特异性IgE)的抗原，不会引起过敏症状。
与此相对，未经食品用蛋白分解酶分解的加热变性蛋清(EW)也许能够作用于Treg细胞而诱导一定程度的免疫耐受，但抑制向Th2细胞的分化诱导(Th2细胞的增殖)、抑制细胞因子(IL-13等)的产生的效果则是PEW更为优良(参照实施例4)。EW还有可能作用于B细胞而产生抗体从而引起经皮致敏、或者作用于S-IgE而引起过敏症状。
另外，在使用“特定的食品用蛋白分解酶”以外的食品用蛋白分解酶的情况下，连Treg细胞所需的T细胞表位也被分解，存在不能诱导免疫耐受或免疫耐受的诱导稳定性欠缺的情况。
但是，本发明不因这种推测而被不当地制约，即使是由于其他原因而通过使用天冬氨酸蛋白酶(例如胃蛋白酶)或金属蛋白酶(例如嗜热菌蛋白酶)来发挥本发明的作用效果，本发明也能够由本说明书的记载来担保。
附图说明
图1示出实施例3中的加热变性蛋清中所含的蛋白质(肽)的分子量分布[A]、胃蛋白酶处理PEW(PEW1)中所含的肽的分子量分布[B]、サモアーゼ(注册商标)PC10F处理PEW(PEW2)中所含的肽的分子量分布[C]、蛋白酶P“アマノ”3SD处理PEW(R-PEW1)中所含的肽的分子量分布[D]和プロチンSD-AY10处理PEW(R-PEW2)中所含的肽的分子量分布[E]的测定结果。
图2[A]-[B]示出实施例4中的各OVA或OVM特异性的、IgE的血中浓度的测定结果。另外，图2[C]-[D]示出实施例3中的从肠系膜淋巴结分离并培养后的细胞的细胞增殖率[C]和培养上清中的IL-13浓度[D]的测定结果。***：p<0.001,**：p<0.01，*：p<0.05，非参数检验：克鲁斯卡尔-沃利斯检验(Kruskal-Wallis test)，多重比较：邓恩多重比较检验(Dunn’s multiple comparisons test)，n＝7-8。
图3示出使用PEW1等的实施例5中的反映过敏性休克的体温变化[A]以及mMCP-1的样品给予前的血中浓度[B]和给予后的血中浓度[C]的测定结果。***：p<0.001，**：p<0.01，*：p<0.05，非参数检验：克鲁斯卡尔-沃利斯检验，多重比较：邓恩多重比较检验，n＝13-15(血清中OVAsIgE为50ng/ml以上)。
图4示出使用PEW2等的实施例6中的反映过敏性休克诱发的体温变化[A]以及mMCP-1的样品给予前的血中浓度[B]和给予后的血中浓度[C]的测定结果。****：p<0.0001,*：p<0.05，非参数检验：克鲁斯卡尔-沃利斯检验，多重比较：邓恩多重比较检验，n＝13(血清中OVAsIgE为50ng/ml以上)。
图5[A]-[B]示出使用PEW1等的实施例7中的OVA特异性IgE的血中浓度[A]和OVM特异性IgE的血中浓度[B](25倍稀释的血清的光学浓度(OD))的测定结果。另外，图5[C]-[D]示出实施例7中的从脾脏分离并培养后的细胞在OVA刺激[C]和OVM刺激[D]下各自的细胞增殖率的测定结果。****：p<0.0001，***：p<0.001，非参数检验：克鲁斯卡尔-沃利斯检验，多重比较：邓恩多重比较检验，n＝19-20。
图6[A]-[B]示出使用PEW2等的实施例8中的OVA特异性IgE的血中浓度[A]和OVM特异性IgE的血中浓度[B](25倍稀释的血清的光学浓度(OD))的测定结果。另外，图6[C]-[D]示出实施例8中的从脾脏分离并培养后的细胞在OVA刺激[C]和OVM刺激[D]下各自的细胞增殖率的测定结果。****：p<0.0001，**：p<0.01，非参数检验：克鲁斯卡尔-沃利斯检验，多重比较：邓恩多重比较检验，n＝19-20。
具体实施方式
-经口免疫耐受剂-
本发明的用于预防或治疗蛋类过敏的经口免疫耐受剂(本说明书中称为“本发明的经口免疫耐受剂”)含有利用特定的食品用蛋白分解酶(本发明中称为“特定酶”)得到的加热变性蛋清的分解产物(PEW)。
