CN114752630A

CN114752630A - 一种对甘薯小象甲进行RNAi的方法及装置

Info

Publication number: CN114752630A
Application number: CN202210332499.0A
Authority: CN
Inventors: 滑金锋; 陈天渊; 李慧峰; 黄咏梅; 李彦青; 廖金秀; 银捷; 梁耀文; 马开彪; 张世刚; 王典杰; 陈洪超
Original assignee: Guangxi Zhuang Nationality Autonomous Region Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Guangxi Zhuang Nationality Autonomous Region Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2022-03-31
Filing date: 2022-03-31
Publication date: 2022-07-15
Anticipated expiration: 2042-03-31
Also published as: CN114752630B

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体公开了一种甘薯小象甲RNAi装置，还公开了一种对甘薯小象甲进行RNAi的方法，包括以下步骤：根据靶标基因的序列设计和合成dsRNA；取甘薯小象甲成虫置于的甘薯小象甲RNAi装置中，盖上盒盖；将dsRNA、乙二胺四乙酸与人工饲料混合得到饲喂材料，将饲喂材料通过加样孔加到盒体内底部，盖上孔盖；在25~28℃下饲养7~11d，完成对甘薯小象甲靶基因表达的RNA干扰。本发明的对甘薯小象甲进行RNAi的方法中，采用饲喂法在特定的RNAi装置中对甘薯小象甲进行RNAi，具有干扰效率高、成功率高，有效解决了较小虫体且具有鞘壳注射法进行RNAi死亡率高的问题，为今后进一步防治甘薯小象甲打下了基础。

Description

一种对甘薯小象甲进行RNAi的方法及装置

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种对甘薯小象甲进行RNAi的方法及装置。

背景技术

甘薯小象甲是甘薯上危害最严重的世界性检疫害虫，在我国南方薯区，甘薯小象甲每年可产生数代，并可以在薯块内或野外越冬。由于甘薯小象甲世代重叠，幼虫在薯块内取食，成虫主要在傍晚和夜间活动，天敌少，成虫又具有短暂的迁飞能力，受害薯块有恶臭和苦味，不能食用和饲用，且能导致黑斑病、软腐病等病菌侵染而腐烂霉坏，造成甘薯产量和品质急剧下降，每年损失数百万美元。目前，对甘薯小象甲的应急防治主要以化学防治为主，但化学防治容易导致害虫的抗药性上升、甘薯上有害物质残留、害虫再猖獗及环境污染等问题，而且由于甘薯小象甲取食的隐蔽性等原因，很难取得很好的防治效果。此外化学农药在杀死害虫的同时，也会危及包括天敌在内的非靶标生物，不可避免的会给农田生态系统造成负面影响，导致生态防治功能得不到应有的发挥。因此，调整目前的甘薯小象甲防治策略对于防治甘薯病害具有重要意义。

RNAi (RNA interference)由外源双链RNA(dsRNA)介导的特定同源基因转录后RNA降解过程，是近年来分子生物学领域的一项重大发现。Napoli等向矮牵牛中导入更多拷贝与粉红色色素合成有关的基因导致花朵颜色变成白色或花白色。Guo等(1995)利用正义RNA(sense RNA)和antisenseRNA技术研究秀丽新小杆线虫的par-1基因功能时，发现了基因表达受到抑制的现象。RNAi不仅是研究基因功能的有力工具，同时在害虫防治方面也具有极大潜力。昆虫的RNA干扰方法，目前报道的有注射法、浸泡法、饲喂法等，这些干扰方法各有优缺点，根据不同种昆虫选择合适的dsRNA导入方法是成功实现昆虫RNAi的关键。注射法步骤较为繁琐，容易产生基因敲除的嵌合体模型，而且注射压以及由于注射造成的伤口不可避免地影响到昆虫正常的生理活动给基因功能的分析带来困难；浸泡法只适用于那些容易从溶液中吸收dsRNA的特殊昆虫细胞组织和特定发育阶段的昆虫。饲喂法操作简单方便，容易实现，对昆虫造成的侵害较小，不影响其他基因的表达。目前通过饲喂法进行RNAi广泛应用于各个目昆虫研究，如双翅目、半翅目、膜翅目、鞘翅目、等翅目、鳞翅目和直翅目。而饲喂法也有明显的缺点，存在作用效果慢、效率低等问题，且在卵期和蛹期等昆虫无法取食的时期不能进行。

