CN114790236A - 一种gcgr/glp-1r双靶点激动多肽的合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种GCGR/GLP‑1R双靶点激动多肽的合成方法，该方法包括：固相合成GCGR/GLP‑1R双靶点激动多肽S1‑S4片段树脂，经裂解，纯化作为第一片段；合成GCGR/GLP‑1R双靶点激动多肽带侧链基团的赖氨酸，作为第二片段；按照GCGR/GLP‑1R双靶点激动多肽的肽序依次偶联氨基酸或肽片段，得到GCGR/GLP‑1R双靶点激动多肽的肽树脂，然后裂解，纯化得到GCGR/GLP‑1R双靶点激动多肽精肽。本发明能够降低D‑His、D‑Thr、D‑Phe等消旋杂质及+Gly杂质的产生，显著降低了粗品纯化的难度，大大提高了GCGR/GLP‑1R双靶点激动多肽的纯度和收率，降低了生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种多肽化合物的合成方法，特别涉及一种GCGR/GLP-1R双靶点激动多肽的合成方法。
背景技术
胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是由人肠道L细胞分泌的一种肽类激素，能够促进胰岛素的分泌，抑制胰高血糖素的分泌，具有降低血糖浓度的功效，被用于II型糖尿病的治疗。然而天然GLP-1在体内不稳定，易被二肽基肽酶-IV(DPP-IV)快速降解。
GCGR/GLP-1R双靶点激动多肽是具有胰高血糖素样肽-1受体(Glucagon-likepeptide-1receptor，GLP-1R)和胰高血糖素受体(Glucagon receptor，GCGR)双激动效应的多肽化合物，其具有高酶解稳定性、高生物活性、无不良反应等特点，能够明显改善BDL诱导的大鼠胆汁淤积性肝纤维化程度，对胆汁性肝硬化等疾病具有显著的治疗作用，该类双靶点激动剂多肽还可用于预防或治疗胆汁性肝硬化及相关肝纤维化疾病。该类双靶点激动剂多肽由于其良好的治疗效果，现已广泛应用于临床治疗中。GCGR/GLP-1R双靶点激动多肽的Lys侧链经PEG2，γ-Glu和棕榈酸(Pal)修饰后，亲水性大大提高，与白蛋白的结合力增强；同时N端第2位的Ala突变为D-Ser后，有效的避免了被DPP-IV酶解而失活，半衰期达到40h，患者每周只需注射一次。
目前已报道的GLP-1或其类似物的制备方法为逐个完成GLP-1或其类似物的主链和侧链的偶联。例如，专利CN106046145 A中公开的制备方法为：首先在固相逐步合成GLP-1类似物直链肽，然后合成侧链修饰基团，再脱去Lys的保护基，并偶联侧链修饰基团，最终裂解得到该多肽产物。由于GLP-1类似物的序列较长且有较多的疏水氨基酸，采用氨基酸逐步缩合的方法合成时，易形成折叠，导致树脂收缩严重，延长反应时间，进而粗肽中产生较多与产品性质极为接近的杂质，如D-His的消旋杂质。
因此，实有必要提供一种降低合成过程中消旋杂质及杂质的合成方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种GCGR/GLP-1R双靶点激动多肽的合成方法，该合成方法能够降低合成过程中消旋杂质及杂质的产生，降低了粗品纯化的难度。
为达上述目的，本发明提供了一种GCGR/GLP-1R双靶点激动多肽的合成方法，该合成方法包括以下步骤：
步骤1：将树脂固相载体和Fmoc-Gly-OH偶联得到Fmoc-Gly-树脂；
步骤2：取步骤1所得的Fmoc-Gly-树脂偶联氨基酸，固相合成GCGR/GLP-1R双靶点激动多肽全保护S1-S4片段树脂，经裂解，纯化，作为第一片段；
步骤3：合成GCGR/GLP-1R双靶点激动多肽带侧链基团的赖氨酸，作为第二片段；
步骤4：将树脂固相载体和Fmoc-Ser(tBu)-OH偶联得到Fmoc-Ser(tBu)-树脂；
步骤5：按照GCGR/GLP-1R双靶点激动多肽的氨基酸序列，取步骤4所得的Fmoc-Ser(tBu)-树脂依次偶联氨基酸或肽片段，经裂解，纯化得到GCGR/GLP-1R双靶点激动多肽。
本发明的GCGR/GLP-1R双靶点激动多肽的合成方法，优选地，所述GCGR/GLP-1R双靶点激动多肽具有以下氨基酸序列表示的母体肽：
His-Xaa2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa10-Ser-Lys-Xaa13-Leu-Asp-Xaal6-Xaal7-Xaal8-Ala-Xaa20-Xaa21-Phe-Xaa23-Xaa24-Trp-Leu-Xaa27-Xaa28-Xaa29-Xaa30-Xaa31-Xaa32-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-COR1；
其中，R1＝-NH2或-OH；
Xaa2＝Aib，Ser或D-Ser；
Xaa10＝Lys或Tyr；
Xaal3＝Lys或Tyr；
Xaal6＝Ser，Aib，Lys或Glu；
Xaal7＝Lys或Arg；
Xaal8＝Arg或Ala；
Xaa20＝His，Gln或Lys；
Xaa21＝Asp或Glu；
Xaa23＝Ile，Leu或Val；
Xaa24＝Glu或Gln；
Xaa27＝Met，Leu，NIe或不存在；
Xaa28＝Ser，Asp，Asn，Arg或不存在；
Xaa29＝Ala，Gly，Thr或不存在；
Xaa30＝Gly或不存在；
Xaa31＝Gly或不存在；
Xaa32＝Pro或不存在；
Xaa33＝Ser或不存在；
Xaa34＝Ser或不存在；
Xaa35＝Gly或不存在；
Xaa36＝Ala或不存在；
Xaa37＝Pro或不存在；
Xaa38＝Pro或不存在；
Xaa39＝Pro或不存在；
Xaa40＝Ser或不存在；
其中，Xaa10，Xaal6，Xaal7或Xaa20中至少一个为Lys，所述至少一个Lys或所述序列的第12位Lys的侧链与亲脂性的取代基相连，连接方式为所述亲脂性的取代基以其羧基与一个桥接基团的氨基形成酰胺键，桥接基团的氨基酸残基的羧基与母体肽的Lys的N-末端残基上形成一个酰胺键连接到母体肽上，所述桥接基团为Glu，Asp和/或(PEG)m，其中m为2-10的整数；所述亲脂性取代基为选自CH3(CH2)nCO-或HOOC(CH2)nCO-的酰基，其中n是10-24的整数。
本发明的GCGR/GLP-1R双靶点激动多肽的合成方法，更优选地，所述GCGR/GLP-1R双靶点激动多肽的氨基酸序列为His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Lys(PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)14CH3)-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Leu-Asn-Thr-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2。