本发明的经口免疫耐受剂至少含有PEW作为有效成分，可根据需要进一步含有其它成分。即，本发明的经口免疫耐受剂可以仅由PEW构成，也可以还含有与其同样地对蛋类过敏的预防或治疗有效的其它成分、作为食品用添加剂使用的各种成分。
本发明的经口免疫耐受剂可以为溶解于水、缓冲液等合适溶剂中的液状形态，也可以为在制备成这种液状形态后进行了粉末化等处理的粉末状等固体状。例如，可以将PEW利用喷雾干燥、冷冻干燥等粉末化，此时根据需要配合添加剂(赋形剂、着色料、香料、甜味料等)后，制造粉末状的经口免疫耐受剂。例如，也可以使用合适的添加剂以像补充剂(营养辅助食品)那样成为散剂(粉末剂)、颗粒剂、片剂、胶囊剂、其它固体状的剂型、凝胶剂、液剂等剂型的方式制造经口免疫耐受剂。
(PEW)
本发明中使用的PEW为通过利用特定酶分解蛋清的加热变性物而制备的物质。蛋清的加热温度为足以发生蛋清中所含的蛋白质(卵白蛋白、卵类粘蛋白等)的变性的温度，至少为60～80℃或该温度以上，例如可在沸水中经过足够的时间来进行。蛋清可以为了保存性而预先干燥粉末化、并在制备PEW时将其再分散于水等中并加热。
需要说明的是，本发明中，可以将蛋清整体的加热变性物作为特定酶分解的对象，不需要像现有技术那样以从蛋清中提取作为蛋清中所含的主要过敏原的卵白蛋白或卵类粘蛋白(除去其它蛋白质和非蛋白质成分)后进行加热变性的产物作为对象。鸡蛋清除了含有卵白蛋白和卵类粘蛋白以外还含有卵转铁蛋白(伴白蛋白)、溶菌酶等具有过敏原性的蛋白质。另外，经加热变性的蛋清的利用特定酶的分解产物与未经加热变性的蛋清的利用特定酶的分解产物根据有无加热变性而使利用酶的切断部位发生变化，生成的肽混合物的组成不会相同，因此作为物质是可区分的。
另外，“蛋清”可以是从全蛋(与蛋黄)分离后的状态的蛋清，也可以是包含在全蛋中的原有状态的蛋清。即，“加热变性蛋清”的利用特定酶的分解产物可以是通过对从全蛋分离出的蛋清的加热变性物进行酶处理而得到的，也可以是对包含在全蛋中的原有状态的蛋清的加热变性物进行酶处理而得到的。
换言之，“含有”加热变性蛋清的利用特定酶的分解产物的本发明的经口免疫耐受剂可以不仅含有“蛋清”(蛋白质)的加热变性物的利用特定酶的分解产物，还可以一起含有对包含在全蛋中的原有状态的蛋清的加热变性物进行酶处理时自发生成的“蛋黄”(蛋白质)的加热变性物的利用特定酶的分解产物。“含有”加热变性蛋清的利用特定酶的分解产物的本发明的食品组合物和其它关联的发明中也同样。对于这种实施方式的发明，也可以将本说明书的“加热变性蛋清”(的利用特定酶的分解产物)替换为“加热变性全蛋”(的利用特定酶的分解产物)。
(特定酶)
本发明中使用的“特定酶”是指来源于各种微生物的、各种食品用蛋白分解酶(蛋白酶、肽酶等)中能够发挥本发明的作用效果的酶，即通过使用利用该酶进行了处理的加热变性蛋清而能够预防蛋类过敏等的酶。作为特定酶，可列举例如“天冬氨酸蛋白酶”(有时也称为“aspartic protease”)和“金属蛋白酶”(有时也称为“metalloprotease”)。作为天冬氨酸蛋白酶和金属蛋白酶，分别已知有各种种类，可以将食品用的一般的天冬氨酸蛋白酶和金属蛋白酶用于本发明中。在考虑最适温度、最适pH等的条件下使特定酶作用于加热变性蛋清合适的时间即可。
作为“天冬氨酸蛋白酶”的具体例，可列举胃蛋白酶(EC.3.4.23.1-3)、凝乳酶(EC3.4.23.4)、组织蛋白酶D(EC 3.4.23.5)，还可以使用其它用于食品用途的来源于各种微生物的公知的天冬氨酸蛋白酶。
作为“金属蛋白酶”的具体例，可列举嗜热菌蛋白酶(EC.3.4.24.27)，也可以使用其它用于食品用途的来源于各种微生物的公知的金属蛋白酶。例如，“サモアーゼ(注册商标)PC10F”(天野エンザイム株式会社制、来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus))作为含有嗜热菌蛋白酶的食品用蛋白酶在售。
