CN114736868A - 一种温度响应功能复合物、一种外泌体均相分离纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物样品分离纯化技术领域，具体涉及一种温度响应功能复合物、一种外泌体均相分离纯化方法。本发明提供的温度响应功能复合物，由温度响应单体和外泌体特异性识别单体相互作用得到；所述相互作用包括化学键键合、主客体作用和生物素‑亲和素相互作用中的一种或多种。本发明提供的温度响应功能复合物的外泌体特异性识别单体能够将溶液中的外泌体固定或吸附在温度响应功能复合物上；同时，温度响应单体能够使温度响应功能复合物具有温度响应的溶解‑沉淀特性，通过调节温度响应功能复合物溶液的温度使其溶解或沉淀析出，从而实现外泌体的均相分离纯化。

Description

一种温度响应功能复合物、一种外泌体均相分离纯化方法
技术领域
本发明属于生物样品分离纯化技术领域，具体涉及一种温度响应功能复合物、一种外泌体均相分离纯化方法。
背景技术
外泌体是一类细胞分泌的磷脂双分子层囊泡，直径约30～200nm。外泌体可调节多种细胞功能，包括信号传导、耐药性、免疫反应、癌症进展和转移等。最近，外泌体由于含有疾病特异性蛋白质、核酸、多糖和脂类等生物标志物而备受关注。基于外泌体的液体活检已成为一种无创、灵敏、实时、高特异性和具有成本效益的新型疾病诊断方法。除疾病诊断外，外泌体还可作为治疗工具，用于组织再生、药物输送和癌症治疗。然而，由于现在仍缺乏经济有效的大规模外泌体分离技术，使基于外泌体的临床诊断和治疗仍面临巨大挑战。
目前，常见的外泌体分离纯化技术主要有超速离心法、微流控法、超滤法、免疫亲和法等。超速离心法是最常用的外泌体纯化手段，采用高速离心力将不同尺寸的细胞外囊泡从溶液中沉淀并纯化出来。该方法需要昂贵的仪器且产率低，难以实现规模化外泌体分离纯化。此外，重复高速离心操作还可能破坏外泌体结构的完整性，从而影响外泌体纯度。微流控法基于微纳米制造工艺，结合声波、介电电泳、微流体黏弹性以及其他物理特性进行外泌体的分离。该方法具有所需样本小、检测速度快及检测成本低等优点，但该方法受限于芯片尺寸，难以实现大规模外泌体的分离纯化和制备。超滤离心法采用超滤技术，配合离心，实现外泌体的分离。该方法简单、省时、成本低，且不影响外泌体的生物活性，但小于膜孔的非外泌体成分或其他混杂蛋白也可以通过滤膜，从而导致外泌体纯度不足。此外，外泌体易吸附于膜上，导致产率降低，同时吸附于膜上的外泌体可阻塞过膜孔，使膜的寿命减短，影响分离效率。
免疫亲和法主要是利用特异性抗体标记的磁珠与外泌体表面的蛋白进行特异性结合，实现外泌体的分离。该方法特异性高、易于与下游分析手段相结合。但是该方法需将特异性抗体或与特异性识别外泌体表面蛋白的分子固载于固相上，以实现外泌体与溶液中其他成分的分离。常用的固相有磁珠、金属有机框架材料等。固相材料在外泌体的分离捕获中存在以下不足：(1)外泌体溶液和固相分离体系存在微观不均一性，直接导致其在分离低丰度外泌体时，即使采用相同的富集流程，富集结果也难以重现；(2)存在相界面，外泌体需先从水相转移至固相材料，方可实现分离纯化，亲水性的外泌体易在相转移过程中易发生损失，造成回收率低问题，且易发生非特异性蛋白共吸附。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种温度响应功能复合物、一种外泌体均相分离纯化方法，本发明提供的外泌体均相分离纯化方法利用温度响应功能复合物温度响应特性，实现外泌体的均相分离纯化，回收率高。
本发明提供了一种温度响应功能复合物，由温度响应单体和外泌体特异性识别单体相互作用得到所述相互作用包括化学键键合、主客体作用和生物素-亲和素相互作用中的一种或多种。
优选的，所述相互作用为主客体作用时，所述主客体作用的主体由温度响应单体和主体单体反应得到；所述主客体作用的客体由外泌体特异性识别单体和客体单体反应得到；所述主体单体包括冠醚、葫芦脲、杯芳烃和柱芳烃中的一种或多种；所述客体单体包括偶氮苯和/或金刚烷胺。
优选的，所述化学键包括碳碳键、碳氮键和二硫键中的一种或多种。
