CN115015207A - 食品色素的双模比色检测荧光试纸及其制备方法和应用 - Google Patents

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CN115015207A CN202210837391.7A CN202210837391A CN115015207A CN 115015207 A CN115015207 A CN 115015207A CN 202210837391 A CN202210837391 A CN 202210837391A CN 115015207 A CN115015207 A CN 115015207A
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袁智宏
李梦瑶
卢小媚
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Abstract

本发明公开了一种用于食品色素半定量双模比色分析的荧光试纸及其制备方法和应用，属于固相微萃取技术领域。制备方法包括以下步骤：S1：荧光试纸的制备；S2：比色卡的制作。在步骤S1中，试纸是滤纸表面经荧光试剂改性而成；在步骤S2中，比色卡是S1中试纸吸附不同浓度色素后呈现的表观颜色和在激发光源下产生的荧光颜色分别按照对应色素的浓度梯度排列而成。本发明的荧光试纸对常见食品色素有良好的吸附性能和荧光响应性，吸附色素前后试纸的表观颜色和荧光颜色变化明显，且抗干扰能力强，同时基于表观颜色和荧光颜色的双模式比色分析可显著提高比色准确度和灵敏度。此外，该比色卡制备简单，操作方便，无专业设备和操作技能要求。

Description

食品色素的双模比色检测荧光试纸及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于固相微萃取技术领域，具体地，涉及一种食品色素的双模比色检测荧光试纸及其制备方法和应用。
背景技术
各类加工食品中经常使用人工食品色素(Artificial food colorants,AFCs)来使产品呈现令人愉悦的色泽，同时改善其外观和口感。然而，现有AFCs的合成方法高度依赖于煤焦油或苯、甲苯、萘等芳香化合物的硝化、磺化、偶氮化等有机合成反应，这样制得的AFCs在食品安全和人类健康方面具有明显的潜在危害。大量文献报道AFCs具有强烈的时间和剂量依赖性毒性，超标摄入可能会引起间歇性头痛、荨麻疹、过敏性反应、神经毒性、胎儿致畸甚至致癌等生命健康问题。另外，AFCs的过量摄入对儿童的生长发育也影响极大。因此，定性、定量检测加工食品中的AFCs极具实际意义。
常见的AFCs分析方法主要有分光光度法、电化学分析法、表面增强拉曼散射光谱法、薄层色谱法、毛细管电泳法、高效液相色谱法(HPLC)、质谱法以及色谱-质谱联用等方法，其中HPLC法是国标GB/T5009.35-2003中规定的AFCs首选分析方法。
尽管AFCs的分析方法多种多样，但这些方法的操作步骤繁琐耗时，分析成本和专业技术要求高。更重要的是，所有这些方法都需要特定的仪器设备，属于非便携式分析方法，无法胜任加工食品中AFCs的现场检验。基于裸眼比色分析的AFCs检测方法是解决该问题的可行方案之一。Sun等人[Chen,H.；Chen,M.；Wang,X.；Sun,R.Self-assembledconjugated polymer/carboxymethyl chitosan grafted poly(p-dioxanone)nanomicelles and their use in functionalized indicator paper for fast andvisual detection of a banned food dye.Polym.Chem.,2014,5,4251-4258]合成了羧甲基壳聚糖改性的聚对二氧环己酮纳米胶束，以此对滤纸表面进行修饰制得色素检测荧光试纸。