CN114806956A

CN114806956A - 贝莱斯芽孢杆菌db219及其应用

Info

Publication number: CN114806956A
Application number: CN202210506467.8A
Authority: CN
Inventors: 吴元锋; 张尧; 胡嘉运; 马雨晨; 孙娟; 宋新杰; 刘晨
Original assignee: Zhejiang Lover Health Science and Technology Development Co Ltd
Current assignee: Zhejiang Lover Health Science and Technology Development Co Ltd
Priority date: 2022-05-11
Filing date: 2022-05-11
Publication date: 2022-07-29
Anticipated expiration: 2042-05-11
Also published as: CN114806956B

Abstract

贝莱斯芽孢杆菌DB219及其应用，属于生物技术领域。本发明一方面提供了一株新的贝莱斯芽孢杆菌DB219，另一方面提供了该贝莱斯芽孢杆菌DB219的应用。发明筛选的贝莱斯芽孢杆菌所产的凝乳酶活性较高，经纯化后，其比酶活、得率和提纯比较高，可以提升凝乳酶的纯化效率，并且大幅度缩短了发酵周期，加快了生产速度，成本低廉，其特性也能更好地满足后期干酪规模化的生产需要，为进一步实现细菌源凝乳酶的工业化生产提供了重要依据。

Description

贝莱斯芽孢杆菌DB219及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及贝莱斯芽孢杆菌DB219及其应用。

背景技术

在奶酪加工生产过程中，凝乳酶是决定奶酪质量的重要因素。凝乳酶的来源主要有三种：动物源、植物源和微生物源。由于市场需求量逐年增加，单纯通过屠宰幼畜提取凝乳酶的方法已经不能适应市场的需要，导致人们不断地去寻找凝乳酶新的来源。近年来，从真菌、酵母和细菌中提取的一些微生物凝乳酶在干酪生产中的应用越来越广泛，尽管如此，寻找高效、优质的凝乳酶替代品仍然是当今的一大研究热题。国内目前对凝乳酶的研究相对滞后，凝乳酶的供应主要依靠国外生产，国内仅有一些科研机构对其进行了较为系统的研究。我国的原制干酪生产工业尚未形成规模化生产，在国内的乳制品消费中占有较少的比重，因而对其生产与加工的研究相对较少。随着国内奶酪市场的不断扩大，以及国内食品加工业的发展，世界范围内的凝乳酶需求量将会进一步加大。因此，提高凝乳酶的产率，提高其产品品质，是推动我国奶业发展的重要因素。

与植物源和动物源的凝乳酶相比，微生物来源的凝乳酶生产成本低，提取容易，经济效益高，生化多样性更广，可以很好地解决小牛皱胃酶供应不足的问题。目前，对细菌源凝乳酶的研究还不多，有关的研究多以枯草芽孢杆菌、淀粉芽孢杆菌为研究对象，且存凝乳活力低、蛋白水解活性高等问题，已成为影响其研究开发及开发利用的瓶颈。与真菌的固态发酵相比，细菌的浸入式发酵在控制发酵程度和物质利用率方面具有明显优势，同时，通过对新菌种进行筛选，优化其发酵工艺，可以有效地解决细菌源凝乳酶的MCA/PA比值较低的问题。因此，关于细菌凝乳酶的研究也越来越多。

从优质原料中筛选出高产凝乳酶的细菌菌株，确定最佳发酵工艺，并对此菌源凝乳酶的凝乳特性进行分析，以确定其凝乳特性能否达到后期干酪生产的要求，对丰富产凝乳酶菌株库及扩大其开发生产具有重要意义。有学者从甜酒曲中分离得到一株解淀粉酶芽孢杆菌，发现其所产凝乳酶最适温度为55℃，最适作用pH 6.5，培养84h酶活达到最高558.13SU/mL。还有学者从黄酒麦曲中筛选得一株枯草芽孢杆菌，发现其所产凝乳酶最适凝乳pH为6.5，发酵24h时凝乳酶活力达到最高 457.72SU/mg。但是，从天然原料中分离得到的凝乳酶活力不高，发酵周期长，在纯化过程中酶活有较大损失，其特性不能很好满足干酪生产的需要。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种贝莱斯芽孢杆菌DB219及其应用的技术方案。该贝莱斯芽孢杆菌DB219具有高凝乳活性、发酵时间短、纯化比高等特性，可用于制备优良性质的凝乳酶以满足干酪生产需要。

