CN110381964A - Glp-1分泌促进剂和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供作为源自乳的成分、优异的GLP‑1分泌促进剂、GLP‑1分泌促进用组合物及包含其的饮食品或药物。以选自胶束酪蛋白、其水解物、其级分、其纯化物及包含序列号1～7中任一项所示的氨基酸序列的肽中的任意者作为GLP‑1分泌促进剂和GLP‑1分泌促进用组合物的有效成分。

Description

GLP-1分泌促进剂和组合物
技术领域
本发明涉及消化道激素GLP-1(胰高血糖素样肽-1，Glucagon-Like Peptide-1)分泌促进剂和GLP-1分泌促进用组合物。GLP-1分泌促进用组合物能够用作药物、饮食品或饲料。
背景技术
GLP-1是与胰高血糖素相关的消化道激素的一种，具有对糖代谢重要的肠促胰岛素作用。
对于GLP-1，通过摄取饮食而从作为主要大量存在于小肠下部的肠道分泌细胞的L细胞释放至血液中，血液中的葡萄糖浓度依赖性地作用于胰腺β细胞而促进胰岛素的分泌，降低餐后的血糖值(非专利文献1)。进而，GLP-1通过抑制胰高血糖素的分泌而使从肝臓释放的葡萄糖降低、使血糖值降低。除这些之外还报道了通过GLP-1作用于中枢神经系统来抑制食欲(非专利文献2)。
由于如上GLP-1的作用对改善糖尿病等生活方式病是有用的，因此GLP-1类似物(GLP-1受体激动剂)、作为血液中GLP-1的分解酶的二肽基肽酶IV(DPP-IV)的抑制剂被用于糖尿病治疗等。
另外，对GLP-1的分泌促进作用也进行了研究，报道了由糖质、脂质带来的作用以及由蛋白质带来的GLP-1分泌促进作用(非专利文献3～8)。启示出如下机理：被摄取的蛋白质通过消化酶而分解为肽、氨基酸后，活化大多分布于下部消化道中的GLP-1产生细胞上的质子协同转运型肽转运蛋白1(PEPT1)、钙感知受体(CaSR)的作用、激活细胞内钙信号、分裂促进因子活化蛋白激酶(MAPK)等细胞内信号传递，由此促进GLP-1的分泌(非专利文献9～11)。
对于乳或源自乳的蛋白质也研究了GLP-1分泌促进作用。例如，报道了：在人临床试验中，由于饮用牛乳而使血浆中的GLP-1浓度提高(非专利文献12)。另外，报道了：通过凝乳酶使乳水解而得到的酪蛋白糖巨肽(CGMP)对于小肠细胞株显示出GLP-1分泌促进活性(专利文献1)。另外，报道了：将脱脂乳在pH4.6下使其酸沉淀时的上清液、即作为得到酸酪蛋白材料时所产生的酸乳清中包含的蛋白质的胶束酪蛋白的酸可溶性蛋白质(专利文献2)、酪蛋白的水解物(专利文献3)、κ-酪蛋白(专利文献4)也具有GLP-1分泌促进作用。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第01/37850号小册子
专利文献2：日本特表2007-525404号
专利文献3：日本特表2009-517464号
专利文献4：国际公开第2007/037413号小册子
非专利文献
非专利文献1：Yabe D et al.(2011)Prog.Biophys.Mol.Biol.107,248-256
非专利文献2：Mejer JJ et al.(2002)Eur.J.Pharmacol.440(2-3),269-279
非专利文献3：Anna L.Gillespie et al.(2016)Food Chem.211,148-159
非专利文献4：JC Gevrey et al.(2004)Diabetologia 47,926-936
非专利文献5：Martine Cordier-Bussat et al.(1998)Diabetes 47,1038-1045
非专利文献6：Dina Ripken et al.(2016)J.of Nutri.Biochem.32,142-150
非专利文献7：N Higuchi et al.(2013)Endocrinology154(9),3089-3098
非专利文献8：Y Ishikawa et al(2015)Food Funct.6,2525-2534
非专利文献9：Liou et al.(2011)Am J.Physiol.Gastrointest.LiverPhysiol.300(5),895-902
非专利文献10：Diakogiannaki E et al.(2013)Diabetologia 56(12),2688-2696
非专利文献11：Reimer et al.(2001)Endocrinology 142(10),4522-4528
非专利文献12：Lijuan Sun et al.(2016)Br.J.Nutri 116,1216-1221
发明内容
发明要解决的问题
作为具有GLP-1分泌促进作用的成分，从安全性、作为食品、药物的摄取容易度、消费者的印象等的观点出发源自乳的成分是有魅力的。
然而，以往报道的源自乳的成分存在基于乳的制备工序繁杂因而为高成本这样的难点。另外，这些制备物所具有的GLP-1分泌促进作用并不一定充分，且不能说实用性高。
鉴于上述状況，目的在于提供作为源自乳的成分、以能够有效地大量制造的物质作为有效成分的、优异的GLP-1分泌促进剂和GLP-1分泌促进用组合物，优选为适宜饮食品或药物的形态的组合物。
用于解决问题的方案
本发明人等为了解决上述的课题而进行了深入研究，结果发现胶束酪蛋白和/或其水解物具有优异的GLP-1分泌促进作用/GLP-1分泌刺激活性，以至完成了本发明。
即，本发明提供含有胶束酪蛋白和/或其水解物作为有效成分的GLP-1分泌促进剂和分泌促进用组合物。前述胶束酪蛋白的水解物的重均分子量优选为400～5000。