发明内容

本发明的目的在于一种对甘薯小象甲进行RNAi的方法及装置，克服背景技术中提到的不足与缺陷。

为实现上述目的，本发明提供了一种甘薯小象甲RNAi装置，包括盒体和活动顶盖，所述盒体为底面封闭、顶部开口的中空圆柱体，为遮光体；所述活动顶盖位于所述盒体顶端，所述活动顶盖顶部由纱网构成，所述盒盖顶部设有加样孔、与加样孔匹配的孔盖。

优选的，上述甘薯小象甲RNAi装置中，所述纱网为80-100目，所述加样孔的直径为0.3-0.5cm。

一种对甘薯小象甲进行RNAi的方法，包括以下步骤：

（1）根据靶标基因的序列设计和合成dsRNA；

（2）取甘薯小象甲成虫置于权利要求1所述的甘薯小象甲RNAi装置中，盖上盒盖；

（3）将步骤（1）得到的dsRNA、乙二胺四乙酸与人工饲料混合得到饲喂材料，将饲喂材料通过加样孔加到盒体内底部，盖上孔盖；

（4）饲养7~11天，完成对甘薯小象甲RNA干扰。

优选的，上述对甘薯小象甲进行RNAi的方法中，所述靶标基因为甘薯小象甲几丁质脱乙酰酶1基因(Chitin Deacetylase1 CDA1)基因，所述甘薯小象甲CDA1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

优选的，上述对甘薯小象甲进行RNAi的方法中，所述dsRNA是基于甘薯小象甲CDA1基因设计的dsRNA1、dsRNA2或dsRNA3，所述dsRNA1的特异性片段序列为SEQ ID No.3：GCTCATGATAACGGAGAAT，所述dsRNA2的特异性片段序列为SEQ ID No.4：GCGCAAGATTCTAAAGAGT，所述dsRNA3的特异性片段序列为SEQ ID No.5：GCGACGCTTTCTGCTTAGC。

优选的，上述对甘薯小象甲进行RNAi的方法中，所述饲喂材料中dsRNA的浓度为50μg/mL，乙二胺四乙酸的浓度为20mmol/L。乙二胺四乙酸能够防止dsRNA降解，提高RNA干扰效率。

优选的，上述对甘薯小象甲进行RNAi的方法中，所述步骤（3）中，饲喂材料的加样量为2ml。

优选的，上述对甘薯小象甲进行RNAi的方法中，所述步骤（4）中，持续饲养过程中每天更换饲喂材料，饲养温度为27±1℃。

与现有的技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明的对甘薯小象甲进行RNAi的方法中，通过靶标基因设计合成dsRNA，然后筛选合适的人工饲料与dsRNA混合、并加入乙二胺四乙酸，并对添加浓度进行合理设计，得到作为甘薯小象甲RNAi的饲喂材料，并设计特定的RNAi装置，对甘薯进行甘薯小象甲进行RNAi，具有靶基因表达抑制效率高、成功率高；实验结果表明，选取的3条dsRNAi效率依次达到64%、76%和74%。本发明的方法有效解决了较小虫体且具有鞘壳注射法进行RNAi死亡率高的问题，同时合成的dsRNA能够有效对甘薯小象甲进行RNAi，最终导致甘薯小象甲死亡，为今后进一步防治甘薯小象甲打下了基础。

附图说明

图1为本发明实施例1的甘薯小象甲RNAi装置结构示意图。

图2为本发明实施例2的甘薯小象甲取食饲喂材料后不同时间段内CDA1基因相对表达量。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

以下实施例中的实验生物材料及试剂来源包括：甘薯小象甲（NCBI分类ID:2611543）：采集于广西壮族自治区农科业科学院明阳基地（经 108°02'，北纬22°27'，海拨90 m），在室内人工气候箱内饲养；In vitroTranscription T7 Kit，购自TaKaRa公司；PrimeScript™RT reagent Kitwith gDNA Eraser(Perfect Real Time)，购自TaKaRa公司；TB GreenPremix Ex TaqII（Tli RNaseH Plus），购自TaKaRa公司。