需要说明的是，作为食品用蛋白分解酶，此外还已知有丝氨酸蛋白酶(胰蛋白酶、糜蛋白酶、凝血酶、纤溶酶、弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶等、例如实施例中使用的“蛋白酶P‘アマノ’3SD”、“プロチンSD-AY10”等制品)、硫醇蛋白酶(木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶、组织蛋白酶B等)。但是，在经口摄取时的蛋类过敏的预防或治疗效果、例如抑制s-IgE的产生的效果的稳定性方面，胃蛋白酶等天冬氨酸蛋白酶和嗜热菌蛋白酶等金属蛋白酶比丝氨酸蛋白酶等更优良。
其中，如后述实施例4(图2)所示，使用“蛋白酶P‘アマノ’3SD”的加热变性蛋清分解产物(R-PEW1)可确认到抑制OVM(卵类粘蛋白)特异性IgE抗体的产生(使血中浓度下降)的作用。卵类粘蛋白是不易因加热而变性、过敏原性高于卵白蛋白的蛋清中的蛋白质。因此，本发明的一个实施方式中，也可使用“蛋白酶P‘アマノ’3SD”作为特定酶。
(蛋类)
本发明中的“蛋类”典型情况下为鸡的蛋(鸡蛋)。即，本发明的典型实施方式中，用于制造经口免疫耐受剂的加热变性蛋清为鸡蛋的蛋清，通过本发明来预防等的蛋类过敏为鸡蛋过敏。但是，本发明中的蛋类不限于鸡蛋，认为也存在如下可能性：为了使用例如鹌鹑、鸭子、其他食用禽类的蛋那样含有与鸡蛋过敏原蛋白同源性高的蛋白质的蛋类(加热变性蛋清)预防或治疗该蛋类的过敏，可以实施本发明。
(制备方法)
在使用胃蛋白酶作为特定酶的情况下，例如可按照下述步骤制备PEW。对于胃蛋白酶以外的天冬氨酸蛋白酶，也可以设定为根据需要进行了改变的同样的步骤。
(1)将预先干燥粉末化的蛋清用水稀释，制备合适浓度(例如20mg/mL)的蛋清水溶液。
(2)将蛋清水溶液在适合于蛋清变性的温度(例如沸水中)加热合适的时间(例如约10分钟)。
(3)添加酸(例如HCl)，将加热变性蛋清水溶液的pH调节至适合于胃蛋白酶的范围(例如1.5)。
(4)向加热变性蛋清水溶液中添加适量(例如，相对于加热变性蛋清水溶液为2wt％)的胃蛋白酶。
(5)将加热变性蛋清水溶液在适合于使胃蛋白酶起作用的温度(例如37℃)下保持合适的时间(例如180分钟)。
(6)添加碱(例如NaOH)，将胃蛋白酶处理加热变性蛋清水溶液的pH调节至中性附近。
(7)将胃蛋白酶处理加热变性蛋清水溶液在适合于使酶失活的温度(例如沸水中)加热合适的时间(例如约15分钟)。
在使用“サモアーゼ(注册商标)PC10F”作为特定酶的情况下，例如可以按照下述步骤制备PEW。对于“サモアーゼ(注册商标)PC10F”(嗜热菌蛋白酶)以外的金属蛋白酶，也可以设定为根据需要进行了改变的同样的步骤。
(1)将预先干燥粉末化的蛋清用水稀释，制备合适浓度(例如20mg/mL)的蛋清水溶液。
(2)将蛋清水溶液在适合于蛋清变性的温度(例如沸水中)加热合适的时间(例如约10分钟)。
(3)添加碱(例如NaOH)，将加热变性蛋清水溶液的pH调节至适合于“サモアーゼ(注册商标)PC10F”的范围(例如8.0)。
(4)向加热变性蛋清水溶液中添加适量的“サモアーゼ(注册商标)PC10F”(例如，相对于加热变性蛋清水溶液为5wt％)。
(5)将加热变性蛋清水溶液在适合于使“サモアーゼ(注册商标)PC10F”起作用的温度(例如65℃)下保持合适的时间(例如180分钟)。
(6)根据需要添加酸，将“サモアーゼ(注册商标)PC10F”处理加热变性蛋清水溶液的pH调节至中性附近。
(7)将“サモアーゼ(注册商标)PC10F”处理加热变性蛋清水溶液在适合于使酶失活的温度(例如沸水中)加热合适的时间(例如约15分钟)。
