CN114736316A

CN114736316A - 一种乙酰化透明质酸盐的绿色制备方法及其应用

Info

Publication number: CN114736316A
Application number: CN202210427780.2A
Authority: CN
Inventors: 韩秀云; 韩鹏; 高瑞; 齐宁
Original assignee: Shandong Awa Biopharm Co ltd
Current assignee: Shandong Awa Biopharm Co ltd
Priority date: 2022-04-22
Filing date: 2022-04-22
Publication date: 2022-07-12
Anticipated expiration: 2042-04-22
Also published as: CN114736316B

Abstract

本发明提供一种乙酰化透明质酸盐的绿色制备方法及其应用，属于生物医药材料制备技术领域。所述制备方法包括：S1：将透明质酸或其盐溶解于离子液体中，加入醋酸酐、有机碱催化剂进行反应得反应液；S2：将步骤S1制得的反应液加入无水乙醇中进行沉淀，纯化得固状物；S3：将固状物加水溶解，加碱液调节pH至弱酸性或中性，用无水乙醇打浆，经纯化后得白色固状物，即乙酰化透明质酸盐。本发明采用绿色离子液体为溶剂，以有机碱为催化剂，所得产品的色泽优良，乙酰化度可调，反应溶媒具有可循环性，生产成本显著降低，是一种绿色可持续的生产工艺，适合于工业化生产，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

一种乙酰化透明质酸盐的绿色制备方法及其应用

技术领域

本发明属于生物医药材料制备技术领域，具体涉及一种乙酰化透明质酸盐的绿色制备方法及其应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

透明质酸(HA)，又叫玻尿酸，是一种存在于生物体内的天然高分子非硫酸化糖胺聚糖，广泛存在于人体组织中，如软骨、皮肤、关节滑液、脐带、眼玻璃体和椎间盘髓核等，是细胞间基质的主要成分，在组织再生中发挥重要作用。其在伤口愈合中发挥重要的生物学功能，能调节细胞的粘附、迁移、分化和增殖，有助于减轻炎症反应，具有改善细胞浸润性、清除自由基和抗氧化的特性。

HA拥有高生物相容性、生物可降解性、高亲水性和粘弹性等优良特性，在医学和化妆品领域应用广泛，但其在应用中的最重要限制是吸水性过强而亲脂性差、其半衰期过短，在体内降解速度快和原位停留时间短，导致生物利用度低。

为了克服这些困难，需要将透明质酸进行一些化学修饰，如乙酰化透明质酸钠(AcHA)，即为透明质酸钠的糖结构单元中的羟基乙酰化，结构如下：

乙酰化透明质酸钠，一般为淡黄色或白色颗粒或粉末状固体，极易溶于水，可溶解于80％乙醇，比透明质酸钠醇溶性提高。研究结果表明，与透明质酸钠相比，乙酰化透明质酸钠具有更好的生物利用度、稳定性、保湿性能，以及修复皮肤屏障和增加皮肤弹性等功效，而且生物毒性也很低，抗炎活性也略有增强。因此，对乙酰化透明质酸盐的合成工艺研究具有重要的研究与应用价值。

迄今为止，乙酰化透明质酸钠的制备方法的绿色化不尽如意。已报道制备方法，有以醋酸酐或醋酸酐和醋酸混合剂为乙酰化试剂，通常以浓硫酸为催化剂，以过量的酰化剂或强极性有机溶剂(DMSO、DMF、甲酰胺等)为反应溶媒，例如，资生堂株式会社发表的专利US005679657A公开了一种乙酰化透明质酸钠的制备方法，该方法在乙酰化反应结束后，洗涤乙酰化透明质酸时使用了大量的水，在沉淀时，使用了大量的丙酮，然后又使用大量的无水乙醇对产品进行脱水，故而该专利提供的方法消耗了大量的有机溶剂，生产步骤复杂，生产周期长以及对环境不友好，不利于工业化生产；再如，专利 CN 109206537B也公开了一种乙酰化透明质酸钠的制备方法，该方法虽然避免了大量使用有机溶剂，但却加大了乙酸酐和乙酸的用量，同时无法有效回收多余的酸液，又大量消耗了沉降和洗涤的水，处理成本较高；再如，专利CN 110981991B报道了一种乙酰化透明质酸盐的制备方法，与之前研究相比，制备工艺虽有优化改进，但仍有不足，如仍然使用浓硫酸做催化剂。发明人发现，现有的制备方法，或多或少地都存在明显的不足，如强酸催化剂，具有腐蚀性；使用过量的醋酸酐和醋酸；有机溶媒不易回收利用，污染较大，等等。

