CN114796331A - 一种制备枳壳总黄酮的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种双水相法优化提取枳壳总黄酮的方法。通过本发明的超声波辅助双水相优化提取枳壳总黄酮的方法获得枳壳总黄酮最优提取工艺，与传统乙醇回流法提法相比，双水相提取缩短提取时间，而且在双水相萃取过程中，大多数黄酮类物质富集于上相，而糖、蛋白质等杂质富集于下相，提高了枳壳总黄酮的提取效率和纯度。通过外体外抗氧化活性测定表明，枳壳总黄酮对DPPH自由基和ABTS自由基均具有清除作用；枳壳总黄酮在10‑800μg/mL范围时，对DPPH自由基清除率由27.7%升至98.57%，枳壳总黄酮为800μg/mL时清除率与维生素C相当。枳壳总黄酮提取物ABTS自由基在10‑3000μg/mL范围时，清除率由13.55%升至98.4%。

Description

一种制备枳壳总黄酮的方法
技术领域
本发明涉及一种枳壳总黄酮双水相的提取方法，属中药制药工程技术领域。
背景技术
枳壳(Fructus Aurantii)为芸香科柑橘属植物酸橙及其栽培变种的干燥未成熟果实，性微寒，味苦、辛、酸，归脾、胃经，具有理气宽中、行滞消胀功效，为常用理气药之一。最早记载于南北朝《雷公炮炙论》。研究显示，枳壳主要含有黄酮类、多糖、生物碱、挥发油等，具有一定升压、抗氧化、抗凋亡、抗休克、抗炎、抗抑郁、免疫调节、抗肿瘤等作用。
目前现有技术如CN 102406734 B枳壳水煎煮反应所需时间长且总黄酮含量为33.61 %，低于本发明。CN 103191236A枳壳乙醇回流反应时间长，有机溶剂用量大，总黄酮苷36.84 %，低于本发明。本发明使用双水相提取，大多数黄酮类物质富集于上相，而糖、蛋白质等杂质富集于下相，提高了枳壳总黄酮的提取效率和纯度。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种双水相法优化提取枳壳总黄酮的方法。
本发明是通过以下技术方案来实现的：一种枳壳总黄酮的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）以枳壳粉末为原料，先进行枳壳总黄酮提取的超声辅波助双水相体系选择，在进行枳壳总黄酮提取的单因素试验，包括液料比的选择、提取时间的选择、提取温度的选择、NaH2PO4·2H2O质量分数选择和丙酮质量分数选择；
（2）以液料比、提取时间、提取温度、NaH2PO4·2H2O质量分数和丙酮质量分数为影响因素，以枳壳中所提取的黄酮得率为评价标准，设计正交试验，进行分析，筛选出对枳壳总黄酮提取影响显著的因素；
(3)对影响因素进行方差分析，确定提取枳壳总黄酮的最佳提取工艺。
优选的，在步骤(1)前还包括以下步骤：将购买的枳壳片，置于60 ℃烘箱烘干，粉碎枳壳果实，将枳壳粉末筛至60目。
优选的，步骤(1)所述的超声辅助双水相体系选择，其特征在于，所述的超声辅助双水相体系选择：超声提取条件为，超声功率300 W，双水相体系按质量配比，系统为20 g，分别称取15 wt%不同无机盐((NH4)2SO4，NaH2PO4·2H2O，Na2HPO4·12H2O，Na2CO3)，35 wt %不同有机溶剂与一定质量的蒸馏水，形成提取溶剂, 所述的不同有机溶剂指乙醇、丙酮、正丁醇、异丙醇；枳壳粉末与提取溶剂的液料比为40 g/g，提取温度为40 ℃，提取时间为20min，获得上清液的离心条件为4000 r/min、离心10 min。
优选的，步骤(1)所述的超声辅助双水相体系选择，其特征在于，所述双水相体系选择为15 wt % NaH2PO4·2H2O，35 wt %丙酮与一定质量的蒸馏水的混合物。
上述步骤(1)所述液料比的选择具体为：以液料比为变量，控制其他因素的反应条件一致，枳壳总黄酮在283 nm波长下分别测量不同的液料比下枳壳总黄酮的吸光度；
步骤(1)所述提取时间的选择具体为：以提取时间为变量，控制其他因素使其他因素的
反应条件一致，枳壳总黄酮在283 nm波长下分别测量不同的提取时间下枳壳总黄酮的吸光度；
步骤(1)所述提取温度的选择具体为：以提取温度为变量，控制其他因素的反应条件一
