CN114796172A - 具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的山杜英枝叶提取物活性部位和应用 - Google Patents

具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的山杜英枝叶提取物活性部位和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的山杜英[Elaeocarpus sylvestris(Lour.)Poir.]枝叶提取物活性部位和应用,属于植物药技术领域。本发明将干燥的山杜英枝叶,用溶剂提取获得粗提物PXS48‑1A,PXS48‑1A通过萃取制备得到乙酸乙酯萃取部位PXS48‑3A和正丁醇萃取部位PXS48‑4A。并分别将乙酸乙酯部位PXS48‑3A和正丁醇萃取部位PXS48‑4A精分得到PXS48‑23、PXS48‑24、PXS48‑25、PXS48‑43、PXS48‑44和PXS48‑45等六个活性部位。这些活性部位对乙酰胆碱酯酶具有显著的抑制活性。本发明同时提供了以山杜英枝叶的植物药活性部位组成的药物组合物,该植物药活性部位及其药物组合物的制备方法,以及它们在制备治疗阿兹海默症的药物中的应用。

Description

具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的山杜英枝叶提取物活性部位和 应用
技术领域:
本发明属于医药技术领域,具体地,涉及植物药技术领域,更具体地,涉及山杜英枝叶提取物活性部位及其药物组合物与其制备方法和其在制备治疗或预防阿兹海默症的药物中的应用。
背景技术:
乙酰胆碱(Acetyl choline,ACh)是最先被发现的神经传递素,它是所有胆碱能神经元使用的神经递质,在外围和中枢神经系统中扮演着非常重要的角色。几乎大脑中的每个区域都受到胆碱能神经元的控制。阿兹海默症(Alzheimer’s disease,AD)是一种渐进性的中枢神经退行性疾病。患有AD的病人在临床上主要表现是记忆力的逐渐丧失和逐渐出现的认知功能障碍。AD的认知能力低下与中枢乙酰胆碱能活性降低相关,而Ach在突触中的含量升高会使人的认知能力和记忆力得到改善。乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)是水解乙酰胆碱的特异性胆碱酯酶,而增强胆碱能功能是目前治疗AD最有效的方法。因此高效的乙酰胆碱酯酶抑制剂的筛选是开发治疗神经退行性疾病药物的基础。随着我国逐渐步入结构老龄化社会,AD日益成为当前老年医学面临的最为严峻的问题之一。从植物中寻找和筛选具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的天然分子也成了新的研究热点。
山杜英[Elaeocarpus sylvestris(Lour.)Poir.]为杜英科杜英属植物,该属植物全世界约有350种,分布于东亚,东南亚及西南太平洋和大洋洲。我国产38种,6变种,主要分布于横断山山脉和南岭山脉,四川峨眉山是其分布的最北界。山杜英主要分布于热带、亚热带地区;越南、老挝、泰国、韩国的济州岛、中国南部以及日本的冲绳和九州,是常绿阔叶森林群落的重要组成树种,国内广东、海南、广西、福建、浙江、江西、湖南、贵州、四川及云南有野生资源分布。
山杜英具有良好的观赏价值,是南方地区常用的绿化行道树。除其观赏价值外,山杜英还是优良的蜜源植物,还具一定的药用功能。据《新华本草纲要》(第一册)记载,山杜英的根具有散瘀消肿的功能,用于跌打肿痛[吴征镒.新华本草纲要.上海:上海科学技术出版社,1988.]。经查,现有技术中未见有山杜英枝叶提取物活性部位及其具有抗老年痴呆或神经退行性疾病价值治疗前景的活性相关报道。
发明内容:
本发明的目的是提供山杜英枝叶提取物活性部位,其制备方法,其药物组合物,其在制备治疗或预防阿兹海默症的药物中的应用。