PEW中含有蛋清中所含的卵白蛋白、卵类粘蛋白等蛋白质的利用特定酶的分解产物(肽混合物)以及此外的成分。根据使用特定酶的处理的实施方式(特定酶的种类、处理时间、处理温度、其它处理条件等)，蛋白质的分解方式会有所变动，得到的肽混合物的组成、分子量分布也可能发生变动，但是只要能发挥本发明的作用效果就允许这样的变动。肽混合物的分子量分布可以使用公知惯用的方法、例如尺寸排阻色谱(SEC)在合适的条件下测定。需要说明的是，标准鸡蛋中含有水分约90％、蛋白质约10％，蛋白质中含有卵白蛋白约54％、卵类粘蛋白约11％、卵转铁蛋白约12％。
(用途)
对于本发明的经口免疫耐受剂而言，既可以单独以补充剂之类的食品形式摄取其本身，也可以适量添加到其它食品中来摄取。另外，也可以预先制备本发明的经口免疫耐受剂，将其作为用于制造本发明的食品组合物的原料的一部分、特别是作为用于诱导经口免疫耐受的成分配合到食品组合物中。
但是，本发明的经口免疫耐受剂的用途不限于上述那样的用途，可以用于与蛋类过敏的预防或治疗这一作用效果有关的各种目的。例如，为了对与可能与蛋类过敏的经口免疫耐受有关的细胞(Treg细胞、B细胞、树突细胞、其它免疫相关细胞等)或抗体(s-IgE)的相互作用进行分析等而在体外使用加热变性蛋清的特定酶分解产物的实施方式也是本发明的经口免疫耐受剂的一个实施方式。
可以使想要诱导经口免疫耐受以预防或治疗蛋类过敏的对象摄取(对其给予)本发明的经口免疫耐受剂。这样的对象可以为人，也可以为人以外的哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔子、豚鼠、沙鼠、仓鼠、雪貂、狗、小型猪、猴、牛、马、绵羊等)。另外，以人为对象时，优选使婴幼儿、例如摄取离乳食的出生后6个月左右起、至1岁左右为止、或至容易发生蛋类过敏的小学入学前的年龄为止的婴幼儿摄取。在预防蛋类过敏的情况下，可以使未被来源于蛋清的过敏原、代表性地为卵白蛋白(OVA)、卵类粘蛋白(OVM)等致敏的对象经口摄取本发明的经口免疫耐受剂，在治疗蛋类过敏的情况下，可以使已被这些过敏原致敏的对象经口摄取本发明的经口免疫耐受剂。
本发明的经口免疫耐受剂的每天的摄取标准量、或每餐的摄取标准量和每天的摄取次数、摄取时间(天数)可基于本发明的经口免疫耐受的实施方式、经口摄取(经口给予)该经口免疫耐受剂的对象的年龄、体重、性別、与蛋类过敏有关的指标、属性(是否已被来源于蛋清的过敏原致敏、是否患有特应性皮炎等)、所期待的蛋类过敏的预防或治疗效果的程度、以及以人或人以外的哺乳动物为对象的非临床或临床的试验结果等来适当设定。
关于本发明的经口免疫耐受剂的预防蛋类过敏的效果，例如可以利用如下所述的方法进行评价。
(A1)使对象(例如小鼠)经口摄取(经口给予)本发明的经口免疫耐受剂一定期间。
(A2)将蛋清中所含的主要过敏原即卵白蛋白(OVA)或者OVA和卵类粘蛋白(OVM)根据需要与佐剂(例如铝盐)一起给予(注射)到对象的腹腔内而使其致敏。该步骤可根据需要间隔一定期间进行多次。
(A3)从对象采血，测定对OVA或OVM呈特异性的抗体(IgE)的浓度。与上述(A1)中经口摄取了本发明的经口免疫耐受剂以外的物质(例如水、未经蛋白水解酶分解的蛋清(EW))的对照组相比，检验有无抗体浓度的统计学上的显著性差异。例如与经口摄取了水的对照组相比，若抗体浓度在统计学上显著低，则可以评价为通过事先经口摄取本发明的经口免疫耐受剂而发挥了能够抑制针对蛋清过敏原的IgE抗体的产生、即能够预防蛋类过敏的作用效果。
关于本发明的经口免疫耐受剂的安全性，例如可以利用如下所述的方法从引起过敏性休克的危险性和经皮致敏的可能性的观点进行评价。
(B1)与上述(A2)同样地，对于对象，将OVA、或OVA和OVM根据需要与佐剂一起给予(注射)到对象的腹腔内而使其致敏。
(B2)从致敏起经过一定期间后，向对象腹腔内给予本发明的经口免疫耐受剂。
