CN114778451A

CN114778451A - 一种食品色素的多模裸眼检测数字化颜色信息卡、制备方法及其应用

Info

Publication number: CN114778451A
Application number: CN202210588143.3A
Authority: CN
Inventors: 王双寿; 王海丽; 李文治; 丁玉雯; 晋琪稳; 卢小媚; 颜庭轩
Original assignee: Anhui University of Technology AHUT
Current assignee: Anhui University of Technology AHUT
Priority date: 2022-05-26
Filing date: 2022-05-26
Publication date: 2022-07-22

Abstract

本发明涉及固相微萃取技术领域，具体涉及一种食品色素的多模裸眼检测数字化颜色信息卡、制备方法及其应用，制备方法包括以下步骤：S1：食品色素检测试纸的制备；S2：比色卡的制作；S3：数字化颜色信息卡的制作，本发明的检测试纸着色性能好，整个检测过程在1分钟内即可完成。此外，该试纸和比色卡的制作简单，操作方便，可在手机/平板电脑等移动系统上实现结果直读，且能避免传统裸眼比色分析中因对颜色的主观判断而引起的误差，具有准确性好、便携性强、成本低廉、适用面广等优点，适用于着色食品中色素的半定量即时检验。

Description

一种食品色素的多模裸眼检测数字化颜色信息卡、制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及固相微萃取技术领域，具体涉及一种食品色素的多模裸眼检测数字化颜色信息卡、制备方法及其应用。

背景技术

无论是为了改善消费者的食欲还是出于市场营销策略考虑，人工合成色素(FCs)均已作为一种常见的食品添加剂在食品工业被广泛使用。然而，大量文献研究报道，FCs不仅不能为人体提供任何营养，许多FCs还具有时间和剂量依赖性毒副作用，过量摄入会导致过敏、荨麻疹、间歇性头痛、腹泻，甚至会引起神经毒性、生育能力下降、胎儿致畸以及致癌等生命安全问题。长期摄入大量的FCs也可能会影响儿童生长发育。此外，因为FCs滥用而造成的全球性食品安全丑闻也屡见不鲜。由此可见，FCs相关的食品安全已成为影响人类健康的重大问题，努力发展FCs分离分析技术对于保障食品安全与质量意义重大。

目前已有多种较为成熟的FCs分析检测方法，主要包括分光光度法、毛细管电泳法、薄层色谱法、高效液相色谱法(HPLC)以及色谱-质谱联用等技术，其中HPLC法是国标GB/T5009.35-2003中规定的FCs首选分析方法。尽管FCs分析方法多样，但绝大部分这些方法的操作繁琐，为了避免基质干扰，通常需要对样品进行预处理。此外，这些方法还高度依赖于特定的仪器设备与专业技术人员，不仅分析成本和技术门槛高，也不适用于现场即时检验，严重制约了它们的应用，特别是在偏远或资源匮乏的环境下，这一问题尤为突出。

基于纸分析技术的便携式裸眼检测策略是解决上述问题的可行方案之一。现有技术中有采用聚苯胺改性滤纸用于染料分离分析，但该方法所得滤纸因本身的背景颜色干扰严重，根本无法用于色素的定量或半定量裸眼检测；也有现有研究制备了羧甲基壳聚糖修饰的聚对二氧环己酮纳米胶束，以此对滤纸进行改性并用于违禁食品色素—苏丹红Ⅰ的快速裸眼检测，但该试纸仅适用于苏丹红Ⅰ这一色素，适用面窄，且其检测结果基于荧光信号，仍需借助专业仪器，便携性差。此外，已有基于试纸比色分析的FCs裸眼检测技术报道，但仅依靠裸眼比色易引起因对颜色的主观判断而使分析结果产生较大的偏差。此外，对于部分着色能力差以及色度不明显的FCs，因其着色后试纸的颜色浅，仅通过比色分析无法实现半定量裸眼检测，尤其在浓度相对较低的情况下，这一问题更为凸出。

鉴于上述缺陷，本发明创作者经过长时间的研究和实践终于获得了本发明。

发明内容

本发明的目的在于解决现有食品色素检测方法操作繁琐、对专业设备和技术人员的依赖性强，分析成本和技术门槛高，不适用于裸眼检测，以及传统裸眼比色分析因对颜色的主观判断而易产生误差的问题，提供了一种食品色素的多模裸眼检测装置、制备方法及其应用。

为了实现上述目的，本发明公开了一种食品色素的多模裸眼检测数字化颜色信息卡的制备方法，包括以下步骤：

S1：制备色素检测试纸：在滤纸表面修饰色素吸附官能团，裁剪定型后得到检测试纸；

S2：比色卡的制作：按一定浓度梯度准确配制标准色素样品，用步骤S1中得到的试纸进行萃取，萃取完成后滤纸呈现的颜色即为比色卡色块的颜色，萃取过一定浓度梯度标准色素的试纸根据相应色素的浓度梯度通过裁剪和排列后制作成比色卡；