本发明的GCGR/GLP-1R双靶点激动多肽的合成方法，优选地，所述步骤3中，合成GCGR/GLP-1R双靶点激动多肽S16带侧链基团的赖氨酸，得到Fmoc-Lys(Pal-γ-Glu-PEG2-PEG2)-OH，作为第二片段。
本发明的GCGR/GLP-1R双靶点激动多肽的合成方法，优选地，所述步骤1中，树脂为2-CTC树脂，Fmoc-Gly-树脂的替代度为0.6～1.0mmol/g。
本发明的GCGR/GLP-1R双靶点激动多肽的合成方法，优选地，所述步骤2中，第一片段的组氨酸为Boc-His(π-MBom)-OH；制备第一片段的裂解液为TFE与DCM的混合液，所述TFE与所述DCM的体积比为1:7～1:3。
本发明的GCGR/GLP-1R双靶点激动多肽的合成方法，优选地，所述步骤3中，侧链基团为下述结构之一：
Lys(PEG2-PEG2-CO(CH2)14CH3)：
Lys(PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)14CH3)：
Lys(PEG2-PEG2-CO(CH2)14CO2H)：
Lys(PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)14CO2H)：
Lys(PEG2-PEG2-CO(CH2)16CO2H)：
Lys(PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)16CO2H)：
Lys(PEG2-PEG2-CO(CH2)16CH3)：
LysPEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)16CH3)：
本发明的GCGR/GLP-1R双靶点激动多肽的合成方法，优选地，所述步骤3中，制备第二片段的方法为：以2-CTC树脂为起始树脂，依次偶联Fmoc-PEG2-OH，Fmoc-PEG2-OH，Fmoc-Glu(OH)-OtBu，棕榈酸，得到Pal-γ-Glu(OtBu)-PEG2-PEG2-CTC树脂，经裂解纯化得到Pal-γ-Glu(OtBu)-PEG2-PEG2-OH，经HOPFP/DIC处理后得到Pal-γ-Glu(OtBu)-PEG2-PEG2-OPFP，然后偶联Fmoc-Lys-OH，得到Fmoc-Lys(Pal-γ-Glu(OtBu)-PEG2-PEG2)-OH。
本发明的GCGR/GLP-1R双靶点激动多肽的合成方法，优选地，所述步骤4中，树脂选自Rink Amide MBHA Resin或Rink Amide AM Resin；所述Rink Amide MBHA Resin或RinkAmide AM Resin的替代度为0.3～0.6mmol/g。
本发明的GCGR/GLP-1R双靶点激动多肽的合成方法，优选地，所述步骤1和/或步骤4中，还需要使用活化剂，所述活化剂选自DIC，DIEA，TEA和DBU中的至少一种；所述步骤2、步骤3和/或步骤5中，偶联过程的缩合剂选自DIC/Cl-HOBt，TBTU/HOBt/DIEA，TBTU/Cl-HOBt/DIEA，TBTU/HOAt/DIEA，TBTU/DIEA，PyBop/DIEA，PyAop/DIEA和COMU/DIEA中的至少一种；所述偶联过程的溶剂选自DMF，DCM，NMP和DMSO中的至少一种。
本发明的GCGR/GLP-1R双靶点激动多肽的合成方法，优选地，所述步骤5中，GCGR/GLP-1R双靶点激动多肽的合成采用全保护S5-S6片段为原料；所述全保护S5-S6片段为Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OH。
本发明的GCGR/GLP-1R双靶点激动多肽的合成方法，优选地，所述步骤5中，所述GCGR/GLP-1R双靶点激动多肽的合成方法具体包括以下步骤：取Fmoc-Ser(tBu)-树脂，通过固相合成法，按GCGR/GLP-1R双靶点激动多肽的肽链从C端至N端的氨基酸序列，依次偶联Fmoc-Pro-OH*3，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH*2，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Gly-OH*2，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Leu-OH*2，Fmoc-Trp(Boc)-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH*2，Fmoc-Lys(Pal-γ-Glu(OtBu)-PEG2-PEG2)-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OH和Boc-His(π-MBom)-D-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Gly-OH，得到GCGR/GLP-1R双靶点激动多肽树脂，然后裂解，得到GCGR/GLP-1R双靶点激动多肽。
本发明的GCGR/GLP-1R双靶点激动多肽的合成方法，优选地，所述步骤5中，所述裂解过程的裂解液为TFA、TIS、H2O和Mpr的混合液，所述TFA、TIS、H2O和Mpr的体积比为90～95:2～5:2～5:1～3。
本发明的GCGR/GLP-1R双靶点激动多肽的固相合成方法采用片段和逐步合成相结合的固相合成法，简化了工艺流程步骤，有利于工业化大生产；通过制备GCGR/GLP-1R双靶点激动多肽全保护S1-S4片段和S5-S6片段，作为关键起始物料应用于GCGR/GLP-1R双靶点激动多肽固相合成中，降低了D-His、D-Thr、D-Phe等消旋杂质及+Gly杂质的产生，显著降低了粗品纯化的难度，大大提高了GCGR/GLP-1R双靶点激动多肽的纯度和收率，降低了生产成本，通过制备GCGR/GLP-1R双靶点激动多肽的带侧链基团的赖氨酸片段，作为关键起始物料应用于GCGR/GLP-1R双靶点激动多肽固相合成中，可以避免脱除Lys侧链保护基(Alloc、Dde等)所用的重金属钯试剂或者基因毒性化合物水合肼，并且大大缩短合成周期。
附图说明
图1为本发明实施例4制备的1-4位肽片段的HPLC色谱图。
图2为本发明实施例16制备的粗品的HPLC色谱图。
图3为本发明实施例19纯化的精肽的HPLC色谱图。
图4为本发明实施例19制备的精肽主峰质谱图；ESI-MSm/z 1271.88[M/4+H]+。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。除非另有说明，否则所用试剂或仪器均可以通过市购获得。
本发明中所使用的缩写及其含义列于下表1中：