(B3)测定给予前和给予后(例如30分钟后)的对象的体温变化。与上述(B2)中给予了本发明的经口免疫耐受剂以外的物质(例如水、EW)的对照组相比，检验有无体温变化的统计学上的显著性差异。例如与给予了水的对照组相比，若体温变化在统计学上没有显著性差异，则可以评价为本发明的经口免疫耐受剂不会引起由过敏反应导致的体温变化(下降)、即危险性低。
(C1)在对象(例如小鼠)的皮肤炎症部粘贴本发明的经口免疫耐受剂一定期间。该步骤可根据需要间隔一定期间进行多次。
(C2)从对象采血，测定对OVA或OVM呈特异性的抗体(IgE)的浓度。与上述(C1)中粘贴了本发明的经口免疫耐受剂以外的物质(例如水、EW)的对照组相比，检验有无抗体浓度的统计学上的显著性差异。例如与给予了水的对照组相比，若抗体浓度在统计学上没有显著性差异，则可以评价为本发明的经口免疫耐受剂不易产生针对OVA或OVM的抗体、即经皮致敏的可能性低。
关于上述各种评价方法的更具体的实施方式，可参照本说明书的实施例。通过这样的评价方法并考虑统计学上的显著性差异的有无、显著性水平等，能够探索更优选的实施方式的经口免疫耐受剂(或含有其的食品组合物)、例如利用特定酶进行处理的优选条件、针对人或人以外的哺乳动物的摄取方式、即每次的量和期间等。
-食品组合物-
本发明的食品组合物至少含有加热变性蛋清的利用特定酶的分解产物(PEW)、例如利用天冬氨酸蛋白酶(胃蛋白酶等)或金属蛋白酶(サモアーゼ(注册商标)PC10F等)的分解产物、即本发明的经口免疫耐受剂，还含有与食品组合物的实施方式相应的至少1种食品原料、食品用添加物、其它成分。
本发明的食品组合物典型情况下为蛋类过敏的预防或治疗用的食品组合物(食品用途发明)。另外，即使不强调这样的用途，本发明的食品组合物对于有发生蛋类过敏的可能性的对象(例如婴幼儿)或已发生蛋类过敏和/或特应性皮炎的对象也可以作为危险性低的食品组合物来摄取。
本发明的食品组合物的种类没有特别限定，可以制造为与常规食品同样种类的食品。作为这样的食品，可列举例如清凉饮料(果汁、咖啡饮料、茶类饮料、矿物质水、运动饮料等)、乳饮料、豆乳饮料、发酵乳(酸奶)、乳酸菌饮料、可可茶、由速食粉末制备的饮料、果冻、布丁、点心类(饼干、曲奇、巧克力等)、面包、谷物、家常菜、调味料(蛋黄酱、调味汁等)等。另外，本发明的食品组合物优选制成适合于婴幼儿摄取的婴儿食品的形态，例如，优选将上文例示的各种食品制成湿式(蒸煮袋装食品、罐装食品等液状或半固体状的食品)或干式(加入水、热水而恢复原状后食用的粉末状、颗粒状、片状、固体状的食品)的婴儿食品。
关于本发明的食品组合物中的PEW(本发明的经口免疫耐受剂)的含量，只要处于通过摄取食品组合物而发挥预防或治疗蛋类过敏的作用效果的范围就没有特别限定。这样的含量可考虑每餐或每天的PEW(以有效成分计的经口免疫耐受剂)的量、所摄取的食品组合物的重量等并适当考虑食品组合物的形态、制造方法等而设定。需要说明的是，与本发明的食品组合物有关的每餐或每天的PEW的量如前面关于本发明的经口免疫耐受剂的部分中所述。
除了还包括配合作为原料之一的PEW(本发明的经口免疫耐受剂)的步骤以外，本发明的食品组合物可以通过与以往的食品组合物同样的方法来制造。PEW可以如上述那样预先制备并在至制造食品组合物为止的期间内进行保管。
关于本发明的食品组合物，可以直接或间接标示用于治疗或预防蛋类过敏这一用途。直接标示的例子为在制品自身、包装、容器、标签、吊牌等有型物上进行记载，间接标示的例子为利用网站、店铺、展览会、招牌、公告牌、报纸、杂志、电视、广播、邮寄物、电子邮件等场所或手段的广告/宣传活动。
实施例
[实施例1]胃蛋白酶处理PEW(PEW1)的制备