发明内容

针对上述现有技术中存在的乙酰化透明质酸盐的制备工艺中的透明质酸盐的有机溶剂溶解性差、反应溶媒难以回收利用、使用高腐蚀的强酸和产品质量不稳定等问题，本发明目的在于提供一种乙酰化透明质酸盐的绿色制备方法及其应用。本发明具有产品色泽优良、乙酰化度可调、质量稳定、反应溶媒具有良好循环使用性能、生产工艺操作简单等优点，从而有效降低生产成本，易于产业化生产，因此具有良好的实际应用之价值。

为了实现上述技术目的，本发明提供的技术方案如下：

本发明的第一个方面，提供一种乙酰化透明质酸盐的绿色制备方法，所述制备方法包括：

S1：将透明质酸或其盐溶解于离子液体中，加入醋酸酐、有机碱催化剂进行反应得反应液；

S2：将步骤S1制得的反应液加入无水乙醇中进行沉淀，纯化得固状物；

S3：将固状物加水溶解，加碱液调节pH至弱酸性或中性，用无水乙醇打浆，经纯化后得白色固状物，即乙酰化透明质酸盐。

其中，透明质酸盐可以为透明质酸钠、透明质酸锌和透明质酸钾。

需要说明的是，为进一步节约生产成本，减少浪费，对步骤S2中过滤产生的含有离子液体的滤液除杂后回收离子液体，可直接用于下一次反应，至少可以重复20次，且对乙酰化透明质酸盐产品的质量无明显影响；所述除杂包括采用真空蒸馏方式除去滤液中的副产物乙酸、未反应的醋酸酐等。

本发明的第二个方面，提供上述制备方法在工业化绿色生产乙酰化透明质酸盐中的应用。

上述一个或多个技术方案的有益技术效果：

1)上述技术方案以离子液体为反应溶媒，不仅有效地提升透明质酸盐的溶解度、提高反应传质速度、增加反应速率，减少了有机溶媒(或酸酐、醋酸)的使用量，而且离子液体易回收利用，有效避免有机溶媒的废弃物的产生，从而降低生产工艺成本；

2)上述技术方案以醋酸酐为乙酰化试剂，且其使用量较低，不使用醋酸，大大节约乙酰化试剂的使用，从而节约生产成本，且减少醋酸废弃物的产生；

3)上述技术方案以有机碱为催化剂，其催化性能优良，有效避免使用无机强酸，减少对反应设备的腐蚀作用，降低设备维护费；

4)上述技术方案所提供的乙酰化透明质酸盐的制备工艺，绿色高效，生产操作简单，产品质量稳定，色泽好，平均乙酰基取代度为2.8～3.8，特性粘数为0.8～1.6dl/g，产率可达到60～75％，因此具有良好的实际应用之价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为本发明所涉及的离子液体的名称与结构式。

图2为本发明实施例1中乙酰化透明质酸钠与透明质酸钠的傅里叶红外图。

图3为本发明实施例1中乙酰化透明质酸钠与透明质酸钠¹H NMR图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/ 或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

如前所述，现有乙酰化透明质酸钠的制备方法，或多或少地都存在明显的不足，如强酸催化剂，具有腐蚀性；使用过量的醋酸酐和醋酸；有机溶媒不易回收利用，污染较大，等等。因此急需开发一种乙酰化透明质酸盐的绿色制备工艺。

而透明质酸属一类天然高分子，具有良好的水溶性，从而注定了其在一般的有机溶剂中的溶解性很小，只有在DMSO、甲酰胺等强极性的有机溶剂中有一定溶解性，但其沸点较高，通常难以回收利用，因此，对其进行化学结构修饰，选择合适的反应溶剂是至关重要的。离子液体是一种兼有有机物和无机物特性的新型绿色的溶媒，结构具有可设计性，兼有溶解和催化复合功能、极性溶剂材料。因其一些独特的物化性质，如常温液态、高稳定性、选择溶解性、低挥发性和适度酸碱性等而广泛地应用于有机合成研究，并逐步向实际的生产应用拓展。离子液体已在纤维素、壳聚糖等天然多糖的制备与应用的过程取得良好的成果，但鲜有报道离子液体在透明质酸制备工艺中的应用。有鉴于此，本发明构建了一种以离子液体为反应体系的乙酰化透明质酸盐的绿色制备工艺。