S3：数字化颜色信息卡的制作：通过程序读出步骤S2中比色卡的数字化颜色信息，将所得颜色信息根据相应色素的浓度梯度进行排列后制得数字化颜色信息卡。

所述步骤S1中滤纸表面的修饰方式为物理或化学修饰。

所述物理修饰为物理涂覆聚合层，所述化学修饰为化学交联。

所述步骤S1中特定官能团为能与食品中色素结合的任意一种官能团。

所述步骤S1中特定官能团氨基、脲基、羧基、磺酸基、杂环、烷基链、饱和/不饱和环烃中的任意一种。

所述步骤S2中比色卡中每种色素的对比颜色包括16个色块，每一个色块对应相应的色素浓度。

所述步骤S3中数字化颜色信息包括RGB值、CMYK值、灰度值、饱和度、明/亮度中任意一种颜色信息。

所述步骤S3中颜色信息读取程序包括计算机程序、手机程序、平板电脑程序中任意一种可解码程序。

本发明还公开了采用上述制备方法制得的食品色素的多模裸眼检测数字化颜色信息卡以及这种食品色素的多模裸眼检测数字化颜色信息卡。

商品化玻纤滤纸表面通过物理涂覆或化学交联的方式修饰上色素吸附基团(如氨基、脲基、羧基、磺酸基、杂环、烷基链、饱和/不饱和环烃等)，滤纸表面因酸/碱性基团在水中电离或质子化等作用而在本研究pH条件下荷电，而烃类基团使滤纸表面具有一定的疏水效应，故本发明中色素的高效萃取主要是通过滤纸与色素间的静电相互作用和疏水效应而实现。

试纸吸附一定浓度梯度的色素标准样品后呈现出与之相应的表观颜色梯度，根据色素的浓度梯度与试纸表观颜色梯度的对应关系制作比色卡，同样地，试纸萃取实际着色食品中的色素后也会呈现一定的颜色，将其与比色卡比对，比色卡中颜色最为接近的色块对应的色素浓度即判定为试纸萃取到的实际着色食品中色素的浓度。

通过颜色解码程序将比色卡的颜色梯度转换成数字化的颜色信息(如RGB值、灰度值等)，按照色素的浓度梯度排序以此建立对应的颜色信息卡，根据数字化颜色信息与色素浓度间的关系绘制RGB-浓度或灰度-浓度关系曲线，并对其进行线性拟合，得出线性回归方程、线性相关系数及其工作浓度范围。通过读取试纸萃取实际着色食品后的颜色信息，将其与颜色信息卡裸眼比对，颜色信息卡中最为接近的颜色信息对应的色素浓度即判定为实际样品中色素的直读浓度；此外，也可将试纸萃取实际着色食品后的颜色信息代入颜色信息方程中进行计算，所得结果即可判定为实际样品中色素的浓度。最后，本发明还将裸眼比色结果和颜色信息卡直读结果与HPLC法分析结果进行比较，进一步证实了多模裸眼检测结果的可靠性。

与现有技术比较本发明的有益效果在于：本发明的比色卡是基于滤纸表面改性并吸附标准色素后呈现的颜色差异制作而成，颜色信息卡是基于颜色解码程序读出的数字化颜色信息后根据对应色素的浓度梯度制作而成，适用于酸性、碱性和两性色素的多模式裸眼检测，无需任何样品前处理步骤，且高效快速，整个分析过程1min内即可完成；通过将试纸和比色卡的颜色转换成数字化颜色信息可消除传统裸眼比色分析方法中因主观颜色判断而易引起的分析误差，提高分析结果准确性的同时增强了可应用性；还具有成本低廉、制备简单、使用方便、比色灵敏度高、便于携带等优点，可用于着色食品中色素的半定量裸眼检测。

附图说明

图1为本发明制备试纸的技术路线示意图；

图2为本发明制备比色卡的技术路线示意图；

图3为本发明整体技术方案的原理示意图；

图4为未功能化的裸玻纤滤纸(A)、10％脲丙基三乙氧基硅烷(UPTES)功能化的玻纤滤纸(B)、20％UPTES功能化的玻纤滤纸(C)和40％UPTES功能化的玻纤滤纸(D)的扫描电镜图；

图5为本发明三中裸玻纤滤纸和40％UPTES功能化玻纤滤纸在干燥和湿润状态时的拉伸应力(A)和弹性模量(B)测试示意图；

图6为本发明四中裸玻纤滤纸和不同含量UPTES功能化玻纤滤纸的热重分析示意图；

图7为本发明五中裸玻纤滤纸(A,E)、10％UPTES功能化的玻纤滤纸(B,F)、20％UPTES 功能化的玻纤滤纸(C,G)和40％UPTES功能化的玻纤滤纸(D,H)的元素映射(A-D)和X射线光电子能谱(E-H)分析示意图；

