CN114778830A - 双模态试纸条、制备及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种双模态试纸条、制备及其应用。本发明提供了一种双模态免疫试纸条的制备方法，及应用上述试纸条检测样品中黄曲霉毒素产毒真菌的高灵敏检测方法。本发明具有操作简单、灵敏度高、准确度高、检测速度快、成本低、不受检测设备限制的优点，能够实现对样品中的黄曲霉毒素产毒真菌的快速检测。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种双模态试纸条、制备及其应用。
背景技术
免疫层析试纸条，由于具有易于操作、便携、快速、现场分析等优势已被广泛应用食品安全、医学疾病诊断、环境监测等领域。然而，免疫层析试纸条较低的灵敏度低、重复性差等缺点在一定程度上限制了其在分析检测领域的应用和推广。另外，现有方法通常借助单一的比色信号或荧光信号来定量目标物含量，这种单信号检测方法体系单一，易受环境因素干扰，在一定程度上会影响实验结果的准确性。因此，亟需开发灵敏性更高、可靠性更高的双模态免疫层析试纸条来满足分析检测的需要。
黄曲霉毒素是由黄曲霉菌和寄生曲霉菌等分泌的有毒次级代谢物，是迄今发现毒性最强、致癌性最强烈的一类真菌毒素。黄曲霉毒素的产毒真菌分布范围广，侵染能力强，在农作物的生长、收获、运输、贮藏、加工等各环节均有机会造成污染。目前食品中产毒真菌检测仍然大量依赖于传统的微生物形态学特征观察法。由于产毒真菌种类繁多，形态特征较为复杂，这种检测方法主观因素影响较大，误判率高，同时检测流程时耗较长，操作繁琐，难以满足快速、高效、即时分析检测的需求。利用酶联免疫分析方法(ELISA)已实现了对黄曲霉毒素产毒黄曲霉菌的检测(Anal.Chem.2013,85,10992-10999，Scientific reports,2017,7(1):4348，中国农业科学，53(7):1473-1481)，但仍存在天然酶的催化活性易受外界环境干扰、天然酶的稳定性较差、方法检测灵敏度较低等不足，难以满足对黄曲霉毒素产毒真菌的高效灵敏的实时检测。并且当前的免疫分析方法大多为ELISA法，免疫层析试纸条用于黄曲霉毒素产毒真菌的研究还未见报道。
发明内容
本发明针对现有技术的不足而提供一种双模态检测试纸条、制备及其应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
双模态检测试纸条，它包括层析试纸条和可结合待测物的聚多巴胺-铜复合纳米材料标记的多克隆抗体反应试剂，其中：所述的层析试纸条包括纸板，纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，所述检测线上包被有识别待测物的纳米抗体或单克隆抗体，所述质控线上包被有可与前述聚多巴胺-铜纳米材料标记的多克隆抗体结合的多克隆抗体(IgG)。
按上述方案，所述层析试纸条中的吸水垫长40～45mm，宽3～5mm；检测垫长25～30mm，宽3～5mm；样品垫长12～18mm，宽2～4mm，相邻各垫的交叠长度为1～3mm；所述检测垫上的检测线与样品垫上沿的间距为5-8mm，质控线和检测线的间距为5-12mm。
按上述方案，所述层析试纸条中检测垫上每厘米检测线所需的待测物的纳米抗体或单克隆抗体的包被量为150～900ng；每厘米质控线所需的羊抗兔多克隆抗体(IgG)的包被量为150～600ng。
作为本发明的进一步改进，上述待测物可为黄曲霉毒素产毒真菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单核球增多性李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌等病原菌。
按上述方案，所述的待测物为黄曲霉毒素产毒真菌；所述的检测线上包被黄曲霉毒素产毒真菌的抗体，与黄曲霉毒素产毒真菌的抗体相结合的多克隆抗体为兔源多克隆抗体；可与黄曲霉毒素产毒真菌的多克隆抗体结合的抗体为羊抗兔多克隆抗体(IgG)。
按上述方案，所述的识别待测物黄曲霉毒素产毒真菌的纳米抗体可采用以下检测方法获得：利用AFT-YJFZ01作为免疫抗原，采用常规方式免疫羊驼或者Balb/c鼠，再利用已知常规的纳米抗体或鼠源单克隆抗体制备技术方案即可研制获得。如中国专利2021106091381的记载。
