CN114748421A - 一种载药纳米胶束及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种载药纳米胶束及其制备方法，本发明采用薄膜水化法，制备了一种pH敏感型聚合物聚乙二醇2000‑二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG2000‑DSPE)及其包载二烯丙基二硫和阿霉素的DD/M纳米胶束。与现有技术相比较，本发明利用纳米胶束载体PEG2000‑DSPE构建共包载DADS和DOX制得的DD/M纳米胶束，其DOX和DADS的包封率和载药量较高，粒径均一性、分散性和稳定性好，具有良好的pH响应性体外释药行为，为后续实验奠定了良好的基础，对于正常细胞的毒性低，并且不会导致溶血，具有良好的生物相容性。同时，本发明DD/M纳米胶束对于三种肝癌细胞的体外增殖抑制效果良好，具有明显的时间以及剂量依赖性；能够成功被肝癌细胞摄取，且具有明显的缓释性。

Description

一种载药纳米胶束及其制备方法
技术领域
本发明涉及医药领域，特别涉及一种新型载药纳米胶束，更特别涉及一种载药纳米胶束及其制备方法。
背景技术
随着社会的不断进步和经济水平的快速发展，肿瘤的发病率和死亡率也持续上升，给各国人民造成了实实在在的经济负担。由于癌细胞具有无限的复制潜力、可以战略性地躲避生长抑制信号、重新编程细胞新陈代谢和持续的增殖，使得癌症成为一种死亡率和致残率都很高的疾病，每年都有超过1000 万人死亡。
早期至轻度HCC患者的主要治疗策略是外科治疗，包括肝切除、局部消融和肝移植，而对于晚期HCC患者或不适合手术切除的患者，全身化疗是防止肿瘤进展的重要策略。由于HCC通常潜伏期较长，并且早期缺乏可诊断的特异性症状，导致肝癌患者初诊时多处于中晚期或晚期，而晚期肝癌进展快，恶性程度高，治疗难度大，迫切需要有效的非手术治疗。因此，化疗仍是治疗HCC主要临床途径，被认为是原发性肝细胞癌患者治疗的最佳选择之一。
阿霉素(Doxorubicin，DOX)是一种抗肿瘤谱广、活性强的蒽环类一线化疗药物，作为Ⅱ型拓扑异构酶抑制剂，DOX可通过干扰或阻断细胞的增殖过程促使细胞凋亡，并可作用于肿瘤细胞核DNA与之相互作用抑制大分子生物合成，因其强大的化疗作用而被广泛应用于包括HCC在内的各种实体瘤、血液系统恶性肿瘤以及软组织肿瘤等。DOX作为最有效的抗肝癌药物之一，在肝癌的临床化疗中得到了广泛的应用。然而，与大多数游离小分子药物一样，DOX组织选择性较弱，不能有效定位于肿瘤部位，限制了治疗效果，并造成严重的不良反应。同时，阿霉素治疗癌症患者的疗效受到剂量依赖性毒副作用的限制，包括骨髓抑制和心脏毒性，大剂量可能导致不可逆转的心力衰竭。因此，如何提高肿瘤组织内药物浓度，提高疗效，减少全身毒性反应成为研究热点，建立新型的DOX靶向可控释放给药体系是一项迫切需要完成的任务。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种载药纳米胶束是由盐酸阿霉素、二烯丙基二硫和聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺制得的pH敏感型聚合物聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG2000-DSPE)及其包载二烯丙基二硫和阿霉素的DD/M纳米胶束，其DOX和DADS的包封率和载药量较高，粒径均一性、分散性和稳定性好，以及良好的pH响应性体外释药行为，为后续实验奠定了良好的基础。
有必要地，本发明还提供了上述载药内米胶束的制备方法：本发明的技术内容是：一种载药纳米胶束，其主要成分包括以下成分：
盐酸阿霉素、二烯丙基二硫和聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺。
优选地，所述盐酸阿霉素、二烯丙基二硫和聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的质量比为1：(15-45)：5。
优选地，所述盐酸阿霉素、二烯丙基二硫和聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的质量比为1：(20-40)：5。
优选地，所述盐酸阿霉素、二烯丙基二硫和聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的质量比为1：(25-35)：5。
优选地，所述盐酸阿霉素、二烯丙基二硫和聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的质量比为1：30：5。
一种制备如上所述的载药纳米胶束的制备方法，包括以下步骤：
1)、将盐酸阿霉素溶解在装有适量无水甲醇的烧杯中，随后添加适量的三乙胺，避光搅拌过夜，得到疏水阿霉素混合液；
2)、将二烯丙基二硫溶解在适量正己烷中，得到二烯丙基二硫的正己烷溶液；
3)、按比例将疏水阿霉素混合液、二烯丙基二硫的正己烷溶液与聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺混合，再溶解在氯仿中；
4)、蒸发去除有机溶剂，得到干脂膜；
5)、将干脂膜溶解在PBS缓冲液中，在水浴中水化得到水化溶液，将水化溶液通过过滤膜过滤，去除未包载的阿霉素、二烯丙基二硫，得到负载有盐酸阿霉素和二烯丙基二硫的纳米胶束DD/M。
其中，所述步骤1)中，无水甲醇与盐酸阿霉素的配比关系为1mgDOX： 1mL无水甲醇；所述三乙胺与盐酸阿霉素的质量比为2：1；
所述步骤2)中二烯丙基二硫与正己烷的体积比为1：100。