图8为本发明六中氨基功能化SiO₂ NPs(A)、吸附日落黄后的SiO₂ NPs(B)、吸附亮蓝后的SiO₂ NPs(C)的表观Zeta电势分布以及三种SiO₂ NPs的典型Zeta电势值(D)；

图9为本发明七中不同类型玻纤滤纸经不同含量UPTES改性后对诱惑红的吸附动力学关系示意图，A～F中UPTES的体积分数分别是0,5％,10％,20％,30％和40％；

图10为本发明八中不同环境因素对试纸吸附效果影响的关系示意图。其中，A是脲基功能化试纸在不同pH下萃取到亮蓝和日落黄标准色素的归一化吸光度与溶液pH间的关系示意图；B是脲基功能化试纸在不同乙腈体积分数下萃取到亮蓝和日落黄标准色素的归一化吸光度与溶液中乙腈含量的关系示意图；C是脲基功能化试纸在不同乙醇体积分数下萃取到亮蓝和诱惑红标准色素的归一化吸光度与溶液中乙醇含量的关系示意图；D是脲基功能化试纸在不同氯化钠浓度下萃取到亮蓝和诱惑红标准色素的归一化吸光度与溶液中氯化钠含量的关系示意图；

图11为本发明九中脲基功能化试纸在不同吸附时间下与亮蓝间的吸附等温线示意图；

图12为本发明十中脲基功能化试纸在不同萃取时间和色素浓度下的着色效果示意图。其中A～F是诱惑红；G～L是亮蓝；色素浓度从左到右依次是0,0.001,0.005,0.01,0.05,0.1,0.25, 0.5,1.0,1.5,2.0,3.0,5.0,7.5和10.0mg/mL；萃取时间：10秒(A,G)；20秒(B,H)；30秒 (C,I)；150秒(D,J)；300秒(E,K)；7200秒(F,L)；

图13为本发明十二中实际饮料样品及其经脲基功能化试纸萃取0.5分钟后的上清液和解吸液的色谱保留行为示意图。其中(A,D)是实际饮料样品；(B,E)是经脲基功能化滤纸萃取后饮料样品的上清液；(C,F)是脲基功能化滤纸萃取饮料样品的解吸液，其中黑色线和灰色线分别对应第1,2次解吸液样品；(A～C)是亮蓝着色饮料；(D～F)是日落黄着色饮料；

图14为本发明十三中日落黄(A)和亮蓝(B)着色的饮料在进行萃取前后连同相应标准溶液的质谱分析示意图。图中谱线由上而下分别对应色素标准样品、实际饮料样品、经脲基功能化滤纸萃取后饮料样品的上清液以及脲基功能化滤纸萃取饮料样品的解吸液；

图15为本发明十四中两种代表性色素制得的比色卡示意图；

图16为本发明十五中日落黄和亮蓝着色的实际饮料样品中色素的半定量目视比色分析示意图。其中1和4分别为试纸吸附含日落黄和亮蓝实际饮料样品后的颜色；2,3和5,6分别为比色卡中与测试结果1和4颜色最为接近的色块及对应色素的浓度；

图17为本发明十五中两种代表性色素比色卡的数字化颜色信息与色素浓度的线性相关性示意图，其中A是亮蓝；B是日落黄。

具体实施方式

以下结合附图，对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。

一、比色卡的制备

S1：试纸的制备

制备路线如图1。先将滤纸用超纯水清洗干净并干燥，再通过可自聚化合物在水相或有机相中的自聚合在滤纸表面包覆含活性官能团的聚合物层，从而得到可用于色素吸附的试纸。该聚合物层在色素萃取过程中起到了吸附作用，使改性后的滤纸对色素有着高的吸附效率。

S2：比色卡的制作

制作过程如图2所示。将步骤S1得到的试纸用于萃取一定浓度梯度的色素标准样品，萃取完成后用水清洗并干燥，再按照色素的浓度梯度将吸附过相应浓度色素的试纸进行排列，制成目测比色卡。

二、脲基功能化试纸的制备

将玻纤滤纸在含有不同体积分数脲丙基三乙氧基硅烷(UPTES)的水溶液(～pH7.4)中完全浸湿后立即取出，置于55℃真空干燥30min。然后用打孔机将所得滤纸打成直径约6mm 的小圆片，制得表面脲基功能化的试纸。裸玻纤滤纸以及10％，20％和40％(v/v)UPTES 修饰试纸的扫描电镜(SEM)照片如图4。由图可知，滤纸表面可清晰地观察到UPTES聚合物层，且修饰后的试纸很好地保留了滤纸本身的多孔结构。