为方便阐述，以下实施例中所制备的GCGR/GLP-1R双靶点激动多肽的氨基酸序列为His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Lys(PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)14CH3)-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Leu-Asn-Thr-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2；但应理解，本发明的合成方法适用于所有GCGR/GLP-1R双靶点激动多肽的合成，包括但不限于具有上述氨基酸序列的GCGR/GLP-1R双靶点激动多肽。
实施例1替代度为0.8mmol/g的Fmoc-Gly-CTC树脂的制备
A.将10g(13mmol)替代度为1.3mmol/g的2-CTC树脂加入反应釜中，加入100mLDCM，混合2min后，滤除DCM，再加入100mLDCM，混合40min后，滤除DCM，最后再加入100mLDCM，混合2min后，滤除DCM，该树脂备用。
B.称取9.81g的Fmoc-Gly-OH和5.35g的HOBT于烧杯中，加入100mLDMF和5.46mL的DIEA，将溶液于0-10℃下搅拌活化5min后，倒入步骤A所得CTC树脂中，于20-25℃条件下混合4h。待反应结束后，加入100mLDMF,滤除DMF。加入4mL甲醇和5.46mL的DIEA，继续混合1h。反应结束后，抽滤，树脂用DMF洗5次，每次100mL；洗毕，用甲醇洗两次，每次100mL；再用DCM洗2次，每次100mL；最后用甲醇洗3次，每次100mL，直至树脂充分分散开。
C.将步骤B所得树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。烘干后，得到12.5g的Fmoc-Gly-CTC树脂，经紫外检测替代度为0.8mmol/g。
实施例2替代度为1.0mmol/g的Fmoc-Gly-CTC树脂的制备
A.将10g(16mmol)替代度为1.6mmol/g的2-CTC树脂加入反应釜中，加入100mLDCM，混合2min后，滤除DCM，再加入100mLDCM，混合40min后，滤除DCM，最后再加入100mLDCM，混合2min后，滤除DCM，该树脂备用。
B.称取9.81g的Fmoc-Gly-OH和5.35g的HOBT于烧杯中，加入100mLDMF和5.46mL的DIEA，将溶液于0-10℃下搅拌活化5min后，倒入步骤A所得CTC树脂中，于20-25℃条件下混合4h。待反应结束后，加入100mLDMF，滤除DMF。加入4mL甲醇和5.46mL的DIEA，继续混合1h。反应结束后，抽滤，树脂用DMF洗5次，每次100mL；洗毕，用甲醇洗两次，每次100mL；再用DCM洗2次，每次100mL；最后用甲醇洗3次，每次100mL，直至树脂充分分散开。
C.将步骤B所得树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。烘干后，得到12g的Fmoc-Gly-CTC树脂，经紫外检测替代度为1.0mmol/g。
实施例3 S1-S4位肽树脂Boc-His(π-MBom)-D-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Gly-CTC树脂的制备
A.将实施例1中得到的Fmoc-Gly-CTC树脂全部倒入反应釜中，用100mL DCM溶胀混合15min后抽干。加入体积浓度为20％哌啶/DMF溶液(即DBLK溶液)100mL，于20-30℃条件下混合5min后，抽干。加入DMF100mL，混合5min后，抽干。加入体积浓度为DBLK溶液100mL，于20-30℃条件下混合10min后，抽干。加入DMF100mL，混合5min后，抽干。重复用DMF洗涤8次，每次100mL，每次混合5min，并在第七次洗涤后，用PH试纸检测滤液，结果显示PH在6.5-7.0为合格。
B.依次称取12.20g的Fmoc-Gln(Trt)-OH，3.03gDIC和2.7g HOBT于干净的1L烧杯中，加入体积比为1:1的DMF/DCM溶液100mL，置于冰水中于0-10℃条件下用机械搅拌器搅拌溶解，待温度恒定后，继续维持温度并搅拌活化5min。将以上活化液缓慢加入到反应釜中，于20-25℃条件下混合2h。待反应结束后，抽干，加入DMF100mL，混合5min后，抽干。重复用DMF洗涤6次，每次100mL，每次混合5min。最后用茚三酮检测为阴性，即得到Fmoc-Gln(Trt)-Gly-CTC树脂。
C.按如上A的去保护方法和B的偶联方法，依先后顺序，依次分别偶联剩余氨基酸，即：Fmoc-D-Ser(tBu)-OH和Boc-His(π-MBom)-OH的偶联。最后用DCM洗5次，每次100mL；洗毕，用甲醇洗两次，每次100mL；再用DCM洗2次，每次100mL；最后用甲醇3次，每次100mL，直至树脂充分分散开。将该树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。得到全保护四肽Boc-His(π-MBom)-D-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Gly-CTC树脂21g。
实施例4 S1-S4位肽片段Boc-His(π-MBom)-D-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Gly-OH的制备
裂解液配比为TFE:DCM＝1:4(体积比)，于15℃条件下，向200mL裂解液中加入实施例3步骤C中所得的CTC树脂的全保护肽树脂21g，升温至30℃，继续搅拌反应3小时，然后用砂芯漏斗进行过滤，滤出的树脂再用40mL的DCM洗涤，重复操作两次后合并滤液，减压浓缩至滤液体积为原始体积的30％，然后将浓缩液缓慢加入到预冷的1L异丙醚中，沉降过夜后离心5次，每次用异丙醚200mL，得到白色固体粉末，先用氮气吹干4h后，再用真空干燥箱干燥10小时，取出称重，即得全保护四肽Boc-His(π-MBom)-D-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Gly-OH粗品9g。全保护四肽Boc-His(π-MBom)-D-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Gly-OH粗品经过纯化后，样品中D-His消旋杂质的含量为0.34％，HPLC色谱图如图1所示。
实施例5 S1-S4位肽片段Boc-His(π-MBom)-D-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Gly-OH的制备