优选的，所述温度响应单体具有温度响应官能团，所述温度响应官能团包括烷基取代酰胺基。
优选的，所述外泌体特异性识别单体包括外泌体特异性识别抗体、外泌体特异性识别适配体、外泌体特异性识别金属离子、精氨酸、赖氨酸、多羟基类化合物和外泌体特异性识别膜联蛋白中的一种或多种。
优选的，所述温度响应单体包含聚(N-异丙基丙烯酰胺)和/或聚(N,N-二乙基丙烯酰胺)单元的单体。
优选的，所述温度响应功能复合物的响应温度为0～40℃。
本发明提供了一种外泌体的均相分离纯化方法，包括以下步骤：
在第一温度条件下，将温度响应功能复合物和含有外泌体的生物样品溶液混合进行均相孵育，得到孵育液；所述孵育液中含有捕获有外泌体的温度响应功能复合物，所述温度响应功能复合物为上述技术方案所述温度响应功能复合物；
在第二温度条件下，将捕获有外泌体的温度响应功能复合物从所述孵育液中析出，第一固液分离后得到捕获有外泌体的温度响应功能复合物；
在第三温度条件下，将捕获有外泌体的温度响应功能复合物溶解于清洗液中均相洗涤净化，得到含有净化的捕获有外泌体的温度响应功能复合物的混合液；
在第四温度条件下，将温度响应功能复合物从混合液中析出，第二固液分离后得到净化的捕获有外泌体的温度响应功能复合物；
在第五温度条件下，将所述净化的捕获外泌体的温度响应功能复合物溶解于洗脱液中脱附外泌体，得到含有温度响应功能复合物和外泌体的洗脱液；
在第六温度条件下，将温度响应功能复合物从洗脱液中析出，第三固液分离后得到纯化的外泌体纯化液；
所述第一温度、第三温度和第五温度独立地为0～10℃；所述第二温度比所述第一温度高≥5℃，所述第四温度比所述第三温度高≥5℃，所述第六温度比所述第五温度高≥5℃。
优选的，所述第二温度、第四温度和第六温度独立地为20～40℃。
优选的，所述第一固液分离分离、第二固液分离和第三固液分离为离心分离，所述第一离心分离、第二离心分离和第三离心分离的速度独立地为3000～8000g。
本发明提供了一种温度响应功能复合物，由温度响应单体和外泌体特异性识别单体相互作用得到；所述相互作用包括化学键键合、主客体作用和生物素-亲和素相互作用中的一种或多种。本发明提供的温度响应功能复合物由温度响应单体和外泌体特异性识别单体相互作用得到。其中，外泌体特异性识别单体能够将溶液中的外泌体固定或吸附在温度响应功能复合物上；同时，温度响应单体能够使温度响应功能复合物具有溶解-沉淀温度响应特性，通过调节温度响应功能复合物溶液的温度使其溶解或沉淀析出，从而实现外泌体的均相分离纯化。
本发明提供了一种外泌体的均相分离纯化方法，包括以下步骤：在第一温度条件下，将温度响应功能复合物和含有外泌体的生物样品溶液混合进行均相孵育，得到孵育液；所述孵育液中含有捕获有外泌体的温度响应功能复合物，所述温度响应功能复合物为上述技术方案所述温度响应功能复合物；在第二温度条件下，将捕获有外泌体的温度响应功能复合物从所述孵育液中析出，第一固液分离后得到捕获有外泌体的温度响应功能复合物；在第三温度条件下，将捕获有外泌体的温度响应功能复合物溶解于清洗液中均相洗涤净化，得到含有净化的捕获有外泌体的温度响应功能复合物的混合液；在第四温度条件下，将温度响应功能复合物从混合液中析出，第二固液分离后得到净化的捕获有外泌体的温度响应功能复合物；在第五温度条件下，将捕所述净化的捕获有外泌体的温度响应功能复合物溶解于洗脱液中脱附外泌体，得到含有温度响应功能复合物和外泌体的洗脱液；在第六温度条件下，将温度响应功能复合物从洗脱液中析出，第三固液分离后得到纯化的外泌体纯化液；所述第一温度、第三温度和第五温度独立地为0～10℃；所述第二温度比所述第一温度高≥5℃，所述第四温度比所述第三温度高≥5℃，所述第六温度比所述第五温度高≥5℃。本发明提供的分离纯化方法首先利用温度响应功能复合物与外泌体进行均相孵育捕获外泌体；随后，借助温度响应功能复合物的溶解-沉淀温度响应行为，促使温度响应功能复合物自组装，与捕获的外泌体一起从溶液中析出，再利用温度响应功能复合物的温度响应行为通过均相洗涤净化和均相洗脱得到纯化的外泌体，分离效率高，且分离速度快。