实施例1 甘薯小象甲RNAi装置

如图1所示，一种甘薯小象甲RNAi装置，包括盒体1和活动顶盖2，盒体1为底面封闭、顶部开口的中空圆柱体，为遮光体；活动顶盖2设于盒体1顶端，活动顶盖2顶部由纱网3构成，活动顶盖2设有加样孔4、与加样孔4匹配的孔盖5，本实施例中的甘薯小象甲RNAi装置中盒体为遮光体能对甘薯小象甲进行遮光培养，有利于甘薯小象甲由于避光性爬向底部饲喂材料处，取食饲喂材料，提高干扰效率。

进一步，盒体1直径为8cm，盒体1高为4cm，纱网3目数为80~100目，加样孔直径为0.5cm。

实施例2 对甘薯小象甲进行RNAi的方法

一种对甘薯小象甲进行RNAi的方法，包括以下步骤：

（1）根据靶标基因的序列设计和合成dsRNA：

靶标基因：首先在甘薯小象甲转录组注释文件中克隆几丁质脱乙酰酶基因，然后将该序列在unigene库中进行本地blast找到cds序列，该cds序列名为ChitinDeacetylase1（CDA1），根据该基因序列，用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物进行克隆该基因测序。CDA1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所述，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2；

合成dsRNA，具体步骤如下：

A1. 模板合成，具体步骤如下：

通过siRNA结合位点设计甘薯小象甲CDA1基因序列的保守区域（https://www.genscript.com/tools/sirna-target-finder），设计六对引物（引物序列见表1），合成5'端含有T7启动子的四条单链DNA模板，在带有T7启动子的5’端加上GATCAC六个碱基以促进酶与模板的结合；

表1实验所用dsRNA1、dsRNA2和dsRNA3的引物序列

	Primer Sequences (5’-3’)	SEQ ID No.
			<i>dsRNA1</i>	A-Forward:GATCACTAATACGACTCACTATAGGGGCTCATGATAACGGAGAATTT	SEQ ID No.6
<i>dsRNA1</i>	A-Reverse:AAATTCTCCGTTATCATGAGCCCCTATAGTGAGTCGTATTAGTGATC	SEQ ID No.7
			<i>dsRNA1</i>	B-Forward:AAGCTCATGATAACGGAGAATCCCTATAGTGAGTCGTATTAGTGATC	SEQ ID No.8
<i>dsRNA1</i>	B-Reverse:GATCACTAATACGACTCACTATAGGGATTCTCCGTTATCATGAGCTT	SEQ ID No.9
			<i>dsRNA2</i>	A-Forward:GATCACTAATACGACTCACTATAGGGGCGCAAGATTCTAAAGAGTTT	SEQ ID No.10
<i>dsRNA2</i>	A-Reverse:AAACTCTTTAGAATCTTGCGCCCCTATAGTGAGTCGTATTAGTGATC	SEQ ID No.11
			<i>dsRNA2</i>	B-Forward:AAGCGCAAGATTCTAAAGAGTCCCTATAGTGAGTCGTATTAGTGATC	SEQ ID No.12
<i>dsRNA2</i>	B-Reverse:GATCACTAATACGACTCACTATAGGGACTCTTTAGAATCTTGCGCTT	SEQ ID No.13
			<i>dsRNA3</i>	A-Forward: GATCACTAATACGACTCACTATAGGGGCGACGCTTTCTGCTTAGCTT	SEQ ID No.14
<i>dsRNA3</i>	A-Reverse:AAGCTAAGCAGAAAGCGTCGCCCCTATAGTGAGTCGTATTAGTGATC	SEQ ID No.15
			<i>dsRNA3</i>	B-Forward:AAGCGACGCTTTCTGCTTAGCCCCTATAGTGAGTCGTATTAGTGATC	SEQ ID No.16
<i>dsRNA3</i>	B-Reverse:GATCACTAATACGACTCACTATAGGGGCTAAGCAGAAAGCGTCGCTT	SEQ ID No.17
			<i>GFP</i>	A-Forward:GATCACTAATACGACTCACTATAGGGGCCACAACGTCTATATCATTT	SEQ ID No.18
<i>GFP</i>	A-Reverse:AAATGATATAGACGTTGTGGCCCCTATAGTGAGTCGTATTAGTGATC	SEQ ID No.19
			<i>GFP</i>	B-Forward:AAGCCACAACGTCTATATCATCCCTATAGTGAGTCGTATTAGTGATC	SEQ ID No.20
<i>GFP </i>	B-Reverse:GATCACTAATACGACTCACTATAGGGATGATATAGACGTTGTGGCTT	SEQ ID No.21
			<i>Cforβ-actin</i>	Forward: CGTCACAAACTGGGATGACA	SEQ ID No.22
<i>Cforβ-actin</i>	Reverse: GAGCTTCGGTCAAAAGAACG	SEQ ID No.23

