CN114790446A - 一种宫颈腺癌类器官培养基及其构建方法 - Google Patents
一种宫颈腺癌类器官培养基及其构建方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及类器官培养技术领域，尤其是涉及一种宫颈腺癌类器官培养基及其构建方法。宫颈腺癌类器官培养基包括以下组分：基础培养基、HEPES缓冲对Hepes缓冲对缓冲对、青霉素链霉素溶液、营养添加剂和特异性因子；特异性因子为烟酰胺、N‑乙酰半胱氨酸、Y‑27632、WNT‑3A、R‑spondin 1、CHIR99021、Noggin因子、A83‑01、EGF、FGF2、FGF7、FGF10、Forskolin和PGE2。本发明针对宫颈腺癌开发出改良的宫颈腺癌类器官培养基可以提高培养宫颈腺癌类器官的成功率，有利于为宫颈癌研究提供新的思路；并且类器官模型构建方法培养的宫颈腺癌类器官能维持原肿瘤组织的组织形态学结构及遗传学特征。
Description
技术领域
本发明涉及类器官培养技术领域，尤其是涉及一种宫颈腺癌类器官培养基及其构建方法。
背景技术
宫颈癌是目前严重威胁女性健康的恶性肿瘤疾病，其发病率呈逐年上升的趋势。宫颈癌最常见的病理类型是鳞状细胞癌和腺癌，分别占所有病例的70％和25％。鳞癌起源于宫颈鳞状上皮，腺癌起源于柱状上皮。迄今为止，宫颈癌研究依赖于数量有限的细胞系、异种移植和转基因的小鼠模型。广泛使用的细胞系如hela，siha经过长期的体外培养选择，已经部分失去对临床病人特征的概括，对临床前的研究价值有限。而异种移植及转基因模型，因价格高昂及培养周期较长等原因无法在研究中实现普遍应用。因此，我们建立一种经济简便有病人代表性的模型来进行宫颈癌的研究。
肿瘤类器官是近年来发展的体外3D培养模型，该模型是在体外利用基质胶或水凝胶等材料模拟细胞外基质，给细胞提供三维支架，外源性添加小分子、生长因子等物质形成干细胞生态环境，诱导来源于组织的干细胞自我更新分化形成三维细胞结构，类器官模型与来源组织密切相关，再现源组织的细胞结构和遗传特质。构建患者来源的肿瘤类器官可很好地在体外复现患者肿瘤的遗传异质性和生物学特性，结合下一代测序在类器官上进行高通量药物筛选可指导患者个体化治疗方案。在肿瘤机制研究中，类器官模型可作为细胞实验和体内实验之间的补充，患者来源的类器官也可成为动物模型和人体临床试验间的桥梁。
目前关于宫颈癌类器官培养的文献报道极少，且所包含的样本例数少，故宫颈癌类器官的培养体系，如宫颈癌类器官培养基，培养条件，操作流程等均无太多研究，现有技术中现存培养宫颈腺癌类器官的培养成功率较低，仅有25％的成功率，因此，有必要提出一种培养成功率较高的宫颈腺癌类器官培养基。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种宫颈腺癌类器官培养基及其构建方法，针对宫颈腺癌开发出本发明的宫颈腺癌类器官培养基可以提高培养宫颈腺癌类器官的成功率，有利于为宫颈癌研究提供新的思路；本发明类器官模型构建方法培养的宫颈腺癌类器官能维持原肿瘤组织的组织形态学结构及遗传学特征。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
第一目的，本发明提供了一种宫颈腺癌类器官培养基，包括以下组分：
基础培养基、HEPES缓冲对、青霉素链霉素溶液、营养添加剂和特异性因子；
所述特异性因子为烟酰胺、N-乙酰半胱氨酸、Y-27632、WNT-3A、R-spondin 1、CHIR99021、Noggin因子、A83-01、EGF、FGF2、FGF7、FGF10、Forskolin 和PGE2。
本发明针对宫颈腺癌开发了适合宫颈腺癌类器官的培养基，大幅提高了宫颈腺癌类器官的培养成功率，使得宫颈腺癌类器官培养成功率可从25％提高至 90％左右，较好的维持了宫颈腺癌类器官的生物活性，其类器官的生长活性和形态不受影响，所培养出宫颈腺癌类器官可维持原肿瘤组织的组织学形态及遗传学特征。