致，枳壳总黄酮在283 nm波长下分别测量不同的提取温度下枳壳总黄酮的吸光度。
步骤(1)所述NaH2PO4·2H2O质量分数的选择具体为：以NaH2PO4·2H2O质量分数为变量，控制其他因素的反应条件一致，枳壳总黄酮在283 nm波长下分别测量不同NaH2PO4·2H2O质量分数的枳壳总黄酮的吸光度；
步骤(1)所述丙酮质量分数选择具体为：以丙酮质量分数为变量，控制其他因素的反应条件一致，枳壳总黄酮在283 nm波长下分别测量不同丙酮质量分数的枳壳总黄酮的吸光度。
上述步骤(2)所述正交试验：运用正交设计助手，进行影响因素的水平试验，以枳壳中所提取的总黄酮得率为评价标准，运用SPSS软件对试验所得的数据进行方差分析，得到枳壳总黄酮得率与所述影响因素之间的关系。
一种枳壳总黄酮提取工艺，其特征在于，为上述的响应面法优化提取枳壳总黄酮的方法。
所述的枳壳总黄酮最佳提取工艺提取的枳壳总黄酮通过ABTS自由基和DPPH自由基清除实验确定抗氧化活性。
优选的，所述抗氧化活性确定具体为：将最佳提取工艺提取的枳壳总黄酮进行ABTS自由基和DPPH自由基清除实验，计算其抗氧化活性；同时通过ABTS自由基和DPPH自由基清除实验做现有抗氧化活性产品的抗氧化活性标准曲线，将枳壳总黄酮与其抗氧化活性进行对比，计算该最佳提取工艺所得提取液的抗氧化活性对应的现有抗氧化活性产品质量数。
所述枳壳总黄酮提取工艺：以枳壳鲜果切片烘干的枳壳为原料，粉碎后以丙酮/NaH2PO4·2H2O双水相体系作为提取剂，液料比为60 g/g，超声300 W，70 ℃提取50 min。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
采用本发明的超声波辅助双水相优化提取枳壳总黄酮的方法获得枳壳总黄酮最优提取工艺，与传统乙醇回流法提法相比，双水相提取缩短提取时间，而且在双水相萃取过程中，大多数黄酮类物质富集于上相，而糖、蛋白质等杂质富集于下相，提高了枳壳总黄酮的提取效率和纯度。通过外体外抗氧化活性测定表明，枳壳总黄酮提取物对DPPH自由基和ABTS自由基均具有清除作用；枳壳总黄酮在10-800μg/mL范围时，枳壳总黄酮清除DPPH自由基的能力随浓度增大而增强，清除率由27.7 %升至98.57 %，枳壳总黄酮为800μg/mL时清除率与维生素C相当。枳壳总黄酮提取物在10-3000μg/mL范围时，枳壳总黄酮提取物清除ABTS自由基的能力随浓度增大而增强，清除率由13.55 %升至98.4 %。
附图说明
图1是柚皮苷标准曲线图。
图2是液料比对黄酮得率的影响检测结果图。
图3是提取时间对黄酮得率的影响检测结果图。
图4是提取温度对黄酮得率的影响检测结果图。
图5是NaH2PO4·2H2O质量分数对黄酮得率的影响检测结果图。
图6是丙酮质量分数对黄酮得率的影响检测结果图。
图7是总黄酮对DPPH自由基的清除能力图。
图8是总黄酮对ABTS自由基的清除能力图。
具体实施方式
本发明实施例中所使用的1，2-二苦基-2-三硝基苯亚肼（DPPH）为现用现配，具体为：精密称取DPPH2 mg，加25.36 mL无水乙醇配制成0.2 mmol/L的溶液。
1.3.7.2清除ABTS自由基
本发明实施例中所使用的2，2’-联氨-双-[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]-二氨盐（ABTS）为现用现配，具体为：ABTS4.06 mg加1 mL水配成7.4 mmol/L溶液，取K2S2O81.05 mg加1.5 mL水配成2.6 mmol/L溶液，取等体积ABTS溶液和K2S2O8溶液混合，室温避光保存12h，得ABTS工作液，将ABTS母液配成0.1 mmol/L溶液。
实施例1
精密称取98 wt%柚皮苷对照品5.0 mg，置于50 mL量瓶中，无水乙醇定容至0.1mg/mL；精密吸取1、2、3、4、5 mL至另一量瓶中，无水乙醇定容至50 mL；在283 nm波长处测定吸光度。根据测量值做出散点图，求出R2，得图1，y=32.307x+0.0007，R²=0.9999。
实施例2