在200μL的离心管中配制退火体系合成两个转录模板：RNase-free dH₂O 14.0μL、OligonucleotidesA1(或B1)（100μmol/L）、OligonucleotidesA2(或B2) （100μmol/L）和10×Annealing Buffer各2.0 μL；

在PCR仪中进行如下退火程序：95℃2min、95-22℃0.1℃/sec和22℃10min;

A2. dsRNA转录，具体步骤如下：

配置转录反应体系如下：NTP Mix8.0μL、10×Transcription Buffer 和T7Enzyme Mix各 2.0μL、DNA模板1和DNA模板2各2μL、RNase-free dH₂O 6.0μL；

加样后轻轻吹打混匀，并将离心管短暂离心于管底，在PCR仪中37℃反应2h；

A3. 转录产物进行双酶消化，具体步骤如下：

用 RNase T1 Dilution Buffer 将100U/μL RNase T1稀释成10U/μL；

配制双酶消化体系如下：Transcription Product20.0μL、RNase-free dH₂O17.0μL、DNase I1.0μL和RNase T1(10U/μL) 2.0μL；

加样后轻轻吹打混匀，并将离心管短暂离心于管底，37℃孵育30min；

A4. 用如下步骤对dsRNA产物进行纯化：

将 RNA Clean Beads从4℃取出，室温放置平衡30min；使用前请颠倒混匀；

向转录产物中加入80μL的磁珠溶液和200μL的异丙醇，反复吹打使溶液充分混匀；

室温孵育10min，使磁珠与dsRNA充分结合；

将离心管置于磁力架上约5min，待溶液澄清后，小心移除上清液。

保持离心管处于磁力架上，加入200μL新配制的80%乙醇，不要扰动到磁珠，室温孵育30sec，小心移除上清；重复该步骤一次；

打开离心管盖子，干燥磁珠8min；

将离心管从磁力架上取下，加入40μL的RNase-free dH₂O，将管壁上的磁珠吹打下来，充分混匀，并室温孵育3min；

将PCR管置于磁力架上，待溶液澄清后，小心将上清液转移至新的RNase-freeEP管中；

在微量核酸检测仪检测纯化产物的A260吸光值，确定其浓度，并于-20℃保存纯化产物，得到dsRNA1、dsRNA2、dsRNA3；

（2）饲喂材料准备：

B1. 配制人工饲料：

称量饲料以下各组分：琼脂粉80g、甘薯粉160g、干酪素20g、纤维素15g、右旋葡萄糖40g、酵母提取物8g、混合盐2g、蔗糖9g、无水乙醇15g、抗坏血酸1.5g、复合维生素B0.1g、氯化胆碱0.075g、肌醇0.5g、豆甾醇0.75g、对羟基苯甲酸甲酯0.6g、山梨酸钾0.8g、四环素0.2g、ddH₂O 900g。混合盐是由磷酸二氢钾、硫酸镁、磷酸二氢钙、氯化钠、硫酸锰、磷酸铁、氯化锌和硫酸铜组成，它们之间的重量比为271:64:20:2:8:2:1；复合维生素B 由VB1、VB2、VB3、VB5、VB6、VB7、VB9、VB 12组成，它们之间的重量比为125:250：500:500:125:10:125:1；

