CN114788899B - 光固化防粘连凝胶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种光固化防粘连凝胶及其制备方法，涉及生物医用材料技术领域；本发明的光固化防粘连凝胶由生物大分子、乙烯基化改性重组胶原蛋白、接枝颗粒以及光引发剂均质后于光照下固化制得；所述光固化防粘连凝胶以接枝颗粒为内核，所述生物大分子和乙烯基化改性重组胶原蛋白包覆在接枝颗粒表面；所述接枝颗粒为接枝MPC的乙烯基化改性重组胶原蛋白颗粒。本发明提供的防粘连凝胶既能在短期内起到物理隔离的目的，在慢性炎症期，又能够长期发挥防粘连的效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域，具体涉及一种光固化防粘连凝胶及其制备方法。
背景技术
粘连是结缔组织纤维带与相邻组织或器官发生结合而形成的异常结构，是手术后最常见的不良反应，常发生于腹腔、妇科、骨科、心胸外科等手术之后，不仅增加了再次手术的困难，而且可能导致严重的并发症，如慢性疼痛、肠梗阻、不孕症等。因此，预防术后粘连成为临床上迫切需要解决的问题。
在防粘连方面，国内外相关技术人员研究开发了多种技术，其中，以生物可降解的防粘连材料作为隔离物是目前的主要方法。现有技术的产品主要有两种：一种是防粘连膜，另一种是防粘连液。
防粘连膜材料可以将患处与周围组织物理性隔离，在组织愈合过程中起到防止形成粘连的作用，在术后一段时间内可在体内自行降解或被吸收；但是，由于膜已预先成型，厚度、形状不可改变，在某些复杂的创面部位不能与组织完全契合，导致防粘连的效果有所下降，且可能需要缝合固定，增加二次粘合的风险且在边缘处很难操作，因而使用受到一定的限制。
防粘连液的优点在于其为液体，推注后可迅速填满创面部位，具有良好的阻隔效果；但防粘连液大多降解较快、且由于其具有流动性能够被体液稀释，难以在创面长时间保持，因而对于慢性炎症期尤其是一些愈合时间较长的创面其效果往往并不理想。
中国专利公开号CN113563607A公开了一种用于治疗或预防宫腔粘连的3D打印水凝胶及其制备方法，其将甲基丙烯酸化明胶、甲基丙烯酸化胶原蛋白和光引发剂加入去离子水中，制得打印墨水；通过3D打印软件设计模型，将模型导入3D打印机；将打印墨水和人羊膜间充质干细胞转移至3D打印机内，打印制得水凝胶初品，然后用蓝光照射固化所述水凝胶初品，得到用于治疗或预防宫腔粘连的3D打印水凝胶。中国专利CN110790950A公开了一种光交联重组胶原蛋白水凝胶、制备方法及其在3D生物打印中的应用，将甲基丙烯酸酐加入到重组胶原蛋白的磷酸盐溶液中，反应得到甲基丙基酸酐改性重组胶原蛋白，再将改性重组胶原蛋白溶解于培养基中，加入光引发剂，混合均匀后光反应交联固化制得光交联重组胶原蛋白水凝胶。上述专利公开了以改性明胶或胶原蛋白为材料的光固化防粘连凝胶，但采用上述专利方法制备的水凝胶不含防粘附成分，在体内降解过快，炎性因子、细胞等的粘附尤其对术后慢性炎症的防粘连效果有限。
因此，提供一种阻隔效果好、能够紧密地附着于创面及其周围组织且能够长时间维持防粘连效果、防止细胞粘附的新型防粘连产品是本领域亟待解决的问题。
发明内容
为克服现有的技术缺陷，本发明的目的在于提供一种光固化防粘连凝胶及其制备方法，本发明的光固化防粘连凝胶通过接枝引入防粘连成分，能够防止细胞粘附，尤其在慢性炎症阶段，减少炎症因子和细胞的粘附和富集，显著减少炎症反应。
为了解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：
第一方面，提供了一种光固化防粘连凝胶，所述光固化防粘连凝胶由生物大分子、乙烯基化改性重组胶原蛋白、接枝颗粒以及光引发剂均质后于光照下固化制得；
所述光固化防粘连凝胶以接枝颗粒为内核，所述生物大分子和乙烯基化改性重组胶原蛋白包覆在接枝颗粒表面；
所述接枝颗粒为接枝MPC的乙烯基化改性重组胶原蛋白颗粒。
在本发明中，MPC为2-甲基丙烯酰氧基乙基磷脂酰胆碱。
本发明的光固化防粘连凝胶中，通过将乙烯基化改性重组胶原蛋白和MPC进行聚合，实现将抗细胞粘附的组分MPC接枝于材料上；通过接枝引入防粘连成分，能够防止细胞粘附，尤其在慢性炎症阶段，减少炎症因子和细胞的粘附和富集，显著减少炎症反应；另一方面，接枝的MPC组分具有极强的亲水性，增加了凝胶的亲水性，为创面提供湿性愈合环境，有助于创面愈合。
具体地，本发明中的乙烯基化改性重组胶原蛋白在光固化后形成网状结构，同时，MPC上的双键和重组胶原蛋白残留氨基的迈克尔加成反应两者协同，增强了凝胶的网络结构，MPC接枝的乙烯基化改性重组胶原蛋白以颗粒形式(即接枝颗粒)包裹于固化的网络结构中。另一方面，生物大分子由于以非交联形式存在，分子链能够相对自由的运动，使得凝胶体系中既存在固化交联的网络结构又存在相对运动自由的亲水性物质。