所述的识别待测物黄曲霉毒素产毒真菌的多克隆抗体可采用以下检测方法获得：用AFT-YJFZ01作为免疫抗原，采用常规方式免疫新西兰大白兔等试验兔，再利用已知常规的多克隆抗体制备技术方案即可研制获得识别待测物黄曲霉毒素产毒真菌的兔源多克隆抗体。如中国专利2021106091381的记载。
按上述方案，所述的可结合待测物的聚多巴胺-铜复合纳米材料标记的多克隆抗体由聚多巴胺-铜纳米材料与可识别待测物的多克隆抗体经过物理吸附后封闭制得，制备方法：将多巴胺-铜纳米分散液和可识别检测物的多克隆抗体溶液混合振摇，使聚多巴胺-铜复合材料和可识别待测物的多克隆抗体充分结合，后封闭多余活性位点，离心后得到聚多巴胺-铜纳米材料标记的多克隆抗体。
作为本发明的进一步改进，所述聚多巴胺-铜纳米分散液的浓度为1.0-3.0mg/mL；所述可识别待测物的多克隆抗体溶液浓度为10-1000μg/mL；所述聚多巴胺-铜纳米分散液与可识别待测物的多克隆抗体溶液的质量比为1.5-50：1，所述的振摇时间为1-4h；所述封闭液为牛血清白蛋白水溶液，质量百分比为0.5-5.0％，离心弃去上清，将离心的沉淀分散于PBS中备用。
按上述方案，所述聚多巴胺-铜纳米分散液可采用一步法制得，制备方法为：一定量盐酸多巴胺溶于三羟甲基氨基甲烷缓冲液与乙醇的混合溶液中，20-35℃搅拌反应0.5-3h；逐滴加入硫酸铜水溶液，20-35℃搅拌反应2-6h，反应结束后，后处理得到聚多巴胺-铜纳米颗粒，所述的后处理为：将上述溶液于4℃下离心10-30min，使用超纯水重复离心洗涤沉淀2-5次，所得聚多巴胺-铜纳米颗粒分散制得聚多巴胺-铜纳米分散液，浓度为1.0-3.0mg/mL。制备过程中：多巴胺表面的羟基官能团与Cu2+配位，配位后的Cu2+被多巴胺还原成Cu+或Cu0的纳米颗粒。
作为本发明的进一步改进，所述盐酸多巴胺溶液的浓度为0.5-1.5mg/mL；所述三羟甲基氨基甲烷缓冲液的浓度10mM，pH 8.5，三羟甲基氨基甲烷缓冲液与乙醇的体积比为3-5:1；所述硫酸铜水溶液浓度为10-50mg/mL，所述硫酸铜与盐酸多巴胺的摩尔比为0.7-9.5：1。
按上述方案，所述的层析试纸条还包括样品稀释液和样品稀释液吸管，所述的样品稀释液为体积分数为1.0～6.0％的吐温-20与体积比为0.5-5.0％BSA水溶液的混合液。
按上述方案，所述的双模态试纸条的制备方法如下：
(1)将吸水纸剪裁得吸水垫；
(2)检测垫的制备
1)检测线的包被
将识别待测物的纳米抗体或单克隆抗体制成包被液，可选用0.01mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)配制成浓度为0.25～1.5mg/mL的包被液；于样品垫上沿5～8mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上得到检测线，每厘米检测线所需识别待测物的纳米抗体或单克隆抗体的包被量为150～900ng，干燥，具体可采用37℃条件下干燥1.5h；
2)质控线的包被
将可与前述聚多巴胺-铜纳米材料标记的多克隆抗体结合的多克隆抗体(IgG)制成包被液，可用含0.02％(m/v)叠氮化钠的0.01mol/L的PBS溶液配制成浓度为0.25-1.0mg/mL的包被液；于距检测线5-12mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上得到质控线，每厘米质控线上所需多克隆抗体(IgG)的包被量为150-600ng，然后干燥，具体可于37℃条件下干燥1.5h；
检测垫可选用Bedford Millipore Corporation生产的CN95膜或日本公司ToyoRoshi Kaisha生产的IAB120或IAB135膜，优选CN95膜；
(3)样品垫的制备
采用硝酸纤维素膜作样品垫，具体可选用中国公司Jieyi BiotechnologyCorporation生产Fusion3、Fusion5做样品垫，优选Fusion3。
(4)试纸条的组装