本发明特定筛选出上述特异性因子的组合，有利于提高宫颈腺癌类器官培养成功率，促进宫颈腺癌的研究。
本发明所述宫颈腺癌类器官培养基的优选实施方式，宫颈腺癌类器官培养基包括以下组分：
基础培养基、HEPES缓冲对10～12mM、青霉素链霉素溶液1％～2％、营养添加剂1％～2％、烟酰胺10～12mmol/L、N-乙酰半胱氨酸1～1.5mmol/L、 Y-27632 0～10μM、WNT-3A 0～100ng/ml、R-spondin 1 50～300ng/ml、 CHIR99021 1～5umol/L、Noggin因子150～300ng/ml、A83-01 450～550nmol/L、 EGF 50～150ng/ml、FGF2 2～10ng/mL、FGF7 30～100ng/mL、FGF10 50～150 ng/mL、Forskolin 0.5～1.5μmol/L和PGE2 0.5～1.5μmol/L。
作为本发明所述宫颈腺癌类器官培养基的优选实施方式，宫颈腺癌类器官培养基包括以下组分：
基础培养基、HEPES缓冲对10～12mM、青霉素链霉素溶液1％～2％、营养添加剂2％、烟酰胺10～12mmol/L、N-乙酰半胱氨酸1.25mmol/L、Y-27632 2～10μM、WNT-3A 10～100ng/ml、R-spondin 1 200ng/ml、CHIR99021 3umol/L、 Noggin因子200ng/ml、A83-01500nmol/L、EGF 100ng/ml、FGF2 5ng/mL、FGF7 50ng/mL、FGF10 100ng/mL、Forskolin 1.0μmol/L和PGE2 1.0μmol/L。
作为本发明所述宫颈腺癌类器官培养基的优选实施方式，所述营养添加剂为浓度为1％的Glutamax和浓度为1％的B27。
第二目的，本发明提供了一种宫颈腺癌类器官模型的构建方法，包括以下步骤：
1)获得宫颈癌组织，机械及酶解消化宫颈癌组织，过滤离心，保留细胞沉淀，去除红细胞，得细胞团块；
2)将细胞团块重悬于基质胶中，接种，固定；然后置于上述的宫颈腺癌类器官培养基中培养，每2-3天观察换液，每7-21天进行传代。
作为本发明所述宫颈腺癌类器官模型的构建方法的优选实施方式，步骤1) 中，机械及酶解消化宫颈癌组织的具体步骤为：将宫颈癌组织剪碎至体积为1 mm3～5mm3的小块，加入消化液，震荡消化；消化液包括含2％双抗及两性霉素B的Advanced DMEM/F12培养基及0.5mg/ml胶原酶II。
作为本发明所述宫颈腺癌类器官模型的构建方法的优选实施方式，步骤1) 中，消化后的宫颈癌组织过80～120μm的细胞筛。更优选地，消化后的宫颈癌组织过100μm的细胞筛。
作为本发明所述宫颈腺癌类器官模型的构建方法的优选实施方式，步骤2) 中，细胞团块和基质胶的质量比为1:2。
第三目的，本发明提供了上述培养基在培养宫颈腺癌类器官中的用途。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明针对宫颈腺癌开发出宫颈腺癌类器官培养基，提高了宫颈癌类器官的培养成功率，较好的维持了宫颈腺癌类器官的生物活性，其类器官的生长活性和形态不受影响，所培养出宫颈腺癌类器官可维持原肿瘤组织的组织学形态及遗传学特征；开发的宫颈腺癌类器官培养基有利于为宫颈癌研究提供新的思路。
附图说明
图1为经过实施例1的宫颈腺癌类器官培养基培养后获得的宫颈腺癌类器官的光学显微镜图；
图2为经过实施例2的宫颈腺癌类器官培养基培养后获得的宫颈腺癌类器官的光学显微镜图；
图3为实施例、对比例1-6的宫颈腺癌类器官培养基培养后的宫颈腺癌类器官直径的对比统计图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