其中，所述步骤3)中疏水阿霉素混合液、二烯丙基二硫的正己烷溶液与聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺混合后的溶液与氯仿的体积比是8:3。
其中，所述步骤5)中PBS缓冲液的添加量与步骤3)溶解在氯仿后所得溶液的体积比是1：4；
所述PBS缓冲液的浓度是0.1M，规格是500mL/瓶。
其中，所述过滤膜是孔径为0.45μm的聚碳酸酯膜。与现有技术相比较，本发明制得的胶束载体PEG2000-DSPE构建共包载DADS和DOX的DD/M纳米胶束，其DOX和DADS的包封率和载药量较高，粒径均一性、分散性和稳定性好，以及良好的pH响应性体外释药行为，为后续实验奠定了良好的基础。
并通过采用H9C2大鼠心肌细胞、L02人肝正常细胞和HUVEC人脐静脉内皮细胞的细胞毒性实验以及血液相容性评价，说明本发明制得的DD/M纳米溶液体系相较于游离DOX，DD/M纳米胶束对于正常细胞的毒性低，并且不会导致溶血，具有良好的生物相容性。
体外抗肿瘤细胞增殖实验证实，本发明DD/M纳米胶束对于三种肝癌细胞的体外增殖抑制效果良好，具有明显的时间以及剂量依赖性；能够成功被肝癌细胞摄取，且具有明显的缓释性，三种肝癌细胞对于DD/M纳米胶束摄取量随着时间延长而增加。
附图说明
图1为DD/M的颗粒粒径分布图；
图2为DD/M的Zeta电位图；
图3为DOX标准曲线；
图4为DADS标准曲线；
图5为DD/M在PBS缓冲液中的稳定性(n＝3)；
图6为DD/M在不同pH环境下的释药行为(n＝3)；
图7为经DOX和DD/M处理24、48、72h后H9C2(a)、L02(b)、HUVEC (c)的存活率(n＝3,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p＜0.0001)；
图8为DOX与DOX/M(a)和DD/M(b)的溶血率(n＝3，****p<0.0001)；
图9为BSA标准曲线；
图10为DD/M、DOX/M以及DOX的BSA吸附率；
图11为经DD/M处理24、48、72h后BEL-7402(a)、SMMC-7721(b)、 HepG2(c)的存活率；
图12为经DOX和DOX/M分别处理24、48、72h后BEL-7402(a、b、c)、 SMMC-7721(d、e、f)、HepG2(h、i、g)的存活率 (n＝3,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p＜0.0001)；
图13为三种肝癌细胞摄取药物DD/M的荧光强度比较。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
物质来源
Figure BDA0003648544990000041
Figure BDA0003648544990000051
Figure BDA0003648544990000061
本发明具体实施方式所用的仪器
仪器名称 来源
MS105DU精密电子天平 美国METTLER TOLEDO公司
集热式恒温磁力搅拌器 巩义市予华仪器有限责任公司
电热恒温鼓风干燥箱 上海龙跃仪器设备有限公司
超声波清洗机 昆山市超声仪器有限公司
动态光散射纳米粒度分析仪(Nano ZS-9090) 英国Malvern公司
紫外可见分光光度计(UV-1750) 美国PerkinElmer公司
旋转蒸发仪 德国IKA公司
水浴锅 上海力辰邦西仪器科技有限公司
HJ-1磁力搅拌器 金坛市白塔新宝仪器厂
SW-CJ-2D双人单面垂直送风净化工作台 苏州博莱尔净化设备有限公司
CO<sub>2</sub>恒温培养箱 美国Sunnico公司
低温高速离心机 德国Heraeus公司
酶联免疫检测仪 美国Thermo公司
-80℃超低温冷冻储存冰箱 美国Thermo公司
三目倒置显微镜 日本Olympus公司
Moticam Pro显微拍照摄像头 麦克奥迪实业集团公司
KQ5200DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司
Simplicity(UV)超纯水系统 美国Merck millipore公司
HJ-1磁力搅拌器 金坛市白塔新宝仪器厂
SHA-C恒温振荡器 上海力辰邦西仪器科技有限公司
倒置荧光显微镜 美国BioTek公司
其余物质来源市售。
实施例1
纳米胶束的制备
1)将盐酸阿霉素(DOX·HCl)溶解在装有适量无水甲醇(比例为1mgDOX： 1mL无水甲醇)的烧杯中，随后添加适量的三乙胺(三乙胺与盐酸阿霉素的质量比为2：1)，避光搅拌过夜，得到疏水阿霉素(DOX)混合液；
2)、将二烯丙基二硫(DADS)溶解在适量正己烷中，二烯丙基二硫与正己烷的体积比为1：100，得到二烯丙基二硫的正己烷溶液备用；
3)将疏水阿霉素混合液、二烯丙基二硫的正己烷溶液与聚乙二醇2000- 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺混合均匀，其中盐酸阿霉素、二烯丙基二硫和聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的质量比为1:30:5，将疏水阿霉素混合液、二烯丙基二硫的正己烷溶液与聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺混合均匀的混合液(8mL)溶解在3mL氯仿中，然后转移到茄形瓶中；
4)、通过真空旋转蒸发器去除有机溶剂后，在瓶底形成干脂膜；