本发明的一个具体实施方式中，提供一种乙酰化透明质酸盐的绿色制备方法，所述制备方法包括：

本发明的又一具体实施方式中，所述透明质酸盐可以为透明质酸钠、透明质酸锌和透明质酸钾。

本发明的又一具体实施方式中，所述步骤S1中，所述离子液体包括但不限于溴化1-乙基-3-甲基咪唑、氯化1-正丁基-3-甲基咪唑、1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐、1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐、1-甲基-1-乙基溴化吡咯烷、1-(2-二甲氨基)-乙基-3-甲基咪唑盐酸盐、1-(2-二甲氨基)-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐和1-(2-二乙氨基)-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐。

所述透明质酸或其盐与离子液体的质量体积比为1:10-20，g/mL；

所述透明质酸或其盐与醋酸酐的质量比为1:2-10；

所述有机碱催化剂包括但不限于三乙胺、N,N-二异丙基乙胺、吡啶、4-二甲氨基吡啶和哌啶，其用量为透明质酸或其盐质量的10～20％；

需要说明的是，步骤S1反应可在室温条件下进行，从而有效节约能源，反应时间控制为12-24h。

本发明的又一具体实施方式中，所述步骤S2中，纯化包括过滤、洗涤的步骤；

沉淀时使用的无水乙醇的量，为反应液体积的5-10倍；洗涤时使用的95％的乙醇的量，为反应液体积的2-3倍。

本发明的又一具体实施方式中，所述步骤S3中，所述碱液可以为含有氢氧化钠、碳酸钠、碳酸钾的溶液中的任意一种或多种，调节后pH值为5.0～7.0，进一步优选为 5.5～6.8。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述制备方法在工业化绿色生产乙酰化透明质酸盐中的应用。

所述乙酰化透明质酸盐可以为乙酰化透明质酸钠、乙酰化透明质酸锌、乙酰化透明质酸钾。本发明生产制备得到的所述乙酰化透明质酸盐可作为辅料应用于化妆品、医药、医疗器械等领域。

下面结合实施例对本发明进一步说明。下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围中。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性前提下，任何对本发明的变化都归属本发明的保护范围。同时，在本发明实施例中，若无特殊说明，所有制备原料均为本领域技术人员熟知的市售产品。

实施例1

一种乙酰化透明质酸钠的绿色制备方法，包括以下步骤：

步骤S1：将透明质酸钠(12KDa，10g)溶解于溴化1-乙基-3-甲基咪唑(200mL) 中，加入三乙胺(2g)，剧烈搅拌，缓慢滴加醋酸酐(100g)，于室温下反应12h；

步骤S2：反应结束后，将反应液加入无水乙醇(1000mL)中，有大量沉淀，经过滤、洗涤得到白色固体；

步骤S3：将白色固体用去离子水(50mL)充分溶解，调节pH值至5.5，充分搅拌后，加入无水乙醇打浆，经过滤、洗涤、真空干燥得到白色固体产物乙酰化透明质酸钠AcHA-1；

步骤S4：将步骤S2中含有溴化1-乙基-3-甲基咪唑的滤液，经真空蒸馏除去滤液中的副产物乙酸、未反应的醋酸酐等，回收离子液体，可直接用于下一次反应，重复使用 20次；重复20次后，采用活性炭脱色，经浓缩后的离子液体，用乙酸乙酯洗涤3次，而后经真空干燥，可继续用于同一反应。

实施例2

一种乙酰化透明质酸钠的绿色制备方法，包括以下步骤：

步骤S1：将透明质酸钠(35KDa，20g)溶解于1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐(250mL)中，加入N,N-二异丙基乙胺(3g)，剧烈搅拌，缓慢滴加醋酸酐(40g)，于室温下反应18h；

步骤S2：反应结束后，将反应液加入无水乙醇(1500mL)中，有大量沉淀，经过滤、洗涤得到白色固体；

步骤S3：将白色固体用去离子水(80mL)充分溶解，调节pH值至6.0，充分搅拌后，加入无水乙醇打浆，经过滤、洗涤、真空干燥得到白色固体产物乙酰化透明质酸钠AcHA-2；