裂解液配比为TFE:DCM＝1:5(体积比)，于15℃条件下，向100mL裂解液中加入全保护肽树脂10g，升温至30℃，继续搅拌反应3小时，然后用砂芯漏斗进行过滤，滤出的树脂再用30mL的DCM洗涤，重复操作两次后合并滤液，减压浓缩至滤液体积为原始体积的30％，然后将浓缩液缓慢加入到预冷的500mL异丙醚中，沉降过夜后离心5次，每次用异丙醚100mL，得到白色固体粉末，先用氮气吹干4h后，再用真空干燥箱干燥10小时，取出称重，即得全保护四肽Boc-His(π-MBom)-D-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Gly-OH粗品5g。全保护四肽Boc-His(π-MBom)-D-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Gly-OH粗品经过纯化后，样品中D-His消旋杂质的含量为0.45％。
实施例6 S1-S4位肽片段Boc-His(π-MBom)-D-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Gly-OH的制备
裂解液配比为TFE:DCM＝1:3(体积比)，于15℃条件下，向300mL裂解液中加入全保护肽树脂30g，升温至30℃，继续搅拌反应3小时，然后用砂芯漏斗进行过滤，滤出的树脂再用100mL的DCM洗涤，重复操作两次后合并滤液，减压浓缩至滤液体积为原始体积的30％，然后将浓缩液缓慢加入到预冷的1.5L异丙醚中，沉降过夜后离心5次，每次用异丙醚300mL，得到白色固体粉末，先用氮气吹干4h后，再用真空干燥箱干燥10小时，取出称重，即得全保护四肽Boc-His(π-MBom)-D-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Gly-OH粗品17g。全保护四肽Boc-His(π-MBom)-D-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Gly-OH粗品经过纯化后，样品中D-His消旋杂质的含量为0.29％。
实施例7 Fmoc-Lys(Pal-γ-Glu-PEG2-PEG2)-OH的合成
A.将100.01g(160.06mmol)替代度为1.6mmol/g的2-CTC树脂加入反应釜中，加入1600mLDCM，混合2min后，滤除DCM，再加入1600mLDCM，混合40min后，滤除DCM，最后再加入1600mLDCM，混合2min后，滤除DCM，该树脂备用。
B.称取117.97g的Fmoc-PEG2-OH于烧杯中，加入1600mLDMF和74mL的DIEA，将溶液于0-10℃下搅拌活化5min后，倒入步骤A所得CTC树脂中，于20-25℃条件下混合4h。待反应结束后，滤除DMF。加入250mL甲醇和1000mL DMF的混合溶液，35mL DIEA和1000mL DMF的混合溶液至树脂中,继续混合1h。反应结束后，抽滤，树脂用DMF洗5次，每次160mL；洗毕，用甲醇洗两次，每次1600mL；再用DCM洗2次，每次1600mL；最后用甲醇洗3次，每次1600mL，直至树脂充分分散开。
C.将步骤B所得树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。烘干后，得到135.5mmol的Fmoc-PEG2-CTC树脂，经检测替代度为0.83mmol/g。
D.将步骤C得到的Fmoc-PEG2-CTC树脂全部倒入反应釜中，用1600mL DCM溶胀混合15min后抽干。加入体积浓度为DBLK溶液1600mL，于20-30℃条件下混合5min后，抽干。加入DMF1600mL，混合5min后，抽干。加入体积浓度为DBLK溶液1600mL，于20-30℃条件下混合10min后，抽干。加入DMF1600mL，混合5min后，抽干。重复用DMF洗涤8次，每次1600mL，每次混合5min，并在第七次洗涤后，用PH试纸检测滤液，结果显示PH在6.5-7.0为合格。
E.依次称取109.53g的Fmoc-PEG2-OH，35.90g DIC和40.12gHOBT于干净的1L烧杯中，加入体积比为1:1的DMF/DCM溶液1600mL，置于冰水中于0-10℃条件下用机械搅拌器搅拌溶解，待温度恒定后，继续维持温度并搅拌活化5min。将以上活化液缓慢加入到反应釜中，于20-25℃条件下混合2h。待反应结束后，抽干，加入DMF1600mL，混合5min后，抽干。重复用DMF洗涤6次，每次1600mL，每次混合5min。最后用茚三酮检测为阴性，即得到Fmoc-PEG2-PEG2-CTC树脂。
F.按如上步骤D的去保护方法和步骤E的偶联方法，依先后顺序，依次分别偶联氨基酸Fmoc-Glu(OH)-OtBu和棕榈酸。最后用DCM洗5次，每次1600mL；洗毕，用甲醇洗两次，每次1600mL；再用DCM洗2次，每次1600mL；最后用醇3次，每次1600mL，直至树脂充分分散开。将该树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。得到Pal-γ-Glu-PEG2-PEG2-CTC树脂243.48g。
G.裂解液配比为TFE:DCM＝1:4(体积比)，于15℃条件下，向2500mL裂解液中加入步骤F中所得的CTC树脂的全保护肽树脂243.48g，升温至30℃，继续搅拌反应3小时，然后用砂芯漏斗进行过滤，滤出的树脂再用400mL的DCM洗涤，重复操作两次后合并滤液，减压浓缩至滤液体积为原始体积的30％，然后将浓缩液缓慢加入到预冷的3L异丙醚中，沉降30min后离心5次，每次用异丙醚500mL，得到白色固体粉末，先用氮气吹干4h后，再用真空干燥箱干燥10小时，取出称重，即得Pal-γ-Glu-PEG2-PEG2-OH粗品108.96g。
H.将步骤G得到的Pal-γ-Glu-PEG2-PEG2-OH粗品10g，溶解于20mL DCM中，加入4.4g五氟苯酚。称取4.8g DCC，溶于20mL DCM中,将DCC溶液缓慢滴加到反应溶液中，搅拌反应1.0h，TLC检测反应完全后，过滤。滤液用饱和食盐水洗涤一次，用水洗涤一次，再用无水硫酸钠干燥DCM溶液，浓缩至干燥，溶于适量的乙腈中得到Pal-γ-Glu-PEG2-PEG2-OPFP的乙腈溶液。另外，称取12.15g Fmoc-Lys-OH.HCl溶解于乙腈/水中(乙腈/水＝1/2)，加入15mLDIEA，搅拌15分钟获得Fmoc-Lys-OH溶液。将以上的Pal-γ-Glu-PEG2-PEG2-OPFP的乙腈溶液缓慢滴加到Fmoc-Lys-OH溶液中，搅拌反应1.5h。加入稀盐酸调pH值约为5-6，加入少量的DCM萃取。经纯化得到Fmoc-Lys(Pal-γ-Glu-PEG2-PEG2)-OH 3.56g。
实施例8 Fmoc-Ser(tBu)-Rink Amide AM Resin的制备
A.将10g(4mmol)替代度为0.40mmol/g的Rink Amide AM Resin加入反应釜中，加入100mLDCM，混合2min后，滤除DCM，再加入100mLDCM，混合40min后，滤除DCM，最后再加入100mLDCM，混合2min后，滤除DCM，加入DBLK溶液脱Fmoc保护2次，时间为10+10min，反应结束后，加入100mLDMF洗涤六次后，该树脂备用。