5)、将干脂膜溶解在2mLPBS缓冲液中，在60℃水浴中水化75分钟，得到的水化溶液通过聚碳酸酯膜(0.45μm孔径)过滤，去除未包载的阿霉素(DOX)、二烯丙基二硫(DADS)，从而得到负载阿霉素(DOX)和二烯丙基二硫(DADS)的DD/M纳米胶束。
DD/M纳米胶束的评价测试
1、DD/M纳米胶束的颗粒粒径及Zeta电位测定
采用移液枪吸取适量实施例1中制备的样品溶液加入干净的石英比色皿中，比色皿的液面高度控制在10mm-15mm之间。采用动态光散射纳米粒度分析仪测定DD/M纳米胶束的平均水合粒径和多分散系数(PDI)。随后吸取适量样品溶液加入干净的Zeta电位比色皿中，液面必须没过两端的电极片，采用纳米粒度仪测定DD/M纳米胶束的Zeta电位。
图1为DD/M纳米胶束的颗粒粒径分布图。当DOX、DADS、PEG2000-DSPE 三者质量比为1：30：5时，采用动态光散射纳米粒度分析仪测定DD/M纳米胶束的平均水合粒径为138.2±1.76nm，PDI约为0.223±0.02，呈正态单峰分布。有理由认为DD/M纳米胶束的粒径较小且分布均匀，能够很好的进行药物递送。
图2为DD/M纳米胶束的Zeta分布图。从图中能够看出DD/M纳米胶束的 Zeta电位约为-27.1mV，DD/M纳米胶束的Zeta电位为负值，从侧面证实了DD/M 纳米胶束的成功包封。
2、包封率与载药量测定
包封率及载药量测定方法
(1)DOX标准曲线的绘制
用电子天平称量适宜DOX粉末，溶解于纯水中，得到澄清的棕红色溶液，在棕色容量瓶中定容作为母液保存。后续取出一部分母液用纯水稀释配制DOX 浓度分别为2μg/mL、4μg/mL、6μg/mL、8μg/mL、10μg/mL的标准溶液备用。在DOX最大吸收波长233nm处采用紫外-可见分光光度计依次测量每个浓度对应的吸光度值，每个浓度平行测量三次，得到的数据取平均值。将整理好的最终数据导入Graphpad Prism 9.0中，横坐标设定为DOX浓度，纵坐标为各浓度所测定出来的吸光度平均值，数据采用线性回归得到DOX的标准曲线以及回归方程。
(2)DADS标准曲线的绘制
将DADS和Tween 80混合至完全溶解(二者比例设定为为1：2)，采用 99％的生理盐水稀释，混匀，作为母液保存。后续取出一部分母液用纯水稀释配制DADS浓度分别为2μg/mL、4μg/mL、6μg/mL、8μg/mL、10μg/mL、 12μg/mL的标准溶液备用。在DADS最大吸收波长225nm处采用紫外-可见分光光度计依次测量每个浓度的吸光度值，每个浓度平行测量三次，得到的数据取平均值。将整理好的最终数据导入Graphpad Prism 9.0中，横坐标设定为DADS浓度，纵坐标为各浓度所测定出来的吸光度平均值，进行线性回归得到DADS的标准曲线和回归方程。
(3)DD/M纳米胶束的包封率及载药量测定
采用紫外-可见分光光度计分别在225nm、233nm处检测DD/M纳米胶束中未包封DOX和DADS的吸光度值。得到的数据代入DOX和DADS标准曲线中，计算出未包封的DOX和DADS的质量。根据以下公式(1)、(2)、(3)、 (4)分别计算DOX以及DADS的包封率和载药量。
Figure BDA0003648544990000081
Figure BDA0003648544990000082
Figure BDA0003648544990000083
Figure BDA0003648544990000084
DD/M纳米胶束包封率与载药量的测定
使用紫外-可见分光光度法描绘DOX的标准曲线。表1中的数据导至 GraphpadPrism 9.0中，进行线性回归得出DOX标准曲线。正如图3所示，得到的线性回归方程是：y＝0.0614x+0.0024，R2＝0.9998。DOX浓度在 2-10μg/mL范围内时，对应的平均吸光度值都处于0.1-0.7之间。这显示得到的DOX标准曲线具有良好的线性关系，产生的误差相对较小。
表1不同浓度的DOX标准溶液对应的平均吸光度值
Concentration(μg/mL) 0 2 4 6 8 10
Absorption 0 0.1237 0.2505 0.3748 0.4949 0.6114
采用紫外-可见分光光度法描绘DADS的标准曲线。表2为不同浓度的DADS 标准溶液对应的平均吸光度值。随后表2中的数据导至Graphpad Prism 9.0 中，进行线性回归得出DADS标准曲线。正如图4所示，得到的线性回归方程为：y＝0.0148x+0.0002，R2＝0.9997。DADS浓度范围在2-12μg/mL时，相应的平均吸光度值都处于在0.02-0.2之间。这表明得到的DADS标准曲线具有良好的线性关系，产生的误差相对较小。
表2不同浓度的DADS标准溶液对应的平均吸光度值
Concentration(μg/mL) 0 2 4 6 8 10 12
Absorption 0 0.0293 0.0605 0.0889 0.1181 0.1505 0.1766
采用紫外-可见分光光度法测量实施例1所制备的DD/M纳米胶束中游离 DOX和DADS的吸光度值。代入图3、4所示的DOX、DADS标准曲线中，计算得出未包载的DOX和DADS量。通过3.2.2章节中的公式(1)、(2)、(3)、(4)计算得出，实施例1制得的DD/M纳米胶束中DOX的包封率和载药量分别为95.50％±0.03％、8.10％±0.05％，DADS的包封率和载药量分别为83.18％±0.12％、7.05％±0.02％。以上数据反映了DD/M胶束体系优异的包封程度，也反映了DD/M纳米胶束的成功构建。
3、DD/M纳米胶束的稳定性测试