另外，本发明的其它方式提供含有胶束酪蛋白的水解物的级分或纯化物作为有效成分的GLP-1分泌促进剂和GLP-1分泌促进用组合物。前述胶束酪蛋白的水解物的级分或纯化物优选含有1种或多种包含序列号1～7中任一项所示的氨基酸序列的肽。
另外，本发明的其它方式提供含有1种或多种包含序列号1～7中任一项所示的氨基酸序列的肽作为有效成分的GLP-1分泌促进和GLP-1分泌促进用组合物。
另外，本发明的GLP-1分泌促进用组合物优选为药物组合物的形态。在该形态中，前述药物组合物优选为高血糖、糖尿病、肥胖症或贪食症的预防和/或改善用途、或者餐后血糖值抑制用途、或者食欲抑制用途。
另外，本发明的GLP-1分泌促进用组合物优选为饮食品组合物的形态。
发明的效果
根据本发明，可提供优异的GLP-1分泌促进剂和GLP-1分泌促进用组合物。本发明的GLP-1分泌促进用组合物能够制成饮食品的形态。另外，本发明的GLP-1分泌促进用组合物可以制成药物的形态，对于预防、改善糖尿病等生活方式病是有用的。
具体实施方式
接着，对本发明进行详细地说明。但是，本发明不限定于以下的实施方式，可以在本发明的范围内进行自由变更。
＜GLP-1分泌促进剂和GLP-1分泌促进用组合物＞
本发明的GLP-1分泌促进剂和GLP-1分泌促进用组合物含有胶束酪蛋白和/或其水解物作为有效成分。需要说明的是，本发明的GLP-1分泌促进用组合物有时还表达为GLP-1分泌刺激促进用组合物、还表达为GLP-1分泌促进剂、GLP-1分泌刺激剂。
本发明中，“胶束酪蛋白(micellar casein)”是指包含酪蛋白蛋白质所形成的胶束胶体(所谓的酪蛋白胶束)的组合物。胶束酪蛋白通常包含在乳或脱脂乳等乳制品中，例如，可通过对脱脂乳进行膜分离处理而得到。该膜分离处理的结果，由脱脂乳得到的乳蛋白浓缩物用作胶束酪蛋白材料。由于通过膜分离处理而可以得到胶束酪蛋白，因此例如无需暴露于如在酪蛋白钠材料等酪蛋白盐的制造工序中所进行的酸沉淀和/或碱溶解处理中。因此，可以认为，该胶束酪蛋白维持了在乳中被视为是酪蛋白所保持的“胶束结构”。
构成胶束酪蛋白的酪蛋白蛋白质为α-酪蛋白、β-酪蛋白及κ-酪蛋白，通常与在乳中存在的酪蛋白为同样的组成。另外，胶束酪蛋白的形态通常与在乳中存在的酪蛋白的胶束胶体为同样的形态，是平均粒径为20～600nm的胶体颗粒。
需要说明的是，如后述的实施例所示，未形成胶束胶体的κ-酪蛋白本身区别于本发明中的胶束酪蛋白。
另外，本发明中的胶束酪蛋白优选为源自乳，更优选为源自牛的乳。
本发明中的胶束酪蛋白优选为利用特定的方法由从生乳中去除脂质后的脱脂乳(skim milk)制造的胶束酪蛋白。即，能够以胶束酪蛋白的形式获得通过从脱脂乳中去除粒径优选为0.1μm以下的成分而得到的、脱脂乳的特定的级分。通常，脱脂乳中包含的粒径0.1μm以下的成分为乳清蛋白、糖质等各种成分。
上述除去粒径0.1μm以下的成分的处理可以利用使脱脂乳通过例如孔径0.1～0.2μm的精密过滤膜(Microfiltration Membrane、MF膜)来进行，将残留在处理后的膜上的成分作为胶束酪蛋白即可。获得的胶束酪蛋白还可以根据需要进行浓缩、喷雾干燥等处理。另外，在胶束酪蛋白的制备工序中，优选不进行如酸或碱处理、蛋白质分解酶的添加及70℃以上的加热处理等使蛋白质发生变性的处理。
由此制造的胶束酪蛋白是保持了存在于通常的乳中的酪蛋白的胶束胶体的组成、形态的物质。另外，就膜处理等操作的性质上而言，通常可以以乳清蛋白与胶束酪蛋白一起存在的形式获得，只要不妨碍本发明的效果就容许上述混入。这样的混入蛋白质的混入量相对于胶束酪蛋白整体，优选为15质量％以下，更优选为10质量％以下，进一步优选为5质量％以下。
需要说明的是，已知乳中的酪蛋白与乳清蛋白的含有比率通常约为8∶2，但本发明中使用的胶束酪蛋白中的酪蛋白与乳清蛋白的含有比率优选为酪蛋白∶乳清蛋白＝8∶2，更优选9∶1。
作为本发明中的胶束酪蛋白，还可以使用市售的物质。例如优选列举出Milei(Milei、德国)公司中利用前述那样的膜处理制造出的胶束酪蛋白、Ingredia公司制(例如，Prodiet 87B Fluid)的胶束酪蛋白。
一直以来进行了从脱脂乳获得酪蛋白材料的技术，但利用现有的方法由脱脂乳制备的酪蛋白材料未保持胶束胶体的形态，区别于本发明中的有效成分。
例如，以往由从生乳中去除了脂质的脱脂乳经过如下工序而以酪蛋白盐的形式制备了酪蛋白，所述工序：进行通过添加硫酸等酸的酸凝固反应、通过添加凝乳酶的酶反应，为了分离凝胶化的蛋白质的预加热工序；用于通过氢氧化钠等碱使沉淀的酪蛋白可溶化的加热工序。需要说明的是，在本说明书中将通过酸凝固反应将乳清分离而得到的酪蛋白记为“酸酪蛋白材料”。另外，在本说明书中将对酸酪蛋白实施氢氧化钠处理而得到的酪蛋白记为“酪蛋白钠材料”。
作为本发明的GLP-1分泌促进剂和GLP-1分泌促进用组合物的有效成分的胶束酪蛋白的水解物优选为通过蛋白质分解酶等而得到的酶分解物。作为用于该酶分解物的酶，只要是蛋白质分解酶等酶就可以是任意的酶，优选能够在将胶束酪蛋白摄取至体内时在消化道中能够模拟消化的状态的胃内酶，例如可列举出胃蛋白酶、胰酶等。另外，通过这些蛋白质分解酶的分解可以在通常在体内消化道中消化的条件(pH、反应温度、反应时间、酶浓度等)下进行。
另外，作为胶束酪蛋白的酶分解物，可以是用蛋白质分解酶等将胶束酪蛋白分解时的粗分解物、分解物的级分及纯化物中的任意者。