将称好的琼脂、干酪素、纤维素、复合盐、酵母提取物、蒸馏水或 ddH₂O混匀后高压灭菌121℃，10min；

将称好的抗坏血酸、复合维生素B、氯化胆碱、肌醇、山梨酸钾和四环素一起溶解在5 mL冷却的灭菌水中；

将称好的豆甾醇和对羟基苯甲酸甲酯溶解在无水乙醇中；

将步骤

中所得的混合物冷却到52℃左右，加入步骤

的混合物以及配方中称量的右旋葡萄糖、甘薯粉、蔗糖，搅拌均匀，得半成品饲料；

将半成品饲料放入容器内用保鲜膜密封并用紫外线消毒17min，即得人工饲料，放入4℃的冰箱内，冷藏备用。

B2. 饲喂材料：将获得靶标基因的dsRNA和EDTA同时加入人工饲料中，使其终浓度分别为50μg/mL和20mmol/L，得到饲喂材料；

（3）取甘薯小象甲成虫置于实施例1的经过清洗消毒干燥的甘薯小象甲RNAi装置中，盖上盒盖；

（4）将2ml饲喂材料通过加样孔加到盒体内底部，盖上孔盖；

（5）然后将甘薯小象甲RNAi装置放在在27℃培养箱中饲养11d，饲养期间每天更换饲喂材料，完成对甘薯小象甲RNA干扰。

具体将甘薯小象甲分成五组，每组30头，其中三组分别饲喂混有dsRNA1、dsRNA2、dsRNA3的饲料，其余两组分别饲喂RNase-free dH₂O人工饲料和dsGFP作为对照组，分别饲喂1d、3d、5d、7d、9d和11d后取样检测该基因表达水平。

检测基因表达水平的方法：

将RNAi处理中收取的实验组和对照组样本甘薯小象甲分别提取RNA，并将模板RNA定量在1μg使用PrimeScript™RT reagent Kitwith gDNA Eraser(Perfect Real Time)进行反转录，然后使用试剂盒TB GreenPremix Ex TaqII（Tli RNaseH Plus）进行定量分析，

获得的RNA按照如下步骤进行反转录：

按5×gDNA Eraser Buffer2.0μL、gDNA Eraser 和Total RNA各 1.0μL、RNaseFree dH₂O 6.0μL成分于冰上配制反应混合液，42℃孵育2min，4℃冷却以去除基因组DNA；

在冰上配制反转录反应液组份如下：步骤①的反应液10.0μL、 PrimeScriptRTEnzyme Mix I和RT Primer Mix各1.0μL、5×PrimeScriptBuffer2（for Real Time）和RNase Free dH₂O各4.0μL，待①反应结束后加入，轻柔混匀后立即进行反转录反应：37℃孵育15min，然 85℃5sec反应，结束后进行下一步实验或-20℃放置备用；

使用上述反转录样品为底物，以Cforβ-actin为内参基因（基因序列见表1）；用TB GreenPremix Ex TaqII（Tli RNaseH Plus）（Code No.RR820A/B）试剂进行qRT-PCR，检测CDA1在甘薯小象甲不同时期的相对表达水平；qRT-PCR 各成分体系如下：TBGreenPremix Ex TaqII10.0μL、PCR Forward Primer（10μM）和 PCR Reverse Primer（10μM）各0.8μL、cDNA溶液2.0μL和ddH₂O6.0μL；

两步法qRT-PCR扩增程序：第一步 95℃，30sec预变性；第二步40个循环的变性95℃，5sec；退火：60℃，45sec。溶解曲线程序：95℃，5sec；60℃，1min，95℃/0.5℃；50℃30sec。实验结果使用GraphPad Prism 8及SPSS 20.0软件进行分析。

试验结果：图2为甘薯小象甲取食饲喂材料后不同时间段内CDA1基因相对表达量。如图2所示，在不同时间段内饲喂含有dsGFP-RNA和RNase-free dH₂O人工饲料的甘薯小象甲CDA1相对表达量差异不显著；饲喂喂含有dsRNA1、dsRNA2和dsRNA3人工饲料的甘薯小象甲CDA1基因在9d时间段内其相对表达量明显被沉默，3条dsRNAi效率依次达到64%、76%和74%，同时雌雄虫存活率分别为65.5%，63.6%和67.2%。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

序列表

<110> 广西壮族自治区农业科学院

<120> 一种对甘薯小象甲进行RNAi的方法及装置

<130> 23

<141> 2022-03-31

<160> 23

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1602

<212> DNA

<213> 甘薯小象甲(Cylas formicarius)