本发明采用动态光散射纳米粒度分析仪测定在第1、2、3、4、5、6和7 天的同一时间点时DD/M纳米胶束的平均水合粒径变化趋势，通过此方式来确认纳米体系的放置稳定性。图5为DD/M纳米胶束(DOX：DADS： PEG2000-DSPE＝1:30:5)在PBS缓冲液中的放置稳定性。从图5中可以看出，一周内DD/M纳米胶束的粒径大小并无明显变化。其粒径大小集中在140nm处上下，呈现一条近乎平缓的曲线，证明了实施例1的DD/M纳米胶束具有优异的放置稳定性。
4、DD/M纳米胶束的体外药物释放特性研究
为验证实施例1的DD/M纳米胶束在体内不同环境下的释药行为，并同时检测DD/M的酸敏感性，本发明采用三种不同pH值(5.0、6.8、7.4)的PBS (HCl)缓冲液进行动态透析实验来分析DD/M纳米胶束的体外释药行为。 pH5.0、6.8、7.4PBS(HCl)缓冲液分别模拟了肿瘤酸性微环境、溶酶体环境、正常生理环境这三种条件。图6所示为DD/M纳米胶束在不同pH条件下的释药曲线。在pH7.4条件时下，得到的曲线没有观察到明显的变化，而且在透析72h后也仅仅释放了少于30％的游离DOX。而当pH逐渐降低到6.8、5.0时， DD/M纳米胶束对于DOX的释放增加至43％和75％以上。这种现象的出现是出于 DD/M纳米胶束中PEG-2000-DSPE的酸敏感性，其在酸性介质下，结构中的酯键断裂，导致纳米粒破损至崩解从而释放药物。以上结果表明本发明制得的 DD/M纳米胶束在正常生理条件下能够保持相对稳定状态，但是一进入到肿瘤酸性的环境，就会使DD/M纳米胶束中胶束酯键的水解断裂导致DOX的快速释放。这种pH响应性释药行为不仅能够降低该体系对正常组织结构的毒副作用，也是DD/M纳米胶束在肿瘤微环境中的定点释放的证据之一。
5、DD/M纳米胶束对H9C2、L02和HUVEC细胞存活率的实验
本实验细胞模型为三种正常细胞，分别是H9C2大鼠心肌细胞、L02人正常肝细胞和HUVEC人脐静脉内皮细胞。
三种细胞按下述方法培养：
(1)主要试剂的配制
PBS缓冲液的配制：预先准备好一个2L的烧杯，清洗干净后用纯水充分润洗。取出一包PBS缓冲溶液干粉倒入烧杯中，加超纯水至2L。用烧杯内溶液反复润洗PBS干粉袋，使袋中无残留PBS粉末，使用提前用纯水润洗过的玻璃棒搅拌，直至烧杯内无白色颗粒，PBS干粉完全溶解。随后将配制好的 PBS缓冲液分装于预先泡酸、高压的500mL蓝口瓶中，并再次高压蒸汽灭菌(为避免瓶内液体因受热膨胀导致蓝口瓶炸裂，此处不可拧紧瓶盖)。待温度降至80℃左右时，高压蒸汽灭菌结束，佩戴手套取出蓝口瓶，将其放入操作台紫外灭菌至冷却，冷却后即可拧紧瓶盖，在标签纸上标注配制日期，贴上封口膜后置于4℃冷藏保存。
培养基的配制：将配制细胞用培养液所需的试剂从冰箱取出并带入至无菌细胞实验房，即DMEM高糖培养基、FBS胎牛血清、青链霉素混合液。在所有试剂周围喷洒75％医用酒精进行消毒处理后移入超净台，按照DMEM培养基溶液：胎牛血清：青链霉素混合液等于9:1:0.1的比例进行配制，并分装至提前通过紫外灭菌处理的50mL离心管中，配制好的完全培养基继续用移液枪混匀，即完成培养基的配制，在标签纸上标注配制日期、姓名、溶液名称等信息后，贴上封口膜后置于4℃冷藏保存。培养基影响到后续细胞状态，因此操作全程需要严格控制无菌，在操作过程中需靠近酒精灯火源(控制在酒精灯火焰周围10cm范围内)，手和外界物品进超净台前必须75％医用酒精喷洒或擦拭，每次开启或盖上瓶口均需要过酒精灯外焰灭菌。
MTT溶液的配制：在严格避光的条件下称取MTT粉末若干，在超净台中以经过高压灭菌处理的PBS缓冲液为溶剂进行溶解，混匀后放入超声波清洗器中超声，直至黄色固体粉末充分溶解后取出。喷酒精后移入洁净台中，使用滤膜对MTT溶液进行过滤，以达到除菌的目的，最后即可得到5mg/mL的无菌 MTT溶液，配制好的MTT溶液用标签纸标注配制日期等信息后用封口膜封口，随后放入-20℃冰箱冷冻保存备用，MTT实验前需提前取出，在融化至室温后方可使用。
SDS溶液的配制：由于SDS溶液用于溶解MTT与细胞作用后的甲瓒，此时细胞已经处于死亡状态，无需严格控制无菌。提前准备一个洁净的500mL烧杯和搅拌子，加入200mL纯水后，烧杯放置于磁力搅拌器上，加入SDS粉末 50g，边加边搅拌。经过比例计算后，加入异丙醇25mL和浓盐酸1.754mL，溶解完全后定容至500mL。在标签纸上标注配制日期等信息后室温保存。
(2)细胞培养
细胞实验前准备：在进行细胞实验前需要至少提前三十分钟将实验材料准备好，喷洒酒精后放置于超净台内进行紫外灭菌，例如：酒精灯、一次性防滑聚乙烯手套、记号笔、封口膜、无菌细胞培养瓶、无菌离心管、冻存管、移液枪、经高压蒸汽灭菌处理的tip头、废液缸等。因紫外线穿透能力差，所有材料需要在台面上平铺放置，使得紫外线照射面积尽可能大，同时需要注意中央工作区域不要有物品。铺好后同时开启超净台内部紫外灯和外部无菌细胞实验房的紫外灯，照射时间维持在三十分钟以上，这样处理的目的是保证细胞实验在无菌条件下进行，防止污染。开始实验前关闭紫外，开启超净台通风3分钟以上，将细胞细菌碎片等污染物吹走后即可进行细胞实验。
细胞复苏：预先开启水浴箱并将温度设置为37℃。首先，从-80℃液氮冰箱中取出复苏所需的细胞，立即放入37℃水浴箱中，同时不断轻轻摇动冻存管，保证冻存管内细胞1min内快速融化，解冻时，液面不可超过冻存管面，以防污染。冻存管内尚有冰渣即可用75％医用酒精擦拭冻存管外部，移入无菌操作台内。接着，从冻存管中吸出细胞悬液，混匀并转移至15mL离心管中，随后先慢后快加入提前预热的完全培养基，800rpm离心5min，弃上清液，加入完全培养基重悬下层细胞，轻轻吹打使细胞混匀，吸出细胞悬液转移至培养瓶中，标记细胞名称、人名、日期，放入37℃、5％CO2恒温培养箱中孵育。