本发明中的胶束酪蛋白的水解物的重均分子量(Mw)优选为400～5000，更优选为500～3500，还特别优选为1000～2000。上述水解物通常具有在将胶束酪蛋白摄取至体内时通过蛋白质分解酶而分解时的消化物的大小和结构，如后述的实施例中所示在其大小、结构以及GLP-1分泌促进作用和/或GLP-1分泌刺激活性方面区别于在其它酪蛋白材料的相同条件下的消化物。
需要说明的是，此处重均分子量是利用以下的方法测定和计算出的值。即，利用高效液相色谱法，使用聚羟乙基天冬酰胺柱(Poly Hydroxyethyl Aspartamide Column：PolyLC公司制；直径4.6×200mm)，通过20mM氯化钠、50mM甲酸以洗脱速度0.4mL/分钟洗脱(宇井信生等编，《蛋白質·ペプチドの高速液体クロマトグラフィー》(蛋白质·肽的高效液相色谱法)、化学增刊第102号、第241页、化学同人株式会社、1984年)。使用UV检测器(株式会社岛津制作所制)进行检测，通过GPC分析系统(株式会社岛津制作所制)进行数据解析而计算出重均分子量。需要说明的是，用于计算分子量的标准品适宜使用分子量已知的蛋白质和/或肽即可，例如可以使用后述的实施例中使用的参照标准品。
本发明的GLP-1分泌促进剂和分泌促进用组合物的有效成分如前所述还可以是胶束酪蛋白的水解物的级分或纯化物。在此情况下，从水解物中选择的级分或纯化物具有将胶束酪蛋白摄取至体内时通过蛋白质分解酶而分解时的消化物中富含的肽片段，另外具有GLP-1分泌促进作用和/或GLP-1分泌刺激活性。
前述胶束酪蛋白的水解物的级分或纯化物优选含有包含序列号1～7中任一项所示的氨基酸序列的肽。包含序列号1～7中任一项所示的氨基酸序列的肽可以是1种，还可以包含多种。
另外，包含序列号1～7中任一项所示的氨基酸序列的肽具有GLP-1分泌促进作用和/或GLP-1分泌刺激活性，因此除了包含在胶束酪蛋白的水解物或其级分或纯化物中的形态之外，还可以以通过化学合成或生物合成而获得的肽的形态包含在GLP-1分泌促进用组合物中。因此，含有1种或多种包含序列号1～7中任一项所示的氨基酸序列的肽作为有效成分的GLP-1分泌促进用组合物也包含在本发明中。
此处，还可以以其盐类的形态含有包含序列号1～7中任一项所示的氨基酸序列的肽。另外，前述肽只要包含序列号1～7中任一项所示的氨基酸序列，就还可以是在其C末端和/或N末端侧添加了1个或多个任意的氨基酸的肽。此处多个优选为2～10个，但没有特别限定。
这些肽是大多数存在于通过蛋白质分解酶而消化的胶束酪蛋白水解物中，且是推测有助于促进GLP-1分泌的肽片段。特别是，由序列号1～5所示的氨基酸序列组成的肽是被证实存在于胶束酪蛋白水解物中但在酪蛋白发生水解时不产生的肽。另外，由序列号6～7所示的氨基酸序列组成的肽还被证实既存在于胶束酪蛋白水解物中也存在于酪蛋白水解物中。可推测出这些水解物中存在的差异是由酪蛋白的胶束结构的有无导致的消化模式的不同所引起的。
本发明的GLP-1分泌促进剂和分泌促进用组合物具有GLP-1分泌促进作用和/或分泌刺激活性。具体而言，通过摄取GLP-1分泌促进剂或GLP-1分泌促进用组合物，从而与未摄取的情况相比能够增加消化道中源自肠道分泌细胞L细胞的GLP-1的分泌量。
因此，针对通过促进GLP-1分泌而能预防或改善的疾病、病状或者起因于GLP-1分泌障碍的疾病、病状的对象者是有用的。例如，针对高血糖、糖尿病、肥胖症或贪食症的患者，能够用于其预防和/或改善，另外还能够用于饮食疗法中的食欲抑制。另外，本发明的GLP-1分泌促进剂和GLP-1分泌促进用组合物的应用可以是治疗性使用或非治疗性使用。需要说明的是，“非治疗性”是指不包括医疗行为、即对人体进行通过治疗的处置行为的概念。
即，本发明的其它方式为促进GLP-1分泌的方法，所述方法包括将本发明的GLP-1分泌促进剂或GLP-1分泌促进用组合物向对象给予的工序。进而，可以是通过促进GLP-1分泌来治疗、改善和/或预防前述的疾病或病状的方法；另外，还可以是抑制对象的餐后血糖值上升和/或食欲的方法。
另外，本发明的其它方案为选自胶束酪蛋白、其水解物、其级分、其纯化物及包含序列号1～7中任一项所示的氨基酸序列的肽中的任意者在制造GLP-1分泌促进剂或GLP-1分泌促进用组合物中的应用。
另外，其它方案为选自胶束酪蛋白、其水解物、其级分、其纯化物及包含序列号1～7中任一项所示的氨基酸序列的肽中的任意者在促进GLP-1分泌中的应用。
＜药物组合物＞
本发明的GLP-1分泌促进用组合物的优选的方式为GLP-1分泌促进用药物组合物。
上述药物组合物的给药形态可以是经口给药和非经口给药中的任意者，但优选经口给药。作为非经口给药，例如可优选列举出对胃或小肠的直接给药等。
上述药物组合物可以根据给药方法适宜制剂化成期望的剂型。例如，经口给药的情况，可以制剂化成散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂等固体制剂；溶液剂、糖浆剂、悬浮剂、乳剂等液体制剂等。另外，非经口给药的情况，可以制剂化成栓剂、软膏剂等。
此外，制剂化可以根据剂型利用适宜公知的方法来实施。在制剂化时，还可以适宜配混制剂载体来进行制剂化。
制剂中的胶束酪蛋白和/或其水解物的含量没有特别限定，可以根据剂型基于每一天的摄取量或给药量进行适宜选择。例如，经口给药制剂的情况，成人1天的摄取量或给药量以胶束酪蛋白的蛋白质量换算计或以胶束酪蛋白的水解物的肽量换算计优选0.1～4g/kg体重/天，更优选0.2～2g/kg体重/天，进一步优选0.4～1.2g/kg体重/天。
在进行制剂化时，除了本发明的GLP-1分泌促进用组合物的有效成分之外，只要不损害本发明的效果，就可以根据剂型使用药理学上可容许的各种有机或无机的载体。作为固体制剂时的载体，例如可列举出：赋形剂、结合剂、崩解剂、润滑剂、稳定剂、矫味剂等。另外，还可以含有通常制剂化中使用的pH调节剂、着色剂、矫味剂等成分。