三、脲基功能化试纸的机械强度测试

将二中制得的40％(v/v)UPTES修饰的试纸和裸玻纤滤纸分别用超纯水完全润湿，然后分别测试两种纸在干燥和湿润状态下的拉伸应力和弹性模量，结果如图5所示。图5A是功能化试纸和裸玻纤滤纸在干燥和湿润状态时的应力-应变曲线关系示意图，图5B是两种滤纸在干燥和润湿状态下弹性模量。由图可知，无论在干燥还是湿润状态，玻纤滤纸在修饰完 UPTES后的抗张强度和弹性模量明显增强(**p≤0.005,***p<0.001)，说明修饰完UPTES后滤纸的机械强度和抗形变能力显著提高。

四、脲基功能化试纸的热重分析(TGA)

将二中制得的不同含量UPTES功能化的试纸和裸玻纤滤纸分别用超纯水和乙醇清洗干净并置于55℃真空干燥，然后分别进行TGA测试，结果如图6所示。图6是裸玻纤滤纸和10％,20％以及40％(v/v)UPTES功能化试纸的TGA测试结果。由图可知，随着测试温度由29.8℃增加到600℃，试纸的失重百分比随着UPTES含量的增加而增加，40％UPTES功能化试纸的失重超过34.3％，而裸玻纤滤纸的失重则不明显(仅约0.8％)，进一步证实了滤纸表面UPTES的修饰是成功的。

五、脲基功能化试纸的元素组成分析

将二中制得的不同含量UPTES功能化的试纸和裸玻纤滤纸分别用超纯水和乙醇清洗干净并置于55℃真空干燥，然后用能量散射X射线光谱仪(EDX)表征其元素组成，结果如图7和表1。其中图7A-D分别是裸玻纤滤纸和10％，20％以及40％(v/v)UPTES功能化试纸的元素映射谱结果示意图；图7E-H分别是这四种滤纸的EDX谱结果示意图；表1是这四种滤纸的C、N、O、Si四种元素的相对含量。由图7和表1可知，滤纸的C和N元素相对含量随UPTES用量增加而显著上升，而O和Si元素的相对含量则大幅下降，证明UPTES 成功修饰，该结果与SEM、EDX和TGA表征完全一致。

表1裸玻纤滤纸和不同含量UPTES功能化试纸的C、N、O、Si四种元素的相对含量

六、试纸对色素的吸附机理考察

S1：氨基功能化二氧化硅纳米粒子(SiO₂ NPs)的制备

0.36mL氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)和0.16mL四乙氧基硅烷(TEOS)溶于8.4mL 乙醇中，该混合溶液用作先导物溶液。64mL乙醇中分别加入3.88mL水和2.88mL氨水，将该溶液缓慢加热到55℃后立刻加入先导物溶液并在剧烈搅拌下继续反应10分钟。最后通过离心收集SiO₂ NPs，将所得SiO₂ NPs分别用乙醇和超纯水清洗两次后保存于水中备用。

S2：SiO₂ NPs吸附色素前后的Zeta电势测定

称取一定质量的日落黄和亮蓝标准品分别溶于水(～pH 7.4)中，配制成浓度为1.0mg/mL 的标准溶液。然后将步骤S1中制得的氨基功能化SiO₂ NPs分散到该溶液中，最终浓度为 2.0mg/mL，室温下温育1小时。温育结束后移除溶液并用水(～pH 7.4)清洗材料3次，接着将结合色素的SiO₂ NPs连同氨基功能化裸SiO₂ NPs重新分散于水中，最终浓度均为2.0mg/mL，分别测定每组样品的Zeta电势，结果如图8。显然，氨基功能化裸SiO₂ NPs表面荷较强的正电，结合过色素的SiO₂ NPs表面荷正电显著降低(***p≤0.0002)，证明色素与氨基功能化SiO₂ NPs间的结合主要归因于静电相互作用。由于脲基功能化试纸与色素间的作用力同样归因于氨基(脲基中的伯胺和仲胺)，故脲基功能化试纸与色素间的作用同样归因于静电相互作用。

七、吸附动力学考察

称取一定质量的诱惑红溶于水(～pH 7.4)中，配制成浓度为0.1mg/mL的标准溶液共5 份，每份2mL。然后将二中制得的5％,10％,20％,30％和40％(v/v)UPTES功能化试纸浸没于该溶液中，每份加入试纸7片。室温下缓慢振荡萃取不同时间后分别取出100μL上清液并测其紫外-可见吸收光谱，同时增补100μL诱惑红标准溶液于反应液中，具体萃取时间设置为： 0,5,10,15,20,30,50,70,90,120,180和240分钟。最后以诱惑红标准溶液在最大吸收波长处的吸光度为基准对测得的上清液的吸光度进行归一化，并将归一化的吸光度对吸附时间作图，结果如图9。由图可知，随着后修饰过程中UPTES用量增加，试纸在相同时间下对诱惑红的吸附能力增强，约30分钟左右达吸附平衡，故本发明后续试验采用40％UPTES功能化滤纸为色素吸附试纸。