然而，该试纸只能检测违禁食品色素—苏丹Ⅰ，对于其它色素的分析检测却无能为力，故适用面窄，应用有限，且其检测的荧光信号仍依赖于特定仪器设备，并未真正意义上实现便携式裸眼比色分析。Mahanta等人[Majumdar,S.；Saikia,U.；Mahanta,D.Polyaniline-coated filter papers:Cost effective hybrid materials for adsorption ofdyes.J.Eng.Chem.Data,2015,60,3382-3391]制备了聚苯胺物理涂覆的滤纸用于色素吸附，虽然该方法不依赖仪器设备，但所得滤纸的本底颜色干扰十分明显，无法直接用于色素的定量或半定量裸眼比色分析；尽管已有文献报道了基于试纸和移液器吸头的AFCs半定量裸眼检测技术[Wang,S.；Zhang,L.；Jin,Q.；Xu,Z.；Zhao,J.；Ding,Y.；Li,W.；Lin,P.；Gu,J.；Zhang,Q.；Chen,Y.；Chen,H.；Yan,T.Filter paper-based colorimetric analysis:Aninstrument-free strategy for semiquantitative naked-eye detection of foodcolorants.Food Chem.,2022,390,133087；Wang,S.；Li,W.；Yan,Z.；Jin,Q.；Ding,Z.；Liu,X.；Ye,M.；Gu,J.；Yan,T.；Chen,H.；Chen,Y.Semiquantitative naked-eye detection ofsynthetic food colorants using highly-branched pipette tip as an all-in-onedevice.Anal.Chim.Acta,2022,1211,339901]，然而，仅依靠主观比色易使分析结果产生误差。此外，对于吸附能力较弱的试纸和某些着色能力差以及色度不明显的AFCs，仅通过单一比色分析同样难以实现半定量裸眼检测，特别是在浓度相对较低的情况下，这一问题更为显著。为此，本发明提出了一种裸眼检测荧光试纸、制备方法及用于着色食品中AFCs的半定量裸眼双模比色检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种食品色素的双模比色检测荧光试纸及其制备方法和应用，解决现有食品色素检测方法强烈依赖于特定仪器设备而产生的便携性差、步骤繁琐耗时、分析成本和技术要求高等问题，同时也为解决现有单一比色技术准确性不佳等问题。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种食品色素的双模比色检测荧光试纸的制备方法，包括如下步骤：
S1：制备荧光试纸
在滤纸表面修饰荧光试剂和吸附基团，裁剪定形后即得荧光试纸；
S2：制作双模比色卡
准确配制浓度梯度的标准色素样品，用步骤S1中得到的荧光试纸进行吸附，吸附完毕后荧光试纸的表观颜色和激发光源下呈现的荧光颜色即为比色卡双模比色颜色，记录比色卡的颜色并在裁剪定型后根据相应色素的浓度梯度排列制作成双模比色卡，获得双模比色检测荧光试纸。
进一步地，步骤S1中所述滤纸表面的修饰方式包括物理修饰和化学修饰，物理修饰为物理涂覆聚合物层，化学修饰为化学交联。
进一步地，步骤S1中所述荧光试剂为能产生荧光信号的任一试剂或材料。
进一步地，步骤S1中所述荧光试剂为有机荧光染料、荧光量子点、荧光聚合物微球、荧光蛋白中的任意一种。
进一步地，步骤S1中所述吸附基团为能与食品色素结合的任一官能团。
进一步地，步骤S1中所述吸附基团为氨基、脲基、羧基、磺酸基、羟基、无机离子、烷基链、芳环和杂环中的任意一种。
进一步地，步骤S2中双模比色卡中每种色素的对比颜色包括试纸吸附色素后的表观颜色和在特定激发光源下的荧光颜色，每一个色块对应相应的色素浓度。