作为赋形剂，可列举例如：乳糖、白糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇等糖衍生物；玉米淀粉、马铃薯淀粉、α-淀粉、糊精、羧甲基淀粉等淀粉衍生物；结晶纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙等纤维素衍生物；阿拉伯胶；葡聚糖；普鲁兰多糖；轻质无水硅酸、合成硅酸铝、偏硅酸铝酸镁等硅酸盐衍生物；磷酸钙等磷酸盐衍生物；碳酸钙等碳酸盐衍生物；硫酸钙等硫酸盐衍生物等。
作为结合剂，例如除了上述赋形剂以外还可列举：明胶；聚乙烯基吡咯烷酮；Macrogol等。
作为崩解剂，例如除了上述赋形剂以外还可列举：交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯基吡咯烷酮等经化学修饰的淀粉或纤维素衍生物等。
作为润滑剂，可列举例如：滑石；硬脂酸；硬脂酸钙、硬脂酸镁等硬脂酸金属盐；胶体二氧化硅；胶状硅酸镁铝(VEEGUM)、鲸蜡等蜡类；硼酸；甘醇；富马酸、己二酸等羧酸类；苯甲酸钠等羧酸钠盐；硫酸钠等硫酸盐类；亮氨酸；月桂基硫酸钠、月桂基硫酸镁等月桂基硫酸盐；硅酸酐、硅酸水合物等硅酸类；淀粉衍生物等。
作为稳定剂，可列举例如：对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯等对羟基苯甲酸酯类；氯代丁醇、苯甲醇、苯乙醇等醇类；苯扎氯铵；乙酸酐；山梨酸等。
作为矫味剂，可列举例如甜味剂、酸味剂、香料等。
需要说明的是，作为经口给药用的液体制剂的情况下所使用的载体，可列举水等溶剂。
本发明的GLP-1分泌促进用药物组合物如前所述具有促进消化道中的GLP-1分泌的作用，GLP-1具有血糖值降低作用。因此，摄取本发明的药物组合物的时机没有特别限定，例如优选在餐前2小时～餐后2小时的范围内摄取或给药，更优选餐前1小时～餐后1小时。
本发明的药物组合物针对通过促进GLP-1分泌而能预防或改善的疾病、病状或者起因于GLP-1分泌障碍的疾病、病状的对象者是有用的。例如，可以是高血糖、糖尿病、肥胖症或贪食症的预防和/或改善用途。另外可以是餐后血糖值上升抑制用途或食欲抑制用途。
本发明的其它方案为选自胶束酪蛋白、其水解物、其级分、其纯化物及包含序列号1～7中任一项所示的氨基酸序列的肽中的任意者在制造药物组合物中的应用，所述药物组合物是高血糖、糖尿病、肥胖症或贪食症的预防和/或改善用途或餐后血糖值抑制用或食欲抑制用途的药物组合物。
另外其它方案为选自胶束酪蛋白、其水解物、其级分、其纯化物及包含序列号1～7中任一项所示的氨基酸序列的肽中的任意者在高血糖、糖尿病、肥胖症或贪食症的预防和/或改善或者餐后血糖值抑制或食欲抑制中的应用。
另外其它方案为选自胶束酪蛋白、其水解物、其级分、其纯化物及包含序列号1～7中任一项所示的氨基酸序列的肽中的任意者在高血糖、糖尿病、肥胖症或贪食症的预防和/或改善或者餐后血糖值抑制或食欲抑制中的应用。
＜饮食品组合物＞
本发明的GLP-1分泌促进用组合物的其它优选的方式为GLP-1分泌促进用的饮食品组合物。
在该方式中，可以将本发明的GLP-1分泌促进剂或GLP-1分泌促进用组合物作为有效成分配混在饮食品中，还可以将GLP-1分泌促进用组合物本身制成饮食品组合物的形态。
本发明的饮食品组合物无论液态、膏状、固体、粉末等形态，除了片剂状糖果、流食、饲料(包括宠物用)等以外，还可列举例如：小麦粉制品、速食食品、农产加工品、水产加工品、畜产加工品、乳/乳制品、油脂类、基础调味料、复合调味料/食品类、冷冻食品、点心类、饮料、这些以外的市售品等。
另外，本发明的饮食品组合物中除了本发明的GLP-1分泌促进用组合物的有效成分之外，只要是食品卫生法等食品规定中容许在饮食品中使用的物质且不损害本发明的效果就可以没有特别限制地含有。例如可以含有糊精、淀粉等碳水化合物；明胶、大豆蛋白、玉米蛋白等蛋白质；丙氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸等氨基酸类；纤维素、阿拉伯胶等多糖类；大豆油、中链脂肪酸甘油三酯等油脂类等。特别是含有碳水化合物的情况下，控制血糖值的同时能够摄取营养的本发明的效果的意义很大，故而优选。
另外，本发明的饮食品组合物可以以标示出GLP-1分泌促进有效的疾病的预防或治疗的用途等的保健用途的饮食品的形式提供/贩卖。
“标示”行为包括用于使需要者知悉上述用途的全部行为，只要是可想起/类推上述用途的表现方式则不论标示目的、标示内容、标示对象物/介质等如何，均相当于本发明的“标示”行为。
另外，“标示”优选通过使需要者直接意识到上述用途的表现方式来进行。具体而言，可列举对在饮食品的商品或商品的包装上记载了上述用途的物品进行转让、交货、为了转让或交货而进行展示、进口的行为；在与商品有关的广告、价格表或交易文件中记载上述用途并展示或发布、或在以这些为内容的信息中记载上述用途并通过电磁方法(互联网等)进行提供的行为；等。
另一方面，作为标示内容，优选为得到行政等许可的标示(例如，基于行政规定的各种制度而得到许可、并以基于该得到许可的形态进行的标示)。另外优选在包装、容器、商品目录、宣传手册、POP等销售现场的宣传材料、其他文件等中带有这样的标示内容。