B.称取8.03g的Fmoc-Ser(tBu)-OH和4.38g的HOBT于烧杯中，加入100mLDMF和4.46mL的DIC，将溶液于0-10℃下搅拌活化5min后，倒入步骤A所得Rink Amide AM Resin中，于20-25℃条件下混合2h。待反应结束后，抽滤，树脂用DMF洗5次，每次100mL；得到Fmoc-Ser(tBu)-Rink Amide AM Resin树脂。
实施例9 Fmoc-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin的制备
A.将10g(3.7mmol)替代度为0.37mmol/g的Rink Amide MBHA Resin树脂加入反应釜中，加入100mLDCM，混合2min后，滤除DCM，再加入100mLDCM，混合40min后，滤除DCM，最后再加入100mLDCM，混合2min后，滤除DCM，加入DBLK溶液脱Fmoc保护2次，时间为10+10min,反应结束后，加入100mLDMF洗涤六次后，该树脂备用。
B.称取8.03g的Fmoc-Ser(tBu)-OH和5.84g的HOBT于烧杯中，加入100mLDMF和5.95mL的DIC，将溶液于0-10℃下搅拌活化5min后，倒入步骤A所得Rink Amide MBHA Resin中，于20-25℃条件下混合2h。待反应结束后，抽滤，树脂用DMF洗5次，每次100mL；得到Fmoc-Ser(tBu)-Rink Amide AM Resin树脂。
实施例10 Fmoc-Ser(tBu)-Rink Amide Resin的制备
A.将10g(3.7mmol)替代度为0.31mmol/g的Rink Amide Resin树脂加入反应釜中，加入100mLDCM，混合2min后，滤除DCM，再加入100mLDCM，混合40min后，滤除DCM，最后再加入100mLDCM，混合2min后，滤除DCM，加入DBLK溶液脱Fmoc保护2次，时间为10+10min,反应结束后，加入100mLDMF洗涤六次后，该树脂备用。
B.称取8.03g的Fmoc-Ser(tBu)-OH和5.84g的HOBT于烧杯中，加入100mLDMF和5.95mL的DIC，将溶液于0-10℃下搅拌活化5min后，倒入步骤A所得Rink Amide Resin中，于20-25℃条件下混合2h。待反应结束后，抽滤，树脂用DMF洗5次，每次100mL；得到Fmoc-Ser(tBu)-Rink Amide Resin树脂。
实施例11全保护S5-S6片段为Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OH的制备
A.Fmoc-Thr(tBu)-OPFP活泼酯的制备
将100mL的单口瓶放置在低温恒温搅拌反应器中，加入8.0g Fmoc-Thr(tBu)-OH和60mL DCM溶剂，再加入4.5g五氟苯酚。在0℃下搅拌溶解澄清后，滴加溶于20mLDCM中的5.4gDCC溶液。10min滴加完毕后升温至25℃反应2h。用TLC监测反应(石油醚:乙酸乙酯＝1:1，额外加入1滴醋酸)。反应完成后，抽滤，加入20mLDCM洗涤，合并滤液并旋蒸除去溶剂获得粘稠物体10.2g。
B.Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OH的制备
将25mL的单口瓶放置低温恒温搅拌反应器中，加入3.8g H-Gly-OH，30mL的0.087g/mL的碳酸钠水溶液和60mL(v/v＝1:1)的ACN/H2O混合溶液，降温至0℃。称取6.8g步骤A获得的Fmoc-Thr(tBu)-OPFP活泼酯溶于30mLACN中并滴加到单口瓶中。10min滴加完毕后升温至25℃反应4h，用TLC监测反应(石油醚:乙酸乙酯＝1:1，额外加入1滴醋酸)。反应完后，先旋蒸去除大部分ACN后，加入柠檬酸水溶液调节PH＝5，分别用EA萃取2次，每次100mL。收集有机相用柠檬酸水溶液洗涤2次，每次200mL。用200mL饱和食盐水洗涤一次，无水硫酸钠干燥后旋蒸除去溶剂获得粘稠固体。加入100mL(v/v＝1:1)的石油醚/异丙醚混合溶剂打浆30min，抽滤获得黄色固体5.0g。
实施例12全保护肽树脂的制备
A.将实施例8中得到的10g Fmoc-Ser(tBu)-Rink Amide AM Resin倒入反应釜中，用100mL DCM溶胀混合15min后抽干。加入DBLK溶液100mL，于20-30℃条件下混合5min后，抽干。加入DMF100mL，混合5min后，抽干。加入体积浓度为DBLK溶液100mL，于20-30℃条件下混合10min后，抽干。加入DMF100mL，混合5min后，抽干。重复用DMF洗涤8次，每次100mL，每次混合5min，并在第七次洗涤后，用PH试纸检测滤液，结果显示PH在6.5-7.0为合格。
B.依次称取3.89g的Fmoc-Pro-OH和0.49g HOBT于干净的1L烧杯中，加入体积比为1:1的DMF/DCM溶液100mL，置于冰水中于0-10℃条件下搅拌溶解，待温度恒定后，加入0.50mL DIC，继续维持温度并搅拌活化3min。将以上活化液缓慢加入到固相反应柱中，于20-25℃条件下混合2h。待反应结束后，抽干，加入DMF100mL，混合5min后，抽干。重复用DMF洗涤6次，每次100mL，每次混合5min。最后用茚三酮检测为阴性，即得到Fmoc-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide AM Resin。
C.按如上步骤A的去保护方法和步骤B的偶联方法，依主链氨基酸先后顺序，依次分别偶联剩余氨基酸或肽片段，即：Fmoc-Pro-OH*2,Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH*2,Fmoc-Pro-OH,Fmoc-Gly-OH*2,Fmoc-Thr(tBu)-OH,Fmoc-Asn(Trt)-OH,Fmoc-Leu-OH,*2,Fmoc-Trp(Boc)-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-Val-OH,Fmoc-Phe-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH*2,实施例7所得的Fmoc-Lys(Pal-γ-Glu-PEG2-PEG2)-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Tyr(tBu)-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Tyr(tBu)-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，实施例11所得的Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OH和实施例4所得的Boc-His(π-MBom)-D-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Gly-OH的偶联。