在具体应用过程中，固化成型的防粘连凝胶首先起到物理隔离的作用，放置于创面后，未经交联的生物大分子逐步降解，同时由于生物大分子中大量的氨基、羧基形成的分子间氢键以及网络结构的牵制，生物大分子在内源性酶作用下的降解也得以延缓；随着时间延长，凝胶的网络结构开始降解，此时，能够防止细胞粘附的接枝颗粒开始暴露出来，阻止了此时周围组织细胞的粘附、富集及爬行，起到避免粘连的目的，尤其对慢性炎症反应期的创面提供了有利的愈合环境。本发明提供的防粘连凝胶既能在短期内起到物理隔离的目的，在慢性炎症期，又能够长期发挥防粘连的效果。
基于上述组分和结构，本发明的防粘连凝胶能在短期和长期内均发挥优异的防粘连效果。
本发明中，所述乙烯基化改性重组胶原蛋白具体为通过改性剂对重组胶原蛋白进行乙烯基化改性；
在本发明中，乙烯基化改性重组胶原蛋白可采用现有已知的制备方法制得，即通过对重组胶原蛋白进行双键修饰，得乙烯基重组胶原蛋白。
具体到本发明中，乙烯基化改性重组胶原蛋白的制备方法为：
将重组胶原蛋白溶解于缓冲液中，制得重组胶原蛋白溶液；将改性剂加入到重组胶原蛋白溶液中，搅拌，冰浴下反应，清洗，冷冻干燥，得乙烯基重组胶原蛋白；
所述改性剂选自丙烯酸酐、甲基丙烯酸酐、乙基丙烯酸酐、乙基丙烯酰氯、羟基丙烯酸酐中的一种；优选为甲基丙烯酸酐；
所述缓冲液为磷酸盐缓冲液；优选为pH为6～8的磷酸盐缓冲液；
所述清洗为将溶液置于截留量为8000～14000KD的透析袋中，于30～50℃纯化水透析2～4天，透析之后离心、取上清液；
所述离心为采用离心机在3000～5000rpm转速下离心5～15min。
在本发明中，通过将乙烯基重组胶原蛋白和MPC溶解并混合均匀后，加入引发剂，使MPC接枝于乙烯基重组胶原蛋白上。
具体到本发明中，接枝颗粒的制备方法为：
将乙烯基化改性重组胶原蛋白和2-甲基丙烯酰氧基乙基磷脂酰胆碱在溶剂中混合均匀，在氮气保护下，加入自由基引发剂反应，反应产物经沉淀、真空干燥，得到接枝MPC的乙烯基化改性重组胶原蛋白；
再通过机械剪切或粉碎将上述接枝MPC的乙烯基化改性重组胶原蛋白制成接枝颗粒；
所述溶剂为三氯甲烷，所述引发剂为偶氮二异丁腈。
优选地，所述接枝颗粒的粒径为0.1～20μm。
进一步地，所述接枝颗粒中，MPC与乙烯基化改性重组胶原蛋白通过自由基聚合。
进一步地，所述光固化防粘连凝胶中：
所述生物大分子的含量为2～30％，所述乙烯基化改性重组胶原蛋白的含量为20～60％，所述接枝颗粒的含量为20～60％，所述光引发剂的含量为0.1％～1％，基于所述光固化防粘连凝胶的总重量。
进一步地，所述生物大分子选自透明质酸、重组胶原蛋白中的一种或多种；即生物大分子可以单独采用透明质酸，或单独采用重组胶原蛋白，或采用透明质酸和重组胶原蛋白的任意比混合物；优选为采用重组胶原蛋白。
在本发明中，重组胶原蛋白为本领域常用的重组胶原蛋白，如重组人源化I型胶原蛋白、重组人源化III型胶原蛋白、重组人源化IV型胶原蛋白、重组人源化VII型胶原蛋白、重组人源化XVII型胶原蛋白。该重组胶原蛋白是基于人体皮肤胶原蛋白的原始基因序列，优化选择其中水溶性强、生物活性高的部分进行密码子优化和拼接重组，提高胶原蛋白的亲水性以及活性。该重组胶原蛋白含有大量的亲水性基因，具有良好的成膜性，保持皮肤角质层水分。同时，其趋向性引导作用可引导上皮细胞快速进入受损部位，有效提高皮肤再生速度，缩短创伤愈合时间。
例如，上述重组胶原蛋白可采用如专利公开号CN112552393A所示的重组人源化III型胶原蛋白。
同理，本发明的重组胶原蛋白还可采用现有已知的其他重组胶原蛋白。
优选地，所述透明质酸的分子量为100～1000KDa，所述重组胶原蛋白的分子量为30～130KDa。
进一步地，所述光引发剂为可见光引发剂或紫外光引发剂。
本发明在进行光照时需选择与光引发剂类型相同的光源，即当光引发剂为可见光引发剂，光源为可见光；当光引发剂为紫外光引发剂，光源为紫外光。
进一步地，所述光固化防粘连凝胶中乙烯基化改性重组胶原蛋白呈网状结构包覆在接枝颗粒表面。
第二方面，本发明还提供了一种如第一方面所述的光固化防粘连凝胶的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
S1、将重组胶原蛋白溶解于缓冲液中，制得重组胶原蛋白溶液；将改性剂加入到重组胶原蛋白溶液中，搅拌后置于冰浴下反应，清洗后冷冻干燥，得到乙烯基化改性重组胶原蛋白；
S2、将乙烯基化改性重组胶原蛋白和2-甲基丙烯酰氧基乙基磷脂酰胆碱在溶剂中混合均匀，在氮气保护下，加入自由基引发剂反应，反应产物经沉淀、真空干燥，得到接枝MPC的乙烯基化改性重组胶原蛋白；