本发明提供的外泌体的均相分离纯化方法能够简单、省时、高效的实现外泌体的高特异性、高回收率、高重复性的大规模分离纯化。该方法步骤简单、易行、成本低廉、条件温和、便于操作，非常适用于生物化学、食品检测、分析化学、检验化学、临床医药等领域中的推广和普及。
附图说明
图1为本发明实施例1中所述方法应用于细胞培养基中外泌体纯化，所得外泌体的透射电镜表征图；
图2为本发明实施例1分离纯化得到的外泌体纯化效率图。
具体实施方式
本发明提供了一种温度响应功能复合物，由温度响应单体和外泌体特异性识别单体相互作用得到；所述相互作用包括化学键键合、主客体作用和生物素-亲和素相互作用中的一种或多种。
在本本发明中，所述温度响应单体具有温度响应官能团，所述温度响应官能团优选包括烷基取代酰胺基。
在本发明中，所述温度响应单体优选包含聚(N-异丙基丙烯酰胺)和/或聚(N,N-二乙基丙烯酰胺)单元的单体，更优选为聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)或聚(N,N-二乙基丙烯酰胺)(PPDEA)。
在本发明中，所述外泌体特异性识别单体优选包括外泌体特异性识别抗体、外泌体特异性识别适配体、外泌体特异性识别金属离子、精氨酸、赖氨酸、多羟基类化合物和外泌体特异性识别膜联蛋白中的一种或多种。
在本发明中，所述外泌体特异性识别单体优选包括膜联蛋白A5、EpCAM适配体、对甲酰苯硼酸、CD63抗体、精氨酸和单宁酸中的一种或多种。
在本发明的具体实施例中，所述外泌体特异性识别单体具体包括膜联蛋白A5、EpCAM适配体、对甲酰苯硼酸、CD63抗体、精氨酸或单宁酸。
在本发明中，所述温度响应单体和特异性识别单体的相互作用形式包括化学键、主客体作用和生物素-亲和素相互作用中的一种或多种。
在本发明中，所述化合键优选包括碳碳键、碳氮键、二硫键中的一种或多种
所述相互作用为主客体作用时，所述主客体作用的主体由温度响应单体和主体单体反应得到；所述主客体作用的客体由外泌体特异性识别单体和客体单体反应得到；所述主体单体优选包括冠醚、葫芦脲、杯芳烃和柱芳烃中的一种或多种；所述客体单体优选包括偶氮苯和/或金刚烷胺。
本发明对所述温度响应功能复合物的具体制备方法没有特殊要求，当所述温度响应功能复合物具体为聚(N-异丙基丙烯酰胺)-膜联蛋白A5温度响应功能复合物、聚(N,N-二乙基丙烯酰胺)-EpCAM温度响应功能复合物、PNIPAM-对甲酰苯硼酸温度响应功能复合物或PNIPAM-CD63温度响应功能复合物时，本发明优选采用下述方法制备。
在本发明中，所述温度响应功能复合物优选包括PNIPAM和膜联蛋白A5以化学键或主客体相互作用得到的复合物，即为：PNIPAM-膜联蛋白A5温度响应功能复合物，所述化学键优选包括氢键和π-π键相互作用。
在本发明的具体实施例中，所述PNIPAM-膜联蛋白A5温度响应功能复合物的制备方法优选包括以下步骤：
首先，在氮气气氛下，取N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)(10mmol)溶在10mL无水四氢呋喃中，加入偶氮二异丁腈(AIBN)(0.1mmol)，60℃下进行自由基聚合12h，加入甲醇进行沉降，离心，乙醚洗去未聚合单体，真空烘箱干燥，得到温度响应聚合物PNIPAM。取110mgPNIPAM与100mg的戊二醛在二氯甲烷进行缩合反应12h后，12h后加入甲醇进行沉降，离心得到功能化的PNIPAM。随后，取100mg功能化的PNIPAM溶于1mL PBS缓冲液中，加入10mg膜联蛋白A5于4℃下反应2h，然后调节溶液的温度至37℃，3000g/min离心10min，即得PNIPAM-膜联蛋白A5温度响应功能复合物。
在本发明中，所述温度响应功能复合物优选包括均PPDEA和EpCAM适配体以二硫键相互作用得到的复合物，即为PPDEA--EpCAM温度响应功能复合物。
在本发明的具体实施例中，所述PPDEA--EpCAM温度响应功能复合物的制备方法优选包括以下步骤：