将枳壳果实片干燥、粉碎后过60目筛备用。
实施例3双水相体系选择
双水相体系按质量配比，系统为20 g，分别称取15 wt%不同无机盐((NH4)2SO4，NaH2PO4·2H2O，Na2HPO4·12H2O，Na2CO3)，35 wt %不同有机溶剂与一定质量的蒸馏水，形成提取溶剂，所述的不同有机溶剂指乙醇、丙酮、正丁醇、异丙醇；枳壳粉末与提取溶剂的液料比为40 g/g，提取温度为40 ℃，提取时间为20 min，获得上清液的离心条件为4000 r/min、离心10 min后，旋转蒸发去除有机溶剂，分别取样分析上下相中枳壳黄酮的含量。有关的计算公式如下；
Figure 876003DEST_PATH_IMAGE001
注：C 1 /C 2 ，为双水相系统上、下相枳壳黄酮的浓度，mg/mL；V 1 /V 2 ，为双水相体系上、下相体积，mL；m为枳壳粉干物质的质量，g；K为黄酮在双水相体系分配系数；R为双水相体系上下相的体积比；Y 1 为黄酮在上相中的收率，%；Y 2 为黄酮在上相中的得率，mg/g。
最适双水相体系为丙酮/NaH2PO4·2H2O双水相体系（表1）。
表1双水相体系的选择
Table 1The selection of aqueous two-phase system
Figure 809456DEST_PATH_IMAGE002
实施例4液料比对枳壳总黄酮得率的影响
固定NaH2PO4·2H2O质量分数为15 %，丙酮质量分数35 %，在40 ℃下按液料比20、30、40、50、60 g/g提取20 min，4000 r/min离心10 min后，旋转蒸发去除有机溶剂，分别取样分析上下相中枳壳总黄酮在283 nm波长下分别测量不同的液料比下枳壳总黄酮的吸光度，得图2。
根据图2液料比在20-50 g/g时，总黄酮得率趋势随液料比增大而增长，液料比在50-60 g/g时枳壳总黄酮得率趋于平衡。这是由于枳壳黄酮浓度超过该双水相萃取能力，上相萃取的枳壳黄酮已达到饱和，多余的黄酮转移至下相，所以得率降低。
实施例5提取时间对枳壳总黄酮得率的影响
固定液料比为60 g/g，NaH2PO4·2H2O质量分数为 15 %，丙酮质量分数35 %，在40℃下按按提取10、20、30、40、50 min，4000 r/min离心10 min后，旋转蒸发去除有机溶剂，分别取样分析上下相中枳壳总黄酮在283 nm波长下分别测量不同的液料比下枳壳总黄酮的吸光度，得图3。
根据图3得出提取时间在10-40 min范围内总黄酮得率逐渐升高，40-50 min时趋于平衡，随提取时间增加，枳壳总黄酮萃取达到饱和。
实施例6提取温度对枳壳总黄酮得率的影响
固定液料比为60 g/g，NaH2PO4·2H2O质量分数为15 %，丙酮质量分数为35 %，在40、50、60、70、80 ℃下提取40 min，4000 r/min离心10 min后，旋转蒸发去除有机溶剂，分别取样分析上下相中枳壳总黄酮在283 nm波长下分别测量不同的液料比下枳壳总黄酮的吸光度，得图4。
根据图4得出提取温度在40-60 ℃范围内总黄酮得率逐渐升高，60 ℃后开始下降，可能是由于温度过高，破坏了黄酮成分。
实施例7NaH2PO4·2H2O质量分数对枳壳总黄酮得率的影响
固定液料比为60 g/g，丙酮质量分数为35 %，NaH2PO4·2H2O质量分数为17 %、19%、21 %、23 %、25 %，在60 ℃下提取40 min，4000 r/min离心10 min后，旋转蒸发去除有机溶剂，分别取样分析上下相中枳壳总黄酮在283 nm波长下分别测量不同的液料比下枳壳总黄酮的吸光度，得图5。
根据图5得出NaH2PO4·2H2O质量分数在17 %-23 %范围内总黄酮得率逐渐升高，23%以后大幅下降，可能是NaH2PO4·2H2O浓度增加，使上相体积减少，使得黄酮在上相的得率减少。
实施例8丙酮质量分数对枳壳总黄酮得率的影响
固定液料比为60 g/g，NaH2PO4·2H2O质量分数为23 %，丙酮质量分数为25 %、30%、35 %、40 %、45 %，在60 ℃下提取40 min，4000 r/min离心10 min后，旋转蒸发去除有机溶剂，分别取样分析上下相中枳壳总黄酮在283 nm波长下分别测量不同的液料比下枳壳总黄酮的吸光度，得图6。