为了实现本发明的上述目的,本发明提供了如下的技术方案:
山杜英枝叶提取物活性部位,包括PXS48-1A、PXS48-3A、PXS48-4A、PXS48-23、PXS48-24、PXS48-25和PXS48-43、PXS48-44、PXS48-45,是由下述方法制备而得的:
(a)山杜英干燥的枝叶,粉碎后用95%的乙醇,60℃水浴超声提取60min,重复3次,合并过滤,减压浓缩得到浸膏PXS48-1A;
(b)将浸膏PXS48-1A用水制成混悬液,用石油醚萃取,石油醚萃取后的水相溶液,继续用乙酸乙酯萃取,回收乙酸乙酯,得乙酸乙酯萃取部位PXS48-3A;乙酸乙酯萃取后的水相溶液,继续用正丁醇萃取,回收正丁醇,得正丁醇萃取部位PXS48-4A;
(c)将乙酸乙酯萃取部位PXS48-3A经正相硅胶80~100目柱层析,用二氯甲烷-甲醇体系10:1→0:1梯度洗脱,得到PXS48-23、PXS48-24和PXS48-25;
(d)将正丁醇萃取部位PXS48-4A,经正相硅胶80~100目柱层析,用二氯甲烷-甲醇10:1→0:1梯度洗脱,得到PXS48-43、PXS48-44和PXS48-45。
同时提供了制备所述的山杜英枝叶提取物活性部位的方法,该方法包括下述步骤:
(a)山杜英干燥的枝叶,粉碎后用95%的乙醇,60℃水浴超声提取60min,重复3次,合并过滤,减压浓缩得到浸膏PXS48-1A;
(b)将浸膏PXS48-1A用水制成混悬液,用石油醚萃取,石油醚萃取后的水相溶液,继续用乙酸乙酯萃取,回收乙酸乙酯,得乙酸乙酯萃取部位PXS48-3A;乙酸乙酯萃取后的水相溶液,继续用正丁醇萃取,回收正丁醇,得正丁醇萃取部位PXS48-4A;
(c)将乙酸乙酯萃取部位PXS48-3A经正相硅胶80~100目柱层析,用二氯甲烷-甲醇体系10:1→0:1梯度洗脱,得到PXS48-23、PXS48-24和PXS48-25;
(d)将正丁醇萃取部位PXS48-4A,经正相硅胶80~100目柱层析,用二氯甲烷-甲醇10:1→0:1梯度洗脱,得到PXS48-43、PXS48-44和PXS48-45。
本发明还提供了一种药物组合物,其含有治疗有效量的山杜英枝叶提取物活性部位PXS48-1A、PXS48-3A、PXS48-4A、PXS48-23、PXS48-24、PXS48-25和PXS48-43、PXS48-44、PXS48-45任其一或其任意组合,以及药学上可接受的载体。
此外,本发明提供了所述的山杜英枝叶提取物活性部位或所述的药物组合物在制备治疗或预防阿兹海默症的药物中的应用。
以及,所述的山杜英枝叶提取物活性部位或所述的药物组合物在制备治疗或预防老年痴呆或神经退行性疾病的药物中的应用。
另外,提供了所述的药物组合物的制备方法,该方法包括下述步骤:
(a)山杜英干燥的枝叶,粉碎后用95%的乙醇,60℃水浴超声提取60min,重复3次,合并过滤,减压浓缩得到浸膏PXS48-1A;
(b)将浸膏PXS48-1A用水制成混悬液,用石油醚萃取,石油醚萃取后的水相溶液,继续用乙酸乙酯萃取,回收乙酸乙酯,得乙酸乙酯萃取部位PXS48-3A;乙酸乙酯萃取后的水相溶液,继续用正丁醇萃取,回收正丁醇,得正丁醇萃取部位PXS48-4A;
(c)将乙酸乙酯萃取部位PXS48-3A经正相硅胶80~100目柱层析,用二氯甲烷-甲醇体系10:1→0:1梯度洗脱,得到PXS48-23、PXS48-24和PXS48-25;
(d)将正丁醇萃取部位PXS48-4A,经正相硅胶80~100目柱层析,用二氯甲烷-甲醇10:1→0:1梯度洗脱,得到PXS48-43、PXS48-44和PXS48-45;
(e)将山杜英枝叶提取物活性部位PXS48-1A、PXS48-3A、PXS48-4A、PXS48-23、PXS48-24、PXS48-25和PXS48-43、PXS48-44、PXS48-45任其一或其任意组合,加入可药用载体。