将鸡蛋的蛋清的干燥粉末加入到纯水中而制备20mg/mL浓度的蛋清水溶液。将蛋清水溶液在沸水中加热并保持10分钟。向得到的加热变性蛋清水溶液中加入盐酸而将pH调节为1.5。向加热变性蛋清水溶液中加入2wt％的胃蛋白酶(来源于猪胃粘膜粉末的胃蛋白酶(Pepsin from porcine gastric mucosa powder)≥250单位/mg固体,SIGMA)，在37℃下保持180分钟。向得到的胃蛋白酶处理加热变性蛋清水溶液中加入氢氧化钠进行中和，之后在沸水中加热15分钟而使酶失活。将得到的水溶液作为PEW1的水溶液。
[实施例2]使用“サモアーゼ(注册商标)PC10F”的PEW(PEW2)的制备
将鸡蛋的蛋清的干燥粉末加入到纯水中而制备20mg/mL浓度的蛋清水溶液。将蛋清水溶液在沸水中加热并保持10分钟。向得到的加热变性蛋清水溶液中加入氢氧化钠而将pH调节到8.0。向加热变性蛋清水溶液中加入5wt％的“サモアーゼ(注册商标)PC10F”(天野エンザイム株式会社、以下简单记作“PC10F”)，在65℃下保持180分钟。之后在沸水中加热15分钟而使酶失活。将得到的PC10F处理加热变性蛋清水溶液作为PEW2的水溶液。
[参考例1]使用“蛋白酶P‘アマノ’3SD”的加热变性蛋清分解产物(R-PEW1)的制备
将鸡蛋的蛋清的干燥粉末加入到纯水中而制备20mg/mL浓度的蛋清水溶液。将蛋清水溶液在沸水中加热并保持10分钟。向得到的加热变性蛋清水溶液中加入氢氧化钠而将pH调节为8.0。向加热变性蛋清水溶液中加入6.7wt％的“蛋白酶P‘アマノ’3SD”(天野エンザイム株式会社、以下简单记作“P3SD”)，在40℃下保持180分钟。之后在沸水中加热15分钟而使酶失活。将得到的P3SD处理加热变性蛋清水溶液作为R-PEW1的水溶液。
[参考例2]使用“プロチンSD-AY10”的加热变性蛋清分解产物(R-PEW2)的制备
将鸡蛋的蛋清的干燥粉末加入到纯水中而制备20mg/mL浓度的蛋清水溶液。将蛋清水溶液在沸水中加热并保持10分钟。向得到的加热变性蛋清水溶液中加入氢氧化钠而将pH调节为9.0。向加热变性蛋清水溶液中加入8.3wt％的“プロチンSD-AY10”(天野エンザイム株式会社、以下简单记作“AY”)，在60℃下保持180分钟。之后在沸水中加热15分钟而使酶失活。将得到的AY处理加热变性蛋清水溶液作为R-PEW2的水溶液。
[实施例3]
使用株式会社岛津制作所制造的HPLC(柱：Superdex peptide10/300GL、洗脱液：0.1％TFA、30％CAN、吸光波长：214nm)测定加热变性蛋清中所含的肽的分子量分布以及实施例1和2、参考例1和2中制备的PEW1、PEW2、R-PEW1、R-PEW2各自所含的肽的分子量分布。将结果示于图1。
[实施例4]使用各种酶的PEW的鸡蛋过敏的预防效果的比较
对于试验动物(BALB/c品系、雌性、3～4周龄)，将实施例1和2中制备的胃蛋白酶处理PEW1和“サモアーゼ(注册商标)PC10F”处理PEW2、以及参考例1和2中制备的“蛋白酶P‘アマノ’3SD”处理R-PEW1和“プロチンSD-AY10”处理R-PEW2分别以2mg经口给予5天(第-18天～第-14天)。在其1周后起的5天(第-11天～第-7天)期间，再次将PEW1和2、R-PEW1和2分别以2mg对试验动物经口给予5天。在其1周后(第0天)，将卵白蛋白(OVA)和卵类粘蛋白(OVM)各自100μg与作为佐剂的铝盐一起腹腔内注射于试验动物。在其2周后(第14天)，再次将OVA和OVM各自100μg与铝盐一起腹腔内注射于试验动物。在其13天后(第27天)从试验动物中采血，分别测定对OVA或OVM呈特异性的IgE的血中浓度。除了经口给予水或2mg的加热变性蛋清(EW)代替各种酶处理加热变性蛋清水溶液以外，同样地设置对照组。