S3、将接枝MPC的乙烯基化改性重组胶原蛋白制成颗粒，得到接枝颗粒；
S4、将生物大分子、步骤S1制得的冻干乙烯基化改性重组胶原蛋白复溶后加入步骤S3制得的接枝颗粒，均质，再加入光引发剂搅拌均匀，避光保存，得凝胶预聚液；
S5、将凝胶预聚液置于光源下，使凝胶预聚液固化，得到光固化防粘连凝胶。
进一步地，步骤S1中，所述改性剂选自丙烯酸酐、甲基丙烯酸酐、乙基丙烯酸酐、乙基丙烯酰氯、羟基丙烯酸酐中的一种；优选为甲基丙烯酸酐；
所述缓冲液为磷酸盐缓冲液；优选为pH为6～8的磷酸盐缓冲液；
所述清洗为将溶液置于截留量为8000～14000KD的透析袋中，于30～50℃纯化水透析2～4天，透析之后离心、取上清液；
所述离心为采用离心机在3000～5000rpm转速下离心5～15min。
进一步地，步骤S2中，所述溶剂为三氯甲烷，所述引发剂为偶氮二异丁腈；
所述乙烯基化改性重组胶原蛋白和2-甲基丙烯酰氧基乙基磷脂酰胆碱的质量比为50～85:15～50，优选为60～70:30～40。
进一步地，步骤S3中，通过机械剪切或粉碎将上述接枝MPC的乙烯基化改性重组胶原蛋白制成接枝颗粒；
优选地，所述接枝颗粒的粒径为0.1～20μm。
进一步地，所述步骤S4中，所述生物大分子为透明质酸、重组胶原蛋白中的至少一种；
所述透明质酸的分子量为100～1000KDa，所述重组胶原蛋白的分子量为30～130KDa；
所述复溶为采用磷酸盐缓冲液作为溶剂进行溶解；所述凝胶预聚液中光引发剂的含量为0.1％～1％，基于所述凝胶预聚液的总重量；
进一步地，所述光引发剂为可见光引发剂或紫外光引发剂；
优选地，所述可见光引发剂为蓝光引发剂LAP，所述紫外光引发剂为Irgacure2959(简写为I2959)。
进一步地，步骤S5中，所述光源为紫外光或可见光，所述光强度为5～15mW/cm2，固化时间为1～10min。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明中的乙烯基化改性重组胶原蛋白在光固化后形成网状结构，同时，MPC上的双键和重组胶原蛋白残留氨基的迈克尔加成反应两者协同，增强了凝胶的网络结构，MPC接枝物以颗粒形式(即接枝颗粒)包裹于固化的网络结构中。另一方面，生物大分子由于以非交联形式存在，分子链能够相对自由的运动，使得凝胶中既存在固化交联的网络结构又存在相对运动自由的亲水性物质。在具体应用过程中，固化成型的防粘连凝胶首先起到物理隔离的作用，放置于创面后，未经交联的生物大分子逐步降解，同时由于生物大分子中大量的氨基、羧基形成的分子间氢键以及网络结构的牵制，生物大分子在内源性酶作用下的降解也得以延缓；随着时间延长，凝胶的网络结构开始降解，此时，能够防止细胞粘附的接枝颗粒开始暴露出来，阻止了此时周围组织细胞的粘附、富集及爬行，起到避免粘连的目的，尤其对慢性炎症反应期的创面提供了有利的愈合环境。本发明提供的防粘连凝胶既能在短期内起到物理隔离的目的，在慢性炎症期，又能够长期发挥防粘连的效果。
2、本发明的防粘连凝胶在使用前为流体，不需要加入化学交联剂，在光照下即可原位成型固化，尤其适用于不同形状、非规则创面护理。
3、本发明提供的乙烯基化改性的重组胶原蛋白和MPC通过自由基聚合，将抗细胞粘附的组分MPC接枝于材料上，通过接枝引入防粘连成分，能够防止细胞粘附，尤其在慢性炎症阶段，减少炎症因子和细胞的粘附和富集，显著减少炎症反应；另一方面，接枝的MPC组分具有极强的亲水性，增加了凝胶的亲水性，为创面提供湿性愈合环境，有助于创面愈合。
本发明附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，这些将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，并不构成对本发明的不当限定，在附图中：
图1为实施例1-3和对比例2-3的凝胶的溶胀比和含水量测试结果示意图；
图2为实施例1和对比例1的抗细胞粘附性能测试结果示意图。
具体实施方式
为了更充分的理解本发明的技术内容，下面将结合附图以及具体实施例对本发明作进一步介绍和说明；此外，术语“第一”、“第二”等描述，是用于区分不同的部件等，不代表先后顺序，也不限定“第一”和“第二”是不同的类型。
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例中，“％”均表示重量百分比。
以下实施例中，重组胶原蛋白均采用专利公开号CN112552393A所示的重组人源化III型胶原蛋白，其他试剂均可通过市售购得。
发明人通过实验得出，以下实施例中，重组胶原蛋白的具体种类不会影响防粘连凝胶的功效。因此，除上述重组胶原蛋白外，还可采用现有已知的其他重组胶原蛋白。
实施例1