另外，作为“标示”，可例示出作为健康食品、功能性食品、经肠营养食品、特别用途食品、保健功能食品、特定保健用食品、营养功能食品、功能性标示食品、准药品等的标示。这些中，可特别列举：经消费厅许可的标示，例如被特定保健用食品、营养功能食品、或功能性标示食品相关的制度、或与这些类似的制度许可的标示等。具体可列举：作为特定保健用食品的标示、作为附加条件的特定保健用食品的标示、主旨为对身体的结构和功能带来影响的标示、降低疾病风险的标示、基于科学根据的功能性的标示等，更具体而言，典型的例子为：作为关于健康增进法中规定的特别用途标示的许可等的内阁府令(平成二十一年八月三十一日内阁府令第五十七号)所规定的特定保健用食品的标示(特别是保健用途的标示)及与其类似的标示。
需要说明的是，制造饮食品组合物时的胶束酪蛋白和/或其水解物的含量没有特别限定，可以基于每一天的摄取量进行适宜选择。例如，成人1天的摄取量以胶束酪蛋白的蛋白质量换算计或以胶束酪蛋白的水解物的肽量换算计优选0.1～4g/kg体重/天，更优选0.2～2g/kg体重/天，进一步优选0.4～1.2g/kg体重/天。
本发明的GLP-1分泌促进剂和GLP-1分泌促进用组合物如前所述具有刺激消化道中的GLP-1分泌并促进分泌的作用，GLP-1具有血糖值降低作用。通过将本发明的GLP-1分泌促进用组合物制成饮食品组合物的形态，从而在饮食时能够促进GLP-1分泌，其结果能够抑制由饮食所致的血糖值上升。
因此，本发明的饮食品组合物针对能通过促进GLP-1分泌来预防或改善的疾病、病状或者起因于GLP-1分泌障碍的疾病、病状的对象者是有用的。例如，对于高血糖、糖尿病、肥胖症或贪食症的患者能够用于其预防和/或改善，另外还能用于抑制餐后血糖值上升、用于饮食疗法中的食欲抑制。
本发明的其它方案为选自胶束酪蛋白、其水解物、其级分、其纯化物及包含序列号1～7中任一项所示的氨基酸序列的肽中的任意者在制造饮食品组合物中的应用，所述饮食品组合物是高血糖、糖尿病、肥胖症或贪食症的预防和/或改善用途、或者餐后血糖值抑制用途或食欲抑制用途的饮食品组合物。
实施例
以下使用实施例对本发明进行进一步具体地说明，但本发明不限定于这些实施例。
通过以下的实施例研究了胶束酪蛋白的GLP-1分泌促进活性(分泌刺激活性)。
＜实施例1＞胶束酪蛋白与酸酪蛋白材料或酪蛋白钠材料的GLP-1分泌促进活性(分泌刺激活性)的比较
(1)试样的制备
作为胶束酪蛋白，使用由Milei公司制造的胶束酪蛋白。作为对比，分别准备了利用现有方法由脱脂乳制备的酸酪蛋白材料(Lactic Casein 720、Fonterra公司制)和酪蛋白钠材料(Tatua100、Tatua公司制)作为试样。
将各试样溶解于MiliQ水中，使用Bradford法制成蛋白质浓度7.5mg/mL。对于这些各溶液，使用1mol/L的盐酸调节为与人胃内相同的pH2.0后，添加蛋白质量的1/12.5(w/w)量的胃蛋白酶(Pep、Sigma-Aldrich；在1mM HCl中)，在37℃的恒温槽中以140rpm振荡30分钟。然后，使用1mol/L的碳酸氢钠调节为pH7.0，停止通过胃蛋白酶的消化反应。接着，添加蛋白质量的1/62.5(w/w)量的胰酶(Pan、Sigma-Aldrich；在0.1M NaHCO3中)，在37℃的恒温槽中以140rpm振荡目标时间(5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、120分钟或整夜反应)。然后，通过在90℃下加热3分钟而停止了通过胰酶的消化反应。将这些消化后溶液冷冻干燥并在4℃下保存。这些消化反应模拟在体内摄取胶束酪蛋白和各种酪蛋白材料时在消化道中消化的状态。
(2)使用了来源于小鼠下部消化道的肠道分泌细胞株(GLUTag细胞)的细胞分析
将GLUTag细胞(例如，参照Food Funct.,2015,vol.6,p.2525-2534)在包含10％的胎牛血清的培养基(杜尔贝科改良伊格尔培养基，(Dulbecco's Modified Eagle'sMedium，DMEM)、GIBCO公司)中、在37℃、5％CO2孵化器中培养2～3天至亚汇合。然后去除培养基，通过HEPES缓冲液(20mM HEPES(Sigma)、140mM NaCl(Wako)、4.5mM KCl(Wako)、10mM葡萄糖(Wako)、1.2mM MgCl2(Wako)、1.2mM CaCl2(Wako)、0.1％BSA(Sigma)、pH7.4)将细胞悬浮2次。
用HEPES缓冲液溶解前述(1)的冷冻干燥试样使各为5mg/mL的浓度，向培养GLUTag细胞的48孔培养用孔板的各孔中各添加80μL，在37℃下进行孵育。进行处置后回收培养上清液，以800g、4℃进行5分钟离心分离，将其上清液作为ELISA测定用样品，在-80℃下保存。上清液中的GLP-1量依据厂商推荐的协议并使用ELISA(Millipore)进行测定。GLP-1量表示为将仅用HEPES缓冲液处置的组(空白组)作为100％的相对量。样品数均以n＝3进行。
将通过处置各试样而分泌的GLP-1量的测定结果示于表1。胶束酪蛋白与现有的作为酪蛋白材料的酸酪蛋白材料和酪蛋白钠材料相比，对GLUTag细胞的GLP-1分泌刺激活性在任意的消化条件下均显著增高。另一方面，未观察到酸酪蛋白材料与酪蛋白钠材料之间的GLP-1分泌刺激活性存在显著差异。进而，可观察到两者的GLP-1分泌刺激活性之差随着酪蛋白的消化进展而变得显著的倾向。需要说明的是，这些数据的显著差异检验使用Tukey-Kramer法。
需要说明的是，专利文献4中GLP-1分泌刺激活性得到确认的κ-酪蛋白试样含有本实施例中的酸酪蛋白材料。
[表1]
＜实施例2＞胶束酪蛋白与酪蛋白钠材料和乳清蛋白的混合物的GLP-1分泌促进活性(分泌刺激活性)的比较
