CN114717224A - 一种基于固相富集并识别糖基化核糖核酸glycoRNA的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于固相富集并识别糖基化核糖核酸glycoRNA的方法，首先，从生物/临床样本提取总RNA，将glycoRNA所带聚糖氧化；然后，将氧化glycoRNA与固相共价结合；接着，洗脱非共价吸附的RNA；最后，用不同糖苷酶逐步获取不同类型的glycoRNA。本发明可鉴定N‑glycoRNA和O‑glycoRNA的种类和数量，为疾病诊断标志物的机制阐明、开发及应用奠定了基础。

Description

一种基于固相富集并识别糖基化核糖核酸glycoRNA的方法

技术领域

本发明属于生物分子分析试剂技术领域，具体涉及固相富集并识别糖基化核糖核酸glycoRNA的方法。

背景技术

糖基化修饰可调控细胞内很多重要的生理功能，比如蛋白质正确折叠、运输以及降解等都离不开糖基化的参与；细胞膜上的糖蛋白和糖脂在细胞之间的交流过程中也扮演着不可或缺的角色。因此，传统的观点认为蛋白质和脂类是糖基化修饰的主要目标大分子，细胞膜上的糖蛋白和糖脂在细胞之间的信息传递中起着重要作用，但目前这一观点已被改变。2021年来自斯坦福大学化学系的Carolyn R.Bertozzi和Ryan A.Flynn科研团队首次提出核糖核酸(RNA)是糖基化的第三大目标大分子(Cell 2021,184(12))。通过对H9和Hela细胞的研究，发现RNA可被N-聚糖糖基化，称作N-glycoRNA。并实验证实其属于small RNA类别包括YRNA、小核RNA(snRNA)、核糖体RNA(rRNA)、核仁小RNA(snoRNAs)和转运RNA(tRNAs)。目前，这些glycoRNA被证明主要富集在活细胞的细胞膜外部，并由此推测其可能与细胞膜上的糖蛋白和脂质具有类似功能。事实上，RNA已经被发现存在多种翻译后修饰，例如乙酰化修饰acetylRNA。但是，glycoRNA糖基化修饰被证明是在细胞膜表面，可能具有重要的生物功能，自发现后受到全球科研界同行的关注。该研究小组进一步研究结果表明这些细胞膜上的glycoRNA不仅可以被RNA抗体识别，还可以充当免疫球蛋白样凝集素(Siglec)受体的直接配体，并在免疫调控中发挥重要的生理功能。此科研团队主要采用DBCO-生物素无铜点击化学方法去识别glycoRNA，利用Northern blot技术结合poly-A磁珠富集来推测glycoRNA长度(＜200nt)。再结合超高速离心法去分离glycoRNA并进行后续的测序。但是，此方法用来标记糖的叠氮化合物(Ac4ManNAz)有剧毒，易爆炸，特异性不高，并且蔗糖梯度离心分离RNA方法费时、提取难度大。该团队中用来识别和鉴定glycoRNA的方法较为复杂，对仪器设备要求高，并且对操作人员有着一定的要求，对后续的研发、制备与生产带来了难度。