将结果示于图2[A]和[B]。对于OVA特异性IgE和OVM特异性IgE中的任一者而言，通过经口摄取实施例1的PEW1和PEW2，认为都能够以高于加热变性蛋清(图中的EW)的可靠性抑制上述IgE的产生，即，能够预防蛋类过敏。另一方面，R-PEW1和R-PEW2的OVA特异性IgE抗体的血中浓度与水组未观察到显著性差异。启示了：并非利用任意食品用蛋白分解酶处理而得到的加热变性蛋清分解产物都具有作为经口免疫耐受剂的有用性，通过选择并使用胃蛋白酶、“サモアーゼ(注册商标)PC10F”之类的特定酶才能得到具有作为经口免疫耐受剂的有用性的加热变性蛋清分解产物。
进而，在采血起1周后(第34天)解剖试验动物并采集肠系膜淋巴结，分离其中所含的细胞。向培养基中添加OVA并培养72小时后，首先回收培养上清并利用ELISA法定量其中所含的细胞因子IL-13。另外，通过向培养基中添加3H胸苷并使其掺入到细胞中的分析来测定细胞增殖率。
将结果示于图2[C]和[D]。实施例1的PEW1的情况下，未确认到致敏小鼠特有的OVA抗原特异性的细胞增殖[C]、抗原刺激特异性的IL-13的产生[D]。由此认为，通过经口给予PEW1，能够抑制由致敏处置导致的向Th2细胞的分化。
[实施例5]PEW1的过敏性休克的危险性的评价
对于试验动物(BALB/c品系、雌性、6周龄)，将卵白蛋白(OVA)和卵类粘蛋白(OVM)各100μg与作为佐剂的铝盐一起进行腹腔内注射，用这些过敏原致敏试验动物。在其2周后(第14天)，再次将OVA和OVM各100μg与铝盐一起腹腔内注射于试验动物，同样地进行致敏。在其14天后(第28天)，以200mg/kg的量对试验动物腹腔内给予水、加热变性蛋清(EW)和实施例1的PEW1(腹腔内负荷试验)。在给予时和给予起30分钟后测定体温，计算其体温变化。另外，在腹腔内负荷试验的2天前(第26天)和试验后(第28天)从试验动物中采血，测定肥大细胞被激活时产生的标志物mMCP-1(mouse mast cell protease 1，小鼠肥大细胞蛋白酶1)的血中浓度。
将结果示于图3。根据[A]，给予对象被OVA和OVM致敏的情况下，摄取加热变性蛋清(图中的EW)时观察到由过敏性休克导致的体温变化(下降)，但实施例1的PEW1中未观察到这样的体温变化。根据[B]，就MCP-1的血中浓度而言，在腹腔内给予前各组间未观察到差异，但根据[C]，就给予后的MCP-1的血中浓度而言，与加热变性蛋清(图中的EW)相比，实施例1的PEW1显著低。根据这些结果认为，就诱发过敏性休克的危险性而言，与加热变性蛋清(EW)相比其利用胃蛋白酶的处理物(PEW1)更低。
[实施例6]PEW2的过敏性休克的危险性的评价
对于试验动物(BALB/c品系、雌性、6周龄)，通过与实施例5同样的步骤进行OVA和OVM致敏。在第2次腹腔内注射的14天后(第28天)，以200mg/kg的量将水、加热变性蛋清(EW)和实施例2的PEW2腹腔内给予于试验动物(腹腔内负荷试验)。在腹腔内负荷试验的2天前(第26天)和试验后(第28天)从试验动物采血，测定肥大细胞被激活时产生的标志物mMCP-1(mouse mast cell protease 1)的血中浓度。
将结果示于图4。根据[A]，在给予对象被OVA和OVM致敏的情况下，摄取加热变性蛋清(图中的EW)时观察到由过敏性休克导致的体温变化(下降)，但实施例2的PEW2中未观察到这样的体温变化。根据[B]，就MCP-1的血中浓度而言，在腹腔内给予前各组间未观察到差异，但根据[C]，就给予后的MCP-1的血中浓度而言，与加热变性蛋清(图中的EW)相比，实施例2的PEW2显著低。根据这些结果认为，就诱发过敏性休克的危险性而言，与加热变性蛋清(EW)相比其利用“サモアーゼ(注册商标)PC10F”的处理物(PEW2)更低。
[实施例7]PEW1的经皮致敏的可能性的评价