本实施例提供一种防粘连凝胶，由11.4％重组胶原蛋白、54％乙烯基化改性重组胶原蛋白、34.5％接枝颗粒以及0.1％光引发剂LAP，均质后于波长为405nm蓝光下固化制得。
上述乙烯基化改性重组胶原蛋白具体为通过改性剂甲基丙烯酸酐对重组胶原蛋白进行乙烯基化改性；
上述接枝颗粒为接枝MPC的乙烯基化改性重组胶原蛋白颗粒；
上述防粘连凝胶以接枝颗粒为内核，所述生物大分子和乙烯基化改性重组胶原蛋白包覆在接枝颗粒表面；
上述防粘连凝胶的制备方法，包括以下步骤：
步骤S1、将重组胶原蛋白溶解于pH为7.4的磷酸盐缓冲液中，制得浓度为15mg/mL的重组胶原蛋白溶液；将改性剂甲基丙烯酸酐加入到重组胶原蛋白溶液中，搅拌，冰浴下反应，将反应液置于截留量为8000～14000KD的透析袋中，30℃纯化水透析3天，透析之后采用离心机在3000rpm转速离心15min，取上清液，冷冻干燥，得到乙烯基化改性重组胶原蛋白；
其中，重组胶原蛋白的分子量为60KDa，甲基丙烯酸酐的添加量为5％(V甲基丙烯酸酐/V重组胶原蛋白溶液)；
步骤S2、将步骤S1所得的乙烯基化改性重组胶原蛋白和2-甲基丙烯酰氧基乙基磷脂酰胆碱(MPC)在三氯甲烷中混合均匀，在氮气保护下，加入4％偶氮二异丁腈(AIBN)，40℃下反应8h，产物用甲醇沉淀、真空干燥，得到接枝MPC的乙烯基化改性重组胶原蛋白；
其中，所述乙烯基化改性重组胶原蛋白与MPC的质量比为50:50；
步骤S3、将步骤S2得到的接枝MPC的乙烯基化改性重组胶原蛋白粉碎成粒径为10μm的接枝颗粒；
步骤S4、将未改性的重组胶原蛋白11.4％与步骤S1制得的乙烯基化改性重组胶原蛋白54％用pH为7.4的磷酸盐缓冲液复溶，再加入34.5％步骤S3所得接枝颗粒，均质后再加入0.1％光引发剂LAP搅拌均匀，避光保存，得凝胶预聚液；
步骤S5、使用时，将步骤4所得凝胶预聚液置于波长为405nm、光强度为5mW/cm2的蓝光下，固化1min，凝胶预聚液在原位固化，得到防粘连凝胶。
实施例2
本实施例提供一种防粘连凝胶，由5％重组胶原蛋白、48.7％乙烯基化改性重组胶原蛋白、45.5％接枝颗粒以及0.8％紫外光引发剂I2959，均质后于波长为365的紫外光下固化制得。
上述乙烯基化改性重组胶原蛋白具体为通过改性剂甲基丙烯酸酐对重组胶原蛋白进行乙烯基化改性；
上述接枝颗粒为接枝MPC的乙烯基化改性重组胶原蛋白颗粒；
上述防粘连凝胶以接枝颗粒为内核，所述生物大分子和乙烯基化改性重组胶原蛋白包覆在接枝颗粒表面；
上述防粘连凝胶的制备方法，包括以下步骤：
步骤S1、将重组胶原蛋白溶解于pH为7.0的磷酸盐缓冲液中，制得浓度为45mg/mL的重组胶原蛋白溶液；将改性剂甲基丙烯酸酐加入到重组胶原蛋白溶液中，搅拌，冰浴下反应；将反应液将置于截留量为8000～14000的透析袋中，35℃纯化水透析2天，透析之后采用离心机在3000rpm转速离心10min，取上清液，冷冻干燥，得到乙烯基化改性重组胶原蛋白；
其中，重组胶原蛋白的分子量为112KDa，甲基丙烯酸酐的添加量为2％(V甲基丙烯酸酐/V重组胶原蛋白溶液)；
步骤S2、将步骤S1所得的乙烯基化改性重组胶原蛋白和2-甲基丙烯酰氧基乙基磷脂酰胆碱(MPC)在三氯甲烷中混合均匀，在氮气保护下，加入6％偶氮二异丁腈(AIBN)，45℃下反应10h，产物用甲醇沉淀、真空干燥，得到接枝MPC的乙烯基化改性重组胶原蛋白；
所述乙烯基化改性重组胶原蛋白与MPC的质量比为60:40；
步骤S3、将步骤S2得到的接枝MPC的乙烯基化改性重组胶原蛋白粉碎成粒径为20μm的颗粒，得到接枝颗粒；
步骤S4、将未改性的重组胶原蛋白5％以及步骤S1制得的冻干乙烯基化改性重组胶原蛋白48.7％用pH为7.0的磷酸盐缓冲液复溶，加入45.5％步骤S3所得接枝颗粒，均质后再加入0.8％紫外光引发剂I2959搅拌均匀，避光保存，得到凝胶预聚液；
步骤S5、使用时，将步骤4所得凝胶预聚液置于波长为365nm、光强度为5mW/cm2的紫外光下，固化3min，凝胶预聚液在原位固化，得到防粘连凝胶。
实施例3
本实施例提供一种防粘连凝胶，包括2％透明质酸、37.5％乙烯基化改性重组胶原蛋白、60％接枝颗粒以及0.5％蓝光引发剂LAP均质后于光照下固化制得。
上述乙烯基化改性重组胶原蛋白具体为通过改性剂甲基丙烯酸酐对重组胶原蛋白进行乙烯基化改性；
上述接枝颗粒为接枝MPC的乙烯基化改性重组胶原蛋白颗粒；
上述防粘连凝胶以接枝颗粒为内核，所述生物大分子和乙烯基化改性重组胶原蛋白包覆在接枝颗粒表面；
上述防粘连凝胶的制备方法，包括以下步骤：