步骤S4：将步骤S2中含有1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐的滤液，经真空蒸馏除去滤液中的副产物乙酸、未反应的醋酸酐等，回收离子液体，可直接用于下一次反应，重复使用20次；重复20次后，采用活性炭脱色，经浓缩后的离子液体，用乙酸乙酯洗涤3次，而后经真空干燥，可继续用于同一反应。

实施例3

一种乙酰化透明质酸钠的绿色制备方法，包括以下步骤：

步骤S1：将透明质酸钠(60KDa，30g)溶解于1-甲基-1-乙基溴化吡咯烷(300mL)中，加入4-二甲氨基吡啶(3g)，剧烈搅拌，缓慢滴加醋酸酐(100g)，于室温下反应 15h；

步骤S2：反应结束后，将反应液加入无水乙醇(2000mL)中，有大量沉淀，经过滤、洗涤得到白色固体；

步骤S3：将白色固体用去离子水(100mL)充分溶解，调节pH值至6.5，充分搅拌后，加入无水乙醇打浆，经过滤、洗涤、真空干燥得到白色固体产物乙酰化透明质酸钠AcHA-3；

步骤S4：将步骤S2中含有1-甲基-1-乙基溴化吡咯烷的滤液，经真空蒸馏除去滤液中的副产物乙酸、未反应的醋酸酐等，回收离子液体，可直接用于下一次反应，重复使用20次；重复20次后，采用活性炭脱色，经浓缩后的离子液体，用乙酸乙酯洗涤3次，而后经真空干燥，可继续用于同一反应。

实施例4

一种乙酰化透明质酸钠的绿色制备方法，包括以下步骤：

步骤S1：将透明质酸钠(100KDa，50g)溶解于1-(2-二甲氨基)-乙基-3-甲基咪唑盐酸盐(800mL)中，加入4-二甲氨基吡啶(8g)，剧烈搅拌，缓慢滴加醋酸酐(400g)，于室温下反应12h；

步骤S2：反应结束后，将反应液加入无水乙醇(4000mL)中，有大量沉淀，经过滤、洗涤得到白色固体；

步骤S3：将白色固体用去离子水(200mL)充分溶解，调节pH值至7.0，充分搅拌后，加入无水乙醇打浆，经过滤、洗涤、真空干燥得到白色固体产物乙酰化透明质酸钠AcHA-4；

步骤S4：将步骤S2中含有1-(2-二甲氨基)-乙基-3-甲基咪唑盐酸盐的滤液，经真空蒸馏除去滤液中的副产物乙酸、未反应的醋酸酐等，回收离子液体，可直接用于下一次反应，重复使用20次；重复20次后，采用活性炭脱色，经浓缩后的离子液体，用乙酸乙酯洗涤3次，而后经真空干燥，可继续用于同一反应。

实施例5

一种乙酰化透明质酸锌的绿色制备方法，包括以下步骤：

步骤S1：将透明质酸锌(500KDa，50g)溶解于1-(2-二甲氨基)-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐(500mL)中，加入吡啶(10g)，剧烈搅拌，缓慢滴加醋酸酐(500g)，于室温下反应12h；

步骤S2：反应结束后，将反应液加入无水乙醇(5000mL)中，有大量沉淀，经过滤、洗涤得到白色固体；

步骤S3：将白色固体用去离子水(250mL)充分溶解，调节pH值至6.0，充分搅拌后，加入无水乙醇打浆，经过滤、洗涤、真空干燥得到白色固体产物乙酰化透明质酸锌AcHA-5；

步骤S4：将步骤S2中含有1-(2-二甲氨基)-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐的滤液，经真空蒸馏除去滤液中的副产物乙酸、未反应的醋酸酐等，回收离子液体，可直接用于下一次反应，重复使用20次；重复20次后，采用活性炭脱色，经浓缩后的离子液体，用乙酸乙酯洗涤3次，而后经真空干燥，可继续用于同一反应。

实施例6

一种乙酰化透明质酸钾的绿色制备方法，包括以下步骤：

步骤S1：将透明质酸钾(300KDa，40g)溶解于1-(2-二乙氨基)-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐(400mL)中，加入哌啶(10g)，剧烈搅拌，缓慢滴加醋酸酐(500g)，于室温下反应12h；