细胞换液：复苏12h后，在显微镜下可以观察到大多数细胞已经贴壁生长，具备完整的细胞形态且生长状态良好。同时需要镜下观察有无污染，污染的细胞不可用于后续实验。若发现有杂菌或絮状、团状等污染物，应当立即弃去细胞培养瓶，防止污染培养箱中其他细胞。若视野清晰且无杂质，则可在瓶身表面喷少许酒精后移入超净台进行换液处理，以去除冻存液对细胞的影响。首先，弃去培养瓶内的旧培养基，加入3mL左右的PBS缓冲液反复清洗培养瓶底面三遍，直至未贴壁的死细胞和活细胞产生的代谢物基本清除，清洗过程注意动作轻柔。最后吸弃细胞瓶中残留的PBS缓冲液，加入3mL新鲜的完全培养基，继续放置于37℃、5％CO2恒温培养箱中孵育。
细胞消化与传代：在显微镜在观察到培养瓶中细胞在对数生长末期，其细胞汇合度在90％以上时，即可进行细胞消化与传代。首先，在培养瓶瓶身周围喷少许酒精，移入超净台中。PBS蓝口瓶瓶口旋转过火，旋开瓶盖，盖口向下置于一侧台面，培养瓶瓶口旋转过火，旋开瓶盖，盖口向下置于一侧台面，移液枪吸弃旧液，培养瓶平放，PBS洗3次，吸净余液。吸取0.5mL胰蛋白酶加至细胞瓶中进行消化，迅速铺平培养瓶底并盖紧瓶盖，置于显微镜下观察细胞状态。倒置显微镜下观察发现大量细胞变圆，透亮，细胞间隙明显增大，但未脱离培养瓶底时，立刻吸弃胰酶，加入3mL完全培养基，轻晃平放，终止消化。按照九分法之字型轻柔吹打培养瓶底的每个角落，包括瓶口斜坡处，直至大部分的细胞被吹打至从瓶壁上脱落下来。将细胞瓶中的细胞悬液转移至15mL离心管中，在800rpm下离心5min，离心期间可在细胞培养瓶上标注细胞种类、传代时间、操作者姓名等信息，离心结束后吸弃上清液。随后，往下层细胞中加入新鲜完全培养基，吹打混匀细胞悬液，根据细胞生长特点的不同，按照1：3或者1：4比例进行分瓶传代。最后，平放到CO2恒温培养箱中继续培养孵育。
细胞冻存：取形态学健康、生长状态良好、处于对数生长末期(细胞汇合度在90％以上)、无污染且代数在10代之内的细胞瓶细胞进行冻存。首先将细胞培养瓶中的贴壁细胞制成细胞悬液，该细胞消化步骤操作与注意事项同前。在800rpm下离心5min，弃去上清液。向下层细胞中加入1mL无血清细胞专用冻存液重悬，吹打制成细胞悬液并转移至冻存管中，记号笔写好细胞名、人名、冻存时间并用封口膜封口，直接置于-80℃冰箱保存，如需保种-80℃冰箱过夜后放至液氮长期储存。
采用MTT法检测不同DADS含量的DD/M纳米胶束对H9C2、L02和HUVEC 细胞存活率的检测。
不同DADS含量的DD/M纳米胶束的制备：
按照实施例1的方法分别制备不同比例的纳米溶液DD/M纳米胶束，其中不同之处在于盐酸阿霉素、二烯丙基二硫和聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的质量比分别为1:15:5、1:20:5、1:25:5、1:35:5、1:40:5、1:45:5，制得不同DADS含量的DD/M纳米胶束。
取细胞生长状态良好且细胞汇合度达到90％以上的细胞进行MTT实验，测定经游离DOX和DD/M纳米胶束处理后上述三种正常细胞系的细胞存活率。按照上述细胞消化步骤对细胞瓶中的贴壁细胞进行消化，离心后重悬，制成细胞悬液，再以此前预实验得出的不同细胞株在不同时间段的最佳接种密度接种于96孔细胞培养板，每孔90μl。计数规则如下：在九宫格手动计数板上统计三个不相邻大格的活细胞数，对于压线细胞，数上不数下，数左不数右。细胞团按照一个细胞计，计数(万个/mL)：稀释倍数×(三个大格子细胞数之和/3)。为防止挥发从而导致药物浓度不准，需在96孔板的外周一圈每孔加200μlPBS缓冲液，种板结束后放入CO2恒温培养箱培养约24h直至大部分细胞贴壁生长且状态良好。将待测样品(盐酸阿霉素或不同DADS含量的DD/M 纳米胶束)采用纯水稀释至阿霉素(DOX)的浓度为1μg/mL浓度，此时DD/M 纳米胶束中DADS所对应的浓度分别是15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL、30 μg/mL、35μg/mL、40μg/mL、45μg/mL，分别加入7组孔中，每组5个复孔，每孔加入10μl。未经任何药物处理的细胞和完全培养基分别作为阳性对照和阴性对照。在到达指定时间点(24h)后，将96孔细胞培养板取出，向每孔加入20μLMTT溶液，继续孵育4h。最后，向每孔加入100μlSDS溶液，于培养箱中放置过夜使紫色结晶物完全溶解，次日用酶联免疫检测仪进行吸光度检测，于490nm处记录吸光度A值。根据以下公式(5)计算细胞存活率。各组细胞存活率利用GraphPad Prism9.0处理分析并绘图。
Figure BDA0003648544990000141
图7为经DD/M纳米胶束、盐酸阿霉素处理24h后，三种正常细胞的细胞存活率与浓度之间的关系(图中DD/M表示DD/M纳米胶束的实验数据，DOX表示盐酸阿霉素的实验数据)。结果表明，由于DOX较大的细胞毒性，三种正常细胞的存活率均较低，并且随游离DOX浓度的增高而逐渐降低，存在一定的量效关系。而用DD/M纳米胶束处理的H9C2、L02、HUVEC的细胞存活率明显高于盐酸阿霉素组，具有显著性差异。由此可见，DD/M纳米胶束有效降低了游离DOX对正常细胞的毒性，具有良好的细胞相容性。
6、血溶性实验
DOX-M纳米胶束的构建
1)将盐酸阿霉素(DOX·HCl)溶解在装有适量无水甲醇(比例为1mgDOX： 1mL无水甲醇)的烧杯中，随后添加适量的三乙胺(三乙胺与阿霉素的质量比为2：1)，避光搅拌过夜，得到疏水阿霉素(DOX)混合液；