<400> 1

atggcgcggg tacgacacgc gctgttcctg ctcctctcga cgatatgttc tcttaccgtt 60

gcccagcagt ctgaggagcc gccaaagaag gaagacagtt tcgaggctga actttgcaaa 120

gacaaagacg ccggtgaatg gtttagattg gtagccggtg aaggtgataa ttgccgtgat 180

gtaatccagt gcacctcttc cggtctgcaa gcgatccgtt gcccggctgg tttgtatttc 240

gatatcgaca agcaaacctg cgactggaaa gattcggtca agaactgcaa gttgaagaac 300

aaagagagaa aagcaaaacc gctactgaac actgacgagc ctatctgcgc cgacggttca 360

ttggcctgcg gcgacggtac ctgtatcgaa cgtgggctgt tctgcaacgg cgacaaagat 420

tgtgccgatg gatctgatga aaacacttgc gatatcgaca atgatccaaa ccgtgccccg 480

ccctgcgacc cggcagtatg caaccttccc gactgcttct gctcggagga cggcaccctg 540

atcccaggca atctccccgc gaaagacatc ccccaaatgg taaccatcac gttcgacgac 600

gccatcaaca acaacaacat cgagctctac aaagagatct tcaacggcaa gcgcaaaaac 660

ccgaacggtt gcgacataaa gtcgacgttc ttcatatcgc acaagtatac caactactcg 720

gccgtgcagg aaatgcacag aaaaggtcac gaaatcgccg tccattccat cacgcacaac 780

gacgacgaaa ggttttggtc aaacgccacc gtcaacgatt gggttaagga gatgggcgga 840

atgagaatta tcaccgagaa attcgccaat atcaccgaca acagcgtcgt cggtgttcgc 900

gcgccgtacc tcagagtcgg gggcaacaac caattcacca tgatggagga agaggctttc 960

ctctacgatt cgacgatcac cgctcccttg aacaaccctc cgttatggcc gtacaccatg 1020

tacttccgta tgcctcacag gtgtcacggt aaccttcaga gttgtccgac gaggtctcac 1080

gccgtctggg aaatggttct gaacgaactg gaccgccgag aagatccgac taacgacgaa 1140

taccttcccg ggtgcgctat ggtcgactcc tgctccaaca ttctgaccgg cgatcagttc 1200

tataactttt tgaaccacaa cttcgaccgg cattacgaag aaaaccgcgc cccgcttggt 1260

ttgtatttcc acgccgcgtg gttgaagaac aacccagagt tcctcgacgc tttcctatac 1320

tggatcgacg agatcctcgc caatcacaac gacgtttact tcgtgacgat gacgcaagtg 1380

attcagtgga tccaaaaccc gaggaccacc acggaggcga agaacttcga accgtggagg 1440

gaaaagtgcg tcgtcgacgg aataccagcc tgctgggtgc cccattcgtg caaactgacg 1500

tcgaaagagg ttcccgggga aactatcaat ctccaaacgt gcgtgagatg tccgaataat 1560

tacccatggg tgaacgaccc gacaggcgac ggtttcttct aa 1602

<210> 2

<211> 533

<212> PRT

<213> 甘薯小象甲(Cylas formicarius)