八、外部因素对试纸吸附性能影响的考察

S1：溶液pH变化对试纸吸附性能的影响

称取等质量的日落黄和亮蓝标准品溶于不同pH的水中，配制成浓度为0.1mg/mL的标准溶液，具体pH梯度设置为：1.5,2.5,3.5,4.5,5.5,6.5,7.5,8.5,9.5,10.5,11.5和12.5。然后将二中制得的试纸置于96孔酶标板中，每孔分别加入150μL上述不同pH的标准溶液，室温下温育30秒。温育结束后移除孔内残留溶液并用相应pH的水清洗孔内滤纸3次，移除溶液后每孔分别加入200μL含60％(v/v)乙腈的NaOH溶液(pH 12.5)进行解吸，室温下解吸2 小时后收集解吸液并分别测其紫外-可见吸收光谱。以pH 1.5吸附条件下所得解吸液在最大吸收波长下的吸光度为基准对所有解吸液在该波长下测得的吸光度进行归一化，该试验平行测定3次，最终结果进行加权平均。根据归一化吸光度与体系pH间的关系绘制相对吸光度-体系pH曲线，结果如图10A。由图可知，试纸对色素的萃取量在pH 1.5～10.5范围内非常稳定，说明脲基功能化滤纸有着宽泛的结合pH范围。此外，当pH>10.5时，试纸对色素的吸附性能显著下降，进一步说明静电相互作用是试纸吸附色素的主要作用力，这一结果与Zeta电势表征结果相符。

S2：乙腈含量对试纸吸附性能的影响

称取等质量的日落黄和亮蓝标准品溶于含不同体积分数乙腈的水中，配制成浓度为0.5 mg/mL的标准溶液，乙腈体积分数具体设置为：1.0,3.0,5.0,10.0,15.0,20.0,30.0,40.0,60.0 和90.0％。然后将实施例二中制得的试纸置于96孔酶标板中，每孔分别加入150μL上述色素标准溶液，室温下温育30秒。温育结束后移除孔内残留溶液并用相应的溶剂清洗孔内滤纸3 次，接着每孔加入200μL含60％(v/v)乙腈的NaOH溶液(pH 12.5)对滤纸进行解吸，室温下解吸2小时，收集解吸液并分别测定解吸液的紫外-可见吸收光谱。以乙腈体积分数为1.0％的吸附条件下所得解吸液在最大吸收波长下的吸光度为基准对所有解吸液在该波长下测得的吸光度进行归一化，该试验平行测定3次，最终结果进行加权平均。根据归一化吸光度与溶液中乙腈体积百分比间的关系绘制相对吸光度-乙腈含量曲线，结果如图10B所示。由图易知，随着体系中乙腈含量的增加，滤纸对色素的萃取量逐渐下降，证明疏水相互作用在滤纸萃取色素的过程中起到了一定的作用。

S3：乙醇含量对试纸吸附性能的影响

称取等质量的诱惑红和亮蓝标准品溶于含不同乙醇体积比的水中，配制成浓度为0.5 mg/mL的标准溶液，乙醇的体积分数具体设置为：1.0,3.0,5.0,10.0,15.0,20.0,30.0和40.0％。然后将实施例二中制得的试纸置于96孔酶标板中，每孔分别加入150μL上述色素标准溶液，室温下温育30秒。温育结束后移除孔内残留溶液并用相应的溶剂清洗孔内滤纸3次，接着每孔加入200μL含60％(v/v)乙腈的NaOH溶液(pH 12.5)对滤纸进行解吸，室温下解吸2 小时，收集解吸液并分别测定解吸液的紫外-可见吸收光谱。以乙醇体积分数为1.0％的吸附条件下所得解吸液在最大吸收波长下的吸光度为基准对所有解吸液在该波长下测得的吸光度进行归一化，该试验平行测定3次，最终结果进行加权平均。根据归一化吸光度与溶液中乙醇体积百分比的关系绘制相对吸光度-乙醇含量曲线，结果如图10C。显然，即使在乙醇体积分数高达40.0％时对试纸的吸附性能也无显著影响，而该乙醇体积分数涵盖了市面上大多数硬饮料的酒精度，说明脲基功能化滤纸适用于某些实际硬饮料中色素的比色检测。

S4：盐浓度对试纸吸附性能的影响

称取等质量的诱惑红和亮蓝标准品溶于含不同浓度氯化钠的水中，配制成浓度为0.5 mg/mL的标准溶液，氯化钠浓度具体设置为：0.1,0.3,0.5,0.7,1.0,1.5,2.0和4.0mol/L。然后将实施例二中制得的试纸置于96孔酶标板中，每孔分别加入150μL上述色素标准溶液，室温下温育30秒。温育结束后移除孔内残留溶液并用相应的溶剂清洗孔内滤纸3次，接着每孔加入200μL含60％(v/v)乙腈的NaOH溶液(pH12.5)对滤纸进行解吸，室温下解吸2小时，收集解吸液并分别测定解吸液的紫外-可见吸收光谱。以氯化钠浓度为0.1mol/L的吸附条件下所得解吸液在最大吸收波长下的吸光度为基准对所有解吸液在该波长下测得的吸光度进行归一化，该试验平行测定3次，最终结果进行加权平均。根据归一化吸光度与溶液中氯化钠浓度的关系绘制相对吸光度-盐浓度曲线，结果如图10D。滤纸对色素的吸附能力随着盐浓度的增加而下降，印证了静电相互作用在吸附过程中起主要作用这一结论。