2)将疏水阿霉素混合液与聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺混合均匀，其中盐酸阿霉素和聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的质量比为1:5，将疏水阿霉素混合液与聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺混合均匀的混合液(2mL)溶解在3mL氯仿中(混合液与氯仿体积比为2：3)，然后转移到茄形瓶中；
4)通过真空旋转蒸发器去除有机溶剂后，在瓶底形成干脂膜；
5)将干脂膜溶解在2mLPBS缓冲液(规格：500mL/瓶)中(干脂膜原液与PBS缓冲液体积比为5：2)，在60℃水浴中水化75分钟，得到的水化溶液通过聚碳酸酯膜(0.45μm孔径)过滤，去除未包载的阿霉素(DOX)，从而得到单负载阿霉素DOX-M纳米胶束。
(1)制备2％红细胞悬液
提前准备好制备红细胞悬液所需的经灭菌处理过的玻璃棒和烧杯。首先，用含肝素钠的真空采血管从健康的新西兰兔耳缘静脉收集适量的静脉血并取 3mL置于烧杯中，手持玻璃棒，按照同一个方向持续搅拌5min，从而得到脱去纤维蛋白原的兔血，以去除纤维蛋白原对本实验的影响。取生理盐水6～9mL 加入上述经脱纤维处理的兔血，同时使用玻璃棒搅拌使烧杯内液体均匀混合，随后放入低温高速离心机以转速4000rpm/min离心15min，离心结束后弃去上清液，底部沉淀即为从血浆中分离出的血红细胞。再次加入适量生理盐水对底部沉淀进行洗涤并继续按照上述要求离心，重复洗涤、离心操作数次，直至上清液变得无色澄清。最后吸取离心管下层的红细胞1mL于50mL容量瓶中，并使用生理盐水定容至刻度，即可得到体积比为2％的红细胞悬液，标注好配制时间、溶液名称姓名等信息后，放入4℃冰箱冷藏备用。
(2)溶血率测定
先采用容量瓶制备预先设置好的一系列等DOX浓度的盐酸阿霉素、DOX-M 纳米胶束和DD/M纳米胶束。用移液枪吸取不同DOX含量的DD/M纳米胶束、 DOX-M纳米胶束和盐酸阿霉素溶液各500μl与上述制备得到的体积比为2％的红细胞悬液500μl分别混合，作为实验组；分别取生理盐水和蒸馏水各500μl 与500μl血红细胞悬液混合均匀，作为阴性对照和阳性对照。所有组别放入 37℃恒温培养箱孵育，孵育3h后，将所有离心管取出，在转速12000rpm/min 下离心15min。离心结束后，使用移液枪在得到的各组样品中小心吸取上清液 100μL加入到96孔板中，每组设5个复孔。最后，放入酶标仪中在波长540nm 下检测各孔的吸光度值。根据以下公式(6)计算溶血率，数据导入至GraphPad Prism 9.0中进行处理分析。
Figure BDA0003648544990000151
图8为盐酸阿霉素、DOX/M纳米胶束(a)和DD/M纳米胶束(b)的溶血率(n＝3，****p<0.0001)，其中图8中DD/M表示DD/M纳米胶束的实验数据， DOX/M表示DOX/M纳米胶束的测试数据，DOX表示盐酸阿霉素的实验数据，由图8可以看出游离DOX、DOX/M纳米胶束和DD/M纳米胶束诱导的溶血现象均呈现出一定的浓度依赖性。然而，不同的是，如图8所示，在DOX浓度为0.1， 1，2，4，8，16和32μg/mL的DOX/M纳米胶束溶液中溶血率分别为0.33％， 0.42％，0.59％，0.81％，1.20％，1.51％和3.14％。也就是说，在所有实验组浓度中，即便在最高DOX浓度下，DOX/M纳米胶束的溶血率仍远低于5％。相比之下，在同样浓度为32μg/mL的游离DOX溶液中，溶血率高达7.35％。如图 8所示，即使在较高浓度下，DD/M纳米胶束溶血率仅为2.04％，依然远低于5％。因此，以上结果表明，包载成胶束的DOX/M纳米胶束、DD/M纳米胶束具有良好的血液相容性，不会引起溶血现象，明显优于游离的小分子DOX，可用于静脉注射给药。
7、蛋白相容性评价
通过利用PBS稀释配制适宜浓度的BSA溶液，将PBS缓冲液作为空白参比，并利用紫外分光光度计在700-200nm的波长范围内进行全波段扫描，确定样品最大吸收波长是在280nm处。
BSA标准曲线的绘制
在BSA的最大吸收波长280nm处测定此前配置好的一系列浓度梯度的BSA 溶液的吸光度值，所测得的数据见表格3。将所测得的吸光度值与其所对应的浓度进行线性回归，如图9所示，即可得到标准曲线方程式为： y＝0.0006x-0.0025,R2＝0.9996。表明BSA溶液在200μg/mL-1200μg/mL的浓度范围内，BSA溶液浓度与其相应的吸光度值之间存在着良好的线性关系。
表3不同浓度的BSA标准溶液对应的平均吸光度值
Concentration(μg/mL) 0 100 200 500 1000 1200
Absorption 0 0.055 0.117 0.297 0.580 0.714
BSA吸附率
图10为DD/M纳米胶束、DOX/M纳米胶束以及盐酸阿霉素的BSA吸附率，图中DD/M表示DD/M纳米胶束的实验数据，DOX/M表示DOX/M纳米胶束的测试数据，DOX表示盐酸阿霉素的实验数据。BSA吸附率是在蛋白层面评价纳米体系生物相容性的一个重要因素，当药物的蛋白吸附率越低，说明在蛋白层面该药物的生物相容性越好。从图10中可以看出，随着时间和浓度的增加，三个实验组的蛋白吸附率均逐渐增加，从这个角度来说，三种药物对BSA的蛋白吸附均具有一定的时间依赖性以及浓度依赖性。但是当达到某一个时间点之后，这一增加的趋势就变得不那么明显，这是因为蛋白吸附是有限度的，达到限度就会慢慢接近饱和。