根据图6得出丙酮质量分数在25 %-40 %范围内总黄酮得率逐渐升高，40 %以后下降，可能是丙酮浓度增加，上相体积增加，但是黄酮已经完全萃取出来，体积增加使得率下降。
实施例9
完成以上单因素实验后，对实验结果进行分析，以枳壳粉末为原材料，丙酮/NaH2PO4·2H2O为提取剂，利用正交设计助手对液料比、提取时间、提取温度、NaH2PO4·2H2O质量分数、丙酮质量分数五个因素进行五因素三水平的实验设计，实验因素水平选择及设计如表2所示。
表2因素水平表
Table 2Factors and Levels
Figure 120351DEST_PATH_IMAGE003
实施例10
通过选取液料比、提取时间、提取温度、NaH2PO4·2H2O质量分数、丙酮质量分数为影响因素，以枳壳总黄酮得率为响应值，进行分析，正交设计与结果如表3所示。
表3试验设计与结果
Table3 Experimental design and results
Figure 781140DEST_PATH_IMAGE004
由统计学分析可知本实验五因素对枳壳总黄酮得率的影响程度依次为A（料液比）>C（提取温度）>E（丙酮质量分数）>B（提取时间）>D（NaH2PO4·2H2O质量分数），因素A、C、E对枳壳总黄酮得率有显著影响（P<0.05），其他两种因素影响不显著（P>0.05）。可知理论最佳组合A 3 B 3 C 3 D 3 E 3 。由于该条件不在正交试验的18次试验中，因此需进一步试验验证。
实施例11
表4验证实验结果
Figure 861091DEST_PATH_IMAGE005
根据优化工艺提取3次（表4），测得总黄酮收率为95 %以上，平均得率为75.9 mg/g高于预测值，验证该正交试验的结果可靠，确定最佳工艺为液料比60 g/g，提取时间50min，提取温度70 ℃，丙酮质量分数45 %，但是NaH2PO4·2H2O质量分数对总黄酮得率无显著影响，其浓度过高会降低总黄酮得率，所以选择为23 %NaH2PO4·2H2O质量分数。
实施例12 DPPH自由基清除实验测定枳壳总黄酮抗氧化活性
取黄酮提取溶液浓度为10、20、50、100、200、400、800、1600、2000、3000μg/ml各0.2mL加入1.5 ml EP管中，分别加入0.2 mmol/LDPPH溶液0.2 mL，振摇混匀，室温避光条件下静置30 min，在517 nm波长处分别测定吸光度A a ，清除率计算如式（5）。同样方法测定维生素C的DPPH自由基清除率。
清除率
Figure 214712DEST_PATH_IMAGE006
（5）
式中A b 为以无水乙醇代替DPPH测定样品的吸光度；A c 为以水代替黄酮提取液测定样品的吸光度。
实施例13 ABTS自由基清除实验测定枳壳总黄酮抗氧化活性
取黄酮提取溶液浓度为10、20、50、100、200、400、800、1600、2000、3000μg/ml各0.1mL加入1.5 mlEP管中，分别加入0.1 mmol/LABTS溶液0.9 mL，振摇混匀，置于避光处10min，在735 nm波长处分别测定吸光度A a ，清除率计算如式（5）。同样方法测定维生素C的清除率。
由图7可知，枳壳总黄酮清除DPPH自由基的能力随浓度增大而增强，枳壳总黄酮在10-800μg/mL范围时，清除率随枳壳黄酮浓度增加而增大，枳壳总黄酮为800μg/mL时清除率与维生素C相当。枳壳总黄酮对DPPH自由基清除率的IC50为48.96，维生素C对DPPH自由基清除率的IC50为3.51。
由图8可知，枳壳总黄酮提取物清除ABTS自由基的能力随浓度增大而增强，枳壳总黄酮提取物在10-3000μg/mL范围时，清除率由13.55 %升至98.4 %。枳壳总黄酮对ABTS自由基清除率的IC50为207.71，维生素C对ABTS自由基清除率的IC50为62.08；
Figure 747325DEST_PATH_IMAGE008

Claims (10)