九、脲基功能化试纸的萃取性能评价

S1：标准曲线的建立

称取一定质量的亮蓝和诱惑红标准品溶于水(～pH 7.4)中，配置成一定浓度梯度的标准溶液，具体浓度设置为：诱惑红：0.2,0.1,0.05,0.025,0.01,0.005,0.0025,0.001,0.0005,0.00025 和0.0001mg/mL；亮蓝：0.05,0.025,0.01,0.005,0.0025,0.001,0.0005和0.00025mg/mL。然后分别测定各样品的紫外-可见(UV-vis)吸收光谱，绘制最大吸收波长处吸光度与对应色素浓度之间的关系曲线并进行线性拟合，得出线性回归方程、检测波长、线性相关系数及其工作范围。结果如表2所示，表2为UV-vis光谱法测得几种色素的标准曲线及其相关工作参数。显然，各色素标准曲线的线性相关性都很好，为后续定量计算提供了保证。

表2紫外-可见吸收光谱法测得诱惑红和亮蓝的标准曲线及其相关工作参数

S2：萃取性能的定量评价

称取相同质量的亮蓝和诱惑红标准品溶于水(～pH 7.4)中，配置成一定浓度梯度的标准溶液，具体浓度设置为：15.0,12.5,10.0,7.5,5.0,3.0,2.0,1.5,1.0,0.5,0.25,0.1,0.05,0.01,0.005 和0.001mg/mL。然后将二中制得的试纸置于96孔酶标板中，每孔分别加入150μL上述标准溶液，室温下吸附0.5分钟。吸附结束后用水(～pH 7.4)清洗滤纸1遍。然后每孔加入200μL 含60％(v/v)乙腈的NaOH溶液(pH 12.5)对滤纸进行解吸，室温下解吸2小时，收集解吸液并分别测定解吸液的紫外-可见吸收光谱，以各解吸液最大吸收波长处的吸光度进行定量计算。该试验平行测定3次，最终结果进行加权平均。通过S1中的标准曲线计算出解吸液中色素的含量，根据解吸液中色素的含量与色素浓度之间的关系绘制吸附等温线。结果如图11。显然，即使在萃取时间短至0.5分钟，脲基功能化滤纸对两种色素仍具有较高的萃取效率。

十、试纸的着色性能评价

称取相同质量的亮蓝和诱惑红标准品溶于水(～pH 7.4)中，配置成一定浓度梯度的标准溶液，具体浓度设置为：10.0,7.5,5.0,3.0,2.0,1.5,1.0,0.5,0.25,0.1,0.05,0.01,0.005,0.001和 0mg/mL。然后将二中制得的试纸置于96孔酶标板中，每孔分别加入150μL上述标准溶液，室温下吸附不同时间，具体吸附时间设置为10,20,30,150,300和7200秒。吸附结束后用水 (～pH 7.4)清洗滤纸1遍，干燥后整板在300dpi分辨率下进行扫描，去除背景并按色素浓度和吸附时间梯度组合后如图12所示。由图易知，在0.001mg/mL的最低色素浓度下，滤纸吸附色素的时间为20～30秒即可呈现明显的颜色；而在10s的最短吸附时间下，滤纸萃取 0.005mg/mL浓度的色素即呈现清晰的颜色。说明脲基功能化试纸具有优异的可着色性。

十一、高效液相色谱法(HPLC)测定日落黄和亮蓝的标准曲线

称取不同质量的亮蓝和日落黄标准品溶于水(～pH 7.4)中，配制成一定浓度梯度的标准溶液，具体浓度设置为：日落黄：0.1,0.05,0.025,0.01,0.005和0.001mg/mL；亮蓝：0.05,0.025, 0.01,0.005,0.0025,0.001,0.0005,0.00025和0.0001mg/mL。色谱条件：色谱柱Pronaos EP-C18 (5μm,4.6×250mm²)；柱温：40℃；进样量：20μL；流动相A：甲醇；流动相B：乙酸铵(pH 7.5)；日落黄的梯度洗脱条件：0min：25％A；0-4min：25％-40％A；4-11min：40％-95％A； 11-18min：95％-40％A；18-22min：40％-25％A；22-50min：25％A，流速为1.0mL/min；亮蓝的梯度洗脱条件：0min：15％A；0-4min：15％-30％A；4-11min：30％-85％A；11-18min： 85％-30％A；18-22min：30％-15％A；22-50min：15％A，流速为0.4mL/min；检测波长：日落黄：482nm；亮蓝：628nm。在上述给定的色谱条件下考察两色素的色谱保留行为，绘制色谱峰面积与色素浓度间的关系曲线并进行线性拟合，得出线性回归方程、线性相关系数及其工作浓度范围。结果如表3，表3为HPLC法测得日落黄和亮蓝的标准曲线及其线性相关性和工作范围。显然，各色素标准曲线的线性相关性极好且工作浓度范围宽，说明HPLC是一种色素定量分析的可靠手段。