其中，偶联Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Val-OH时采用DIC/Cl-HOBt偶联体系和DMF溶剂；偶联Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Trp(Boc)-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH时采用TBTU/HOBt/DIEA偶联体系和DCM溶剂；偶联Fmoc-Glu(OtBu)-OH时采用TBTU/Cl-HOBt/DIEA偶联体系；偶联Fmoc-Phe-OH时采用TBTU/HOAt/DIEA偶联体系；偶联Fmoc-Ala-OH时采用TBTU/DIEA偶联体系；偶联Fmoc-Ser(tBu)-OH时采用PyBop/DIEA偶联体系；偶联Fmoc-Thr(tBu)-OH时采用PyAop/DIEA偶联体系；偶联Fmoc-Lys(Pal-γ-Glu-PEG2-PEG2)-OH时采用HATU/DIEA偶联体系和NMP/DMF＝1:1的混合溶剂。最后用DCM洗5次，每次100mL；洗毕，用甲醇洗两次，每次100mL；再用DCM洗2次，每次100mL；最后用甲醇洗3次，每次100mL，直至树脂充分分散开。将该树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。得到肽树脂22.5g。
实施例13 S1-S4位肽树脂Fmoc-His(Trt)-D-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Gly-CTC树脂的制备
A.将6g替代度为0.8mmol/g的Fmoc-Gly-CTC树脂倒入反应釜中，用100mL DCM溶胀混合15min后抽干。加入DBLK溶液100mL，于20-30℃条件下混合5min后，抽干。加入DMF100mL，混合5min后，抽干。加入体积浓度为DBLK溶液100mL，于20-30℃条件下混合10min后，抽干。加入DMF100mL，混合5min后，抽干。重复用DMF洗涤8次，每次100mL，每次混合5min，并在第七次洗涤后，用PH试纸检测滤液，结果显示PH在6.5-7.0为合格。
B.依次称取6.25g的Fmoc-Gln(Trt)-OH，1.51gDIC和1.35g HOBT于干净的1L烧杯中，加入体积比为1:1的DMF/DCM溶液100mL，置于冰水中于0-10℃条件下搅拌溶解，待温度恒定后，继续维持温度并搅拌活化5min。将以上活化液缓慢加入到固相合成柱中，于20-25℃条件下混合2h。待反应结束后，抽干，加入DMF100mL，混合5min后，抽干。重复用DMF洗涤6次，每次100mL，每次混合5min。最后用茚三酮检测为阴性，即得到Fmoc-Gln(Trt)-Gly-CTC树脂。
C.按如上A的去保护方法和B的偶联方法，依先后顺序，依次分别偶联剩余氨基酸，即：Fmoc-D-Ser(tBu)-OH和Fmoc-His(Trt)-OH的偶联。最后用DCM洗5次，每次100mL；洗毕，用甲醇洗两次，每次100mL；再用DCM洗2次，每次100mL；最后用甲醇3次，每次100mL，直至树脂充分分散开。将该树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。得到全保护四肽Fmoc-His(Trt)-D-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Gly-CTC树脂11.5g。
实施例14 S1-S4片段Fmoc-His(Trt)-D-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Gly-OH的制备
裂解液配比为TFE:DCM＝1:4(体积比)，于15℃条件下，向200mL裂解液中加入实施例13步骤C中所得的CTC树脂的全保护肽树脂11.5g，升温至30℃，继续搅拌反应3小时，然后用砂芯漏斗进行过滤，滤出的树脂再用40mL的DCM洗涤，重复操作两次后合并滤液，减压浓缩至滤液体积为原始体积的30％，然后将浓缩液缓慢加入到预冷的1L异丙醚中，沉降过夜后离心5次，每次用异丙醚200mL，得到白色固体粉末，先用氮气吹干4h后，再用真空干燥箱干燥10小时，取出称重，即得全保护四肽Fmoc-His(Trt)-D-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Gly-OH粗品5.3g。全保护四肽Fmoc-His(Trt)-D-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Gly-OH粗品经过纯化后，样品中D-His消旋杂质的含量为2.05％。
实施例15全保护肽树脂的制备
A.将实施例8中得到的10g Fmoc-Ser(tBu)-Rink Amide AM Resin倒入反应釜中，用100mL DCM溶胀混合15min后抽干。加入DBLK溶液100mL，于20-30℃条件下混合5min后，抽干。加入DMF100mL，混合5min后，抽干。加入体积浓度为DBLK溶液100mL，于20-30℃条件下混合10min后，抽干。加入DMF100mL，混合5min后，抽干。重复用DMF洗涤8次，每次100mL，每次混合5min，并在第七次洗涤后，用PH试纸检测滤液，结果显示PH在6.5-7.0为合格。
B.依次称取3.89g的Fmoc-Pro-OH和0.49g HOBT于干净的1L烧杯中，加入体积比为1:1的DMF/DCM溶液100mL，置于冰水中于0-10℃条件下用机械搅拌器搅拌溶解，待温度恒定后，加入0.50mL DIC，继续维持温度并搅拌活化3min。将以上活化液缓慢加入到反应釜中，于20-25℃条件下混合2h。待反应结束后，抽干，加入DMF100mL，混合5min后，抽干。重复用DMF洗涤6次，每次100mL，每次混合5min。最后用茚三酮检测为阴性，即得到Fmoc-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide AM Resin。