在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为1～3mm，即得层析试纸条。
按上述方案，0.01mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)为每1L中含有氯化钠8g，氯化钾0.2g，十二水磷酸氢二钠2.9g，磷酸二氢钾0.24g，盐酸调节pH值为7.4。
按上述方案，含0.02％(m：v)叠氮化钠的0.01mol/L的PBS溶液为每50mL 0.01mol/L的PBS溶液中含有叠氮化钠0.01g。
所述层析试纸条的制备中使用的封闭液为：每100mL 0.01mol/L的PBS溶液中含有牛血清白蛋白0.5g，吐温20为1.6g。
基于上述双模态免疫检测试纸条的双模态检测方法，检测方法如下：
提供待测样品溶液，提供聚多巴胺-铜纳米材料标记的识别待测物的多克隆抗体溶液，将其分别加入酶标孔中，混匀，插入层析试纸条，孵育一段时间后，读取结果；同时提供阴性对照样品组。
按上述方案，所述待测样品为玉米、花生、大米中的一种或几种。
按上述方案，上述孵育过程为：聚多巴胺-铜复合材料标记的多克隆抗体反应试剂用缓释液稀释定容，加到酶标孔中，取待测样品溶液加入到含检测液的酶标孔进行孵育。
按上述方案，上述缓释液为：每1mL缓释液中含16μL吐温-20,5mg BSA，984μL0.01mol/L的磷酸盐缓冲液。
按上述方案，聚多巴胺-铜纳米材料标记的多克隆抗体反应试剂缓释液与待测物溶液溶液以体积比为4-6.5：1混合。
按上述方案，25-37℃下孵育5-15min，直接读取比色信号。
按上述方法，滴加信号放大显色液于检测线，25℃放置15-45s，读取催化放大的比色信号结果。
按上述方案，所述的信号放大显色液为TMB-H2O2，TMB溶液的浓度5-50mmol/L，H2O2质量浓度为3-8％，将TMB-H2O2分散在pH为3.0-6.5的酸性缓冲溶液中得到。
按上述方案，所述的酸性缓冲溶液为乙酸-乙酸钠或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中的一种。
按上述方法，用808nm激光照射试纸条检测线，并利用近红外热成像仪记录光热信号结果。
按上述方案，激光功率为0.5-2.0W/cm2，照射时间为2-6min；
按上述方案，所述的待测样品中的黄曲霉毒素产毒真菌含量的具体计算方法为：基于所述试纸条中的检测线有无待测物的强度灰度值变化率或温度变化((I-I0)/I0或ΔT，获得ΔI(即I-I0)/I0或ΔT(ΔT是温度升高值，即ΔT1-ΔT0，T1和T0分别是实验组和空白组经激光照射后的温度差值)与待测物间的关系曲线，经拟合得到试纸条检测线比色强度变化值或温度变化值与待测物浓度的关系曲线，将获得的待测样品溶液的检测线比色强度变化值或温度变化值，代入上述拟合的关系曲线，获得待测样品溶液中待测物的含量，最后经换算即得待测样品中待测物的含量。
本发明双模态试纸条的检测原理：
待测物溶液，以黄曲霉素产毒真菌为例，将黄曲霉素产毒真菌细胞裂解液与聚多巴胺-铜复合纳米材料标记的黄曲霉素产毒真菌的多克隆抗体溶液依次加入酶标孔中，插入免疫层析试纸条，并且通过毛细力而向吸收垫的方向流动，当待测液中含有待测物黄曲霉毒素产毒真菌时，黄曲霉素产毒真菌与免疫层析试纸条的检测线上识别黄曲霉素产毒真菌的纳米抗体或单克隆抗体进行特异性免疫识别，同时该黄曲霉素产毒真菌又可与聚多巴胺-铜纳米材料标记的黄曲霉素产毒真菌的多克隆抗体进行特异性免疫识别，进而在检测线上形成抗体-黄曲霉素产毒真菌-聚多巴胺铜标记的多克隆抗体的三明治结构。待测液中目标物黄曲霉素产毒真菌的含量越多，形成的夹心三明治结构越多，检测线的颜色越深，同时经TMB-H2O2催化放大后的蓝色也越深，温度也越高。反之，当待测液中不含待测物黄曲霉素产毒真菌时，不能形成三明治夹心结构，检测线无明显颜色增强，经TMB-H2O2体系催化放大后也无明显的蓝色增强，无明显的温度增强。TMB-H2O2催化放大的原理为：在含有TMB-H2O2的溶液中，聚多巴胺-铜纳米材料标记的黄曲霉素产毒真菌的纳米抗体或单克隆抗体中的催化活性中心铜纳米颗粒，催化H2O2产生羟基自由基，形成的羟基自由基进一步与无色底物TMB发生氧化反应，形成一种蓝色的氧化型TMB产物。待测物越多，与待测物结合的聚多巴胺-铜标记的黄曲霉素产毒真菌的纳米抗体或单克隆抗体越多，检测线上经TMB-H2O2催化产生的蓝色氧化型TMB越多，蓝色越深。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种双模态免疫检测试纸条，本发明利用聚多巴胺-铜复合纳米材料作为信号传导媒介，可同时获取检测的比色和光热信号，提供了一种双模态免疫检测试纸条。