进一步地，步骤S2中激发光源为专用分析仪器、紫光手电、验钞笔、紫外激光笔、UV固化枪、手持式LED紫外灯、紫外消毒灯、紫外台灯中的任意一种。
本发明还公开了由上述制备方法制得的食品色素荧光试纸在着色食品中色素的半定量目视比色检测中的应用。
所述荧光试纸在基于表观颜色和荧光颜色的单模或双模比色方式下用于食品中色素含量的半定量裸眼检测。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种食品色素荧光试纸的制备方法及其用于着色食品中色素的半定量裸眼双模比色分析，它是基于滤纸表面改性并吸附浓度梯度的标准色素后呈现的表观颜色和荧光颜色梯度制作而成；本发明的双模比色检测荧光试纸对常见食品色素有着良好的吸附性能和荧光响应性，吸附色素前后试纸的表观颜色和荧光颜色变化明显，且抗干扰能力强，同时基于表观颜色和荧光颜色的双模式比色分析可显著提高食品色素的比色准确度和灵敏度；
本发明的双模比色检测荧光试纸在对食品中色素进行分析时，无需依赖于特定仪器设备，并且形成的荧光颜色梯度克服了单一比色技术准确性差的问题，本发明的荧光试纸具有比色灵敏度高、准确性好、适用面广、制备简单、成本低廉、操作方便、便于携带等优点，可用于食品中色素的半定量裸眼检测。
附图说明
图1为本发明的荧光试纸制备路线原理示意图。
图2为本发明的荧光量子点制备路线原理示意图。
图3为本发明的双模比色卡制备路线原理示意图。
图4为不同浓度UPTES改性滤纸吸附几种色素标准样品后的表观颜色(A)和荧光颜色(B)示意图。其中1-6对应的色素分别是亮蓝、日落黄、诱惑红、苋菜红、叶绿素铜钠和赤藓红。图A和B中自上而下对应UPTES的体积分数分别为40％,30％,20％,10％,5％,2.5％和0.5％。
图5是未功能化的裸玻纤滤纸(A,B)和实施例二中制得的20％(v/v)UPTES功能化荧光试纸(C,D)在不同放大倍率下的扫描电镜图。
图6是未功能化的裸玻纤滤纸的能量散射X射线光谱(A)与元素映射分析(B)示意图。
图7是实施例二中制得的20％(v/v)UPTES功能化荧光试纸的能量散射X射线光谱(A)与元素映射分析(B)示意图。
图8为量子点的荧光激发(A)和发射(B)光谱示意图。
图9为5mg/mL QDs掺杂的20％(v/v)UPTES功能化试纸的荧光光谱(A)、328nm激发波长下连续激发60分钟时试纸的荧光稳定性(B)以及同一批次制得15片荧光试纸(C)和10批不同批次荧光试纸(D)的荧光强度。
图10为不同浓度量子点掺杂的20％UPTES功能化试纸的荧光光谱(A)、试纸荧光强度与量子点浓度间的变化关系(B)以及试纸在365nm激发波长下的荧光照片(C/左)和实物照片(C/右)。
图11为以UPTES为单体制得的SiO2纳米粒子(A)及其吸附亮蓝(B)、日落黄(C)和诱惑红(D)后的Zeta电势分布示意图及其定量比较(E)和实物照片(F)。图E中，从左到右分别对应图A-D中材料的Zeta电势；图F中，从左到右分别为SiO2纳米粒子和吸附过诱惑红、日落黄和亮蓝的SiO2纳米粒子。
图12为不同食品添加剂和酒精含量对试纸荧光的影响示意图。其中图12A是试纸吸附过不同食品添加剂后的荧光光谱，图12B是吸附过不同食品添加剂后试纸的荧光强度(B)，图12C是试纸在不同酒精含量溶液中的荧光光谱，图12D是试纸荧光强度与溶液中酒精含量的变化关系。
图13为日落黄(A)、诱惑红(B)和亮蓝(C)的标准样品、着色实际饮料样品及其经试纸萃取后得到的上清液与解吸液的紫外-可见吸收光谱示意图。
图14为实际饮料样品(A,D和G)及其经试纸萃取后的上清液(B,E和H)和解吸液(C,F和I)的高效液相色谱保留示意图。其中图(A-C)是日落黄着色样品；图(D-F)是诱惑红着色样品；图(G-I)是亮蓝着色样品。