表3 HPLC法测得日落黄和亮蓝的标准曲线及其相关工作参数

十二、HPLC法评价脲基功能化滤纸对实际饮料样品中色素的萃取效果

S1：HPLC法测定实际饮料样品中色素的含量

将含有日落黄或亮蓝的实际饮料样品分别编号为1和2号受试物，然后在十一中相应的色谱条件下直接进行色谱分析并以相应的标准色素样品为参照来确定色素在饮料样品中的色谱峰位置。每个样品平行测定3次并对3次色谱峰的峰面积进行加权平均，再根据十一中的 HPLC标准曲线计算各实际饮料样品中色素的含量。亮蓝和日落黄着色饮料的色谱保留结果分别如图13A和D，HPLC法测得各饮料中色素的含量如表4。表4为HPLC法测得的两种实际饮料样品中色素的含量。显然，几种饮料中色素的添加量均在国家限用标准内。

表4 HPLC法测得的两种实际饮料样品中色素的含量

实际饮料样品序号	添加色素的种类	测定浓度(mg/mL)	样品体积(μL)	测定量(μg)
					1	日落黄	0.0270	150	4.05
2	亮蓝	0.0014	150	0.21

S2：HPLC法评价脲基功能化滤纸对实际饮料样品中色素的吸附性能

将二中制得的试纸置于96孔酶标板中，每孔分别加入150μL步骤S1中的两种实际饮料样品溶液，室温下温育0.5分钟。温育结束后收集上清液，用水(～pH 7.4)清洗滤纸1遍。然后每孔加入200μL含60％(v/v)乙腈的NaOH溶液(pH 12.5)对滤纸进行解吸，室温下解吸2小时，收集解吸液。解吸步骤重复2次。在十一中给定的色谱条件下对上清液和解吸液分别进行HPLC分析，再根据十一中各色素的HPLC标准曲线计算上清液中色素的含量和脲基功能化滤纸在各实际饮料样品中萃取到色素的含量，样品1和2的上清液和解吸液的色谱保留结果分别如图13B,C和E,F。HPLC法测得上清液和解吸液中色素的含量如表5。表5 为两种实际饮料样品经脲基功能化滤纸萃取后上清液和萃取物中色素的含量。对比表4和表 5可得出如下结论：即使萃取时间短至0.5分钟，脲基功能化滤纸也可从实际饮料样品中有效地萃取到色素。

表5 HPLC法测得上清液和萃取物中色素的含量

十三、质谱(MS)法评价脲基功能化滤纸对实际饮料样品中色素的萃取效果

将二中制得的试纸置于96孔酶标板中，每孔分别加入150μL十二中的两种实际饮料样品溶液，室温下吸附0.5分钟。吸附结束后收集上清液，用水(～pH 7.4)清洗滤纸1遍。然后每孔加入200μL含60％(v/v)乙腈的氨水溶液(pH 12.5)对滤纸进行解吸，室温下解吸2小时，收集解吸液。将实际饮品样品溶液、相应的上清液和解吸液，连同色素标准溶液一起进行MS分析，标准溶液的浓度设定为：亮蓝2×10^-5mg/mL；日落黄：2×10^-4mg/mL，测试结果如图14所示。通过m/z 203.1和373.4的[M-2Na]^2-峰可判定试纸有效地萃取到了实际饮料样品中的色素，该结果与HPLC的分析结果相符。

十四、亮蓝和日落黄比色卡的制作

称取等质量的亮蓝和日落黄标准品溶于水(～pH 7.4)中，每个样品配置成相同的浓度梯度，包括0.5,0.4,0.3,0.2,0.1,0.08,0.06,0.04,0.02,0.01,0.008,0.006,0.004,0.002,0.001和 0mg/mL。将二中制得的试纸在室温下对这些色素吸附0.5分钟，所得试纸的颜色如图15所示。可以得出以下结论：脲基功能化滤纸在吸附完不同浓度的色素后呈现的颜色梯度与色素的浓度梯度一一对应，色素的浓度越高，滤纸的颜色越明显。