与现有方法相比，本发明具有以下优点：
(1)除了传统的直接比色检测信号，还可利用聚多巴胺-铜复合纳米粒子的高效的过氧化物模拟酶活性，极大地提升了检测信号的放大输出；并可利用聚多巴胺-铜高的光热转换效率，为检测提供了一种新的光热信号源，增强了检测方法的可靠性。
(2)检测范围广，多重信号输出，检测灵敏度高。本发明提供的双模态检测试纸条可用于测定待测物中的黄曲霉毒素产毒真菌，以黄曲霉菌为例，检测范围1ng/mL-100μg/mL，最低可检测1ng/mL的黄曲霉菌。克服了现有技术灵敏度偏低、仅依靠比色信号来判断检测效果的不足。
附图说明
图1为双模态比色-光热试纸条检测示意图。
具体实施方式
实施例1
双模态黄曲霉毒素产毒真菌试纸条的制备及检测方法，具体方法为：
1.免疫试纸条的制备
(1)吸水垫的制备
将吸水纸剪裁成长45mm宽3mm的规格，制得吸水垫；
(2)检测垫的制备
将规格长25mm，宽3mm的CN95硝酸纤维素膜粘贴到纸板相应位置再分别喷涂检测线和质控线。
1)检测线的包被
称取黄曲霉毒素产毒真菌纳米抗体1.0mg，用1mL 0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液(PBS)溶解并配制成浓度为1mg/mL的包被液；在距样品垫上沿5mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上得到检测线，喷涂速度为0.6μL/cm，每厘米检测线上喷黄曲霉毒素产毒真菌纳米抗体600ng，然后于37℃条件下干燥1.5h；
上述所述PBS配方：氯化钠8g，氯化钾0.2g，十二水磷酸氢二钠2.9g，磷酸二氢钾0.24g，加800mL水溶解后，用盐酸调节pH值到7.4，用超纯水定容到1L，0.22μm滤膜过滤，配成0.01mol/L的PBS。
2)质控线的包被
称取叠氮化钠0.02g溶于100mL 0.01mol/L的磷酸缓冲液(PBS)中，0.22μm滤膜过滤，配成含0.02％(m/v)叠氮化钠的0.01mol/L的PBS溶液。
称取羊抗兔多克隆抗体(IgG)1mg，溶于1mL含0.02％(m/v)叠氮化钠的0.01mol/LPBS溶液配制成浓度为1mg/mL的包被液；在距检测线7mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，喷涂速度为0.6μL/cm，得到质控线，每厘米质控线上喷涂羊抗兔多克隆抗体(IgG)600ng，然后于37℃条件下干燥1.5h。
(3)试纸条的组装
在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为2mm，即得层析试纸条；
上述所述样品垫为中国公司Jieyi Biotechnology Corporation生产的Fusion3，Fusion 5。
2.聚多巴胺-铜标记的多克隆抗体反应试剂的制备
(1)聚多巴胺-铜纳米材料的制备
9.368mg盐酸多巴胺用6.4mL三羟甲基氨基甲烷缓冲液(10mM,pH 8.5)和1.6mL乙醇混合溶液(v:v＝4:1)溶解，25℃下1000rpm搅拌反应1h。随后，向上述反应液中逐滴加入1mL 24mg/mL CuSO4·5H2O，25℃下1000rpm搅拌反应3h。反应完成后，将上述混合溶液在4℃下10000rpm离心15min，沉淀用超纯水重复离心洗涤三次，最后制得3.6mg聚多巴胺-铜复合纳米材料。用2mL超纯水分散，得到浓度为1.8mg/mL的聚多巴胺-铜复合纳米分散液。
(2)聚多巴胺-铜标记的多克隆抗体反应试剂的制备