步骤S1、将重组胶原蛋白溶解于pH7.8的磷酸盐缓冲液中，制得浓度为70mg/mL的重组胶原蛋白溶液；将改性剂甲基丙烯酸酐加入到重组胶原蛋白溶液中，搅拌，冰浴下反应，将反应液置于截留量为8000～14000KD的透析袋中，45℃纯化水透析2天，透析之后用离心机在4500rpm转速离心5min，取上清液；冷冻干燥，得到乙烯基化改性重组胶原蛋白；
其中，重组胶原蛋白的分子量为45KDa；甲基丙烯酸酐的添加量为6％(V甲基丙烯酸酐/V重组胶原蛋白溶液)
步骤S2、将步骤S1得到的乙烯基化改性重组胶原蛋白和2-甲基丙烯酰氧基乙基磷脂酰胆碱(MPC)在溶剂三氯甲烷中混合均匀，在氮气保护下，加入自由基引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)，50℃下反应6h，产物用甲醇沉淀、真空干燥，得接枝MPC的乙烯基化改性重组胶原蛋白；
所述乙烯基化改性重组胶原蛋白与MPC的质量比为80:20，所述偶氮二异丁腈的含量为总反应物质量的3％；
步骤S3、将步骤2得到的接枝MPC的乙烯基化改性重组胶原蛋白粉碎制成粒径为0.5μm的接枝颗粒；
步骤S4、将2％透明质酸(分子量为130KDa)、以及步骤S1制得的乙烯基化改性重组胶原蛋白37.5％用pH为7.0的磷酸盐缓冲液复溶，加入60％步骤S3所得接枝颗粒，均质后再加入0.5％蓝光引发剂LAP，搅拌均匀，避光保存，得凝胶预聚液；
步骤S5、使用时，将步骤4所得凝胶预聚液置于波长为405nm、光强度为5mW/cm2的蓝光下，固化1min，凝胶预聚液在原位固化，得到防粘连凝胶。
实施例4
本实施例提供一种防粘连凝胶，由30％重组胶原蛋白、41％乙烯基化改性重组胶原蛋白、28％接枝颗粒以及1％紫外光引发剂I2959，均质后于紫外光下固化制得。
上述乙烯基化改性重组胶原蛋白具体为通过改性剂甲基丙烯酸酐对重组胶原蛋白进行乙烯基化改性；
上述接枝颗粒为接枝MPC的乙烯基化改性重组胶原蛋白颗粒；
上述防粘连凝胶以接枝颗粒为内核，所述生物大分子和乙烯基化改性重组胶原蛋白包覆在接枝颗粒表面；
上述防粘连凝胶的制备方法，包括以下步骤：
步骤S1、重组胶原蛋白溶解于pH为6.8的磷酸盐缓冲液中，制得浓度为100mg/mL的重组胶原蛋白溶液；将甲基丙烯酸酐加入到重组胶原蛋白溶液中，搅拌，冰浴下反应，将反应液置于截留量为8000～14000KD的透析袋中，50℃纯化水透析3天，透析之后用离心机在4000rpm转速离心10min，取上清液，冷冻干燥，得到乙烯基化改性重组胶原蛋白；
其中，重组胶原蛋白的分子量为60KDa，甲基丙烯酸酐的添加量为8％(V甲基丙烯酸酐/V重组胶原蛋白溶液)；
步骤S2、将步骤S1制得的乙烯基化改性重组胶原蛋白和2-甲基丙烯酰氧基乙基磷脂酰胆碱(MPC)在三氯甲烷中混合均匀，在氮气保护下，加入偶氮二异丁腈(AIBN)，60℃下反应8h，产物用甲醇沉淀、真空干燥，得接枝MPC的乙烯基化改性重组胶原蛋白；
所述乙烯基化改性重组胶原蛋白与MPC的质量比为70:30，所述偶氮二异丁腈的含量为总反应物质量的3％；
步骤S3、将步骤S2得到的接枝MPC的乙烯基化改性重组胶原蛋白粉碎制成粒径为5μm的接枝颗粒；
步骤S4、将30％重组胶原蛋白、以及步骤S1制得的乙烯基化改性重组胶原蛋白41％用pH为7.0的磷酸盐缓冲液复溶，加入28％步骤S3所得接枝颗粒，均质后再加入1％紫外光引发剂I 2959，搅拌均匀，避光保存，得凝胶预聚液；
步骤S5、使用时，将步骤S4所得凝胶预聚液置于波长为365nm、光强度为8mW/cm2的紫外光光源下，固化为2min使凝胶预聚液固化，得到防粘连凝胶。
实施例5
本实施例提供一种防粘连凝胶，由18％透明质酸、10％重组胶原蛋白、32％乙烯基化改性重组胶原蛋白、39％接枝颗粒以及1％紫外光引发剂I2959，均质后于紫外光下固化制得。
上述乙烯基化改性重组胶原蛋白具体为通过改性剂甲基丙烯酸酐对重组胶原蛋白进行乙烯基化改性；
上述接枝颗粒为接枝MPC的乙烯基化改性重组胶原蛋白颗粒；
上述防粘连凝胶以接枝颗粒为内核，所述生物大分子和乙烯基化改性重组胶原蛋白包覆在接枝颗粒表面；
上述防粘连凝胶的制备方法，包括以下步骤：
步骤S1、重组胶原蛋白溶解于pH 7.0的磷酸盐缓冲液中，制得浓度为135mg/mL的重组胶原蛋白溶液；将甲基丙烯酸酐加入到上述重组胶原蛋白溶液中，搅拌，冰浴下反应，将反应液置于截留量为8000～14000KD的透析袋中，48℃纯化水透析4天，透析之后采用离心机在5000rpm转速离心15min，取上清液，冷冻干燥，得到乙烯基化改性重组胶原蛋白；
其中，重组胶原蛋白的分子量为90KDa，甲基丙烯酸酐的添加量为9％(V甲基丙烯酸酐/V重组胶原蛋白溶液)
步骤S2、将步骤S1制得的乙烯基化改性重组胶原蛋白和2-甲基丙烯酰氧基乙基磷脂酰胆碱(MPC)在三氯甲烷中混合均匀，在氮气保护下，加入偶氮二异丁腈(AIBN)，65℃下反应10h，产物用甲醇沉淀、真空干燥，得接枝MPC的乙烯基化改性重组胶原蛋白；