对于试验动物(BALB/c品系、雌性、6周龄)，按照下述步骤进行经皮致敏。剃掉试验动物的后背的毛，用乳膏脱毛后，进行3次粘贴胶带并剥离的操作，然后在后背粘贴水、4mg的加热变性蛋清(EW)或4mg的实施例1的PEW1。缠绕绷带并保持3天后，拆掉绷带并保持7天。将该循环进行3次(第0天～第9天、第10天～第19天、第20天～第29天)。在第31天采血，测定OVA特异性IgE抗体和OVM特异性IgE抗体的血中浓度。进而，在第32天解剖试验动物，采集脾脏并分离其中所含的细胞。向培养基中添加OVA或OVM并培养72小时后，通过向培养基中添加3H胸苷并使其掺入到细胞中的分析来测定细胞增殖率。
将结果示于图5。关于OVA特异性IgE抗体[A]和OVM特异性IgE抗体[B]任一者的产生量，实施例1的PEW1均显著低于加热变性蛋清(图中的EW)，像与对照(图中的水)没有显著性差异的程度那样几乎没有产生。根据这些结果认为，胃蛋白酶处理加热变性蛋清分解产物(PEW1)几乎没有引起经皮致敏的危险性，至少低于加热变性蛋清(EW)。进而，OVA刺激[C]中，实施例1的PEW1与加热变性蛋清(图中的EW)相比，抗原特异性的细胞增殖率显示出统计学上没有显著性差异的低值，关于OVM刺激[D]也认为，实施例1的PEW1与加热变性蛋清(图中的EW)相比，抗原特异性的细胞增殖得到抑制，从即使进行经皮致敏的处置也不易分化出OVA和OVM特异性增殖的T细胞的观点而言是优良的。
[实施例8]PEW2的经皮致敏的可能性的评价
对于试验动物(BALB/c品系、雌性、6周龄)，使用实施例2的PEW2代替实施例1的PEW1，除此以外与实施例7同样地进行经皮致敏后，进行OVA特异性IgE抗体和OVM特异性IgE抗体的血中浓度的测定和脾细胞增殖率的测定。
将结果示于图6。关于OVA特异性IgE抗体[A]和OVM特异性IgE抗体[B]中任一者的产生量，实施例2的PEW2与加热变性蛋清(图中的EW)相比均显著低，像与对照(图中的水)没有显著性差异的程度那样几乎没有产生。根据这些结果认为，“サモアーゼ(注册商标)PC10F”处理加热变性蛋清分解产物(PEW2)几乎没有引起经皮致敏的危险性，至少低于加热变性蛋清(EW)。进而，在OVA刺激[C]中，实施例1的PEW1与加热变性蛋清(图中的EW)相比，抗原特异性的细胞增殖率显示出统计学上没有显著性差异的低值，关于OVM刺激[D]也认为，实施例2的PEW2与加热变性蛋清(图中的EW)相比，抗原特异性的细胞增殖得到抑制，从即使进行经皮致敏的处置也不易分化出OVA和OVM特异性增殖的T细胞的观点而言是优良的。

Claims (11)

1.一种用于预防或治疗蛋类过敏的经口免疫耐受剂，其含有加热变性蛋清的利用天冬氨酸蛋白酶或金属蛋白酶的分解产物。
2.根据权利要求1所述的经口免疫耐受剂，其中，所述天冬氨酸蛋白酶为胃蛋白酶。
3.根据权利要求1所述的经口免疫耐受剂，其中，所述金属蛋白酶为嗜热菌蛋白酶。
4.一种食品组合物，其含有加热变性蛋清的利用天冬氨酸蛋白酶或金属蛋白酶的分解产物。
5.根据权利要求4所述的食品组合物，其用于预防或治疗蛋类过敏。
6.根据权利要求4或5所述的食品组合物，其中，所述天冬氨酸蛋白酶为胃蛋白酶。
7.根据权利要求4或5所述的食品组合物，其中，所述金属蛋白酶为嗜热菌蛋白酶。
8.一种用于预防或治疗蛋类过敏的经口免疫耐受剂的制造方法，其包括利用天冬氨酸蛋白酶或金属蛋白酶使加热变性蛋清分解的步骤。
9.一种食品组合物的制造方法，其包括向原料中配合加热变性蛋清的利用天冬氨酸蛋白酶或金属蛋白酶的分解产物的步骤。
10.根据权利要求9所述的食品组合物的制造方法，其中，所述食品组合物用于预防或治疗蛋类过敏。
11.一种加热变性蛋清的利用天冬氨酸蛋白酶或金属蛋白酶的分解产物的应用方法，其中，所述分解产物作为用于通过经口免疫耐受来治疗或预防蛋类过敏的成分而添加到食品中。
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