因此，有必要开发一种快速、准确、安全和低成本的方法去富集和鉴定glycoRNA。

发明内容

本发明目的是提供一种基于固相富集并识别糖基化核糖核酸glycoRNA的方法。

本发明的一种技术方案是：

一种基于固相富集糖基化核糖核酸glycoRNA的方法，包括步骤：

(1)提取总RNA：

①向样本中加入Trizol试剂，再加入氯仿，震摇混匀，冰上静置；

②离心，吸取上清液，并加入等体积异丙醇，上下摇匀混合，室温静置；

③离心，移除上清液，留存沉淀；

④将所述沉淀用乙醇冲洗多次，并在室温下离心，移除管中液体；

⑤室温下干燥，将沉淀用DEPC水溶解，得到总RNA溶液；

(2)制备glycoRNA：

①向所述总RNA溶液中加入氧化剂并孵育，获得氧化后的RNA；

②根据步骤(1)中获得的总RNA的质量来量取树脂，并转到不含有RNase的离心管过滤管中，使用DEPC水清洗所述树脂多次，并加入所述氧化后的RNA，孵育；

③移除所述离心过滤管中液体，并用DEPC水清洗多遍，使得洗脱液里不含有RNA；

④将所述离心过滤管的底部密封，并向所述离心过滤管中加入N-内切酶和缓冲液，孵育，收集洗脱液为N-glycoRNA，保存于-80℃；

⑤使用DEPC水洗脱树脂多遍，保证洗脱液里不含有RNA；

⑥向所述离心过滤管中加入O糖苷酶和缓冲液，孵育，收集洗脱液为O-glycoRNA，保存于-80℃。

进一步的，在步骤(1)的⑤之后，还包括步骤：

⑥用Nanodrop仪器测量总RNA溶液浓度及光密度值；

⑦配制琼脂糖溶液，放入微波炉中处理，冷却，获得琼脂糖凝胶溶液，将GelGreen染料均匀混于所述琼脂糖凝胶溶液中，将混匀好的琼脂糖凝胶溶液倒入胶板模具，冷却，放入电泳缓冲液并上样，提取总RNA；

⑧用生物分析仪检测总RNA的完整性。

进一步的，在步骤⑥中，所述总RNA溶液浓度及光密度值的A260/A280为1.8-2.0，A260/A230为2.1-2.3。

进一步的，在步骤⑦中，所述琼脂糖溶液由琼脂糖和1×三醋酸乙二胺四乙酸缓冲液组成，所述琼脂糖和1×三醋酸乙二胺四乙酸缓冲液的比例为1g:100mL，所述上样的样品中总RNA质量为200-1000ng，所述提取总RNA满足28S的亮度是18S的亮度的两倍且条带无扩散。

进一步的，在步骤⑧中，RIN＞9。

进一步的，在步骤(2)的②中，所述总RNA的质量与所述树脂的体积之比为1μg：4μL。

进一步的，在步骤(2)的④中，所述总RNA的质量与所述N-内切酶之比为5μg：1μL。

进一步的，在步骤(2)的⑥中，所述总RNA的质量与所述O糖苷酶之比为5μg：1μL。

本发明的另一种技术方案是：

一种基于固相识别糖基化核糖核酸glycoRNA的方法，包括步骤：

(1)通过一种基于固相富集糖基化核糖核酸glycoRNA的方法获得N-glycoRNA、O-glycoRNA；

(2)Small RNA的质检和测序：

①采用生物分析仪分别检测所述N-glycoRNA和O-glycoRNA溶液中RNA长度分布，当40nt内有峰型时，质检合格；

②当质检合格后，进行样品文库的构建，当qPCR的浓度大于3nM时，文库构建成功，再进行small RNA测序。

进一步的，在步骤(2)所述的Small RNA的质检和测序之后还包括：

(3)生物信息学分析：

①对所述small RNA测序的测序结果进行基本数据处理：图像识别、碱基识别、过滤接头序列、去除低质量序列；

②高级数据处理：统计small RNA长度分布、比较正常和疾病组样本的公共序列和特有序列分析、鉴定已知的microRNA、预测新的microRNA、small RNA注释、两样本差异靶基因的下游分析及可视化。

本发明提供了一种基于固相富集并识别糖基化核糖核酸glycoRNA的方法，能简单快速的制备glycoRNA，可用于正常细胞和异常细胞中glycoRNA的定性和定量分析，以及糖基化位点的寻找；可避免繁琐的实验步骤，有毒的试剂以及昂贵的仪器；提高了样本的处理效率，可用于高通量样本处理，以寻找差异glycoRNA；区别N-glycoRNA和O-glycoRNA为后续机制的研究，生物标志物的发现等奠定基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中，