本发明具体采用以下技术方案实现：

本发明第一方面提供了一株贝莱斯芽孢杆菌DB219，分类命名为Bacillusvelezensis。该菌株已于2022年03月31日保藏于中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，其保藏编号为：CGMCC No.24624。

该菌株分离筛自黑龙江省穆棱市奶牛场挤奶区土壤。

该菌株筛选方法如下：根据宁夏、云南、黑龙江安达、黑龙江穆棱、山东青岛、山东枣庄等地奶牛场中所筛选得到的90余株菌中通过分析各菌株在酪蛋白平板上形成的沉淀圈和水解圈情况，确定具有产凝乳酶能力的菌株。进一步分析具有产凝乳酶能力的菌株单菌落在酪蛋白平板上不同时间点菌落直径、沉淀圈与水解圈直径的比值情况，挑选比值较大的菌株。对挑选的若干菌株进行发酵培养，测定分析不同发酵时间蛋白酶水解活力，所产凝乳酶的凝乳活力、蛋白水解活力及凝乳后的脱脂乳pH值，综合对比，确定菌株。

本发明第二方面提供了贝莱斯芽孢杆菌DB219在制备凝乳酶中的应用。

本发明第三方面提供了利用贝莱斯芽孢杆菌DB219制备凝乳酶的方法，其包括以下步骤：

1)将贝莱斯芽孢杆菌DB219涂布、划线培养12h，然后接种于改良TYC培养基中37℃，180r/min震荡培养10～12h得到种子液；

2)将上述种子液以5％体积比接种量接种于麸皮培养基中于37℃，180r/min 震荡培养36～48h得发酵液，将所得到的发酵液低温离心取上清液；

3)将硫酸铵与步骤2)中所得的上清液混合，于4℃下沉淀2h，低温高速离心弃上清，收集沉淀，复溶于20mmol/L pH 7.0的Tris-HCl缓冲液中，于4℃下搅拌透析12h，经冷冻干燥后得粗制凝乳酶粉末；

4)将粗酶溶于20mmol/L pH 7.0的Tris-HCl缓冲液，通过0.22μm滤膜，经 DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析分离纯化并透析、冻干后得到凝乳酶产品。

进一步，所述步骤1)中改良TYC培养基为：葡萄糖50g，酪蛋白胨15g，氯化钠1g，碳酸氢钠2g，L-胱氨酸0.2g，磷酸氢二钠2g，酵母膏5g，去离子水定容至1000mL，115℃灭菌20min；所述步骤2)中麸皮培养基为：去离子水 1000mL，熟小麦细麸皮20～60g，可溶性淀粉10g，玉米浆3g，115℃灭菌20min。

进一步，所述步骤3)中硫酸铵与上清液混合的混合液，其硫酸铵饱和度为60％。

进一步，所述步骤3)中冷冻干燥以及步骤4)中冻干参数为：-80℃预冻300 min；-80℃冻干800min。

进一步，所述步骤4)中DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱，体积为5 mL，起始洗脱条件为20mmol/L pH 8.5的Tris-HCl缓冲液，流速为0.5mL/min。