本发明还另外提供了一种改善阿兹海默症的植物药,其含有治疗有效量的山杜英枝叶提取物活性部位PXS48-1A、PXS48-3A、PXS48-4A、PXS48-23、PXS48-24、PXS48-25和PXS48-43、PXS48-44、PXS48-45任其一或其任意组合,和药学上可接受的载体。
本发明将干燥的山杜英枝叶,用溶剂提取和萃取制备得到PXS48-1A、PXS48-3A、PXS48-4A,其对乙酰胆碱酯酶具有显著的抑制活性。将PXS48-3A和PXS48-4A分别以及柱层析分离,得到PXS48-23、PXS48-24、PXS48-25、PXS48-43、PXS48-44和PXS48-45均对乙酰胆碱酯酶具有显著的抑制活性。PXS48-1A、PXS48-3A、PXS48-4A、PXS48-23、PXS48-24、PXS48-25、PXS48-43、PXS48-44和PXS48-45及其不同的组合,提供了新的治疗或预防阿兹海默症的药物。
本发明山杜英枝叶提取物活性部位用作药物时,可以直接使用,或者以药物组合物的形式使用。该药物组合物含有20–90%的本发明山杜英枝叶提取物活性部位,其余为药物学上可接受的,对人和动物无毒和惰性的可药用载体或赋形剂。
所述的药用载体或赋形剂是一种或多种固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明的药物可经注射(静注、肌注)和口服两种形式给药。
本发明所述的山杜英枝叶及其提取物为原料能制备预防和治疗阿兹海默症的药物,能制备治疗或预防老年痴呆或神经退行性疾病的药物,可在现有技术的基础上,采用中药制剂常规方法制备成任何药用的制剂。例如,将山杜英枝叶制成散剂冲服;将提取物制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂,但这并不限制本发明的保护范围。
与现有技术相比,本发明具有下述的优益效果:
首次提供了山杜英枝叶提取物活性部位PXS48-1A、PXS48-3A、PXS48-4A、PXS48-23、PXS48-24、PXS48-25和PXS48-43、PXS48-44、PXS48-45,填补了现有技术的空白。
本发明的山杜英提取物活性部位,特别是乙醇提取物(PXS48-1A)对乙酰胆碱酯酶具有显著的抑制活性,其半数抑制浓度(IC50值)为1.88±0.09μg/mL。对乙醇提取物进行萃取和进一步的精分划段后测试其乙酰胆碱酯酶的抑制活性,结果显示其乙酸乙酯萃取部位(PXS48-3A)、正丁醇萃取部位(PXS48-4A)和精分划段部位PXS48-23、PXS48-24、PXS48-25、PXS48-43、PXS48-44和PXS48-45均有乙酰胆碱酯酶抑制活性,其中PXS48-24和PXS48-25的IC50值接近对照他克林,分别为0.2±0.1μg/mL和0.32±0.1μg/mL。PXS48-43,PXS48-44和PXS48-45的IC50值平均为1.0μg/mL。
本发明的制备方法原料易得,步骤简单易行,可操作性强,环保,得率高。
本发明首次提供了山杜英枝叶提取物活性部位或所述的药物组合物在制备治疗或预防阿兹海默症的药物中的应用,以及,在制备治疗或预防老年痴呆或神经退行性疾病的药物中的应用。
具体实施方式:
下面用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容,但并不以此来限定本发明。
实施例1:
PXS48-1A的制备。
取山杜英[Elaeocarpus sylvestris(Lour.)Poir.]的枝叶干燥后的样品11.0kg,粉碎后经95%的乙醇(15L),60℃水浴超声提取60min,重复3次,合并过滤,减压浓缩得到浸膏(编号为:PXS48-1A)3.7kg。
实施例2:
PXS48-3A和PXS48-4A的制备。