<400> 2

Met Ala Arg Val Arg His Ala Leu Phe Leu Leu Leu Ser Thr Ile Cys

1 5 10 15

Ser Leu Thr Val Ala Gln Gln Ser Glu Glu Pro Pro Lys Lys Glu Asp

20 25 30

Ser Phe Glu Ala Glu Leu Cys Lys Asp Lys Asp Ala Gly Glu Trp Phe

35 40 45

Arg Leu Val Ala Gly Glu Gly Asp Asn Cys Arg Asp Val Ile Gln Cys

50 55 60

Thr Ser Ser Gly Leu Gln Ala Ile Arg Cys Pro Ala Gly Leu Tyr Phe

65 70 75 80

Asp Ile Asp Lys Gln Thr Cys Asp Trp Lys Asp Ser Val Lys Asn Cys

85 90 95

Lys Leu Lys Asn Lys Glu Arg Lys Ala Lys Pro Leu Leu Asn Thr Asp

100 105 110

Glu Pro Ile Cys Ala Asp Gly Ser Leu Ala Cys Gly Asp Gly Thr Cys

115 120 125

Ile Glu Arg Gly Leu Phe Cys Asn Gly Asp Lys Asp Cys Ala Asp Gly

130 135 140

Ser Asp Glu Asn Thr Cys Asp Ile Asp Asn Asp Pro Asn Arg Ala Pro

145 150 155 160

Pro Cys Asp Pro Ala Val Cys Asn Leu Pro Asp Cys Phe Cys Ser Glu

165 170 175

Asp Gly Thr Leu Ile Pro Gly Asn Leu Pro Ala Lys Asp Ile Pro Gln

180 185 190

Met Val Thr Ile Thr Phe Asp Asp Ala Ile Asn Asn Asn Asn Ile Glu

195 200 205

Leu Tyr Lys Glu Ile Phe Asn Gly Lys Arg Lys Asn Pro Asn Gly Cys

210 215 220

Asp Ile Lys Ser Thr Phe Phe Ile Ser His Lys Tyr Thr Asn Tyr Ser

225 230 235 240

Ala Val Gln Glu Met His Arg Lys Gly His Glu Ile Ala Val His Ser

245 250 255

Ile Thr His Asn Asp Asp Glu Arg Phe Trp Ser Asn Ala Thr Val Asn

260 265 270

Asp Trp Val Lys Glu Met Gly Gly Met Arg Ile Ile Thr Glu Lys Phe

275 280 285

Ala Asn Ile Thr Asp Asn Ser Val Val Gly Val Arg Ala Pro Tyr Leu

290 295 300

Arg Val Gly Gly Asn Asn Gln Phe Thr Met Met Glu Glu Glu Ala Phe

305 310 315 320

Leu Tyr Asp Ser Thr Ile Thr Ala Pro Leu Asn Asn Pro Pro Leu Trp

325 330 335

Pro Tyr Thr Met Tyr Phe Arg Met Pro His Arg Cys His Gly Asn Leu

340 345 350

Gln Ser Cys Pro Thr Arg Ser His Ala Val Trp Glu Met Val Leu Asn

355 360 365

Glu Leu Asp Arg Arg Glu Asp Pro Thr Asn Asp Glu Tyr Leu Pro Gly

370 375 380

Cys Ala Met Val Asp Ser Cys Ser Asn Ile Leu Thr Gly Asp Gln Phe

385 390 395 400

Tyr Asn Phe Leu Asn His Asn Phe Asp Arg His Tyr Glu Glu Asn Arg

405 410 415

Ala Pro Leu Gly Leu Tyr Phe His Ala Ala Trp Leu Lys Asn Asn Pro

420 425 430

Glu Phe Leu Asp Ala Phe Leu Tyr Trp Ile Asp Glu Ile Leu Ala Asn

435 440 445

His Asn Asp Val Tyr Phe Val Thr Met Thr Gln Val Ile Gln Trp Ile

450 455 460

Gln Asn Pro Arg Thr Thr Thr Glu Ala Lys Asn Phe Glu Pro Trp Arg

465 470 475 480

Glu Lys Cys Val Val Asp Gly Ile Pro Ala Cys Trp Val Pro His Ser

485 490 495

Cys Lys Leu Thr Ser Lys Glu Val Pro Gly Glu Thr Ile Asn Leu Gln

500 505 510

Thr Cys Val Arg Cys Pro Asn Asn Tyr Pro Trp Val Asn Asp Pro Thr

515 520 525

Gly Asp Gly Phe Phe

530

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 甘薯小象甲(Cylas formicarius)

<400> 3

gctcatgata acggagaat 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 甘薯小象甲(Cylas formicarius)

<400> 4

gcgcaagatt ctaaagagt 19

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 甘薯小象甲(Cylas formicarius)

<400> 5

gcgacgcttt ctgcttagc 19

<210> 6

<211> 47

<212> DNA

<213> 甘薯小象甲(Cylas formicarius)

<400> 6

gatcactaat acgactcact ataggggctc atgataacgg agaattt 47

<210> 7

<211> 47

<212> DNA

<213> 甘薯小象甲(Cylas formicarius)

<400> 7

aaattctccg ttatcatgag cccctatagt gagtcgtatt agtgatc 47

<210> 8

<211> 47

<212> DNA

<213> 甘薯小象甲(Cylas formicarius)

<400> 8

aagctcatga taacggagaa tccctatagt gagtcgtatt agtgatc 47

<210> 9

<211> 47

<212> DNA

<213> 甘薯小象甲(Cylas formicarius)

<400> 9

gatcactaat acgactcact atagggattc tccgttatca tgagctt 47

<210> 10

<211> 47

<212> DNA

<213> 甘薯小象甲(Cylas formicarius)

<400> 10

gatcactaat acgactcact ataggggcgc aagattctaa agagttt 47

<210> 11

<211> 47

<212> DNA

<213> 甘薯小象甲(Cylas formicarius)