进一步，所述步骤4)中透析条件为：4℃下搅拌透析12h。

本发明第四方面提供了一种通过上述任一方法制备得到的凝乳酶。

本发明所述凝乳酶活性指：40min凝集l mL 10％脱脂奶粉的酶量义为—个活力单位SU(Soxhlet unit)。

凝乳活力(SU)＝(供试乳数量/凝乳酶量)×2400/T×N，式中：2400为40min 转化为秒为单位；N为稀释倍数；T为凝乳时间，s。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极效应在于：本发明筛选的贝莱斯芽孢杆菌经10～12h震荡培养后发酵36～48h即可达到最大凝乳活性，可达1200SU/mL以上，经纯化后比酶活为6110SU/mg，得率为28.87％，提纯比达3.16。此外，在底物浓度pH较低时凝乳活力低，从而使得凝乳酶在奶酪生产后期更易排出。

因此，本发明筛选的贝莱斯芽孢杆菌所产的凝乳酶活性较高，经纯化后，其比酶活、得率和提纯比较高，可以提升凝乳酶的纯化效率，并且大幅度缩短了发酵周期，加快了生产速度，成本低廉，其特性也能更好地满足后期干酪规模化的生产需要，为进一步实现细菌源凝乳酶的工业化生产提供了重要依据。

附图说明

图1贝莱斯芽孢杆菌DB219 16S rRNA系统发育树；

图2为DB219凝乳酶的pH稳定性；

图3为DB219凝乳酶的热稳定性；

图4为底物钙离子浓度对DB218凝乳酶活力的影响；

图5为DB219凝乳酶的凝乳形态；

图6为DB219凝乳酶在奶酪制作中的应用。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均视为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特别说明，均可从商业途径得到。

实施例中测凝乳酶活力(MCA)的步骤如下：

取V_s体积的未稀释或用0.05mol/L、pH 7.0PBS稀释一定倍数的贝莱斯芽孢杆菌发酵上清液在35℃水浴中孵育10min，加入到V_E体积的含有10mM CaCl₂的10％(w/v)脱脂乳溶液中，每15s将样品取出并倾斜45°观察样品状态，若无变化则快速放回水浴，形成不连续颗粒时停止计时，并记为时间T。

MCA＝(2400×V_S×N)/(T×V_E)。式中：MCA为凝乳酶活力(SU/mL)；V_s为脱脂乳底物体积(mL)，V_E为酶液体积(mL)，T为凝乳时间(s)，N为MCE稀释倍数。

实施例中用考马斯亮蓝法和凯氏定氮仪测定样品蛋白含量，其中考马斯亮蓝法步骤如下：

Bradford工作液配置方法为：100mg考马斯亮蓝G250，40mL 95％乙醇，100 mL85％磷酸，去离子水定容至1L；绘制蛋白质样品标准曲线；加入20μL的样品稀释液，以及200μL Bradford工作液迅速混匀，室温25～30℃，反应5min后，在酶标仪上测各孔的A595值。

实施例1：贝莱斯芽孢杆菌DB219的获得

根据宁夏、云南、黑龙江安达、黑龙江穆棱、山东青岛、山东枣庄等地奶牛场中所筛选得到的90余株菌中通过分析各菌株在酪蛋白平板上形成的沉淀圈和水解圈情况，确定具有产凝乳酶能力的菌株，其中部分优选菌株的形态和凝乳潜力见表1。进一步分析具有产凝乳酶能力的菌株单菌落在酪蛋白平板上不同时间点菌落直径、沉淀圈与水解圈直径的比值情况，挑选比值较大的菌株。对挑选的若干菌株进行发酵培养，测定分析不同发酵时间蛋白酶水解活力，所产凝乳酶的凝乳活力、蛋白水解活力及凝乳后的脱脂乳pH值，选择具有凝乳活力大、蛋白水解活力小的非产酸特性菌株。通过16S rRNA测序、绘制同源性系统发育树(见图1)、API 20 E理化实验、API 50 CHB鉴定和产酶情况复筛，获得一株高产凝乳酶的贝莱斯芽孢杆菌DB219并获得登陆号OM188386，并且保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24624。