将100μL 1.8mg/mL聚多巴胺-铜纳米颗粒溶液与500μL 100μg/mL黄曲霉毒素产毒真菌的多克隆抗体混合，100rpm下温和振摇2h；反应完成后，4℃下10000rpm离心15min，弃去上清，所得沉淀用200μL 0.01mol/L PBS溶解。然后再加入200μL的2％BSA水溶液，100rpm下缓慢振摇2h，以封闭多余活性位点；反应完成后，4℃下10000rpm离心15min，丢弃清液，保留沉淀，沉淀用超纯水重复离心洗涤3次，最后用200μL 0.01mol/L的PBS溶液进行重新分散，置于4℃冰箱，备用。
2％BSA溶液配制:称取0.02g牛血清白蛋白(BSA)溶解于1mL超纯水中，0.22μm滤膜过滤，得2％BSA水溶液。
上述识别待测物黄曲霉毒素产毒真菌的纳米抗体可采用以下检测方法获得：利用AFT-YJFZ01作为免疫抗原，采用常规方式免疫羊驼或者Balb/c鼠，再利用已知常规的纳米抗体或鼠源单克隆抗体制备技术方案即可研制获得。如中国专利2021106091381的记载。
上述识别待测物黄曲霉毒素产毒真菌的多克隆抗体可采用以下检测方法获得：用AFT-YJFZ01作为免疫抗原，采用常规方式免疫新西兰大白兔等试验兔，再利用已知常规的多克隆抗体制备技术方案即可研制获得识别待测物黄曲霉毒素产毒真菌的兔源多克隆抗体。如中国专利2021106091381的记载。
3.检测方法
(1)黄曲霉毒素产毒真菌裂解液的制备
1)黄曲霉菌孢子液制备
以黄曲霉菌3.4408为例，将黄曲霉菌3.4408接到马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)固体培养基上活化，28℃培养箱内黑暗培养7天，待长满黄绿色孢子后取出，用灭菌的0.1％吐温80水冲洗孢子，得到孢子悬浮液，用血球计数板于显微镜下观察孢子形态并计数。
其中，上述所述PDA固体培养基配方如下：葡萄糖20.0g，琼脂粉20.0g，马铃薯浸粉6.0g，用超纯水溶解后定容至1L，121℃下高压灭菌20min，备用。
2)黄曲霉菌菌丝裂解液的制备
将1)中孢子液加入到200mL液体沙氏培养基中，保证孢子最终浓度为3×105cfu/mL。将上述培养基放入28℃恒温摇床中，200rpm下培养5天，用灭菌纱布收集菌丝，收集过程中用无菌水洗涤3～5次除去培养基。将收集的菌丝用冷冻干燥机干燥，将干燥后的菌丝用液氮研磨至粉末状，并将其转移至PBS中，确保菌丝最终浓度为10mg/mL，低温下用高压均质仪均质菌丝。先以100bar低压均质2次，再用1000bar高压均质2次，最终制得黄曲霉菌丝裂解液。
其中，上述所述沙氏培养基配方为：蛋白胨10g，葡萄糖40g，3-(N-吗啡啉)丙磺酸(MOPS)10.0g，用超纯水溶解后定容至1L，121℃下高压灭菌20min，备用。
(2)黄曲霉毒素产毒真菌的多模态检测程序
1)比色检测
将聚多巴胺-铜标记的多克隆抗体与黄曲霉菌细胞破碎液与PBS(v:v＝6：1)于酶标孔中混合成200μL，以黄曲霉菌3.4408为例，黄曲霉菌细胞裂解液浓度从0.01、0.1、1、10、50、100、1000μg/mL，同步设置不含黄曲霉菌细胞裂解液的对照组，在25℃下混合均匀后，将免疫层析试纸条插入酶标孔反应溶液中，25℃反应。9min后停止反应。无论阳性结果和阴性结果，质控线均显示灰色条带，若质控线灰色条带消失，则试纸条失效。25℃下干燥1.5h后，拍照，观察结果。颜色信号强度使用Image J软件中的灰度强度值，获得灰度强度值与黄曲霉菌细胞破碎液浓度间的定量关系。
2)催化放大的比色检测
将聚多巴胺-铜标记的多克隆抗体与黄曲霉菌细胞破碎液与PBS(v:v＝6：1)于酶标孔中混合成200μL，以黄曲霉菌3.4408为例，黄曲霉菌细胞破碎液浓度从0.001、0.01、0.1、1、10、50、100μg/mL，同步设置不含黄曲霉菌细胞裂解液的对照组，在25℃下混合均匀后，将免疫层析试纸条插入酶标孔反应溶液中，25℃反应。9min后停止反应。25℃下干燥1.5h后，向检测线上滴加1μL TMB-H2O2显色溶液，25℃下催化显色30s后，拍照记录，观察结果。无论阳性结果和阴性结果，质控线均显示灰色条带，若质控线灰色条带消失，则试纸条失效。颜色信号强度使用Image J软件中的灰度强度值，获得催化放大后蓝色强度值与黄曲霉毒素产毒真菌浓度间的定量关系。