图15为荧光试纸吸附0-0.5mg/mL日落黄(A,B)、0-0.2mg/mL诱惑红(D,E)和0-0.06mg/mL亮蓝(G,H)后制得的表观颜色比色卡(A,D,G)和荧光比色卡(B,E,H)以及试纸吸附日落黄(C)、诱惑红(F)和亮蓝(I)着色的实际饮料样品后的双模比色分析。图15C中，左为试纸吸附日落黄着色饮料后的表观颜色(C1)和荧光颜色(C3)右为比色卡A和B中与之颜色最为接近的色块及其对应色素的浓度；图15F中，左为试纸吸附日落黄着色饮料后的表观颜色(F1)和荧光颜色(F3)右为比色卡D和E中与之颜色最为接近的色块及其对应色素的浓度；图15I中，左为试纸吸附日落黄着色饮料后的表观颜色(I1)和荧光颜色(I3)右为比色卡G和H中与之颜色最为接近的色块及其对应色素的浓度。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明中所用的超纯水是指经过美国密理博公司Milli-Q Advantage A10超纯水净化系统得到的水。
实施例一：双模比色卡的制备
S1：荧光试纸的制备
制备路线如图1所示。首先将滤纸分别用超纯水和乙醇清洗干净并干燥，再利用掺杂过荧光试剂的可自聚合化合物在水相或有机相中的自聚合在滤纸表面形成含有荧光试剂和特定官能团的聚合物层，从而得到可用于色素吸附的荧光试纸。该聚合物层在色素的萃取过程中起到了吸附和提供荧光信号的作用，使改性后的滤纸对色素有着高的吸附效率和敏感的荧光响应行为。
S2：双模比色卡的制作
制作过程如图2所示。将步骤S1得到的荧光试纸用于吸附一定浓度的色素标准样品，吸附完成后用水清洗，再按照色素的浓度梯度将吸附过相应浓度色素的试纸进行排列，制成同时具有表观颜色和荧光颜色梯度的双模比色卡。
实施例二：UPTES用量的确定
S1：CdTe荧光量子点(QDs)的制备
制备路线如图2所示。首先将一定量的CdCl2·2.5H2O溶于水中，再加入适量巯基乙酸，然后用NaOH将水溶液调节至～pH 11.0，剧烈搅拌一定时间后加入适量的Na2TeO3水溶液作为碲源，溶液混合均匀后再加入一定量的NaBH4还原剂，最后将混合溶液置于100℃回流适当的时间(通过实时荧光监测来确定)即得到QDs粗产物。反应结束后在体系中加入过量乙醇，静置一定时间即可使QDs形成絮状沉淀，最后通过离心分离并清洗即可得到QDs纯品。
S2：不同浓度脲丙基三乙氧基硅烷(UPTES)功能化荧光试纸的制备
首先将滤纸分别用超纯水和乙醇清洗干净并干燥，再将所得滤纸浸泡于掺杂过5mg/mL QDs的不同浓度UPTES的水溶液中，具体UPTES浓度设置分别为40％,30％,20％,10％,5％,2.5％和0.5％(v/v)。滤纸浸湿后立即取出，置于55℃真空干燥。待纸片干燥后用打孔机将所得滤纸打成直径约为6mm的小圆片，这样就制得不同浓度UPTES功能化的荧光试纸。
S3：UPTES用量的确定
称取等质量的日落黄、亮蓝、苋菜红、赤藓红、诱惑红和叶绿素铜钠标准样品溶于水(pH 7.2～7.4)中，每个色素样品配置成0.1mg/mL溶液。将步骤S2中制得的不同浓度UPTES功能化的荧光试纸在室温下分别对这些色素吸附2小时，其表观颜色和荧光颜色如图4所示。其中图4A是试纸吸附色素后的表观颜色，图4B是试纸吸附色素后的荧光颜色，1～6分别对应色素亮蓝、日落黄、诱惑红、苋菜红、叶绿素铜钠和赤藓红。由图4可以得出以下结论：UPTES用量越大，所得试纸吸附色素的能力越强，表观颜色越深，荧光淬灭越强；然而，当UPTES用量超过20％(v/v)时，试纸的荧光颜色呈现明显的颗粒感，着色均一性变差，而其表观颜色与更高浓度下制得的试纸差异并不显著，故20％(v/v)的UPTES用量为最佳。
实施例三：荧光试纸的结构与形貌分析
将实施例二中制得的最佳UPTES功能化荧光试纸和未功能化的裸玻纤滤纸分别用超纯水和乙醇清洗干净并置于55℃真空干燥，然后用扫描电子显微镜(SEM)分析其微观结构与形貌。所得试纸的SEM照片如图5。由图可知，UPTES聚合物成功地修饰到滤纸表面，且试纸很好地保留了固有的多孔结构。
实施例四：脲基功能化荧光试纸的相对元素含量分析