表1部分优选菌株的形态和凝乳潜力

注：“+”为阳性；“–”为阴性。

实施例2

(1)将贝莱斯芽孢杆菌涂布、划线培养12h，然后接种于改良后的TYC培养基中37℃，180r/min震荡培养10～12h得到种子液，所述菌株为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)DB219，保藏编号为CGMCC No.24624；改良TYC培养基为：葡萄糖50g，酪蛋白胨15g，氯化钠1g，碳酸氢钠2g，L-胱氨酸0.2g，磷酸氢二钠2g，酵母膏5g，去离子水定容至1000mL，115℃灭菌20min；

(2)将上述种子液以5％接种量接种于麸皮培养基中于37℃，180r/min震荡培养36～48h得发酵液，将所得到的发酵液低温离心取上清液，所述百分比为体积百分比，麸皮培养基为：去离子水1000mL，熟小麦细麸皮60g，115℃灭菌 20min；

(3)将硫酸铵与步骤(2)中所得的上清液混合，硫酸铵饱和度为60％，于 4℃下沉淀2h，低温高速离心弃上清，收集沉淀，复溶于20mmol/L pH 7.0的 Tris-HCl缓冲液中，于4℃下搅拌透析12h，经冷冻干燥后得粗制凝乳酶粉末，冷冻干燥条件为：-80℃预冻300min；-80℃冻干800min；

(4)将粗酶溶于20mmol/L pH 7.0的Tris-HCl缓冲液，通过0.22μm滤膜，经DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析分离纯化并透析、冻干后得到凝乳酶产品，冻干条件为-80℃预冻300min；-80℃冻干800min，DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱，体积为5mL，起始洗脱条件为20mmol/L pH 8.5的Tris-HCl 缓冲液，流速为0.5mL/min，透析条件为：4℃下搅拌透析12h；

(5)将步骤(4)所得凝乳酶产品溶于去离子水中，探究该贝莱斯芽孢杆菌凝乳酶在后期奶酪制作过程中所具备的优良性质。

在实施例2的基础上，采用不同的发酵时间进行对比。

表2 DB219 MCE的MCA随发酵时间的变化

表2的结果说明当DB219以改良TYC作为培养基，发酵时间为48h时，凝乳活力值达到最大1198SU/ml。同时说明，DB219菌株的天然发酵凝乳活性较一般芽孢杆菌高，故本发明选择的发酵时间为36～48h。

表3不同发酵时间的凝乳pH

表3的结果说明，DB219在发酵过程中，凝乳pH比较稳定，基本保持在 6.64。

实施例3

在250mL锥形瓶中分别配置50mL含有20、30、40、50、60和70g/L麸皮的培养基，所述百分比为体积百分比，其余条件和操作步骤均与实施例2完全相同。

表4不同麸皮浓度对凝乳酶活力的影响

由表4的结果表明，当DB219采用改良的培养及发酵方法时，麸皮浓度在 20～60g/L范围内，麸皮浓度越高，最大酶活逐渐增加，但随着麸皮浓度继续增大，最大酶活逐渐减小，产酶时间逐渐缩短，故本发明选择的麸皮浓度为20～60 g/L。

实施例4

在实施例3的最优发酵培养基基础上，在250mL锥形瓶中分别配置50mL 含有额外10g/L葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麦芽糊精和乳糖不同碳源的发酵培养基，所述百分比为体积百分比，其余条件和操作步骤均与实施例2完全相同。

表5额外添加不同碳源对凝乳酶活力的影响

由表5的结果表明，当DB219发酵时在最优麸皮浓度培养基础上额外添加碳源时，葡萄糖对DB219产酶有明显抑制，可溶性淀粉对DB219产酶有显著性促进作用。

实施例5

在实施例4的最优发酵培养基基础上，在250mL锥形瓶中分别配置50mL 含有额外3g/L玉米浆、酪蛋白胨、尿素、酵母浸出粉、硫酸铵和柠檬酸铵不同氮源的发酵培养基，所述百分比为体积百分比，其余条件和操作步骤均与实施例 2完全相同。