C.按如上步骤A的去保护方法和步骤B的偶联方法，依主链氨基酸先后顺序，依次分别偶联剩余氨基酸或肽片段，即：Fmoc-Pro-OH*2,Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH*2,Fmoc-Pro-OH,Fmoc-Gly-OH*2,Fmoc-Thr(tBu)-OH,Fmoc-Asn(Trt)-OH,Fmoc-Leu-OH,*2,Fmoc-Trp(Boc)-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-Val-OH,Fmoc-Phe-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH*2,实施例7所得的Fmoc-Lys(Pal-γ-Glu-PEG2-PEG2)-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Tyr(tBu)-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Tyr(tBu)-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，实施例11所得的Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OH和实施例14所得的Fmoc-His(Trt)-D-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Gly-OH的偶联。其中，偶联Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Val-OH时采用DIC/Cl-HOBt偶联体系和DMF溶剂；偶联Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Trp(Boc)-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH时采用TBTU/HOBt/DIEA偶联体系和DCM溶剂；偶联Fmoc-Glu(OtBu)-OH时采用TBTU/Cl-HOBt/DIEA偶联体系；偶联Fmoc-Phe-OH时采用TBTU/HOAt/DIEA偶联体系；偶联Fmoc-Ala-OH时采用TBTU/DIEA偶联体系；偶联Fmoc-Ser(tBu)-OH时采用PyBop/DIEA偶联体系；偶联Fmoc-Thr(tBu)-OH时采用PyAop/DIEA偶联体系；偶联Fmoc-Lys(Pal-γ-Glu-PEG2-PEG2)-OH时采用HATU/DIEA偶联体系和NMP/DMF＝1:1的混合溶剂。最后用DCM洗5次，每次100mL；洗毕，用甲醇洗两次，每次100mL；再用DCM洗2次，每次100mL；最后用甲醇洗3次，每次100mL，直至树脂充分分散开。将该树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。得到肽树脂22.5g。
实施例16粗品的制备
裂解液配比为TFA:Tis:H2O:Mpr＝94:2.5:2.5:1(体积比)，于15℃条件下，向100mL裂解液中加入实施例12中所得的Rink Amide AM Resin的全保护肽树脂10g，升温至30℃，继续搅拌反应3小时，然后用砂芯漏斗进行过滤，滤出的树脂再用30mL的TFA洗涤，重复操作两次后合并滤液，减压浓缩至滤液体积为原始体积的30％，然后将浓缩液缓慢加入到预冷的300mL异丙醚中，沉降0.5h后离心5次，每次用异丙醚200mL，得到白色固体粉末，先用氮气吹干后，再用真空干燥箱干燥10小时，取出称重，即得粗品6.6g，HPLC纯度为67.1％，HPLC色谱图如图2所示。
实施例17粗品的制备
裂解液配比为TFA:Tis:H2O:Mpr＝92.5:2.5:2.5:2.5(体积比)，于15℃条件下，向100mL裂解液中加入实施例15所得的全保护肽树脂10g，升温至30℃，继续搅拌反应3小时，然后用砂芯漏斗进行过滤，滤出的树脂再用30mL的TFA洗涤，重复操作两次后合并滤液，减压浓缩至滤液体积为原始体积的30％，然后将浓缩液缓慢加入到预冷的300mL异丙醚中，沉降0.5h后离心5次，每次用异丙醚200mL，得到白色固体粉末，先用氮气吹干后，再用真空干燥箱干燥10小时，取出称重，即得粗品7.1g，HPLC纯度为65.3％，HPLC色谱图与图2相似。
实施例18粗品的制备
裂解液配比为TFA:Tis:H2O＝95:2.5:2.5(体积比)，于15℃条件下，向100mL裂解液中加入实施例15所得的全保护肽树脂10g，升温至30℃，继续搅拌反应3小时，然后用砂芯漏斗进行过滤，滤出的树脂再用30mL的TFA洗涤，重复操作两次后合并滤液，减压浓缩至滤液体积为原始体积的30％，然后将浓缩液缓慢加入到预冷的300mL异丙醚中，沉降0.5h后离心5次，每次用异丙醚200mL，得到白色固体粉末，先用氮气吹干后，再用真空干燥箱干燥10小时，取出称重，即得粗品6.6g，HPLC纯度为69.3％，HPLC色谱图与图2相似。
实施例19精肽的制备
取实施例16所得的6.6g粗品溶于乙腈/水溶液，以十八烷基键合硅胶为固定相，以磷酸二氢钾盐溶液和乙腈为流动相对粗肽溶液进行HPLC梯度洗脱，收集馏分，用旋转蒸发仪旋蒸去除部分乙腈，获得多肽的一次纯化溶液。多肽的一次纯化液以十八烷基键合硅胶为固定相，用0.％醋酸水溶液和乙腈为流动相进行HPLC线性洗脱，收集馏分，用旋转蒸发仪旋蒸去除乙腈和大部分水，冷冻干燥，获得精肽2.23g,HPLC纯度为99.8％，HPLC色谱图如图3所示,MS谱图如图4所示纯化收率为45.4％。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。
当然，本发明还可有其它多种实施例及其变形，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明权利要求的保护范围。
Claims (10)
1.一种GCGR/GLP-1R双靶点激动多肽的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：将树脂固相载体和Fmoc-Gly-OH偶联得到Fmoc-Gly-树脂；
步骤2：取步骤1所得的Fmoc-Gly-树脂偶联氨基酸，固相合成GCGR/GLP-1R双靶点激动多肽全保护S1-S4片段树脂，经裂解，纯化，作为第一片段；
步骤3：合成GCGR/GLP-1R双靶点激动多肽带侧链基团的赖氨酸，作为第二片段；
步骤4：将树脂固相载体和Fmoc-Ser(tBu)-OH偶联得到Fmoc-Ser(tBu)-树脂；
步骤5：按照GCGR/GLP-1R双靶点激动多肽的氨基酸序列，取步骤4所得的Fmoc-Ser(tBu)-树脂依次偶联氨基酸或肽片段，经裂解，纯化得到GCGR/GLP-1R双靶点激动多肽。
2.根据权利要求1所述的GCGR/GLP-1R双靶点激动多肽的合成方法，其特征在于，所述GCGR/GLP-1R双靶点激动多肽具有以下氨基酸序列表示的母体肽：
His-Xaa2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa10-Ser-Lys-Xaa13-Leu-Asp-Xaal6-Xaal7-Xaal8-Ala-Xaa20-Xaa21-Phe-Xaa23-Xaa24-Trp-Leu-Xaa27-Xaa28-Xaa29-Xaa30-Xaa31-Xaa32-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-COR1；