1.一种制备枳壳总黄酮的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）以枳壳粉末为原料，先进行枳壳总黄酮提取的超声波辅助双水相体系选择，再进行枳壳总黄酮提取的单因素试验，包括料液比的选择、提取时间的选择、提取温度的选择、NaH2PO4·2H2O质量分数选择和丙酮质量分数选择；
（2）以料液比、提取时间、提取温度、NaH2PO4·2H2O质量分数和丙酮质量分数为影响因素，以枳壳中所提取的黄酮得率为评价标准，设计正交试验，进行分析，筛选出对枳壳总黄酮提取影响显著的因素；
(3)对影响因素进行方差分析，确定提取枳壳总黄酮的最佳提取工艺。
2.根据权利要求1所述的一种制备枳壳总黄酮的方法，其特征在于，枳壳粉末制备：枳壳果实粉碎后的枳壳粉末筛至60目。
3.根据权利要求1所述的一种制备枳壳总黄酮的方法，其特征在于，所述的超声波辅助双水相体系的选择：提取条件为，超声功率300 W，双水相体系按质量配比，系统为20 g，分别称取15 wt%不同无机盐((NH4)2SO4，NaH2PO4·2H2O，Na2HPO4·12H2O，Na2CO3)，35 wt %不同有机溶剂与一定质量的蒸馏水，形成提取溶剂, 所述的不同有机溶剂指乙醇、丙酮、正丁醇、异丙醇；枳壳粉末与提取溶剂的液料比为40 g/g，提取温度为40 ℃，提取时间为20min，获得上清液的离心条件为4000 r/min、离心10 min。
4.根据权利要求3所述的一种制备枳壳总黄酮的方法，其特征在于，所述双水相体系选择为15 wt % NaH2PO4·2H2O，35 wt %丙酮与一定质量的蒸馏水的混合物。
5.根据权利要求1所述的一种制备枳壳总黄酮的方法，其特征在于，步骤(1)所述液料比的选择具体为：以液料比为变量，控制其他因素的反应条件一致，枳壳总黄酮在283 nm波长下分别测量不同的液料比下枳壳总黄酮的吸光度；步骤(1)所述提取时间的选择具体为：以提取时间为变量，控制其他因素使其他因素的反应条件一致，枳壳总黄酮在283 nm波长下分别测量不同的提取时间下枳壳总黄酮的吸光度；步骤(1)所述提取温度的选择具体为：以提取温度为变量，控制其他因素的反应条件一致，枳壳总黄酮在283 nm波长下分别测量不同的提取温度下枳壳总黄酮的吸光度；
步骤(1)所述NaH2PO4·2H2O质量分数的选择具体为：以NaH2PO4·2H2O质量分数为变量，控制其他因素的反应条件一致，枳壳总黄酮在283 nm波长下分别测量不同NaH2PO4·2H2O质量分数的枳壳总黄酮的吸光度；步骤(1)所述丙酮质量分数选择具体为：以丙酮质量分数为变量，控制其他因素的反应条件一致，枳壳总黄酮在283 nm波长下分别测量不同丙酮质量分数的枳壳总黄酮的吸光度。
6.根据权利要求1所述的一种制备枳壳总黄酮的方法，其特征在于，步骤(2)所述正交试验：运用正交助手，进行影响因素的水平试验，以枳壳中所提取的总黄酮得率为评价标准，运用SPSS软件对试验所得的数据进行方差分析，得到枳壳总黄酮得率与所述影响因素之间的关系。
7.一种枳壳总黄酮提取工艺，其特征在于，为权利要求1-6任一项所述的响应面法优化提取枳壳总黄酮的方法。
8.根据权利要求7所述枳壳总黄酮提取工艺，其特征在于，所述枳壳总黄酮提取工艺：切片烘干的枳壳为原料，粉碎后以丙酮/ NaH2PO4·2H2O双水相体系作为提取剂，液料比为60 g/g，超声300 W，70 ℃提取50 min。
9.根据权利要求7或8所述的枳壳总黄酮提取工艺，其特征在于，枳壳总黄酮最佳提取工艺提取的枳壳总黄酮通过ABTS自由基和DPPH自由基清除实验确定抗氧化活性。
10.根据权利要求9所述的枳壳总黄酮提取工艺，其特征在于，所述抗氧化活性确定具体为：将最佳提取工艺提取的枳壳总黄酮进行ABTS自由基和DPPH自由基清除实验，计算其抗氧化活性；同时通过ABTS自由基和DPPH自由基清除实验做现有抗氧化活性产品的抗氧化活性标准曲线，将枳壳总黄酮与其抗氧化活性进行对比，计算该最佳提取工艺所得提取液的抗氧化活性对应的现有抗氧化活性产品质量数。
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