表6额外添加不同氮源对凝乳酶活力的影响

由表5的结果表明，当DB219发酵时在最优发酵培养基基础上额外添加氮源时，尿素、硫酸铵和柠檬酸铵对DB219产酶有明显抑制，玉米浆、酪蛋白胨和酵母浸出粉对DB219产酶有显著性促进作用，其中玉米浆作用效果最佳。

实施例6

表7凝乳酶的纯化

如表3所示，在实施例5的最优发酵培养基基础上采用本实施例的一种贝莱斯芽孢杆菌凝乳酶的制备方法后，纯化比酶活为6110SU/mg，得率为28.87％，提纯比达到3.16，凝乳酶纯化后比酶活、得率和提纯比都有提高。

实施例7

取凝乳酶成品，分别配置pH为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的脱脂乳溶液，测定不同pH条件下的凝乳酶活力。结果如图2所示，随着pH的升高，凝乳酶酶活力逐渐下降，当pH达到7.5时基本上失活，在pH5.5得脱脂乳溶液中，相对酶活最大，凝乳形态如图5所示。

实施例8

取凝乳酶成品，分别于35、40、45、50、55和60℃水浴中分别孵育10、20、 30、40和50min，以脱脂乳溶液为底物，测定凝乳酶活力。结果如图3所示，当温度增加到55℃，酶活呈明显下降趋势，在60℃下水浴30min，酶活几乎完全消失。

实施例9

取凝乳酶成品，分别配置含有0、10、20、30、40、50、60、70、80、90和 100mM CaCl₂的脱脂乳溶液，测定不同钙离子浓度下的凝乳酶活力。结果如图4 所示，凝乳活力在含有20mMCa²⁺的脱脂乳溶液中达到最大，是对照组的1.2倍。

实施例10

将牛奶巴氏杀菌后冷却，加入活化后的发酵剂进行发酵和预酸化。当牛奶pH 降至6.3时加入0.1g/L CaCl₂，混匀后立即加入凝乳酶溶液，等待凝乳。凝乳结束后，将其切割成均匀的乳块并静置3-5min。随即进行搅拌和升温，排乳清结束后，将聚集的乳块切割成小块并加入食盐搅拌均匀。最后将其入模并置于15℃中成熟28天，结果如图6所示。

Claims

1.贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)DB219，其保藏编号为CGMCC No.24624。

2.如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌DB219在制备凝乳酶中的应用。

3.利用权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌DB219制备凝乳酶的方法，其特征在于包括以下步骤：

2)将上述种子液以5％体积比接种量接种于发酵培养基中于37℃，180r/min震荡培养36～48h得发酵液，将所得到的发酵液低温离心取上清液；

4)将粗酶溶于20mmol/L pH 7.0的Tris-HCl缓冲液，通过0.22μm滤膜，经DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析分离纯化并透析、冻干后得到凝乳酶产品。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述步骤1)中改良TYC培养基为：葡萄糖50g，酪蛋白胨15g，氯化钠1g，碳酸氢钠2g，L-胱氨酸0.2g，磷酸氢二钠2g，酵母膏5g，去离子水定容至1000mL，115℃灭菌20min；所述步骤2)中发酵培养基为：去离子水1000mL，熟小麦细麸皮20～60g，可溶性淀粉10g，玉米浆3g，115℃灭菌20min。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述步骤3)中硫酸铵与上清液混合的混合液，其硫酸铵饱和度为60％。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述步骤3)中冷冻干燥以及步骤4)中冻干参数为：-80℃预冻300min；-80℃冻干800min。

7.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述步骤4)中DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱，体积为5mL，起始洗脱条件为20mmol/L pH 8.5的Tris-HCl缓冲液，流速为0.5mL/min。

8.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述步骤4)中透析条件为：4℃下搅拌透析12h。

9.一种如权利要求3～8任意一项所述方法制备得到的凝乳酶。