首先，在氮气气氛下，取聚(N,N-二乙基丙烯酰胺)(PDEA)(10mmol)溶在10mL无水四氢呋喃中，加入偶氮二异丁腈(AIBN)(0.1mmol)，60℃下进行自由基聚合12h，加入甲醇进行沉降，离心，乙醚洗去未聚合单体，真空烘箱干燥，得到温度响应聚合物PPDEA。取130mgPPDEA、130mg磺基-NHS和148mg EDC于4℃下活化1h。将NHS激活后的PPDEA，加入5mg链霉亲和素于4℃下反应24h。加入1mg生物素-二硫键-EpCAM适配体于4℃下反应4h，然后调节溶液的温度至37℃，3000g/min离心10min。即得PPDEA--EpCAM温度响应功能复合物。
在本发明的具体实施例中，所述PNIPAM-对甲酰苯硼酸温度响应功能复合物的制备方法优选包括以下步骤：
首先，在氮气气氛下，取N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)(10mmol)溶在10mL无水四氢呋喃中，加入偶氮二异丁腈(AIBN)(0.1mmol)，60℃下进行自由基聚合12h，加入甲醇进行沉降，离心，乙醚洗去未聚合单体，真空烘箱干燥，得到温度响应聚合物PNIPAM。取110mgPNIPAM与150mg的对甲酰苯硼酸在1mLPBS缓冲液中，于4℃下反应2h，然后调节溶液的温度至37℃，3000g/min离心10min，即得PNIPAM-对甲酰苯硼酸温度响应功能复合物。
在本发明中，所述温度响应功能复合物优选包括PNIPAM和精氨酸以二硫键相互作用得到的复合物。
在本发明中，所述温度响应功能复合物优选包括PNIPAM和单宁酸以生物素-亲和素相互作用得到的复合物。
在本发明中，所述温度响应功能复合物优选包括PNIPAM和CD63抗体以金刚烷胺与葫芦[6]脲主客体相互作用得到的复合物即为：PNIPAM-CD63温度响应功能复合物。
在本发明的具体实施例中，所述PNIPAM-CD63温度响应功能复合物的制备方法优选包括以下步骤：
取6-N-丙烯酰胺基已酸(10mmol)和三乙胺(1.39mL)溶在10mL无水四氢呋喃中，冰浴冷却至0℃，加入氯甲酸乙酯(10mmol),反应40分钟后加入金刚烷胺(10mmol)，在0℃反应2h后，室温下继续搅拌反应16h,加入N-异丙基丙烯酰胺(10mmol)，加入偶氮二异丁腈(AIBN)(0.1mmol)，60℃下进行自由基聚合12h，加入甲醇进行沉降，离心，乙醚洗去未聚合单体，真空烘箱干燥，得到PNIPAM-金刚烷温度响应聚合物。取110mg PNIPAM-金刚烷聚合物溶于1mL PBS缓冲液中，加入5mg葫芦[6]脲偶联CD63抗体于4℃下反应2h，然后调节溶液的温度至37℃，3000g/min离心10min，即得PNIPAM-CD63温度响应功能复合物。
在本发明中，所述温度响应功能复合物的响应温度优选为0～40℃。
在本发明中，所述温度响应功能复合物具有溶解-沉淀温度响应特性。
在本发明中，所述温度响应功能复合物通过溶液自组装的方式制备得到，所述自组装时的相互作用力优选为氢键、π-π相互作用和主客体相互作用。在本发明中，所述温度响应功能复合物通过亲核取代反应、加成反应形成相应共价键制备，所述共建键优选为二硫键和/或碳氮键；以及生物素-亲和素相互作用制备而得。
本发明提供了一种外泌体的均相分离纯化方法，包括以下步骤：
在第一温度条件下，将温度响应功能复合物和含有外泌体的生物样品溶液混合进行均相孵育，得到孵育液；所述孵育液中含有捕获有外泌体的温度响应功能复合物，所述温度响应功能复合物为上述技术方案所述温度响应功能复合物；
在第二温度条件下，将所述捕获有外泌体的温度响应功能复合物从所述孵育液中析出，第一固液分离后得到捕获外泌体的温度响应功能复合物；
在第三温度条件下，将捕获有外泌体的温度响应功能复合物溶解于清洗液中均相洗涤净化，得到含有净化的捕获有外泌体的温度响应功能复合物的混合液；
在第四温度条件下，将温度响应功能复合物从混合液中析出，第二固液分离后得到净化的捕获有外泌体的温度响应功能复合物；
在第五温度条件下，将所述净化的捕获有外泌体的温度响应功能复合物溶解于洗脱液中脱附外泌体，得到含有温度响应功能复合物和外泌体的洗脱液；