其中，上述所述TMB-H2O2显色液配置如下：称取24mg TMB，然后用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液进行定容到1mL，配成100mM TMB显色底物，然后加3mL 25mM pH 4.0乙酸-乙酸钠缓冲溶液体系，加入1mL H2O2(30％)形成TMB-H2O2显色液。
3)光热检测
将聚多巴胺-铜标记的多克隆抗体与黄曲霉菌裂解液与PBS(v:v＝6：1)于酶标孔中混合成200μL，以黄曲霉菌3.4408为例，设置黄曲霉菌3.4408裂解液浓度为0.001、0.01、0.1、1、10、50、100μg/mL，同时设置不含黄曲霉菌细胞裂解液的对照组，在25℃下混合均匀后，将免疫层析试纸条插入酶标孔反应溶液中，25℃反应，9min后停止反应。25℃下干燥1.5h后，使用激光照射免疫试纸条上的检测线，3min记录检测线的温度。通过ΔT和黄曲霉菌细胞裂解液的浓度获得定量关系。无论阳性结果和阴性结果，质控线均显示灰色条带，若质控线灰色条带消失，则试纸条失效。
其中ΔT＝T1-T0，ΔT是温度升高值，T1和T0分别是实验组和空白组经激光照射后的温度差值。
其中所述激光波长为808nm近红外光，功率为1.5W/cm2。
实施例2双模态免疫检测试纸条的应用，具体方法如下：
(1)花生、玉米样品的制备
选取黄曲霉菌污染的花生与黄曲霉菌加标的玉米样品，磨碎后，称取10mg于2mL离心管中，加入1mL PBS溶液，于球磨机中60Hz，球磨30s，获得花生和玉米悬浮液。将上述混合悬浮液10000rpm下，4℃离心20min后，收集上清，0.22μm膜过滤，收集滤液，稀释10倍，配成1mg/mL溶液，备用。
(2)样品中产黄曲毒素产毒真菌的检测
设置不同浓度梯度的花生、玉米，将其与聚多巴胺-铜标记的多克隆抗体反应试剂(v：v＝6：1)于酶标孔中混合成200μL，同时设置不含未污染的实际样品为对照组，在25℃下混合均匀后，将免疫层析试纸条插入酶标孔反应溶液中，25℃反应9min后停止反应。利用实施例1检测花生、玉米中产黄曲毒素产毒真菌的含量。
检测结果：受黄曲霉毒素产毒真菌污染程度越多的花生、玉米，对应的检测试纸条检测线颜色越深，被TMB-H2O2催化后的颜色越蓝，检测线的温度越高。当实际花生、玉米中黄曲霉毒素产毒真菌浓度低于10ng/mL时，常规可视化检测线无法鉴定，经TMB-H2O2体系催化放大后，可视化检测最低可检测到1ng/mL的黄曲毒素产毒真菌。同时，检测线的温度信号值最低也可检测到黄曲毒素产毒真菌的浓度为1ng/mL。无论阳性结果和阴性结果，质控线均显示灰色条带，若质控线灰色条带消失，则试纸条失效。
Claims (13)
1.一种双模态试纸条，其特征在于：它包括层析试纸条和可结合待测物的聚多巴胺-铜复合纳米材料标记的多克隆抗体反应试剂，其中：所述的层析试纸条包括纸板，纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，所述检测线上包被有识别待测物的纳米抗体或单克隆抗体，所述质控线上包被有可与前述聚多巴胺-铜纳米材料标记的多克隆抗体结合的多克隆抗体。
2.根据权力要求1所述的双模态试纸条，其特征在于：所述吸水垫长40～45mm，宽3～5mm；检测垫长25～30mm，宽3～5mm；样品垫长12～18mm，宽2～4mm，相邻各垫的交叠长度为1～3mm；所述检测垫上的检测线与样品垫上沿的间距为5-8mm，质控线和检测线的间距为5-12mm。
3.根据权力要求1所述的双模态试纸条，其特征在于：所述层析试纸条中检测垫上每厘米检测线所需的纳米抗体或单克隆的包被量为150～900ng；每厘米质控线所需的羊抗兔多克隆抗体的包被量为150～600ng。
4.根据权利要求1所述的双模态试纸条，其特征在于：所述的待测物为黄曲霉毒素产毒真菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单核球增多性李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌中的一种或几种；所述的检测线上识别待测物的抗体为纳米抗体或单克隆抗体，与纳米抗体或单克隆抗体相结合的抗体为兔源或鼠源多克隆抗体；所述的质控线上可与多克隆抗体结合的抗体为羊抗兔或羊抗鼠多克隆抗体。