通过膜处理等，从脱脂乳中去除粒径0.1～0.2μm以下的成分而得到的胶束酪蛋白可以以与酪蛋白一起存在10％左右的乳清蛋白的形态获得。测定了实施例1中使用的胶束酪蛋白的批量制品的酪蛋白：乳清蛋白的质量比，结果为90.6∶9.4。
然而，已知乳清蛋白在未分解物和分解物中也具有GLP-1分泌刺激活性(FoodChemistry,189,2015,p.120-128)。
因此，为了确认实施例1中得到确认的胶束酪蛋白的GLP-1分泌刺激活性不仅仅起因于乳清蛋白而进行了以下的试验。
(1)试样的制备
准备以质量比90.6∶9.4混合实施例1中使用的胶束酪蛋白、酪蛋白钠材料(Tatua100、Tatua公司)及乳清蛋白纯化物(Whey Protein Isolate：WPI、WPI8855、Fonterra公司)而成的组合物作为试样。对于各试样，将胰酶的反应时间设为30分钟、60分钟或120分钟，除此以外在与实施例1同样的方法/条件下进行通过胃蛋白酶和胰酶的消化反应，将消化后的溶液冷冻干燥并在4℃下保存。
(2)使用了来源于小鼠下部消化道的肠道分泌细胞株(GLUTag细胞)的细胞分析
对于前述(1)的冷冻干燥试样，在与实施例1同样的方法/条件下进行使用了GLUTag细胞的分析，GLP-1分泌量表示为将空白组作为100％的相对量。样品数均以n＝3进行。
将通过处置各试样而分泌的GLP-1量的测定结果示于表2。
与酪蛋白钠材料和乳清蛋白纯化物的混合物相比，胶束酪蛋白可观察到GLP-1分泌刺激活性高的倾向。其中，在胃蛋白酶和胰酶60分钟或胃蛋白酶和胰酶120分钟的消化条件下显著增高。该结果启示出：通过胶束酪蛋白的高GLP-1分泌刺激活性不仅仅起因于在通过膜处理的制备中混入的10％左右的乳清蛋白。需要说明的是，这些数据的显著差异检验使用Tukey-Kramer法。
[表2]
※简记：pep：胰岛素处理、pan：胰酶处理、pan后的数字表示处理时间(分钟)。
在同一处置组内，括号内不同的字母的情况表示具有P＜0.05显著差异。
pep的处理时间全部为30分钟
<实施例3>胶束酪蛋白与κ-酪蛋白或κ-酪蛋白酶分解物的GLP-1分泌刺激活性的比较
为了对胶束酪蛋白、与已知具有GLP-1分泌刺激活性的蛋白质即κ-酪蛋白或作为κ-酪蛋白酶分解物的糖巨肽的GLP-1分泌刺激活性进行比较而进行了以下的试验。
(1)试样的制备
准备实施例1中使用的胶束酪蛋白和作为κ-酪蛋白的“κ-casein from bovinemilk(来自牛乳的κ-酪蛋白)”(Sigma-Aldrich公司)作为试样。对于各试样，在与实施例2同样的方法/条件下进行通过胃蛋白酶和胰酶的消化反应，将消化后的溶液冷冻干燥并在4℃下保存。。
(2)使用了来源于小鼠下部消化道的肠道分泌细胞株(GLUTag细胞)的细胞分析
对于前述(1)的冷冻干燥试样，在与实施例1同样的方法/条件下进行使用了GLUTag细胞的分析，GLP-1分泌量以将空白组作为100％的相对量的形式测定。但是，对于κ-酪蛋白材料的试样的消化物，在溶解于HEPES缓冲液中时设为5mg/mL或0.5mg/mL的浓度。另外，还准备糖巨肽(CGMP：Arla公司)作为试样，将标准品以5mg/mL的浓度的方式直接溶解于HEPES缓冲液中。另外，在分析时将用70mM KCl对GLUTag细胞进行去极化刺激后的细胞作为阳性对照。GLP-1分泌量表示为将空白组作为100％的相对量。样品数均以n＝3～4进行。
将通过处置胶束酪蛋白和κ-酪蛋白而分泌的GLP-1量的测定结果示于表3。
其结果，胶束酪蛋白与κ-酪蛋白相比，在任意的消化条件下均显示出显著高的GLP-1分泌刺激活性。另外，确认了有与未分解物相比该差异在人工消化物(表3中的仅pep、pep+pan30、pep+pan60)中变得显著的倾向。需要说明的是，这些数据的显著差异检验使用Tukey-Kramer法。
[表3]
※简记：pep：胰岛素处理、pan：胰酶处理、pan后的数字表示处理时间(分钟)。
在同一处置组内，括号内不同的字母的情况表示具有P＜0.05显著差异。
pep的处理时间全部为30分钟
将通过处置胶束酪蛋白和κ-酪蛋白酶分解物而分泌的GLP-1量的测定结果示于表4。
其结果，胶束酪蛋白与糖巨肽相比，在所有消化条件下GLP-1分泌刺激活性均显著增高。需要说明的是，这些数据的显著差异检验使用Student t-test法。
需要说明的是，专利文献3中GLP-1分泌促进活性(分泌刺激活性)得到确认的酪蛋白水解物试样含有本实施例中的酪蛋白酶分解物(糖巨肽)。
[表4]
※简记：pep：胰岛素处理、pan：胰酶处理、pan后的数字表示处理时间(分钟)。
***表示与糖巨肽相比具有P＜0.001显著差异。
pep的处理时间全部为30分钟
<实施例4>胶束酪蛋白与酸乳清材料的GLP-1分泌刺激活性的比较
为了对胶束酪蛋白与含有得到酸酪蛋白材料时所产生的酸可溶性蛋白质的酸乳清材料的GLP-1分泌刺激活性进行比较而进行了以下的试验。
(1)试样的制备
准备实施例1中使用的胶束酪蛋白及、作为含有酸可溶性蛋白质的酸乳清的乳清蛋白纯化物(WPI8855、Fonterra公司)作为试样。对于各试样，在与实施例2同样的方法/条件下进行通过胃蛋白酶和胰酶的消化反应，将消化后的溶液冷冻干燥并在4℃下保存。
(2)使用了来源于小鼠下部消化道的肠道分泌细胞株(GLUTag细胞)的细胞分析
对于前述(1)的冷冻干燥试样，在与实施例1同样的方法/条件下进行使用了GLUTag细胞的分析，GLP-1分泌量表示为将空白组作为100％的相对量。样品数均以n＝3进行。