在以下实施例和对比例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例和对比例中，营养添加剂包括Glutamax和B27，特异性因子为烟酰胺、N-乙酰半胱氨酸、Y-27632、WNT-3A、R-spondin 1、CHIR99021、Noggin 因子、A83-01、EGF、FGF2、FGF7、FGF10、Forskolin和PGE2。
在以下实施例和对比例中，青霉素链霉素溶液(100×青霉素链霉素混合液)、Hepes缓冲对、Glutamax、B27均购自英潍捷基(上海)贸易有限公司；烟酰胺(nicotinamide)、N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine)、Forskolin、A83-01 购自Sigma-Aldrich公司；WNT-3A、R-spondin 1、CHIR99021、Noggin因子、 EGF、FGF2、FGF7、FGF10购自PeproTech公司；Y-27632、PGE2购自stem cell 公司。
实施例1、宫颈腺癌类器官培养基
本实施例提供了一种宫颈腺癌类器官培养基，包括基础培养基Advanced DMEM/F12、10mM Hepes缓冲对、1％青霉素链霉素溶液、1％Glutamax、1％ B27、10mmol/L烟酰胺、1.25mmol/L N-乙酰半胱氨酸、10μM Y-27632、100ng/ml WNT-3A、200ng/ml R-spondin 1、3μmol/L CHIR99021、200ng/ml Noggin因子、 500nmol/L A83-01、100ng/ml EGF、5ng/mLFGF2、50ng/ml FGF7、100ng/ml FGF10、1μM Forskolin和1μM PGE2。特异性因子各组分的浓度以其在宫颈腺癌类器官培养基中的浓度为准。
实施例2、宫颈腺癌类器官培养基
本实施例提供了一种宫颈腺癌类器官培养基，包括基础培养基Advanced DMEM/F12、12mM Hepes缓冲对、1％青霉素链霉素溶液、1％Glutamax、1％ B27、12mmol/L烟酰胺、1.25mmol/L N-乙酰半胱氨酸、200ng/ml R-spondin 1、 3μmol/L CHIR99021、200ng/mlNoggin因子、500nmol/L A83-01、100ng/ml EGF、 5ng/mL FGF2、50ng/ml FGF7、100ng/mlFGF10、1μM Forskolin和1μM PGE2。特异性因子各组分的浓度以其在宫颈腺癌类器官培养基中的浓度为准。
实施例3、宫颈腺癌类器官培养基
本实施例提供了一种宫颈腺癌类器官培养基，包括基础培养基Advanced DMEM/F12、10mM Hepes缓冲对、2％青霉素链霉素溶液、0.5％Glutamax、0.5％ B27、12mmol/L烟酰胺、1.0mmol/L N-乙酰半胱氨酸、2uM Y-27632、10ng/ml WNT-3A、50ng/ml R-spondin 1、1μmol/L CHIR99021、150ng/ml Noggin因子、 450nmol/L A83-01、50ng/ml EGF、2ng/mLFGF2、30ng/ml FGF7、50ng/ml FGF10、0.5μM Forskolin和0.5μM PGE2。特异性因子各组分的浓度以其在宫颈腺癌类器官培养基中的浓度为准。
实施例4、宫颈腺癌类器官培养基
本实施例提供了一种宫颈腺癌类器官培养基，包括基础培养基Advanced DMEM/F12、12mM Hepes缓冲对、1％青霉素链霉素溶液、1％Glutamax、1％ B27、10mmol/L烟酰胺、1.5mmol/L N-乙酰半胱氨酸、10uM Y-27632、100ng/ml WNT-3A、300ng/ml R-spondin 1、5μmol/L CHIR99021、300ng/ml Noggin因子、 550nmol/L A83-01、150ng/ml EGF、10ng/mLFGF2、100ng/ml FGF7、150ng/ml FGF10、1.5μM Forskolin和1.5μM PGE2。特异性因子各组分的浓度以其在宫颈腺癌类器官培养基中的浓度为准。