在第六温度条件下，将温度响应功能复合物从洗脱液中析出，第三固液分离后得到纯化的外泌体纯化液；
所述第一温度、第三温度和第五温度独立地为0～10℃；所述第二温度比所述第一温度高≥5℃，所述第四温度比所述第三温度高≥5℃，所述第六温度比所述第五温度高≥5℃。
本发明在第一温度条件下，将温度响应功能复合物和含有外泌体的生物样品溶液混合进行均相孵育，得到孵育液；所述孵育液中含有捕获有外泌体的温度响应功能复合物，所述温度响应功能复合物为上述技术方案所述温度响应功能复合物。
在本发明中，所述第一温度优选为3～5℃。
在本发明中，所述温度响应功能复合物以温度响应功能复合物水溶液的形式应用，在本发明中，所述温度响应功能复合物水溶液的质量浓度优选为10～20mg/mL。
本发明对所述含有外泌体的生物样品溶液的来源和质量浓度没有特殊要求。
在本发明中，所述均相孵育的保温时间优选为1～2h。
在本发明中，所述均相孵育优选在振摇条件下进行。
得到孵育液后，本发明在第二温度条件下，将所述捕获有外泌体的温度响应功能复合物从所述孵育液中析出，第一固液分离后得到捕获外泌体的温度响应功能复合物。
在本发明中，所述第二温度优选为20～40℃，更优选为35～38℃，最优选为37℃。
在本发明中，所述第一固液分离的温度优选为20～40℃，更优选为35～38℃，最优选为37℃。
在本发明中，所述第一固液分离优选为离心分离，所述离心分离的速度优选为3000～8000g，更优选为3500～7000g。
在本发明中，所述第一固液分离的时间优选为10～15min。
得到捕获有外泌体的温度响应功能复合物后，本发明在在第三温度条件下，将捕获有外泌体的温度响应功能复合物溶解于清洗液中均相洗涤净化，得到含有净化的捕获有外泌体的温度响应功能复合物的混合液。
在本发明的具体实施例中，所述清洗液具体优选为PBS缓冲液。
在本发明中，所述第三温度优选为3～5℃。
得到混合液后，本发明在第四温度条件下，将温度响应功能复合物从混合液中析出，第二固液分离后得到净化的捕获有外泌体的温度响应功能复合物。
在本发明中，所述第四温度优选为20～40℃，更优选为35～38℃，最优选为37℃。
在本发明中，所述第二固液分离的温度优选为20～40℃，更优选为35～38℃，最优选为37℃。
在本发明中，所述第二固液分离优选为离心分离，所述离心分离的速度优选为3000～8000g，更优选为3500～7000g。
在本发明中，所述第二固液分离的时间优选为10～15min。
本发明通过均相洗涤去除初始洗脱液中的非特异性吸附蛋白。
本发明优选进行上述均相洗涤3～5次。
得到净化的捕获有外泌体的温度响应功能复合物后，本发明在第五温度条件下，将所述净化的捕获有外泌体的温度响应功能复合物溶解于洗脱液中脱附外泌体，得到含有温度响应功能复合物和外泌体的洗脱液。
在本发明的具体实施例中，所述洗脱液可为乙二胺四乙酸水溶液(EDTA水溶液)、二硫苏糖醇水溶液(DTT水溶溶液)、环糊精、PBS缓冲液中的一种或多种。
在本发明的具体实施中，所述洗脱液的质量浓度具体优选为20mmol/L。
在本发明中，所述第五温度优选为3～5℃。
在本发明中，所述脱附外泌体的保温时间优选为1～2h。
得到洗脱液后，本发明在第六温度条件下，将温度响应功能复合物从洗脱液中析出，第三固液分离后得到纯化的外泌体纯化液。
在本发明中，所述第六温度优选为20～40℃，更优选为35～38℃，最优选为37℃。
在本发明中，所述第三固液分离的温度优选为20～40℃，更优选为35～38℃，最优选为37℃。
在本发明中，所述第三固液分离优选为离心分离，所述离心分离的速度优选为3000～8000g，更优选为3500～7000g。
在本发明中，所述第三固液分离的时间优选为10～15min。
本发明通过均相洗脱去除温度响应功能复合物得到外泌体纯化液。
本发明提供外泌体的均相分离纯化方法利用温度响应功能复合物特异性识别外泌体在均相中实现外泌体的分离纯化。本方法提供的外泌体分离纯化方法能够在均一溶液中完成外泌体的捕获、清洗、洗脱，能够简单、省时、高效的实现外泌体的高特异性、高回收率、高重复性的大规模分离纯化。