将胶束酪蛋白和酸乳清材料的测定结果示于表5。
其结果，胶束酪蛋白与含有酸可溶性蛋白质的酸乳清材料相比，观察到有GLP-1分泌刺激活性高的倾向。其中，在胃蛋白酶和胰酶60分钟或胃蛋白酶和胰酶120分钟消化条件下显著增高。需要说明的是，这些数据的显著差异检验使用Tukey-Kramer法。
需要说明的是，专利文献2中GLP-1游离刺激活性得到确认的、作为在获得酸酪蛋白材料时所产生的酸乳清中包含的蛋白质的胶束酪蛋白的酸可溶性蛋白质试样相当于本实施例中的酸乳清试样。
[表5]
※简记：pep：胰岛素处理、pan：胰酶处理、pan后的数字表示处理时间(分钟)。
在同一处置组内，括号内不同的字母的情况表示具有P＜0.05显著差异。
pep的处理时间全部为30分钟
<实施例5>胶束酪蛋白与牛乳或生乳的GLP-1分泌刺激活性的比较
为了对胶束酪蛋白与市售牛乳或生乳的GLP-1分泌刺激活性进行比较而进行了以下的试验。
(1)试样的制备
作为实施例1中使用的胶束酪蛋白及市售牛乳，分别准备将“YOTSUBA牛乳(经UHT灭菌)”4批量及生乳4批量作为试样。对于各试样，在与实施例2同样的方法/条件下进行通过胃蛋白酶和胰酶的消化反应，将消化后的溶液冷冻干燥并在4℃下保存。。
(2)使用了来源于小鼠下部消化道的肠道分泌细胞株(GLUTag细胞)的细胞分析
对于前述(1)的冷冻干燥试样，在与实施例1同样的方法/条件下进行使用了GLUTag细胞的分析，GLP-1分泌量表示为将空白组作为100％的相对量。样品数均以n＝3～4进行。
将胶束酪蛋白、市售牛乳、和生乳的测定结果示于表6。
其结果，与市售牛乳和生乳相比，胶束酪蛋白观察到有GLP-1分泌刺激活性高的倾向。其中，在胃蛋白酶和胰酶60分钟消化条件下显著增高。需要说明的是，这些数据的显著差异检验使用Tukey-Kramer法。
[表6]
※简记：pep：胰岛素处理、pan：胰酶处理、pan后的数字表示处理时间(分钟)。
在同一处置组内，括号内相同的字母的情况表示无显著差异，
括号内不同的字母的情况表示具有P＜0.05显著差异。
pep的处理时间全部为30分钟
<实施例6>表现出GLP-1分泌促进活性(分泌刺激活性)的胶束酪蛋白消化物(酶分解物)的研究
为了研究表现出GLP-1分泌促进活性(分泌刺激活性)的胶束酪蛋白的酶分解物、及与该酶分解物在相同条件下消化的酸酪蛋白材料以及酪蛋白钠材料的各酶分解物的分子量分布而进行了试验。
(1)试样的制备
将实施例1中使用的胶束酪蛋白、酸酪蛋白材料及酪蛋白钠材料的各酶分解物(在胃蛋白酶30分钟和胰酶60分钟消化的物质)以成为1mg/ml的浓度的方式溶解于50mM甲酸、20mM氯化钠溶液中，制备了试样。
(2)分子量分布的测定
通过使用了填充有poly-hydroxyethyl-aspartamide(聚羟乙基天冬酰胺)凝胶的柱的高效液相色谱(株式会社岛津制作所制)对(1)中制备的试样进行分析。用GPCsoftware(株式会社岛津制作所制)来分析得到的质谱图，按照分子量范围解析了酶分解物的比例。
需要说明的是，作为用于计算出分子量的参照标准品，分别使用了IgG(分子量：160000道尔顿、Sigma-Aldrich公司制)、乳过氧化物酶(分子量：93000道尔顿、Sigma-Aldrich公司制)、卵白蛋白(分子量：43000道尔顿、Sigma-Aldrich公司制)、胰凝乳蛋白酶原(分子量：25000、Pharmacia公司制)、核糖核酸酶(分子量：13700道尔顿、Pharmacia公司制)、胰岛素(分子量：5740道尔顿、和光纯药工业株式会社制)、杆菌肽(分子量：1427道尔顿、Sigma-Aldrich公司制)、催产素(分子量：1007道尔顿、Bachem Americas社制)、脑啡肽酰胺(分子量：588道尔顿、Bachem Americas社制)、L-蛋氨酸(分子量：149道尔顿、KYOWAHAKKO BIO CO.,LTD.制)、L-谷氨酰胺(分子量：146道尔顿、KYOWA HAKKO BIO CO.,LTD.制)。
将胶束酪蛋白、与酸酪蛋白材料和酪蛋白钠材料的消化物(酶分解物)的分子量分布的结果示于表7。
其结果，确认了存在如下倾向，与酸酪蛋白材料酶分解物和酪蛋白钠材料酶分解物相比，胶束酪蛋白的酶分解物中具有2000道尔顿以上的分子量的分解物多。
测定了各酶分解物的重均分子量(Mw)，结果胶束酪蛋白酶分解物为1554，而酸酪蛋白材料酶分解物为742，酪蛋白钠材料酶分解物为733，胶束酪蛋白的酶分解物与酸酪蛋白材料酶分解物和酪蛋白钠材料酶分解物相比显示出约2倍的重均分子量。
如此，可认为：由于胶束酪蛋白酶分解物与其它蛋白质材料酶分解物相比具有较大的重均分子量，因此在将这些各蛋白质材料供于人工消化时，以分解物的形式产生的肽可能发生结构性差异，启示出该差异可能导致产生人工消化物的GLP-1分泌刺激活性差异。进而，对于以分解物的形式产生的肽不同的情况，由各蛋白质材料的乳材料制备方法的不同产生各蛋白质材料的热历程的不同，其结果，启示出材料中包含的蛋白质的变性、聚集的程度不同，因此可能对消化性产生影响。
[表7]
※分子量范围的数值表示含有比例(％)
<实施例7>合成肽的GLP-1分泌刺激活性的比较
为了鉴定胶束酪蛋白的消化物所具有的较高GLP-1分泌刺激活性的效果本身而进行了以下的试验。
(1)肽的合成
使用纳米液相色谱质谱分析装置(Thermo Scientific)分别对实施例2中使用的“胶束酪蛋白”和“混合了酪蛋白钠材料和乳清蛋白纯化物而成的组合物”的消化物进行分析，由此详尽地解析了消化物中包含的肽片段。在检测出的肽片段中，将大量包含且推测对GLP-1分泌刺激活性的帮助高的7个肽片段(序列号1～7)委托Biosynthesis公司进行合成。购入后在-80℃下保存合成肽(冷冻干燥品)。