实施例5、一种宫颈腺癌类器官模型的构建方法
一种宫颈鳞癌类器官模型的构建方法，包括以下步骤：
1)样本预处理：将刚切除/活检得到的宫颈癌组织标本用生理盐水冲洗3-5 次除去表面杂质，装进含浓度为2％双抗及两性霉素B的Advanced DMEM/F12 培养基中保存，冰上运输；
2)样本消化：在生物安全柜中，将样本转移至10cm无菌培养皿中加入1ml 0.5mg/ml胶原酶II(消化液，基底：含2％双抗及两性霉素B的Advanced DMEM/F12培养基)，用灭菌眼科剪将组织剪碎至1mm3-5mm3大小，将组织块及消化液转移至50ml离心管中，按组织体积适量补充消化液，37度，120rpm 震荡消化120mins；
3)样本解离：用同体积的PBS终止消化，将消化后的组织悬液用100μm 的细胞筛过滤，收集细胞筛上未过滤组织碎片于50ml离心管中，加入3ml tryple (依碎片多少加减)，37度，120rpm震荡消化10mins；
4)细胞过滤：用同体积的PBS终止消化，将消化后的组织悬液再次用100μm 的细胞筛过滤，收集两次过滤的滤液，4度600g离心5min，保留细胞沉淀去除上清；
5)裂解红细胞(可选)：肉眼可见细胞沉淀内混有红细胞，加入1-2ml常规的红细胞裂解液，重悬细胞，室温裂解2min；
6)细胞清洗：用10mlPBS终止裂解，4度600g离心5min，保留细胞沉淀去除上清，重复两次；
7)接种：取类器官培养基及基质胶(体积比例为1:2)以1万细胞/10μl的密度重悬细胞沉淀，以30μl/孔接种至48孔板中，小心将孔板倒置，于37度培养箱中固定30mins，待胶凝固后加入200ul培养基覆盖胶滴；
8)培养：于上述实施例1-4中宫颈腺癌类器官培养基下培养，培养条件为 37℃、5％CO2浓度，每2-3天观察换液，每7-21天进行传代。
按照实施例5的构建方法，通过在上述实施例1-2宫颈腺癌类器官培养基培养后获得的宫颈腺癌类器官在倒置的光学显微镜下观察如图1-2所示。经过实施例3-4宫颈腺癌类器官培养基培养后获得的宫颈腺癌类器官在倒置的光学显微镜下的形态与图1-2类似，故不再阐述。
对比例1-6
在实施例1的基础上，对比例1-6为分别减去或添加如表1的特异性因子构成的宫颈腺癌类器官培养基，然后再按照实施例5宫颈腺癌类器官模型的构建方法培养宫颈腺癌类器官7天后，在倒置显微镜下随机挑选5个视野进行类器官的直径测定。
表1
分析结果：
参考图3，经过对比例1-6宫颈腺癌类器官培养基培养后的宫颈腺癌类器官直径不及实施例1宫颈腺癌类器官培养基培养效果，其中对比例1去掉R-spondin 1，宫颈腺癌类器官培养效果明显不及实施例1，说明R-spondin 1在宫颈腺癌类器官的形成中起重要作用。其中对比例2-5分别去掉CHIR99021，FGF2，FGF7， PGE2中的一种，宫颈腺癌类器官培养效果不及实施例1，说明CHIR99021， FGF2，FGF7，PGE2中相互协同促进宫颈鳞癌类器官培养效果，提高培养宫颈癌类器官的成功率。对比例6的培养基添加Hydrocortisone因子，这种培养基培养后的宫颈腺癌癌类器官大小不及实施例2，说明不是任意特异性因子的添加就能获得本发明的技术效果。
试验例、宫颈腺癌类器官培养基对宫颈腺癌培养成功率的影响
本试验纳入20例宫颈腺癌类器官样本，按照实施例5的构建方法，检测经过上述实施例1-4宫颈腺癌类器官培养基培养后获得的宫颈腺癌类器官的活性，各组培养宫颈腺癌类器官的成功率如表2所示，其中，培养成功指的是在特定的培养条件下消化后的肿瘤细胞或细胞团能在体外形成立体结构即类器官培养成功。
表2
| 组别 | 宫颈癌类器官培养成功率(％) |
| 实施例1 | 90％ |
| 实施例2 | 85％ |
| 实施例3 | 80％ |
| 实施例4 | 85％ |