从图10中可以发现，DOX/M纳米胶束和DD/M纳米胶束的BSA吸附率均远远小于DOX，在6h时，当DOX浓度为0.32μg/mL时，DD/M纳米胶束与DOX/M 纳米胶束的BSA吸附率均在20％左右，而DOX在90％左右。随着浓度的增加，两胶束药物组与游离DOX组之间的差距逐渐增大，在最小浓度时，相差10％左右，而在最大浓度时则达到70％左右，所以浓度越大，纳米胶束体系与游离小分子药物之间的蛋白吸附率差异越明显，也充分证明了制备成DOX胶束体系DD/M纳米胶束在蛋白层面的生物相容性比游离小分子DOX更为优良。
8、MTT法检测不同比例DD/M纳米胶束对肝癌细胞系的增殖抑制情况
取生长状态良好且细胞汇合度达到90％以上的细胞进行MTT法测定不同比例的DD/M纳米胶束和游离DOX对BEL-7402、SMMC-7721和HepG2细胞的增殖抑制情况。MTT法详细操作步骤按照上述“采用MTT法检测不同DADS含量的 DD/M纳米胶束对H9C2、L02和HUVEC细胞存活率的检测”的方法进行。在用三种药物分别孵育上述三种肝癌细胞24h、48h和72h，到达指定的时间点后，将96孔细胞培养板取出，向每孔加入20μLMTT溶液，继续放入CO2恒温培养箱孵育4h。最后，向每孔加入100μlSDS溶液，于培养箱中放置过夜使紫色结晶物完全溶解，次日用酶联免疫检测仪进行吸光度检测，于490nm处记录吸光度值，各组细胞存活率利用GraphPad Prism 9.0处理分析并绘图。
为了评价将DOX与DADS两种药物联用是否具有协同抗肝癌作用，按照文献报道，应用Chou-Talalay法，根据公式(7)计算DOX与DADS联合用药的协同指数(combinationindex,CIX)，当CI＞1表示联合用药具有协同抗肿瘤作用、CI＝1仅仅表示药物之间仅具有加和作用，CI＜1则表示联合用药会产生拮抗的抗肿瘤作用。CI50表示药物的抑制率为50％(即半数抑制浓度)时 DOX与DADS联合用药时的协同指数。
Figure BDA0003648544990000171
其中，(CX)DOX和(CX)DADS分别表示组合药物制剂中DOX和DADS在抑制率为X％时的浓度；(C)DOX和(C)DADS和分别表示单一给药制剂在抑制率为X％时DOX和DADS的浓度。
用MTT法评估了盐酸阿霉素、二烯丙基二硫和聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的质量比1:15:5、1:20:5、1:25:5、1:30:5、1:35:5、1:40:5、 1:45:5七种不同比例的载药胶束分别孵育24h、48h和72h后对BEL-7402、 SMMC-7721和HepG2细胞的体外细胞增殖抑制作用。图11为经DD/M处理24、 48、72h后BEL-7402(a)、SMMC-7721(b)、HepG2(c)的存活率；从图11 中的趋势可以发现，BEL-7402细胞对DD/M纳米胶束最为敏感。虽然BEL-7402、 SMMC-7721和HepG2细胞对DD/M纳米胶束的敏感性不同，但是随DD/M纳米胶束作用时间的延长以及载药胶束浓度的增加，三种肝癌细胞的细胞存活率均逐渐降低，证明延长给药时间和增加药物浓度可以使DD/M纳米胶束更加有效地抑制肝癌细胞的增殖，即DD/M纳米载药胶束的体外抗肿瘤效果具有时间依赖性以及浓度依赖性。在三种肝癌细胞中，与24、48h相比，72h时DD/M各组给药浓度下相应细胞存活率均显著低于24h和48h，说明包载成胶束的纳米药物具有缓释效果。
图12为经盐酸阿霉素(游离阿霉素DOX)和DOX/M纳米胶束分别处理24、 48、72h后BEL-7402(a、b、c)、SMMC-7721(d、e、f)、HepG2(h、i、g) 的存活率，(n＝3,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p＜0.0001)，图12 中DOX/M表示DOX/M纳米胶束的测试数据，DOX表示盐酸阿霉素的实验数据。
经盐酸阿霉素(游离阿霉素DOX)和DOX/M纳米胶束处理后三种肝癌细胞的IC50值拟合结果展示在表4中。可以发现，相较于游离小分子药物DOX，DOX/M 纳米胶束药物抑制肝癌细胞增殖的能力更强。综合比较三种肝癌细胞在不同时间下的IC50值，我们可以得出结论：相较于肝癌细胞SMMC-7721与HepG2，肝癌细胞BEL-7402在三个时间段下都表现得最为敏感，在三个时间段下都拥有最低的IC50值，说明包载成胶束的纳米给药体系对其增殖抑制效果最强。
在拟合了DOX与DADS在游离状态给药时的IC50后，又计算了二者联合用药时的IC50值，并代入公式算得达到细胞生长抑制率为50％时的CI值。结果发现，DOX联合DADS的CI50值均值为0.730。据前文所述，当CI值<1.0表明两药具有协同作用，并且CI值越小表明协同抗肿瘤作用越强。因此可以得出结论：本发明制得的DD/M纳米胶束中阿霉素和二烯丙基二硫具有协同抗瘤作用。
表4游离DOX与DOX/M胶束对BEL-7402、SMMC-7721和HepG2的IC50值
Figure BDA0003648544990000191
图11、图12和表4均表明，DOX属于小分子药物，通过自由扩散的形式进入细胞，这一运输形式的优点是不耗能，效率快，因此可以快速地发挥强烈的抗肿瘤作用。所以随着时间的延长，DOX/M纳米胶束与游离DOX对肝癌细胞的抑制作用才变得越来越明显。然而由于游离小分子DOX不具备靶向性，用药时容易导致全身毒性，而DD/M纳米胶束不仅能发挥药物本身的优势，有效的抑制肿瘤细胞的生长与增殖，而且还具有缓释特性，可在血液循环中维持稳定的血药浓度，减少给药次数，从而减少毒副作用的产生。
9、DD/M纳米胶束的体外靶向性研究：荧光倒置显微镜观察BEL-7402、 SMMC-7721和HepG2细胞对DD/M纳米胶束的摄取情况