5.根据权利要求1所述的双模态试纸条，其特征在于：所述的可结合待测物的聚多巴胺-铜复合纳米材料标记的多克隆抗体由聚多巴胺-铜纳米材料与可识别待测物的多克隆抗体经过物理吸附后封闭制得，制备方法：将多巴胺-铜纳米分散液和可识别检测物的多克隆抗体溶液混合振摇，使聚多巴胺-铜复合材料和可识别待测物的多克隆抗体充分结合，后封闭多余活性位点，离心后得到聚多巴胺-铜纳米材料标记的多克隆抗体。
6.根据权力要求5中所述的双模态试纸条、制备及其应用，其特征在于：所述聚多巴胺-铜纳米分散液的浓度为1.0-3.0mg/mL；所述可识别待测物的的多克隆抗体浓度为10-1000μg/mL；多巴胺-铜复合纳米材料分散液与多克隆抗体溶液的质量比为1.5-50：1；所述的振摇时间为1-4h；所述封闭液为牛血清白蛋白水溶液，质量百分比为0.5-5.0％。
7.根据权力要求6中所述的双模态试纸条，其特征在于：所述聚多巴胺-铜纳米分散液采用一步法制得，制备方法为：一定量盐酸多巴胺溶于三羟甲基氨基甲烷缓冲液与乙醇的混合溶液中，20-35℃搅拌反应0.5-3h；逐滴加入硫酸铜水溶液，20-35℃搅拌反应2-6h，反应结束后，后处理得到聚多巴胺-铜纳米颗粒。
8.根据权力要求7中所述的双模态试纸条，其特征在于：所述盐酸多巴胺溶液的浓度为0.5-1.5mg/mL；所述三羟甲基氨基甲烷缓冲液的浓度10mM，pH 8.5，三羟甲基氨基甲烷缓冲液与乙醇的体积比为3-5:1；所述硫酸铜水溶液浓度为10-50mg/mL，所述硫酸铜与盐酸多巴胺的摩尔比为0.7-9.5：1。
9.权利要求1所述的双模态试纸条的制备方法，其特征在于：步骤如下：
(1)将吸水纸剪裁得吸水垫；
(2)检测垫的制备
1)检测线的包被
将识别待测物的纳米抗体或单克隆抗体制成包被液，可选用0.01mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)配制成浓度为0.25～1.5mg/mL的包被液；于样品垫上沿5～8mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上得到检测线，每厘米检测线所需识别待测物的纳米抗体或单克隆抗体的包被量为150～900ng，干燥；
2)质控线的包被
将可与前述聚多巴胺-铜纳米材料标记的多克隆抗体结合的多克隆抗体(IgG)制成包被液，可用含0.02％(m/v)叠氮化钠的0.01mol/L的PBS溶液配制成浓度为0.25-1.0mg/mL的包被液；于距检测线5-12mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上得到质控线，每厘米质控线上所需多克隆抗体(IgG)的包被量为150-600ng，然后干燥；
(3)样品垫的制备
采用硝酸纤维素膜作样品垫；
(4)试纸条的组装
在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为1～3mm，即得层析试纸条。
10.基于权利要求1所述的双模态免疫检测试纸条的双模态检测方法，检测方法如下：提供待测样品溶液，提供聚多巴胺-铜纳米材料标记的识别待测物的多克隆抗体溶液，将其分别加入酶标孔中，混匀，插入层析试纸条，孵育一段时间后，读取结果；同时提供阴性对照样品组。
11.根据权利要求10所述的双模态检测方法，其特征在于：所述待测样品为玉米、花生、大米中的一种或几种；聚多巴胺-铜复合纳米材料标记的多克隆抗体反应试剂与待测样品溶液以体积比为4-6.5：1混合。
12.根据权利要求10所述的双模态检测方法，其特征在于:25-37℃下孵育5-15min，直接读取比色信号；
或滴加信号放大显色液于检测线，放置15-45s，读取催化放大的比色信号结果；所述的信号放大显色液为TMB-H2O2，TMB溶液的浓度5-50mmol/L，H2O2质量浓度为3-8％，将TMB-H2O2分散在pH为3.0-6.5的酸性缓冲溶液中得到；
或用808nm激光照射试纸条检测线，并利用近红外热成像仪记录光热信号结果。