<400> 11

aaactcttta gaatcttgcg cccctatagt gagtcgtatt agtgatc 47

<210> 12

<211> 47

<212> DNA

<213> 甘薯小象甲(Cylas formicarius)

<400> 12

aagcgcaaga ttctaaagag tccctatagt gagtcgtatt agtgatc 47

<210> 13

<211> 47

<212> DNA

<213> 甘薯小象甲(Cylas formicarius)

<400> 13

gatcactaat acgactcact atagggactc tttagaatct tgcgctt 47

<210> 14

<211> 47

<212> DNA

<213> 甘薯小象甲(Cylas formicarius)

<400> 14

gatcactaat acgactcact ataggggcga cgctttctgc ttagctt 47

<210> 15

<211> 47

<212> DNA

<213> 甘薯小象甲(Cylas formicarius)

<400> 15

aagctaagca gaaagcgtcg cccctatagt gagtcgtatt agtgatc 47

<210> 16

<211> 47

<212> DNA

<213> 甘薯小象甲(Cylas formicarius)

<400> 16

aagcgacgct ttctgcttag cccctatagt gagtcgtatt agtgatc 47

<210> 17

<211> 47

<212> DNA

<213> 甘薯小象甲(Cylas formicarius)

<400> 17

gatcactaat acgactcact ataggggcta agcagaaagc gtcgctt 47

<210> 18

<211> 47

<212> DNA

<213> 甘薯小象甲(Cylas formicarius)

<400> 18

gatcactaat acgactcact ataggggcca caacgtctat atcattt 47

<210> 19

<211> 47

<212> DNA

<213> 甘薯小象甲(Cylas formicarius)

<400> 19

aaatgatata gacgttgtgg cccctatagt gagtcgtatt agtgatc 47

<210> 20

<211> 47

<212> DNA

<213> 甘薯小象甲(Cylas formicarius)

<400> 20

aagccacaac gtctatatca tccctatagt gagtcgtatt agtgatc 47

<210> 21

<211> 47

<212> DNA

<213> 甘薯小象甲(Cylas formicarius)

<400> 21

gatcactaat acgactcact atagggatga tatagacgtt gtggctt 47

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 甘薯小象甲(Cylas formicarius)

<400> 22

cgtcacaaac tgggatgaca 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 甘薯小象甲(Cylas formicarius)

<400> 23

gagcttcggt caaaagaacg 20

Claims

1.一种甘薯小象甲RNAi装置，其特征在于，包括盒体和活动顶盖，所述盒体为底面封闭、顶部开口的中空圆柱体，为遮光体；所述活动顶盖位于所述盒体顶端，所述活动顶盖顶部由纱网构成，所述活动顶盖顶部设有加样孔、与加样孔匹配的孔盖。

2.根据权利要求1所述的甘薯小象甲RNAi装置，其特征在于，所述纱网为80-100目，所述加样孔的直径为0.3-0.5cm。

3.一种对甘薯小象甲进行RNAi的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）根据靶标基因的序列设计和合成dsRNA；

（4）持续饲养7~11d，完成对甘薯小象甲RNA干扰。

4. 根据权利要求3所述的对甘薯小象甲进行RNAi的方法，其特征在于，所述靶标基因为甘薯小象甲CDA1基因，所述甘薯小象甲CDA1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

5. 根据权利要求3所述的对甘薯小象甲进行RNAi的方法，其特征在于，所述dsRNA是基于甘薯小象甲CDA1基因设计的dsRNA1、dsRNA2或dsRNA3，所述dsRNA1的特异性片段序列为SEQ ID No.3，所述dsRNA2的特异性片段序列为SEQ ID No.4，所述dsRNA3的特异性片段序列为SEQ ID No.5。

6.根据权利要求3所述的对甘薯小象甲进行RNAi的方法，其特征在于，所述饲喂材料中dsRNA的浓度为50μg/mL，乙二胺四乙酸的浓度为20mmol/L。

7.根据权利要求3所述的对甘薯小象甲进行RNAi的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，饲喂材料的加样量为2ml。

8.根据权利要求3所述的对甘薯小象甲进行RNAi的方法，其特征在于，所述步骤（4）中，持续饲养过程中每天更换饲喂材料，饲养温度为27±1℃。