取生长状态良好且细胞汇合度达到90％以上的细胞进行免疫荧光成像实验观察BEL-7402、SMMC-7721和HepG2细胞对DD/M纳米胶束的摄取情况。
按上述方法将三种细胞(H9C2大鼠心肌细胞、L02人正常肝细胞和HUVEC 人脐静脉内皮细胞)培养好。
为观察DADS是否会影响细胞对DOX的摄取以及对比观察细胞对游离药物和纳米胶束载药体系的摄取是否不同，设置了DD/M纳米胶束、DOX/M纳米胶束以及盐酸阿霉素三个实验组，以此评估三种细胞对这三种药物的摄取情况。对药物进行稀释并加至24孔细胞培养板内，使得等效DOX终浓度为1μg/mL，将24孔细胞培养板放入CO2恒温培养箱中培养1h、3h、6h。在到达各指定时间点后，取出24孔板，用移液枪吸去旧培养基，使用PBS缓冲溶液将培养孔底面小心清洗两遍。向每孔加入0.2mL多聚甲醛组织固定液固定细胞15min，继续用PBS缓冲液反复清洗两遍，清洗完成后向每孔加入0.5mLDAPI染色液染核10min，注意严格避光。再次用PBS缓冲液反复清洗两遍后，用锡箔纸将 24孔细胞板避光处理。将制备的样品置于倒置荧光显微镜下观察其荧光信号，以此分析细胞对于药物摄取情况，平均荧光强度采用Image J进行处理分析。
通过对荧光拍照结果进行定量分析，所获得的荧光图片经Image J处理分析后，得到的平均荧光强度定量分析数据如表5所示，图13表示在BEL-7402 细胞、SMMC-7721细胞和HepG2细胞中经DD/M纳米胶束孵育1h、3h、6h 荧光强度的变化。可以发现，在各个时间段，使用DD/M纳米胶束孵育时，三种肝癌细胞内红色荧光强度为使用游离DOX孵育时的2至3倍，并且随着药物作用时间的延长，DD/M纳米胶束组测得的平均荧光强度的增加幅度明显高于游离DOX组。此外，三种肝癌细胞在DD/M纳米胶束作用6h后的平均荧光强度均远远高于1h，以上结果说明肝癌细胞对于DD/M纳米胶束的摄取具有缓释特性和时间依赖性，可维持较长一段时间的药物浓度，可以发挥比服用游离DOX更为持久的药效。
表5三种肝癌细胞经DD/M纳米胶束、DOX/M纳米胶束与盐酸阿霉素处理后的平均荧光强度
Figure BDA0003648544990000201
本发明中所有实验均独立进行至少3次，所得数据以平均值±标准差表示。组间比较采用T检验，*p<0.05为差异有统计学意义。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种载药纳米胶束，其特征在于其主要成分包括以下成分：
盐酸阿霉素、二烯丙基二硫和聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺。
2.如权利要求1所述的载药纳米胶束，其特征在于：
所述盐酸阿霉素、二烯丙基二硫和聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的质量比为1：(15-45)：5。
3.如权利要求2所述的载药纳米胶束，其特征在于：
所述盐酸阿霉素、二烯丙基二硫和聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的质量比为1：(20-40)：5。
4.如权利要求3所述的载药纳米胶束，其特征在于：
所述盐酸阿霉素、二烯丙基二硫和聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的质量比为1：(25-35)：5。
5.如权利要求3所述的载药纳米胶束，其特征在于：
所述盐酸阿霉素、二烯丙基二硫和聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的质量比为1：30：5。
6.一种制备如权利要求1-5任一项所述的载药纳米胶束的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)、将盐酸阿霉素溶解在装有适量无水甲醇的烧杯中，随后添加适量的三乙胺，避光搅拌过夜，得到疏水阿霉素混合液；
2)、将二烯丙基二硫溶解在适量正己烷中，得到二烯丙基二硫的正己烷溶液；
3)、按比例将疏水阿霉素混合液、二烯丙基二硫的正己烷溶液与聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺混合，再溶解在氯仿中；
4)、蒸发去除有机溶剂，得到干脂膜；
5)、将干脂膜溶解在PBS缓冲液中，在水浴中水化得到水化溶液，将水化溶液通过过滤膜过滤，去除未包载的阿霉素、二烯丙基二硫，得到负载有盐酸阿霉素和二烯丙基二硫的纳米胶束DD/M。
7.如权利要求6所述的载药纳米胶束的制备方法，其特征在于：
所述步骤1)中，无水甲醇与盐酸阿霉素的配比关系为1mgDOX：1mL无水甲醇；所述三乙胺与盐酸阿霉素的质量比为2：1；
所述步骤2)中二烯丙基二硫与正己烷的体积比为1：100。
8.如权利要求7所述的载药纳米胶束的制备方法，其特征在于：
所述步骤3)中疏水阿霉素混合液、二烯丙基二硫的正己烷溶液与聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺混合后的溶液与氯仿的体积比是8:3。
9.如权利要求8所述的载药纳米胶束的制备方法，其特征在于：
所述步骤5)中PBS缓冲液的添加量与步骤3)溶解在氯仿后所得溶液的体积比是1：4；所述PBS缓冲液的浓度是0.1M。
10.如权利要求9所述的载药纳米胶束的制备方法，其特征在于：
所述过滤膜是孔径为0.45μm的聚碳酸酯膜。
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