(2)使用了来源于小鼠下部消化道的肠道分泌细胞株(GLUTag细胞)的细胞分析
用HEPES缓冲液溶解前述(1)的合成肽使浓度成为1mM或5mM，利用与实施例1同样的方法进行使用了GLUTag细胞的分析。GLP-1分泌量表示为将空白组作为100％的相对量。样品数均以n＝3进行。
将对各合成肽进行处理后在培养基中分泌的游离GLP-1量的测定结果示于表8。其结果，在序列号1的肽(5mM)、序列号2的肽(5mM)、序列号3的肽(1mM)与空白组的比较中，显示出显著高的GLP-1分泌刺激活性。需要说明的是，这些数据的显著差异检验使用Dunnettt-test法。
[表8]
(*)表示与空白组相比具有P＜0.05显著差异。
序列表（SEQUENCE LISTING）
<110> 森永乳业株式会社（Morinaga milk industry co., ltd.）
<120> GLP-1分泌促进剂和组合物
<130> OP-18030-PCT
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 肽1
<400> 1
Gly Pro Val Arg Gly Pro Phe Pro Ile Ile Val
1 5 10
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 肽2
<400> 2
His Ile Gln Lys Glu Asp Val Pro Ser Glu
1 5 10
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 肽3
<400> 3
Tyr Pro Val Glu Pro Phe Thr Glu Ser Gln
1 5 10
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 肽4
<400> 4
His Gln Gly Leu Pro Gln Glu Val Leu Asn Glu
1 5 10
<210> 5
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 肽5
<400> 5
Leu Glu Asp Ser Pro Glu Val Ile Glu Ser Pro Pro Glu Ile Asn Thr
1 5 10 15
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 肽6
<400> 6
Ser Arg Tyr Pro Ser Tyr Gly Leu Asn
1 5
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 肽7
<400> 7
Tyr Gln Lys Phe Pro Gln Tyr Leu
1 5

Claims (13)

1.一种GLP-1分泌促进用组合物，其含有胶束酪蛋白和/或其水解物作为有效成分。
2.根据权利要求1所述的GLP-1分泌促进用组合物，其中，所述胶束酪蛋白的水解物的重均分子量为400～5000。
3.一种GLP-1分泌促进用组合物，其含有胶束酪蛋白的水解物的级分或纯化物作为有效成分。
4.根据权利要求3所述的GLP-1分泌促进用组合物，其中，所述胶束酪蛋白的水解物的级分或纯化物含有1种或多种包含序列号1～7中任一项所示的氨基酸序列的肽。
5.一种GLP-1分泌促进用组合物，其含有1种或多种包含序列号1～7中任一项所示的氨基酸序列的肽作为有效成分。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的GLP-1分泌促进用组合物，其为药物组合物。
7.根据权利要求1～5中任一项所述的GLP-1分泌促进用组合物，其为饮食品组合物。
8.根据权利要求6或7所述的GLP-1分泌促进用组合物，其为高血糖、糖尿病、肥胖症或贪食症的预防和/或改善用途、或者餐后血糖值抑制用途、或者食欲抑制用途。
9.选自胶束酪蛋白、其水解物、其级分、其纯化物及包含序列号1～7中任一项所示的氨基酸序列的肽中的任意者在制造饮食品组合物中的应用，所述饮食品组合物是高血糖、糖尿病、肥胖症或贪食症的预防和/或改善用途、或者餐后血糖值抑制用途或食欲抑制用途的饮食品组合物。
10.选自胶束酪蛋白、其水解物、其级分、其纯化物及包含序列号1～7中任一项所示的氨基酸序列的肽中的任意者在制造药物组合物中的应用，所述药物组合物是高血糖、糖尿病、肥胖症或贪食症的预防和/或改善用途、或者餐后血糖值抑制用途或食欲抑制用途的药物组合物。
11.一种含有选自胶束酪蛋白、其水解物、其级分、其纯化物及包含序列号1～7中任一项所示的氨基酸序列的肽中的任意者的组合物，其用于促进GLP-1分泌、预防和/或改善高血糖、糖尿病、肥胖症或贪食症或者抑制餐后血糖值或抑制食欲。
12.一种预防和/或改善能通过促进GLP-1分泌来预防或改善的疾病或病状或起因于GLP-1分泌障碍的疾病或病状的方法，其包括如下步骤：向对象给予选自胶束酪蛋白、其水解物、其级分、其纯化物及包含序列号1～7中任一项所示的氨基酸序列的肽中的任意者。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述疾病或病状为高血糖、糖尿病、肥胖症或贪食症。
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