将实施例二中制得的最佳UPTES功能化荧光试纸和未功能化的裸玻纤滤纸分别用超纯水和乙醇清洗干净并置于55℃真空干燥，然后用能量散射X射线光谱仪(EDX)测定其相对元素含量，结果如图6、图7和表1。其中图6和图7分别是裸玻纤滤纸和UPTES功能化荧光试纸的EDX能谱和元素映射谱结果示意图；表1是裸玻纤滤纸和UPTES功能化荧光试纸的C、N、O、Si四种元素的相对含量。由图6、图7和表1可知，UPTES功能化滤纸的N和Si元素相对含量显著上升，而C和O元素的相对含量大幅下降，证明UPTES修饰是成功的，该结果与SEM表征一致。
表1
Figure BDA0003749168390000091
实施例五：QDs的荧光激发/发射性质考察
分别取实施例二中不同回流时间下得到的QDs溶液200μL冷却至室温，然后分别用96孔微板多功能读数仪测其荧光激发和发射光谱，结果如图8。图7是不同回流时间制得QDs的荧光激发(A)和发射(B)光谱示意图。由图可知，所得QDs具有宽泛的荧光激发波长和窄的荧光发射波长，且随着回流时间的延长，QDs的荧光发射波长大幅红移。
实施例六：试纸的荧光性质考察
将实施例二中制得的5mg/mL QDs掺杂的20％(v/v)UPTES功能化荧光试纸和未功能化的裸玻纤滤纸分别用超纯水和乙醇清洗干净并置于55℃真空干燥，然后用96孔微板多功能读数仪分析其荧光性质，结果如图9。其中图9A为试纸的荧光激发/发射光谱，图9B为试纸在连续60分钟激发光照射下的荧光稳定性结果，图9C是同一批次制得的15张试纸的荧光强度，图9D是不同批次下制得试纸的相对荧光强度。由图可知，QDs成功地掺杂到试纸中，且所得荧光试纸具有极佳的光稳定性和批内/批间荧光重现性。
实施例七：QDs掺杂的量对试纸荧光的影响评价
称取一定质量的实施例二中制得的QDs分散于含20％(v/v)UPTES的水中，配置成一定浓度梯度的预聚液，具体浓度设置为：5.0,3.0,2.0,1.5,1.0,0.5,0.1,0.05和0mg/mL。然后将清洁的滤纸分别浸泡于上述掺杂过不同浓度QDs的UPTES水溶液中，滤纸浸湿后立即取出，置于55℃真空干燥。待纸片干燥后用打孔机将所得滤纸打成直径约为6mm的小圆片，接着用96孔微板多功能读数仪测定所得试纸的荧光光谱并对其荧光照片拍照记录，结果如图10。其中图10A为不同浓度QDs掺杂试纸的荧光发射光谱，图10B为试纸的荧光强度与QDs浓度的关系曲线，图10C为按从左到右QDs浓度依次递增的试纸的荧光照片(左)和实物照片(右)。由图可知，试纸的荧光随着QDs掺杂量的增加而增强。
实施例八：吸附机理考察
S1：脲基功能化二氧化硅纳米粒子(SiO2 NPs)的制备
将UPTES和原硅酸四乙酯(TEOS)溶于适量乙醇中作为先导溶液，然后将含有乙醇适量水和氨水的混合液在剧烈搅拌下缓慢加热至55℃，接着快速加入先导溶液。继续反应50-60分钟后，通过离心收集SiO2 NPs，分别用乙醇和水洗涤两次后再次分散到水中，储存在4℃下备用。
S2：Zeta电势测定
称取一定质量日落黄、亮蓝和诱惑红标准样品分别溶于含有步骤S1中制得SiO2NPs的中性水中，色素和SiO2 NPs的最终浓度分别为1.0和2.0mg/mL。室温下孵育1小时后，离心分离色素结合过的SiO2 NPs并用水洗涤3次，然后将获得的SiO2 NPs重新分散到等体积的水中。用Zeta电位仪测定吸附色素前后SiO2 NPs的Zeta电位，该试验平行测定3次并对最终结果进行加权平均。结果如图11，其中图11A-D分别为脲基功能化SiO2 NPs及其吸附过亮蓝、日落黄和诱惑红后的Zeta电位分布示意图，图11E为上述四种材料Zeta电位的定量比较，图11F从左到右分别是脲基功能化SiO2 NPs及其吸附过诱惑红、日落黄和亮蓝后的实物照片。由图可知，吸附过FCs后SiO2 NPs的Zeta电位显著降低，证明静电相互作用的试纸吸附FCs的主要作用机制。
实施例九：试纸的荧光抗干扰能力评价