本发明提供的分离纯化方法步骤简单、易行、成本低廉、条件温和、便于操作，非常适用于生物化学、食品检测、分析化学、检验化学、临床医药等领域中的推广和普及。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
以N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)为制备温度响应单体的原料，以膜联蛋白A5为特异性识别单体，以戊二醛为化学键合试剂将NIPAM与膜联蛋白A5进行化学键合，制备温度响应功能复合物，应用于外泌体的分离纯化。
以N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)为温度响应单体，以膜联蛋白A5为特异性识别单体。首先，在氮气气氛下，取N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)(10mmol)溶在10mL无水四氢呋喃中，加入偶氮二异丁腈(AIBN)(0.1mmol)，60℃下进行自由基聚合12h，加入甲醇进行沉降，离心，乙醚洗去未聚合单体，真空烘箱干燥，得到温度响应聚合物PNIPAM。取110mg PNIPAM与100mg的戊二醛在二氯甲烷进行缩合反应12h后，12h后加入甲醇进行沉降，离心得到功能化的PNIPAM。随后，取100mg官能化的PNIPAM溶于1mL PBS缓冲液中，加入10mg膜联蛋白A5于4℃下反应2h，然后调节溶液的温度至37℃，3000g/min离心10min，即得PNIPAM-膜联蛋白A5温度响应功能复合物。
取5mL人乳腺癌细胞MCF-7细胞培养基(4℃)，加入200μL含Ca2+溶液(2.5mM)，加入1mL PNIPAM-膜联蛋白A5温度响应功能复合物水溶液(10～20mg/mL，4℃)，混合后于4℃下温和振摇1h，实现外泌体的均相捕获。然后调节溶液的温度至37℃，3000g/min离心10min，离心温度37℃，去除上清液，得到捕获外泌体的温度响应功能复合物沉淀。向沉淀中加入500μL的PBS缓冲液(4℃)，使沉淀溶解，均相下清洗，去除非特异性吸附蛋白，调节溶液的温度至37℃，3000g/min离心10min，离心温度37℃，去除上清液，得到清洗后的沉淀。重复该洗涤步骤3次，得到净化的捕获外泌体的温度响应功能复合物沉淀。在净化的捕获有外泌体的沉淀中加入200μL 20mmol/L的EDTA，使沉淀溶解，于4℃孵育1h，均相条件下洗脱外泌体。调节溶液的温度至37℃，PNIPAM-膜联蛋白A5温度响应功能复合物沉淀析出，离心取含有纯化后外泌体的上清液，4℃保存备用。
PNIPAM-膜联蛋白A5温度响应功能复合物所捕获外泌体的电镜图如图1所示，其对外泌体的纯化效率如图2所示。由图1可以看出，所捕获的外泌体呈杯状结构，其粒径约为100nm。由图2可以看出，本实施例提供的分离纯化方法可15min内达到捕获平衡，捕获效率85％以上。
实施例2
以N,N-二乙基丙烯酰胺(PDEA)为原料，采用自由基聚合的方式得到均聚N,N-二乙基丙烯酰胺(PPDEA)，以PPDEA为制备温度响应单体的原料，以EpCAM适配体作为特异性识别单体，利用生物素-亲和素将PPDEA与EpCAM适配体相连接，制备温度响应功能复合物，应用于外泌体的分离纯化。
在氮气气氛下，取N,N-二乙基丙烯酰胺(PDEA)(10mmol)溶在10mL无水四氢呋喃中，加入偶氮二异丁腈(AIBN)(0.1mmol)，60℃下进行自由基聚合12h，加入甲醇进行沉降，离心，乙醚洗去未聚合单体，真空烘箱干燥，得到温度响应聚合物PPDEA。取130mg PPDEA、130mg磺基-NHS和148mg EDC于4℃下活化1h。将NHS激活后的PPDEA，加入5mg链霉亲和素于4℃下反应24h。加入1mg生物素-二硫键-EpCAM适配体于4℃下反应4h，然后调节溶液的温度至37℃，3000g/min离心10min。即得PPDEA--EpCAM温度响应功能复合物。