所述乙烯基化改性重组胶原蛋白与MPC的质量比为65:35，所述偶氮二异丁腈的含量为总反应物质量的5％；
步骤S3.将步骤2得到的接枝MPC的乙烯基化改性重组胶原蛋白粉碎制成粒径为1μm的接枝颗粒；
步骤S4、将18％透明质酸(分子量为220KDa)、10％重组胶原蛋白以及步骤1制得的32％乙烯基化改性重组胶原蛋白用pH为8.0的磷酸盐缓冲液溶解，再加入步骤S3所得的接枝颗粒39％，均质，再加入1.0％紫外光引发剂I2959搅拌均匀，避光保存，得凝胶预聚液；
步骤S5、使用时，将步骤4所得凝胶预聚液置于波长为365nm、强度为5mW/cm2的紫外光下，固化5min使凝胶预聚液固化，得到防粘连凝胶。
对比例1
对比例1与实施例1不同之处在于，未进行MPC接枝，具体如下：
对比例1的凝胶，由25％重组胶原蛋白、74.5％乙烯基化改性重组胶原蛋白、0.5％光引发剂LAP，均质后于波长为405nm蓝光下固化制得。
上述乙烯基化改性重组胶原蛋白具体为通过改性剂甲基丙烯酸酐对重组胶原蛋白进行乙烯基化改性；
上述凝胶的制备方法，包括以下步骤：
步骤S1、将重组胶原蛋白溶解于pH为7.4的磷酸盐缓冲液中，制得浓度为15mg/mL的重组胶原蛋白溶液；将改性剂甲基丙烯酸酐加入到重组胶原蛋白溶液中，搅拌，冰浴下反应，将反应液置于截留量为8000～14000KD的透析袋中，30℃纯化水透析3天，透析之后采用离心机在3000rpm转速离心15min，取上清液，冷冻干燥，得到乙烯基化改性重组胶原蛋白；
其中，重组胶原蛋白的分子量为60KDa，甲基丙烯酸酐的添加量为5％(V甲基丙烯酸酐/V重组胶原蛋白溶液)；
步骤S2、将未改性的重组胶原蛋白25％以及步骤1制得的乙烯基化改性胶原蛋白74.5％用pH为7.4的磷酸盐缓冲液复溶，再加入0.5％光引发剂LAP搅拌均匀，避光保存，得凝胶预聚液；
步骤S3、使用时，将步骤S2所得凝胶预聚液置于波长为405nm、光强度为5mW/cm2的蓝光下，固化1min，凝胶预聚液在原位固化，得到凝胶。
对比例2
对比例2与实施例2不同之处在于，不包括未交联的重组胶原蛋白，具体如下：
对比例2的防粘连凝胶，由52％乙烯基化改性重组胶原蛋白、46％接枝颗粒以及2％紫外光引发剂I2959，均质后于波长为365nm的紫外光下固化制得。
上述乙烯基化改性重组胶原蛋白具体为通过改性剂甲基丙烯酸酐对重组胶原蛋白进行乙烯基化改性；
上述接枝颗粒为接枝MPC的乙烯基化改性重组胶原蛋白颗粒；
上述防粘连凝胶以接枝颗粒为内核，所述乙烯基化改性重组胶原蛋白包覆在接枝颗粒表面；
上述防粘连凝胶的制备方法，包括以下步骤：
将重组胶原蛋白溶解于pH为7.0的磷酸盐缓冲液中，制得浓度为45mg/mL的重组胶原蛋白溶液；将改性剂甲基丙烯酸酐加入到重组胶原蛋白溶液中，搅拌，冰浴下反应；将反应液将置于截留量为8000～14000KD的透析袋中，35℃纯化水透析2天，透析之后采用离心机在3000rpm转速离心10min，取上清液，冷冻干燥，得到乙烯基化改性重组胶原蛋白；
其中，重组胶原蛋白的分子量为30KDa，甲基丙烯酸酐的添加量为2％(V甲基丙烯酸酐/V重组胶原蛋白溶液)；
步骤S2、将步骤S1所得的乙烯基化改性重组胶原蛋白和2-甲基丙烯酰氧基乙基磷脂酰胆碱(MPC)在三氯甲烷中混合均匀，在氮气保护下，加入6％偶氮二异丁腈(AIBN)，45℃下反应10h，产物用甲醇沉淀、真空干燥，得到接枝MPC的乙烯基化改性重组胶原蛋白；
所述乙烯基化改性重组胶原蛋白与MPC的质量比为60:40；
步骤S3、将步骤S2得到的接枝MPC的乙烯基化改性重组胶原蛋白粉碎成粒径为20μm的颗粒，得到接枝颗粒；
步骤S4、将步骤S1制得的冻干乙烯基化改性重组胶原蛋白52％用pH为7.0的磷酸盐缓冲液复溶，加入46％步骤S3所得接枝颗粒，均质后再加入2％紫外光引发剂I2959搅拌均匀，避光保存，得到凝胶预聚液；
步骤S5、使用时，将步骤4所得凝胶预聚液置于波长为365nm、光强度为5mW/cm2的紫外光下，固化3min，凝胶预聚液在原位固化，得到防粘连凝胶。
对比例3
对比例3提供一种凝胶，由99％改性重组胶原蛋白以及1％光引发剂均质后于光照下固化制得。
上述乙烯基化改性重组胶原蛋白具体为通过改性剂甲基丙烯酸酐对重组胶原蛋白进行乙烯基化改性；
上述凝胶的制备方法，包括以下步骤：
步骤S1、重组胶原蛋白溶解于pH 7.2的磷酸盐缓冲液中，制得浓度为100mg/mL的重组胶原蛋白溶液；将甲基丙烯酸酐加入到上述重组胶原蛋白溶液中，搅拌，冰浴下反应，将反应液置于截留量为8000～14000KD的透析袋中，35℃纯化水透析3天，透析之后用离心机在5000rpm转速离心15min，取上清液，冷冻干燥，得到乙烯基化改性重组胶原蛋白；