准确称取一定质量的食用香精(异戊酸异戊酯)、安赛蜜、甜菊糖苷、DL-苹果酸、磷酸二氢钾、六偏磷酸钠、蔗糖素(三氯蔗糖)、苯甲酸钠、柠檬酸、柠檬酸钠、氯化钠、蔗糖和葡萄糖标准样品你溶于水中，配置成一定浓度的溶液，具体浓度设置如下：安赛蜜0.58mg/mL；甜菊糖苷0.2mg/mL；三氯蔗糖0.25mg/mL；苯甲酸钠1mg/mL；磷酸二氢钾和六偏磷酸钠5mg/mL；异戊酸异戊酯、果葡糖浆、DL-苹果酸、柠檬酸、柠檬酸钠、氯化钠、蔗糖和葡萄糖均为50mg/mL。将实施例二中制得的5mg/mL QDs掺杂的20％(v/v)UPTES功能化荧光试纸分别置于96孔酶标板中，每孔一片，接着每孔中分别添加上述溶液各200μL，平行设置3组复孔，加入中性水的一组为对照，然后置于摇床上室温下温育2小时，每孔中的试纸用水(pH 7.2～7.4)清洗2次后在96孔微板多功能读数仪上测定其荧光。结果如图12，其中图12A是试纸吸附过不同食品添加剂后的荧光光谱，图12B是吸附过不同食品添加剂后试纸的荧光强度(B)，图12C是试纸在不同酒精含量溶液中的荧光光谱，图12D是试纸荧光强度与溶液中酒精含量的变化关系。由图可知，试纸的荧光对酸性食品添加剂较敏感，而对其它食品添加剂具有良好的荧光抗干扰能力。同样地，在酒精含量不高于30％时，试纸的荧光强度无明显下降(ΔI≤13.4％)，而这一酒精含量覆盖市售绝大多数硬饮料的酒精度，说明该试纸可胜任于常见硬饮料中FCs的双模比色分析。
实施例十：分光光度法评价试纸对实际饮料中FCs的原位萃取效果
称取一定质量的日落黄、诱惑红和亮蓝标准样品溶于水(pH 7.2～7.4)中，配置成不同浓度的标准溶液，具体浓度设置为：日落黄和诱惑红为0.02mg/mL，亮蓝为0.001mg/mL。将实施例二中制得的3mg/mL QDs掺杂的20％(v/v)UPTES功能化荧光试纸置于96孔酶标板中，每孔一片，接着每孔中分别添加日落黄着色的实际饮料样品，每孔200μL，平行设置3组复孔，室温下温育2小时后收集上清液，吸附过日落黄着色饮料的试纸用含有60％乙腈的pH＝12.5的氢氧化钠溶液解吸(200μL/孔)，解吸2小时后收集解吸液；将实施例二中制得的2mg/mL QDs掺杂的20％(v/v)UPTES功能化荧光试纸按照上述相同的操作对诱惑红和亮蓝着色的实际饮料样品进行吸附和解吸，分别收集解吸液。接着用紫外-可见分光光度法测定上述各组标准溶液、实际饮料样品溶液及其上清液和解吸液的吸收光谱。结果如图13，由图可知，所有样品都呈现了对应色素的特征吸收峰，且相比于实际饮料样品而言，上清液的吸光度下降明显，而解吸液中日落黄的特征吸收峰清晰可辨，这些结果证实了试纸能很好地从实际饮料样品中萃取到日落黄色素。
实施例十一：高效液相色谱法(HPLC)评价试纸对实际饮料样品中色素的萃取性能
S1：HPLC标准曲线测定
称取不同质量的日落黄、诱惑红和亮蓝标准样品溶于水(pH 7.2～7.4)中，配制成一定浓度梯度的标准溶液，具体浓度设置为：日落黄为0.1,0.05,0.01,0.005,0.001,0.0005和0.0001mg/mL；诱惑红为0.005,0.0025,0.001,0.0005,0.00025,0.0001和0.00005mg/mL；亮蓝为0.05,0.025,0.01,0.005,0.0025,0.001,0.0005,0.00025和0.0001mg/mL。色谱条件：色谱柱Pronaos EP-C18(5μm,4.6×250mm)；柱温：40℃；进样量：20μL；流动相A：甲醇；流动相B：乙酸铵(pH 7.5)；日落黄的梯度洗脱条件：0min：10％A；0-8min：10-25％A；8-15min：25-100％A；15-30min：100-40％A；30-35min：40-10％A；35-50min：10％A，流速为1.0mL/min；亮蓝的梯度洗脱条件：0min：15％A；0-4min：15-30％A；4-11min：30-85％A；11-18min：85-30％A；18-22min：30-15％A；22-50min：15％A，流速为0.4mL/min；诱惑红的梯度洗脱条件：0min：10％A；0-4min：10-30％A；4-11min：30-93％A；11-18min：93-35％A；18-22min：35-10％A；22-50min：10％A，流速为0.6mL/min；检测波长：日落黄、亮蓝和诱惑红分别为480,628和505nm。