其中，R1＝-NH2或-OH；
Xaa2＝Aib，Ser或D-Ser；
Xaa10＝Lys或Tyr；
Xaal3＝Lys或Tyr；
Xaal6＝Ser，Aib，Lys或Glu；
Xaal7＝Lys或Arg；
Xaal8＝Arg或Ala；
Xaa20＝His，Gln或Lys；
Xaa21＝Asp或Glu；
Xaa23＝Ile，Leu或Val；
Xaa24＝Glu或Gln；
Xaa27＝Met，Leu，NIe或不存在；
Xaa28＝Ser，Asp，Asn，Arg或不存在；
Xaa29＝Ala，Gly，Thr或不存在；
Xaa30＝Gly或不存在；
Xaa31＝Gly或不存在；
Xaa32＝Pro或不存在；
Xaa33＝Ser或不存在；
Xaa34＝Ser或不存在；
Xaa35＝Gly或不存在；
Xaa36＝Ala或不存在；
Xaa37＝Pro或不存在；
Xaa38＝Pro或不存在；
Xaa39＝Pro或不存在；
Xaa40＝Ser或不存在；
其中，Xaa10，Xaal6，Xaal7或Xaa20中至少一个为Lys，所述至少一个Lys或所述序列的第12位Lys的侧链与亲脂性的取代基相连，连接方式为所述亲脂性的取代基以其羧基与一个桥接基团的氨基形成酰胺键，桥接基团的氨基酸残基的羧基与母体肽的Lys的N-末端残基上形成一个酰胺键连接到母体肽上，所述桥接基团为Glu，Asp和/或(PEG)m，其中m为2-10的整数；所述亲脂性取代基为选自CH3(CH2)nCO-或HOOC(CH2)nCO-的酰基，其中n是10-24的整数。
3.根据权利要求2所述的GCGR/GLP-1R双靶点激动多肽的合成方法，其特征在于，所述GCGR/GLP-1R双靶点激动多肽的氨基酸序列为His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Lys(PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)14CH3)-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Leu-Asn-Thr-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2。
4.根据权利要求1或3所述的GCGR/GLP-1R双靶点激动多肽的合成方法，其特征在于，所述步骤3中，合成GCGR/GLP-1R双靶点激动多肽S16带侧链基团的赖氨酸，得到Fmoc-Lys(Pal-γ-Glu-PEG2-PEG2)-OH，作为第二片段。
5.根据权利要求1所述的GCGR/GLP-1R双靶点激动多肽的合成方法，其特征在于，所述步骤1中，树脂为2-CTC树脂，Fmoc-Gly-树脂的替代度为0.6～1.0mmol/g；所述步骤2中，第一片段的组氨酸为Boc-His(π-MBom)-OH；制备第一片段的裂解液为TFE与DCM的混合液，所述TFE与所述DCM的体积比为1:7～1:3。
6.根据权利要求1所述的GCGR/GLP-1R双靶点激动多肽的合成方法，其特征在于，所述步骤3中，制备第二片段的方法为：以2-CTC树脂为起始树脂，依次偶联Fmoc-PEG2-OH，Fmoc-PEG2-OH，Fmoc-Glu(OH)-OtBu，棕榈酸，得到Pal-γ-Glu(OtBu)-PEG2-PEG2-CTC树脂，经裂解纯化得到Pal-γ-Glu(OtBu)-PEG2-PEG2-OH，经HOPFP/DIC处理后得到Pal-γ-Glu(OtBu)-PEG2-PEG2-OPFP，然后偶联Fmoc-Lys-OH，得到Fmoc-Lys(Pal-γ-Glu(OtBu)-PEG2-PEG2)-OH。
7.根据权利要求1所述的GCGR/GLP-1R双靶点激动多肽的合成方法，其特征在于，所述步骤4中，树脂选自Rink Amide MBHA Resin或Rink Amide AM Resin；所述Rink AmideMBHA Resin或Rink Amide AM Resin的替代度为0.3～0.6mmol/g。
8.根据权利要求1所述的GCGR/GLP-1R双靶点激动多肽的合成方法，其特征在于，所述步骤1和/或步骤4中，还需要使用活化剂，所述活化剂选自DIC，DIEA，TEA和DBU中的至少一种；所述步骤2、步骤3和/或步骤5中，偶联过程的缩合剂选自DIC/Cl-HOBt，TBTU/HOBt/DIEA，TBTU/Cl-HOBt/DIEA，TBTU/HOAt/DIEA，TBTU/DIEA，PyBop/DIEA，PyAop/DIEA和COMU/DIEA中的至少一种；所述偶联过程的溶剂选自DMF，DCM，NMP和DMSO中的至少一种。
9.根据权利要求1所述的GCGR/GLP-1R双靶点激动多肽的合成方法，其特征在于，所述步骤5中，GCGR/GLP-1R双靶点激动多肽的合成采用全保护S5-S6片段为原料；所述全保护S5-S6片段为Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OH。
10.根据权利要求3所述的GCGR/GLP-1R双靶点激动多肽的合成方法，其特征在于，所述步骤5中，所述GCGR/GLP-1R双靶点激动多肽的合成方法具体包括以下步骤：取Fmoc-Ser(tBu)-树脂，通过固相合成法，按GCGR/GLP-1R双靶点激动多肽的肽链从C端至N端的氨基酸序列，依次偶联Fmoc-Pro-OH*3，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH*2，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Gly-OH*2，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Leu-OH*2，Fmoc-Trp(Boc)-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH*2，Fmoc-Lys(Pal-γ-Glu(OtBu)-PEG2-PEG2)-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OH和Boc-His(π-MBom)-D-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Gly-OH，得到GCGR/GLP-1R双靶点激动多肽树脂，然后裂解，得到GCGR/GLP-1R双靶点激动多肽；所述步骤5中，所述裂解过程的裂解液为TFA、TIS、H2O和Mpr的混合液，所述TFA、TIS、H2O和Mpr的体积比为90～95:2～5:2～5:1～3。
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