取浸膏PXS48-1A(3.7kg),加蒸馏水(2L)制成混悬液后,用依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇分别萃取6~10次,回收萃取溶剂后,分别得到石油醚萃取部位,乙酸乙酯萃取部位(编号为:PXS48-3A)665.0g;正丁醇萃取部位(编号为:PXS48-4A)541.0g和水部分。
实施例3:
PXS48-23、PXS48-24和PXS48-25的制备。
将乙酸乙酯萃取部位(PXS48-3A,660.0g)进行正相硅胶(80~100目)柱层析,用二氯甲烷-甲醇体系(10:1→0:1)梯度洗脱,得到PXS48-23(97.6g)、PXS48-24(115.7g)和PXS48-25(128.4g)。
实施例4:
PXS48-43、PXS48-44和PXS48-45的制备。
将正丁醇萃取部位(PXS48-4A,540.0g),经正相硅胶(80~100目)柱层析,用二氯甲烷-甲醇(10:1→0:1)梯度洗脱,得到PXS48-43(16.0g),PXS48-44(19.5g)和PXS48-45(25.8g)。
实施例5:
PXS48-1A、PXS48-2A和PXS48-4A对乙酰胆碱酯酶的抑制作用。
一、实验原理
乙酰胆碱酯酶能够催化其底物类似物碘化硫代乙酰胆碱降解,生成硫代胆碱和乙酸,反应生成物与显色剂DTNB反应生成黄色物质,在405nm处有特异光吸收。样品与乙酰胆碱酯酶的混合液在37℃反应,如果样品对乙酰胆碱酯酶有抑制作用,那么乙酰胆碱酯酶催化底物类似物碘化硫代乙酰胆碱降解的量就会减少,相应的与DTNB反应生成的黄色样品减少,即在405nm处的光吸收值变小,以此来筛选具有抑制活性的样品。
二、试剂仪器
提取物样品:PXS48-1A、PXS48-3A和PXS48-4A;Na2HPO4;NaH2PO4;乙酰胆碱酯酶、碘化硫代乙酰胆碱、DTNB、他克林均购自Sigma。
仪器:酶标仪Multiskan FC(Thermo Fisher,USA)。
三、实验方法
1.用磷酸盐缓冲液(每100mL磷酸盐缓冲液中含0.1M Na2HPO4溶液94.7mL;0.1MNaH2PO4溶液5.3mL,调pH至8.0)将AChE稀释成0.1U/mL工作液;
2.碘化硫代乙酰胆碱和DTNB用磷酸盐缓冲液配成6.25mM的溶液(工作液);
3.粗提物稀释成2mg/mL工作液,粗提物终浓度为100μg/mL。阳性对照为他克林,终浓度为0.333μM;阴性对照组(NC组)为2%DMSO溶剂对照。
4.反应在96孔板中进行,向96孔板中依次加入下列试剂(加入试剂的体积为一个反应的体积),每个样品做3个重复;
(1)样品和他克林浓度梯度的设定(用1%DMSO稀释)。
(2)铺板:200μL/体系,每孔内DMSO的终浓度均为0.1%,每个样本做3个复孔。
表1.实验试剂加样体系
Figure BDA0003664567030000061
Figure BDA0003664567030000071
5.加入显色剂和底物后1小时内,每30秒钟检测一次405nm吸光值。
6.选择NC组吸光值平均值约为1时的样品吸光值,计算样品吸光值平均值(样品测定值-背景值),并按照(NC-样品吸光值平均值)/NC*100%来计算样品AChE抑制率。
四、实验结果
结果显示,山杜英枝叶乙醇提取物PXS48-1A,乙酸乙酯萃取部位PXS48-3A和正丁醇萃取部位PXS48-4A均对乙酰胆碱酯酶具有抑制活性。
表2.PXS48-1A、PXS48-3A和PXS48-4A对乙酰胆碱酯酶的抑制活性
Figure BDA0003664567030000072
实施例6:
PXS48-23、PXS48-24、PXS48-25、PXS48-43、PXS48-44和PXS48-45对乙酰胆碱酯酶的抑制作用。
实验原理、试剂仪器和实验方法同实施例5,实验样品为:PXS48-23、PXS48-24、PXS48-25、PXS48-43、PXS48-44和PXS48-45。