13.根据权利要求12所述的双模态检测方法，其特征在于:所述的酸性缓冲溶液为乙酸-乙酸钠或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中的一种；
激光功率为0.5-2.0W/cm2，照射时间为2-6min；
所述的待测样品中的黄曲霉毒素产毒真菌含量的具体计算方法为：基于所述试纸条中的检测线有无待测物的强度灰度值变化率或温度变化((I-I0)/I0或ΔT，获得ΔI(即I-I0)/I0或ΔT(ΔT是温度升高值，即T1-T0，T1和T0分别是实验组和空白组经激光照射后的温度差值)与待测物间的关系曲线，经拟合得到试纸条检测线比色强度变化值或温度变化值与待测物浓度的关系曲线，将获得的待测样品溶液的检测线比色强度变化值或温度变化值，代入上述拟合的关系曲线，获得待测样品溶液中待测物的含量，最后经换算即得待测样品中待测物的含量。
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Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
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| US20180164240A1 (en) * | 2015-09-24 | 2018-06-14 | Case Western Reserve University | Sensor for detection of analytes |
| CN114354591A (zh) * | 2022-01-10 | 2022-04-15 | 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 | 黄曲霉毒素b1快速检测的比色/荧光双模式生物传感检测方法 |
-
2022
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101930006A (zh) * | 2010-08-05 | 2010-12-29 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 快速检测黄曲霉毒素总量的高灵敏度免疫层析试纸条及其制备方法 |
| US20180164240A1 (en) * | 2015-09-24 | 2018-06-14 | Case Western Reserve University | Sensor for detection of analytes |
| CN114354591A (zh) * | 2022-01-10 | 2022-04-15 | 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 | 黄曲霉毒素b1快速检测的比色/荧光双模式生物传感检测方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| DAI LU等: "An In Situ Generated Prussian Blue Nanoparticle-Mediated Multimode Nanozyme-Linked Immunosorbent Assay for the Detection of Aflatoxin B1", ACS APPL. MATER. INTERFACES, vol. 13, 27 May 2021 (2021-05-27), pages 2 * |
| JIAQI WANG等: "Ultrasensitive microfluidic immunosensor with stir bar enrichment for point-of-care test of Staphylococcus aureus in foods triggered by DNAzyme-assisted click reaction", FOOD CHEMISTRY, vol. 378, 8 January 2022 (2022-01-08), pages 2 * |
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