其中，重组胶原蛋白的分子量为60KDa；甲基丙烯酸酐的添加量为7％(V甲基丙烯酸酐/V重组胶原蛋白溶液)
步骤S2、将步骤S1制得的乙烯基化改性重组胶原蛋白用pH 7.2的磷酸盐缓冲液复溶，再加入1％紫外光引发剂I2959搅拌均匀，避光保存，得凝胶预聚液；
步骤S3、使用时，将步骤S2所得凝胶预聚液置于波长为365nm、光强度为5mW/cm2的紫外光下，固化5min，使凝胶预聚液固化，得到防粘连凝胶。
对实施例1-5以及对比例1-3制得的凝胶进行相关测试。
溶胀性能测试
凝胶的溶胀性能是表征其保水能力的一个重要指标。凝胶的溶胀性能在37℃下进行测试。冷冻干燥实施例1-3和对比例2、3的凝胶，取一定量凝胶称重记为W0，将其置于纯化水中，每8h换液一次，充分溶胀24h后，擦拭表面残留水分，并称重，记为Wt，每组取3个平行样。
溶胀比和含水量的计算公式分别如下：
溶胀比＝(Wt-W0)/W0；含水量＝(Wt-W0)/Wt
测试结果如表1和图1所示。
表1：实施例1-3和对比例2-3的凝胶的溶胀比和含水量
| 测试组 | <![CDATA[W<sub>0</sub>]]> | <![CDATA[W<sub>t</sub>]]> | 溶胀比 | 含水量 |
| 实施例1 | 1.25 | 18.175 | 13.54 | 0.9312242 |
| 实施例2 | 1.34 | 24.4818 | 17.27 | 0.9452655 |
| 实施例3 | 1.07 | 29.38 | 26.46 | 0.9635807 |
| 对比例2 | 1.37 | 11.7957 | 7.61 | 0.883856 |
| 对比例3 | 1.19 | 3.52 | 1.96 | 0.6619318 |
根据表1和图1的溶胀性能数据测试可见，相较于对比例2、3，实施例1～3由于含有生物大分子透明质酸和/或重组胶原蛋白，凝胶的溶胀比、吸水量明显高于不含生物大分子的对比例2、3，这是由于在固化的凝胶中，生物大分子由于以非交联形式存在，分子链能够相对自由的运动，使得凝胶体系中既存在固化交联的网络结构又存在相对运动自由的亲水性物质，亲水性极强的生物大分子使得凝胶的溶胀程度明显提升，表现出了极强的保水性。另一方面，通过实施例1-3和对比例3的溶胀测试数据，可以看出，由于MPC强极性的两性离子结构，在接触到水时，凝胶中富集的大量MPC接枝链使得凝胶能够结合大量水，而未接枝MPC的对比例3其性能明显低于实施例1-3。由此说明，本发明的凝胶中通过接枝MPC并加入生物大分子，可以更好的模拟天然组织，在提供物理屏障的同时，为创面愈合提供了湿性愈合环境，利于创面愈合，亲水性的增加也能够有效抑制由输水作用所诱导的蛋白质与细胞的粘附。
流变性能测试
使用旋转流变仪的时间扫描模式测量实施例1和2、对比例1和3的凝胶的储能模量G’，其中频率为1Hz，应变为0.5％，结果如下表2所示。
表2：
| 测试组 | G’(KPa) |
| 实施例1 | 378.6 |
| 实施例2 | 304.4 |
| 对比例1 | 150.1 |
| 对比例3 | 585.2 |
根据表2的数据可得，与对比例1和3中未经MPC接枝的凝胶相比，经MPC接枝后，MPC上的双键和改性胶原蛋白上的双键的自由基聚合、以及MPC上的双键和胶原蛋白残留氨基的迈克尔加成反应两者协同，增强了凝胶的网络结构，加之未经交联的生物大分子与凝胶网络结构的结合，使得凝胶具有更适宜的力学性能；同时，对比例1和对比例3所制得的凝胶中，由于不含接枝颗粒和/或生物大分子，不含接枝颗粒的凝胶其弹性模量明显降低、凝胶固化后不易成型且可能发生移位；而既不含接枝颗粒又不含未经交联的生物大分子的凝胶(对比例3)中，体系中乙烯基化改性重组胶原蛋白在光固化后成为交联密度很高的网络结构，凝胶表现出极高的弹性模量、凝胶刚性大，不易发生变形，在固化后难以与创面高度契合，不利于实际应用。
抗粘附性能
1、取实施例1和对比例1完成含水量测定的样品1cm2，置于浓度为200ug/mL的纤维蛋白原的PBS溶液中(pH＝7.4)，于4℃环境中孵育12h。使用TU-1810C型紫外-可见光分光光度计测量溶液在230nm的吸光度，通过工作曲线计算吸附后溶液的浓度，单位面积凝胶吸附蛋白质的质量M按照下面公式计算：
M＝(吸附前浓度-吸附后浓度)×溶液体积
测试结果如表3所示。
表3：
| <![CDATA[M(μg/cm<sup>2</sup>)]]> | |
| 实施例1 | 20.40515 |
| 对比例1 | 141.8653 |
2、将样品浸泡在75％酒精中1小时，取出后在超净台中自然吹干并放入新的6孔板中，孔板盖在超净台中扣好。样品共分四组：(1)实施例1所得凝胶、(2)对比例1所得凝胶、(3)空白对照，将HFF-1细胞接种于样品，分别于1d、3d、7d拍照记录细胞数目，结果如图2所示。