取5mL人非小细胞肺癌细胞A549细胞培养基(4℃)，加入1mL PPDEA-EpCAM温度响应功能复合物水溶液，(10～20mg/mL，4℃)，二者混合后于4℃下温和振摇1h，实现外泌体的均相捕获。然后调节溶液的温度至37℃，3000g/min离心10min，离心温度37℃，去除上清液，得到捕获外泌体的温度响应功能复合物沉淀。
向沉淀中加入500μL的PBS缓冲液(4℃)，使沉淀溶解，均相下清洗，去除非特异性吸附蛋白，调节溶液的温度至37℃，3000g/min离心10min，离心温度37℃，去除上清液，得到清洗后的沉淀。重复该洗涤步骤3次，得到净化的捕获外泌体的温度响应功能复合物沉淀。
在净化的捕获有外泌体的沉淀中加入200μL 20mmol/L的DTT，使沉淀溶解，于4℃孵育1h，均相条件下洗脱外泌体。调节溶液的温度至37℃，PPDEA-EpCAM温度响应功能复合物沉淀析出。离心取含有纯化后外泌体的上清液，4℃保存备用。
实施例3
以均聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)为温度响应单体的原料，以对甲酰苯硼酸作为特异性识别单体，利用对甲酰苯硼酸上的醛基与N-异丙基丙烯酰胺上的氨基进行缩合反应，制备温度响应功能复合物，应用于外泌体的分离纯化。
首先，在氮气气氛下，取N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)(10mmol)溶在10mL无水四氢呋喃中，加入偶氮二异丁腈(AIBN)(0.1mmol)，60℃下进行自由基聚合12h，加入甲醇进行沉降，离心，乙醚洗去未聚合单体，真空烘箱干燥，得到温度响应聚合物PNIPAM。取110mgPNIPAM与150mg的对甲酰苯硼酸在1mLPBS缓冲液中，于4℃下反应2h，然后调节溶液的温度至37℃，3000g/min离心10min，即得PNIPAM-对甲酰苯硼酸温度响应功能复合物。
取2mL人脐带间充质干细胞培养基或200μL人血清(调节温度至4℃)，加入1mLPNIPAM-对甲酰苯硼酸温度响应功能复合物水溶液(调节温度至4℃，pH 8)，二者混合后于4℃下温和振摇1h，实现外泌体的均相捕获。然后调节溶液的温度至37℃，3000g/min离心10min，离心温度37℃，去除上清液，得到捕获有外泌体的沉淀。
向沉淀中加入500μL的PBS缓冲液(pH 8，4℃)，使沉淀溶解，均相下清洗，去除非特异性吸附蛋白，调节溶液的温度至37℃，3000g/min离心10min，离心温度37℃，去除上清液，得到清洗后的沉淀。重复该洗涤步骤3次，得到净化的捕获外泌体的温度响应功能复合物沉淀。
在净化的捕获有外泌体的沉淀中加入PBS缓冲液(pH 6)，使沉淀溶解，于4℃孵育1h，均相条件下洗脱外泌体。调节溶液的温度至37℃，PNIPAM-对甲酰苯硼酸温度响应功能复合物沉淀析出。离心取含有纯化后外泌体的上清液，4℃保存备用。
实施例4
以均聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)为制备温度响应单体的原料，以CD63抗体作为特异性识别单体，利用金刚烷胺与葫芦[6]脲将PNIPAM与CD63抗体相连接，制备温度响应功能复合物，应用于外泌体的分离纯化。
取6-N-丙烯酰胺基已酸(10mmol)和三乙胺(1.39mL)溶在10mL无水四氢呋喃中，冰浴冷却至0℃，加入氯甲酸乙酯(10mmol)反应40分钟后加入金刚烷胺(10mmol)，在0℃反应2h后，室温下继续搅拌反应16h,加入N-异丙基丙烯酰胺(10mmol)，加入偶氮二异丁腈(AIBN)(0.1mmol)，60℃下进行自由基聚合12h，加入甲醇进行沉降，离心，乙醚洗去未聚合单体，真空烘箱干燥，得到PNIPAM-金刚烷温度响应聚合物。取110mg聚合物溶于1mLPBS缓冲液中，加入5mg葫芦[6]脲偶联CD63抗体于4℃下反应2h，然后调节溶液的温度至37℃，3000g/min离心10min，即得PNIPAM-CD63温度响应功能复合物，应用于外泌体的分离纯化。
实施例5