步骤S2：反应结束后，将反应液加入无水乙醇(2500mL)中，有大量沉淀，经过滤、洗涤得到白色固体；

步骤S3：将白色固体用去离子水(200mL)充分溶解，调节pH值至5.5，充分搅拌后，加入无水乙醇打浆，经过滤、洗涤、真空干燥得到白色固体产物乙酰化透明质酸钾AcHA-6；

步骤S4：将步骤S2中含有1-(2-二乙氨基)-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐的滤液，经真空蒸馏除去滤液中的副产物乙酸、未反应的醋酸酐等，回收离子液体，可直接用于下一次反应，重复使用20次；重复20次后，采用活性炭脱色，经浓缩后的离子液体，用乙酸乙酯洗涤3次，而后经真空干燥，可继续用于同一反应。

实施例7

本发明所制备的乙酰化透明质盐，经傅里叶红外IR、核磁¹H NMR分析表征，由图2可知，与HA的IR图相比，AcHA的IR图上有新峰，在1732cm^-1处，为O原子上的乙酰基的C-O伸缩吸收峰；由图3可知，与HA的¹H NMR图相比，AcHA的¹H NMR 图上δ＝1.7ppm处的新峰，为乙酰基的CH₃峰，综上所述，透明质盐已成功地引入乙酰基，即产物为乙酰化透明质酸盐。

本发明实施例合成的六个乙酰化透明质酸盐，其取代度可采用羟胺比色法测定，即利用强碱条件下游离出来的乙酰基与羟胺反应生成乙酰肟羟酸，再与Fe³⁺生成可溶性红色络合物羟肟酸铁，即可利用分光光度计进行乙酰基取代度测定。该法较为简便快捷，灵敏度高，适用范围较广。取代度DS：透明质酸中一个重复单元中的可供乙酰化的醇羟基的个数，一般是0-4，可根据下列计算方法计算DS：

乙酰基百分含量(W，％)＝M1/M2×100----------公式1

取代度(DS)＝401.3×W/[43-(43-1)×W]----------公式2

式中：M1：样品乙酰化透明质酸中乙酰基的质量(mg)；

M2：样品乙酰化透明质酸的质量(mg)；

401.3：透明质酸每个基本糖单元的相对分子质量；

43：乙酰基的相对分子质量，1：氢原子的相对分子质量；

本发明的实施例中所获得乙酰化透明质酸盐的实验结果如表1所示：

表1乙酰化透明质酸盐的实验结果

应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims

1.一种乙酰化透明质酸盐的绿色制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，透明质酸盐包括透明质酸钠、透明质酸锌和透明质酸钾。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，所述离子液体包括溴化1-乙基-3-甲基咪唑、氯化1-正丁基-3-甲基咪唑、1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐、1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐、1-甲基-1-乙基溴化吡咯烷、1-(2-二甲氨基)-乙基-3-甲基咪唑盐酸盐、1-(2-二甲氨基)-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐和1-(2-二乙氨基)-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐；

优选的，所述透明质酸或其盐与离子液体的质量体积比为1:10-20，g/mL。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述透明质酸或其盐与醋酸酐的质量比为1:2-10。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述有机碱催化剂包括三乙胺、N,N-二异丙基乙胺、吡啶、4-二甲氨基吡啶和哌啶，其用量为透明质酸或其盐质量的10～20％。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1反应在室温条件下进行，反应时间控制为12-24h。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，纯化包括过滤、洗涤的步骤；

优选的，沉淀时使用的无水乙醇的量，为反应液体积的5-10倍；洗涤时使用的95％的乙醇的量，为反应液体积的2-3倍。

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，对步骤S2中过滤产生的含有离子液体的滤液除杂后回收离子液体，直接用于下一次反应；优选的，所述除杂包括采用真空蒸馏方式除去滤液中的副产物乙酸、未反应的醋酸酐。

9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中，所述碱液为含有氢氧化钠、碳酸钠、碳酸钾的溶液中的任意一种或多种，调节后pH值为5.0～7.0，进一步优选为5.5～6.8。

10.权利要求1-9任一项所述制备方法在工业化绿色生产乙酰化透明质酸盐中的应用；

优选的，所述乙酰化透明质酸盐包括乙酰化透明质酸钠、乙酰化透明质酸锌和乙酰化透明质酸钾；

优选的，所述乙酰化透明质酸盐作为辅料应用于化妆品、医药和医疗器械领域。