在上述给定的色谱条件下考察日落黄、亮蓝和诱惑红的色谱保留行为，绘制色谱峰面积与色素浓度间的关系曲线并进行线性拟合，得出线性回归方程、线性相关系数及其工作浓度范围。结果如表2，表2为HPLC法测得日落黄、亮蓝和诱惑红的标准曲线及其线性相关性和工作范围。显然，所有色素标准曲线的线性相关性极好且工作浓度范围宽泛，说明HPLC是一种用于色素定量分析的有效手段。
表2
Figure BDA0003749168390000131
S2：试纸对实际饮料样品中色素吸附性能的定量评价
将实施例十中得到的含有日落黄、亮蓝和诱惑红的实际饮料样品溶液及其上清液和解吸液作为受试物直接色谱进样，在步骤S1中的色谱条件下进行分析并以日落黄标准样品为参照来确定饮料中色素的色谱保留时间。每个样品平行测定3次并对3次色谱峰面积加权平均，再根据步骤S1中的HPLC标准曲线计算实际饮料样品及其上清液和解吸液中色素的含量。色谱保留结果如图14，测得各样品中色素的含量如表3。图14(A,D和G)分别为日落黄、诱惑红和亮蓝着色实际饮料样品的HPLC保留结果，图14(B,E和H)分别为日落黄、诱惑红和亮蓝着色实际饮料样品经试纸萃取后的上清液的HPLC保留结果，图14(C,F和I)分别为试纸萃取日落黄、诱惑红和亮蓝着色饮料样品后的两次解吸液的HPLC保留结果。显然，三种饮料中色素的添加量均在国家限用标准内，且试纸能有效地萃取到三种实际饮料样品中的色素，萃取效率均在50％以上(由于一次解吸不完全，故萃取效率通过从实际饮料样品中扣除上清液中剩余日落黄的含量换算得到)。
表3
Figure BDA0003749168390000141
实施例十二：荧光试纸用于实际饮料样品中色素的双模比色分析
S1：双模比色卡的制作
取日落黄、诱惑红和亮蓝着色的实际饮料样品分别调节pH至中性，接着利用实施例二中制得的40％(v/v)UPTES修饰的试纸(Ф25mm)吸附2小时，重复该操作直至样品中检测不到色素的紫外-可见吸收带，以这三种去除过色素的饮料样品为溶剂。然后称取一定质量的日落黄、诱惑红和亮蓝标准品分别溶于相应的溶剂中，配置一系列浓度梯度的溶液，具体浓度梯度设置包括：日落黄为0.5,0.25,0.1,0.08,0.06,0.04,0.02,0.01和0mg/mL；诱惑红为0.2,0.1,0.05,0.01,0.005,0.001,0.0005,0.0001和0mg/mL；亮蓝为0.06,0.04,0.025,0.02,0.01,0.005,0.002,0.001和0mg/mL。室温下，将实施例二中制得的3mg/mL QDs掺杂的20％(v/v)UPTES功能化荧光试纸对日落黄溶液吸附2小时，2mg/mL QDs掺杂的20％(v/v)UPTES功能化荧光试纸对诱惑红和亮蓝溶液分别吸附2小时，所得试纸的表观颜色和荧光颜色如图15A,B,D,E,G和H所示。其中，图15A和B分别是试纸吸附日落黄溶液后的表观颜色和荧光颜色梯度，图15D和E分别是试纸吸附诱惑红溶液后的表观颜色和荧光颜色梯度，图15G和H分别是试纸吸附亮蓝溶液后的表观颜色和荧光颜色梯度。由图可知：试纸在吸附完不同浓度的色素后呈现的表观颜色和荧光颜色梯度与色素的浓度梯度一一对应，色素浓度越高，试纸的表观颜色越明显，而荧光颜色越弱。
S2：实际饮料样品中色素的双模裸眼比色分析