实验结果显示,精分划段获得的PXS48-23、PXS48-24、PXS48-25、PXS48-43、PXS48-44和PXS48-45均对乙酰胆碱酯酶具有抑制作用。
表3.PXS48-23、PXS48-24、PXS48-25、PXS48-43、PXS48-44和PXS48-45对乙酰胆碱酯酶的抑制活性
Figure BDA0003664567030000073
Figure BDA0003664567030000081
制剂实施例
1.取PXS48-1A、PXS48-3A、PXS48-4A、PXS48-23、PXS48-24、PXS48-25、PXS48-43、PXS48-44和PXS48-45任其一或其任意组合,按其与赋形剂重量比1:1的比例加入赋形剂,制粒压片。
2.取PXS48-1A、PXS48-3A、PXS48-4A、PXS48-23、PXS48-24、PXS48-25、PXS48-43、PXS48-44和PXS48-45任其一或其任意组合,按其与赋形剂重量比1:2的比例加入赋形剂,制粒压片。
3.取PXS48-1A、PXS48-3A、PXS48-4A、PXS48-23、PXS48-24、PXS48-25、PXS48-43、PXS48-44和PXS48-45任其一或其任意组合,按常规胶囊制剂方法制成胶囊。
4.取PXS48-1A、PXS48-3A、PXS48-4A、PXS48-23、PXS48-24、PXS48-25、PXS48-43、PXS48-44和PXS48-45任其一或其任意组合100mg,再取淀粉适量、玉米浆适量、硬脂酸镁适量,制成片剂。
5.胶囊剂:取PXS48-1A、PXS48-3A、PXS48-4A、PXS48-23、PXS48-24、PXS48-25、PXS48-43、PXS48-44和PXS48-45任其一或其任意组合100mg,淀粉适量,硬脂酸模适量,制备方法:将活性部位与助剂混合,过筛,在合适的容器中均匀混合,把得到的混合物装入硬明胶胶囊。
6.鼻喷雾剂:
取PXS48-1A、PXS48-3A、PXS48-4A、PXS48-23、PXS48-24、PXS48-25、PXS48-43、PXS48-44和PXS48-45任其一或其任意组合,80mg
Figure BDA0003664567030000082
制备方法:搅拌下于适当体积的重蒸榴水中每次加入一种成分,直至完全溶解,然后再加入另一种成分。加水至2mL后,将该溶液在无菌过滤器上过滤,装入瓶中并按照适当的剂量分隔。
7.滴丸:取PXS48-1A、PXS48-3A、PXS48-4A、PXS48-23、PXS48-24、PXS48-25、PXS48-43、PXS48-44和PXS48-45任其一或其任意组合1g,聚乙二醇6000 9g。制法:按上述处方量称取PXS48-1A、PXS48-3A、PXS48-4A、PXS48-23、PXS48-24、PXS48-25、PXS48-43、PXS48-44和PXS48-45任其一或其任意组合,加入适量无水乙醇,微热溶解后,加入处方量的聚乙二醇熔融液中(60℃水浴保温),搅拌混合均匀,直至乙醇挥尽为止,静置于60℃水浴中保温30分钟,待气泡除尽,将除尽气泡的上述混匀熔融液转入贮液筒内,在80~85℃保温条件下,控制滴速,逐滴滴入冷凝液中,待冷凝完全,倾去冷凝液,收集滴丸,沥净和用滤纸除去丸上的冷凝液,放置硅胶干燥器中或自然干燥即可。

Claims (8)

1.山杜英枝叶提取物活性部位,其特征在于所述的山杜英枝叶提取物活性部位包括PXS48-1A、PXS48-3A、PXS48-4A、PXS48-23、PXS48-24、PXS48-25和PXS48-43、PXS48-44、PXS48-45,是由下述方法制备而得的:
(a)山杜英干燥的枝叶,粉碎后用95%的乙醇,60℃水浴超声提取60 min,重复3次,合并过滤,减压浓缩得到浸膏PXS48-1A;