十五、比色卡用于实际饮料样品中色素的多模裸眼检测

S1：基于比色卡的实际饮料样品中色素的裸眼比色分析

将二中制得的试纸置于96孔酶标板中，每孔分别加入150μL含日落黄或亮蓝的实际饮料样品溶液，室温下温育0.5分钟。吸附结束后收集上清液，用水(～pH 7.4)清洗滤纸1遍。该吸附实验平行测定3次。将所得滤纸的颜色与实施例十四中制得的色素比色卡进行裸眼比对，结果如图16。实际饮料样品中日落黄和亮蓝的比色分析结果分别为0.02～0.04mg/mL和 0.001～0.002mg/mL。通过与十二中HPLC测得的实际饮料样品中色素的含量进行比较，两者结果基本一致，故可做出如下结论：本发明的比色卡用于饮料样品中色素含量的半定量裸眼检测是可行的，但是色素浓度较低时，仅通过裸眼比色不容易进行半定量测定，因主观判色引起的误差会很大。

S2：数字化颜色信息卡的制作

将十四中得到的比色卡用合适的应用程序读出RGB值和灰度值等数字化颜色信息，再按照色素的浓度梯度将所得颜色信息进行排列，制成数字化颜色信息卡，结果如表6所示。表 6为基于比色卡色块读出的亮蓝和日落黄两种色素在不同浓度下的RGB(R/B或B/R)值和灰度值。绘制表中的颜色信息(R/B、B/R和灰度值)与色素浓度间的关系曲线并进行线性拟合，得出线性回归方程、线性相关系数及其工作浓度范围。结果如图17和表7。图17为RGB (R/B或B/R)值和灰度值与色素浓度关系示意图。表7为通过颜色信息与色素浓度拟合得到的标准曲线及其线性相关性和工作范围。由图17、表6和表7可知，B/R值随着亮蓝浓度在0.001～0.04mg/mL范围内增加而线性增加，R/B值随时日落黄浓度在0.001～0.1mg/mL范围内增加而线性增加，而灰度值随着两种色素在相应浓度范围内增加均线性降低，且颜色信息与色素浓度间的线性关系良好(R²≥0.958)，说明十四中比色卡的颜色梯度与色素的浓度梯度在一定浓度范围内具有良好的对应关系，也说明了颜色信息卡可用于色素浓度的直接对比分析，在浓度交底时也能清楚辨别。

表6基于比色卡色块读出的亮蓝和日落黄在不同浓度下的颜色信息

表7基于颜色信息测得色素的标准曲线及其相关工作参数

S3：基于颜色信息卡的实际饮料样品中色素的裸眼检测

将步骤S1中萃取过实际饮料样品的脲基功能化试纸通过手机APP或计算机程序读出其 RGB/灰度值，结果如表8所示。表8为萃取过亮蓝或日落黄着色饮料后试纸对应的B/R或 R/B值以及灰度值。通过查找表6中的颜色信息并与表8进行简单比对或将表8的颜色信息值通过表7中的线性方程进行计算可知，实际饮料样品中亮蓝的浓度为0.001～0.002mg/mL；日落黄的浓度为0.02～0.04mg/mL。这与裸眼比色分析和HPLC的分析结果吻合，证实了颜色信息用于实际饮料样品中色素浓度范围的半定量直读是可行的。

表8萃取过实际饮料样品后试纸的颜色信息

以上所述仅为本发明的较佳实施例，对本发明而言仅仅是说明性的，而非限制性的。本专业技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效，但都将落入本发明的保护范围内。

Claims

1.一种食品色素的多模裸眼检测数字化颜色信息卡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的一种食品色素的多模裸眼检测数字化颜色信息卡的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中滤纸表面的修饰方式为物理或化学修饰。

3.如权利要求2所述的一种食品色素的多模裸眼检测数字化颜色信息卡的制备方法，其特征在于，所述物理修饰为物理涂覆聚合层，所述化学修饰为化学交联。

4.如权利要求1所述的一种食品色素的多模裸眼检测数字化颜色信息卡的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中特定官能团为能与食品中色素结合的任意一种官能团。

5.如权利要求1所述的一种食品色素的多模裸眼检测数字化颜色信息卡的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中特定官能团氨基、脲基、羧基、磺酸基、杂环、烷基链、饱和/不饱和环烃中的任意一种。

6.如权利要求1所述的一种食品色素的多模裸眼检测数字化颜色信息卡的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中比色卡中每种色素的对比颜色包括16个色块，每一个色块对应相应的色素浓度。

7.如权利要求1所述的一种食品色素的多模裸眼检测数字化颜色信息卡的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中数字化颜色信息包括RGB值、CMYK值、灰度值、饱和度、明/亮度中任意一种颜色信息。

8.如权利要求1所述的一种食品色素的多模裸眼检测数字化颜色信息卡的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中颜色信息读取程序包括计算机程序、手机程序、平板电脑程序中任意一种可解码程序。

9.一种采用如权利要求1～8任一项所述的制备方法制得的食品色素的多模裸眼检测数字化颜色信息卡。

10.一种如权利要求9所述的食品色素的多模裸眼检测数字化颜色信息卡在着色食品中色素的半定量现场即时检测中的应用。