将实施例二中制得的3mg/mL QDs掺杂的20％(v/v)UPTES功能化荧光试纸置于96孔酶标板中，每孔分别加入200μL含日落黄的实际饮料样品溶液，室温下吸附2小时。将实施例二中制得的2mg/mL QDs掺杂的20％(v/v)UPTES功能化荧光试纸按照上述相同的操作对诱惑红和亮蓝着色的实际饮料样品进行吸附。吸附结束后移除上清液，用水(pH 7.2～7.4)清洗滤纸1遍。该吸附实验平行测定3次。将所得滤纸的颜色与步骤S1制得的双模比色卡进行比对，日落黄、诱惑红和亮蓝的比色分析结果分别如图15C,F和I。表观颜色和荧光颜色同步比色测定实际饮料样品中日落黄的浓度均为0.02～0.04mg/mL、诱惑红的浓度均为0.001～0.0005mg/mL、亮蓝的浓度均为0.001～0.002mg/mL。通过与实施例十一中HPLC测得的实际饮料样品中日落黄、诱惑红和亮蓝的浓度进行比较，两者结果基本一致，故可做出如下结论：本发明的双模比色卡用于饮料样品中色素含量的半定量可视化检测是可行的。显然，基于表观颜色和荧光颜色的双模比色分析比传统单一颜色比色分析具有更高的可靠性。
以上具体实施方式部分对本发明所涉及的分析方法进行了具体的介绍。应当注意的是，上述介绍仅是为了帮助本领域技术人员更好地理解本发明的方法及思路，而不是对相关内容的限制。在不脱离本发明原理的情况下，本领域技术人员还可以对本发明进行适当的调整或修改，上述调整和修改也应当属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.食品色素的双模比色检测荧光试纸的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：制备荧光试纸
在滤纸表面修饰荧光试剂和吸附基团，裁剪定形后即得荧光试纸；
S2：制作双模比色卡
准确配制浓度梯度的标准色素样品，用步骤S1中得到的荧光试纸进行吸附，吸附完毕后荧光试纸的表观颜色和激发光源下呈现的荧光颜色即为比色卡双模比色颜色，记录比色卡的颜色并在裁剪定型后根据相应色素的浓度梯度排列制作成双模比色卡。
2.根据权利要求1所述的食品色素的双模比色检测荧光试纸的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述滤纸表面的修饰方式包括物理修饰和化学修饰，物理修饰为物理涂覆聚合物层，化学修饰为化学交联。
3.根据权利要求1所述的食品色素的双模比色检测荧光试纸的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述荧光试剂为能产生荧光信号的任一试剂或材料。
4.根据权利要求3所述的食品色素的双模比色检测荧光试纸的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述荧光试剂为有机荧光染料、荧光量子点、荧光聚合物微球、荧光蛋白中的任意一种。
5.根据权利要求1所述的食品色素的双模比色检测荧光试纸的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述吸附基团为能与食品色素结合的任一官能团。
6.根据权利要求5所述的食品色素的双模比色检测荧光试纸的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述吸附基团为氨基、脲基、羧基、磺酸基、羟基、无机离子、烷基链、芳环和杂环中的任意一种。
7.根据权利要求1所述的食品色素的双模比色检测荧光试纸的制备方法，其特征在于，步骤S2中双模比色卡中每种色素的对比颜色包括试纸吸附色素后的表观颜色和在特定激发光源下的荧光颜色，每一个色块对应相应的色素浓度。
8.根据权利要求1-7任一项所述的制备方法制得的用于食品色素目视双模比色检测荧光试纸。
9.根据权利要求8所述的食品色素的双模比色检测荧光试纸在着色食品中色素的半定量目视比色检测中的应用。
10.根据权利要求9所述的食品色素的双模比色检测荧光试纸的应用，其特征在于，所述荧光试纸在基于表观颜色和荧光颜色的单模或双模比色方式下用于食品中色素含量的半定量裸眼检测。
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