(b)将浸膏PXS48-1A用水制成混悬液,用石油醚萃取,石油醚萃取后的水相溶液,继续用乙酸乙酯萃取,回收乙酸乙酯,得乙酸乙酯萃取部位PXS48-3A;乙酸乙酯萃取后的水相溶液,继续用正丁醇萃取,回收正丁醇,得正丁醇萃取部位PXS48-4A;
(c)将乙酸乙酯萃取部位PXS48-3A经正相硅胶80~100目柱层析,用二氯甲烷-甲醇体系10:1→0:1梯度洗脱,得到PXS48-23、PXS48-24和PXS48-25;
(d)将正丁醇萃取部位PXS48-4A,经正相硅胶80~100目柱层析,用二氯甲烷-甲醇10:1→0:1梯度洗脱,得到PXS48-43、PXS48-44和PXS48-45。
2.制备权利要求1所述的山杜英枝叶提取物活性部位的方法,其特征在于该方法包括下述步骤:
(a)山杜英干燥的枝叶,粉碎后用95%的乙醇,60℃水浴超声提取60 min,重复3次,合并过滤,减压浓缩得到浸膏PXS48-1A;
(b)将浸膏PXS48-1A用水制成混悬液,用石油醚萃取,石油醚萃取后的水相溶液,继续用乙酸乙酯萃取,回收乙酸乙酯,得乙酸乙酯萃取部位PXS48-3A;乙酸乙酯萃取后的水相溶液,继续用正丁醇萃取,回收正丁醇,得正丁醇萃取部位PXS48-4A;
(c)将乙酸乙酯萃取部位PXS48-3A经正相硅胶80~100目柱层析,用二氯甲烷-甲醇体系10:1→0:1梯度洗脱,得到PXS48-23、PXS48-24和PXS48-25;
(d)将正丁醇萃取部位PXS48-4A,经正相硅胶80~100目柱层析,用二氯甲烷-甲醇10:1→0:1梯度洗脱,得到PXS48-43、PXS48-44和PXS48-45。
3.药物组合物,其含有治疗有效量的权利要求1所述的山杜英枝叶提取物活性部位PXS48-1A、PXS48-3A、PXS48-4A、PXS48-23、PXS48-24、PXS48-25和PXS48-43、PXS48-44、PXS48-45任其一或其任意组合,以及药学上可接受的载体。
4.权利要求1所述的山杜英枝叶提取物活性部位或权利要求3所述的药物组合物在制备治疗或预防阿兹海默症的药物中的应用。
5.权利要求1所述的山杜英枝叶提取物活性部位或权利要求3所述的药物组合物在制备治疗或预防老年痴呆的药物中的应用。
6.权利要求1所述的山杜英枝叶提取物活性部位或权利要求3所述的药物组合物在制备治疗或预防神经退行性疾病的药物中的应用。
7.权利要求3所述的药物组合物的制备方法,其特征在于,该方法包括下述步骤:
(a)山杜英干燥的枝叶,粉碎后用95%的乙醇,60℃水浴超声提取60 min,重复3次,合并过滤,减压浓缩得到浸膏PXS48-1A;
(b)将浸膏PXS48-1A用水制成混悬液,用石油醚萃取,石油醚萃取后的水相溶液,继续用乙酸乙酯萃取,回收乙酸乙酯,得乙酸乙酯萃取部位PXS48-3A;乙酸乙酯萃取后的水相溶液,继续用正丁醇萃取,回收正丁醇,得正丁醇萃取部位PXS48-4A;
(c)将乙酸乙酯萃取部位PXS48-3A经正相硅胶80~100目柱层析,用二氯甲烷-甲醇体系10:1→0:1梯度洗脱,得到PXS48-23、PXS48-24和PXS48-25;
(d)将正丁醇萃取部位PXS48-4A,经正相硅胶80~100目柱层析,用二氯甲烷-甲醇10:1→0:1梯度洗脱,得到PXS48-43、PXS48-44和PXS48-45;
(e)将山杜英枝叶提取物活性部位PXS48-1A、PXS48-3A、PXS48-4A、PXS48-23、PXS48-24、PXS48-25和PXS48-43、PXS48-44、PXS48-45任其一或其任意组合,加入可药用载体。
8.一种改善阿兹海默症的植物药,其含有治疗有效量的权利要求1或2所述的山杜英枝叶提取物活性部位PXS48-1A、PXS48-3A、PXS48-4A、PXS48-23、PXS48-24、PXS48-25和PXS48-43、PXS48-44、PXS48-45任其一或其任意组合,和药学上可接受的载体。
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