以N,N-二乙基丙烯酰胺(PDEA)为制备温度响应单体的原料，以精氨酸作为特异性识别单体，以戊二醛为二者的连接试剂，制备方法与实施例1基本相同，将原料替换为PDEA和精氨酸，制备温度响应功能复合物，应用于外泌体的分离纯化。
实施例6
以N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)为制备温度响应单体的原料，以单宁酸作为特异性识别单体，以生物素-亲和素相互作用为二者的连接方式，制备方法与实施例2基本相同，将原料替换为PNIPAM和单宁酸，制备温度响应功能复合物，应用于外泌体的分离纯化。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种温度响应功能复合物，其特征在于，由温度响应单体和外泌体特异性识别单体相互作用得到；所述相互作用包括化学键键合、主客体作用和生物素-亲和素相互作用中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的温度响应功能复合物，其特征在于，所述相互作用为主客体作用时，所述主客体作用的主体由温度响应单体或外泌体特异性识别单体与主体单体反应得到；所述主客体作用的客体由特异性识别单体或外泌体温度响应单体与客体单体反应得到；
所述主体单体包括冠醚、葫芦脲、杯芳烃和柱芳烃中的一种或多种；所述客体单体包括偶氮苯和/或金刚烷胺。
3.根据权利要求1所述的温度响应功能复合物，其特征在于，所述化学键包括碳碳键、碳氮键和二硫键中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的温度响应功能复合物，其特征在于，所述温度响应单体具有温度响应官能团，所述温度响应官能团包括烷基取代酰胺基。
5.根据权利要求1所述的温度响应功能复合物，其特征在于，所述外泌体特异性识别单体包括外泌体特异性识别抗体、外泌体特异性识别适配体、外泌体特异性识别金属离子、精氨酸、赖氨酸、多羟基类化合物和外泌体特异性识别膜联蛋白中的一种或多种。
6.根据权利要求1或4所述的温度响应功能复合物，其特征在于，所述温度响应单体包含聚(N-异丙基丙烯酰胺)和/或聚(N,N-二乙基丙烯酰胺)单元的单体。
7.根据权利要求1所述的温度响应功能复合物，其特征在于，所述温度响应功能复合物的响应温度为0～40℃。
8.一种外泌体的均相分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
在第一温度条件下，将温度响应功能复合物和含有外泌体的生物样品溶液混合进行均相孵育，得到孵育液；所述孵育液中含有捕获有外泌体的温度响应功能复合物，所述温度响应功能复合物为权利要求1～7任一项所述温度响应功能复合物；
在第二温度条件下，将捕获有外泌体的温度响应功能复合物从所述孵育液中析出，第一固液分离后得到捕获有外泌体的温度响应功能复合物；
在第三温度条件下，将捕获有外泌体的温度响应功能复合物溶解于清洗液中均相洗涤净化，得到含有净化的捕获有外泌体的温度响应功能复合物的混合液；
在第四温度条件下，将所述净化的捕获有外泌体的温度响应功能复合物从混合液中析出，第二固液分离后得到净化的捕获有外泌体的温度响应功能复合物；
在第五温度条件下，将所述净化的捕获外泌体的温度响应功能复合物溶解于洗脱液中脱附外泌体，得到含有温度响应功能复合物和外泌体的洗脱液；
在第六温度条件下，将温度响应功能复合物从洗脱液中析出，第三固液分离后得到外泌体纯化液；
所述第一温度、第三温度和第五温度独立地为0～10℃；所述第二温度比所述第一温度高≥5℃，所述第四温度比所述第三温度高≥5℃，所述第六温度比所述第五温度高≥5℃。
9.根据权利要求8所述的均相分离纯化方法，其特征在于，所述第二温度、第四温度和第六温度独立地为20～40℃。
10.根据权利要求8所述的均相分离纯化方法，其特征在于，所述第一固液分离分离、第二固液分离和第三固液分离为离心分离，所述第一离心分离、第二离心分离和第三离心分离的速度独立地为3000～8000g。
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