根据上述结果可知，采用实施例1的宫颈腺癌类器官培养基培养后获得的宫颈鳞癌类器官的成功率可以提高至90％，实施例2-4提高宫颈鳞癌类器官成功培养的效果与实施例2类似。
对比例1-6中的培养基缺少R-spondin 1、CHIR99021、FGF2、FGF7、PGE2 中的一项特异性因子时，或增加其他特异性因子，其培养宫颈腺癌类器官的效果不及实施例1，说明特异性因子不是随意可以添加的，有些特异性因子的加入反而会影响类器官培养的效果。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (9)
1.一种宫颈腺癌类器官培养基，其特征在于，包括以下组分：
基础培养基、HEPES缓冲对、青霉素链霉素溶液、营养添加剂和特异性因子；
所述特异性因子为烟酰胺、N-乙酰半胱氨酸、Y-27632、WNT-3A、R-spondin 1、CHIR99021、Noggin因子、A83-01、EGF、FGF2、FGF7、FGF10、Forskolin和PGE2。
2.如权利要求1所述的宫颈腺癌类器官培养基，其特征在于，包括以下组分：
基础培养基、HEPES缓冲对10～12mM、青霉素链霉素溶液1％～2％、营养添加剂1％～2％、烟酰胺10～12mmol/L、N-乙酰半胱氨酸1～1.5mmol/L、Y-27632 0～10μM、WNT-3A 0～100ng/ml、R-spondin 1 50～300ng/ml、CHIR99021 1～5umol/L、Noggin因子150～300ng/ml、A83-01 450～550nmol/L、EGF 50～150ng/ml、FGF2 2～10ng/mL、FGF7 30～100ng/mL、FGF10 50～150ng/mL、Forskolin 0.5～1.5μmol/L和PGE2 0.5～1.5μmol/L。
3.如权利要求2所述的宫颈腺癌类器官培养基，其特征在于，包括以下组分：
基础培养基、HEPES缓冲对10～12mM、青霉素链霉素溶液1％～2％、营养添加剂2％、烟酰胺10～12mmol/L、N-乙酰半胱氨酸1.25mmol/L、Y-27632 2～10μM、WNT-3A 10～100ng/ml、R-spondin 1 200ng/ml、CHIR99021 3umol/L、Noggin因子200ng/ml、A83-01 500nmol/L、EGF 100ng/ml、FGF2 5ng/mL、FGF7 50ng/mL、FGF10 100ng/mL、Forskolin 1.0μmol/L和PGE2 1.0μmol/L。
4.如权利要求1所述的宫颈腺癌类器官培养基，其特征在于，所述营养添加剂为浓度为1％的Glutamax和浓度为1％的B27。
5.一种宫颈腺癌类器官模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)获得宫颈癌组织，机械及酶解消化宫颈癌组织，过滤离心，保留细胞沉淀，去除红细胞，得细胞团块；
2)将细胞团块重悬于基质胶中，接种，固定；然后置于如权利要求1～4任一项所述的宫颈腺癌类器官培养基中培养，每2-3天观察换液，每7-21天进行传代。
6.如权利要求5所述的宫颈腺癌类器官模型的构建方法，其特征在于，步骤1)中，机械及酶解消化宫颈癌组织的具体步骤为：将宫颈癌组织剪碎至体积为1mm3～5mm3的小块，加入消化液，震荡消化；消化液包括含2％双抗及两性霉素B的Advanced DMEM/F12培养基及0.5mg/ml胶原酶II。
7.如权利要求5所述的宫颈腺癌类器官模型的构建方法，其特征在于，步骤1)中，消化后的宫颈癌组织过80～120μm的细胞筛。
8.如权利要求5所述的宫颈腺癌类器官模型的构建方法，其特征在于，步骤2)中，细胞团块和基质胶的体积比为1:2。
9.如权利要求1～4任一项所述的培养基在培养宫颈腺癌类器官中的用途。
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