根据表3的测试数据以及图2的测试结果可以看出，经过MPC接枝的凝胶(实施例1)较未经MPC接枝的凝胶(对比例1)，随着时间的延长，其蛋白和细胞粘附逐渐减低，说明经过MPC接枝，凝胶的抗粘附性能得到了大幅度提升。
以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Claims (12)
1.一种光固化防粘连凝胶，其特征在于，所述光固化防粘连凝胶由生物大分子、乙烯基化改性重组胶原蛋白、接枝颗粒以及光引发剂均质后于光照下固化制得；
所述光固化防粘连凝胶以接枝颗粒为内核，所述生物大分子和乙烯基化改性重组胶原蛋白包覆在接枝颗粒表面；
所述接枝颗粒为接枝MPC的乙烯基化改性重组胶原蛋白颗粒；
所述生物大分子选自透明质酸、重组胶原蛋白中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的光固化防粘连凝胶，其特征在于，所述光固化防粘连凝胶中：
所述生物大分子的含量为2～30％，所述乙烯基化改性重组胶原蛋白的含量为20～60％，所述接枝颗粒的含量为20～60％，所述光引发剂的含量为0.1％～1％；基于所述光固化防粘连凝胶的总重量。
3.根据权利要求1所述的光固化防粘连凝胶，其特征在于，所述透明质酸的分子量为100～1000KDa，所述重组胶原蛋白的分子量为30～130KDa。
4.根据权利要求1或2所述的光固化防粘连凝胶，其特征在于，所述接枝颗粒的粒径为0.1～20μm。
5.根据权利要求1或2所述的光固化防粘连凝胶，其特征在于，所述光引发剂为可见光引发剂或紫外光引发剂。
6.根据权利要求1所述的光固化防粘连凝胶，其特征在于，所述光固化防粘连凝胶中，乙烯基化改性重组胶原蛋白呈网状结构包覆在接枝颗粒表面。
7.一种如权利要求1-6任一项所述的光固化防粘连凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将重组胶原蛋白溶解于缓冲液中，制得重组胶原蛋白溶液；将改性剂加入到重组胶原蛋白溶液中，搅拌后置于冰浴下反应，清洗后冷冻干燥，得到乙烯基化改性重组胶原蛋白；
S2、将乙烯基化改性重组胶原蛋白和2-甲基丙烯酰氧基乙基磷脂酰胆碱在溶剂中混合均匀，在氮气保护下，加入自由基引发剂反应，反应产物经沉淀、真空干燥，得到接枝MPC的乙烯基化改性重组胶原蛋白；
S3、将接枝MPC的乙烯基化改性重组胶原蛋白制成颗粒，得到接枝颗粒；
S4、将生物大分子、步骤S1制得的乙烯基化改性重组胶原蛋白复溶后加入步骤S3制得的接枝颗粒，均质，再加入光引发剂搅拌均匀，避光保存，得凝胶预聚液；
S5、将凝胶预聚液置于光源下，使凝胶预聚液固化，得到光固化防粘连凝胶。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述改性剂选自丙烯酸酐、甲基丙烯酸酐、乙基丙烯酸酐、乙基丙烯酰氯、羟基丙烯酸酐中的一种；
所述缓冲液为磷酸盐缓冲液；所述清洗为将溶液置于截留量为8000～14000KD的透析袋中，于30～50℃纯化水透析2～4天，透析之后离心、取上清液。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述改性剂为甲基丙烯酸酐；所述磷酸盐缓冲液的pH为6～8。
10.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述溶剂为三氯甲烷，所述引发剂为偶氮二异丁腈；
所述乙烯基化改性重组胶原蛋白和2-甲基丙烯酰氧基乙基磷脂酰胆碱的质量比为50～85:15～50。
11.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述乙烯基化改性重组胶原蛋白和2-甲基丙烯酰氧基乙基磷脂酰胆碱的质量比为60～70:30～40。
12.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中，
所述生物大分子为透明质酸、重组胶原蛋白中的至少一种；
所述透明质酸的分子量为100～1000KDa，所述重组胶原蛋白的分子量为30～130KDa；
所述复溶为采用磷酸盐缓冲液作为溶剂进行溶解；所述凝胶预聚液中光引发剂的含量为0.1％～1％，基于所述凝胶预聚液的总重量；
所述光引发剂为可见光引发剂或紫外光引发剂；
步骤S5中，所述光源为紫外光或可见光，光强度为5～15mW/cm2，固化时间为1～10min。
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