图1为本发明中glycoRNA制备通过固相富集糖基化RNA的工作流程示意图，其中，正方形阴影表示N-乙酰葡糖胺，圆形阴影表示葡萄糖，圆形涂色表示半乳糖，正方形涂色表示唾液酸，三角形涂色表示岩藻糖；

图2为本发明中总RNA的提取的示意图；

图3为本发明中glycoRNA氧化的示意图；

图4为本发明中氧化后的N-glycoRNA与带有氨基的固相结合并获得N-glycoRNA的示意图；

图5为本发明中氧化后的O-glycoRNA与带有氨基的固相结合并获得O-glycoRNA的示意图；

图6为本发明中M1和M2样品琼脂糖凝胶电泳结果图；

图7为本发明中M1样品在安捷伦2200质检结果图；

图8为本发明中M1样品在安捷伦2100质检结果图；

图9为本发明中M1样品在安捷伦2100的文库片段分布图；

图10为本发明中M1和M2样品中small RNA的长度分布和种类图。

具体实施方式

本发明开发了一种基于固相富集并识别糖基化核糖核酸glycoRNA的方法，请参阅图1，图1为本发明中glycoRNA制备通过固相富集糖基化RNA的工作流程示意图。如图1所示，总RNA提取后经氧化得到带有醛基的glycoRNA，与酰肼或者胺基共价结合在树脂上富集glycoRNA，最后用酶水解得到N-glycoRNA或者含有GalNAc及GalGalNAc的glycoRNA。具体包括步骤：总RNA的提取与质检；glycoRNA的富集和制备；Small RNA质检与测序；glycoRNA生物信息学分析。

通过上述方法，将glycoRNA中的聚糖氧化，将glycoRNA耦合到带有氨基或者酰肼的固相树脂(bead)上,再使用N-糖苷酶和O-糖苷酶分别进行酶切，收集各自的洗脱液，分别鉴定N-糖基化和O-糖基化glycoRNA的种类和数量，为后续疾病生物标志物的开发和机制的阐明奠定了基础。

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和实施例进一步说明本发明的技术方案。但是本发明不限于所列出的实施例，还应包括在本发明所要求的权利范围内其他任何公知的改变。

首先，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

其次，本发明利用结构示意图等进行详细描述，在详述本发明实施例时，为便于说明，示意图会不依一般比例作局部放大，而且所述示意图只是实例，其在此不应限制本发明保护的范围。此外，在实际制作中应包含长度、宽度及深度的三维空间。

最后，本发明中涉及到的水均为DEPC(deionized and diethylpyrocarbonate)水，所用的仪器和试管，移液枪等均经过RNase去除试剂处理。M是指浓度mol/L，所用试剂配制如下：

1M NH₄HCO₃＝79.06mg NH₄HCO₃+1mL DEPC水

25mM NH₄HCO₃＝40μL 1M NH₄HCO₃+1560μL DEPC水

20％DMSO＝120μL+480μL DEPC水

70％乙醇＝7mL乙醇+3mL DEPC水

实施例1

一种基于固相富集并识别糖基化核糖核酸glycoRNA的方法，包括步骤：

(1)细胞中总RNA的提取与质检

这里采用传统Trizol法提取来源于人体或动物的组织或细胞(统称为样本)的总RNA。具体步骤请参阅图2，图2为本发明中总RNA的提取的示意图。如图2所示，样本溶于氯仿后用Trizol法提取RNA，分层后水相(PH<7)加入异丙醇来沉淀总RNA，再使用70-75％的乙醇洗涤总RNA，沉淀至少2次，最后用DEPC水去溶解总RNA沉淀来得到总RNA溶液。更进一步详细步骤如下：

①向样本中加入Trizol试剂(Beyozol,上海)(5×10⁶细胞/1mL Trizol；50-100mg组织匀浆液/1mL Trizol)并转移到1.5mL离心管中，再加入200μL的氯仿，震摇混匀30s，冰上静置3min；

②4℃离心机(提前将系统冷却至所需温度)12000g，离心15min，吸取上清液400μL，并加入等体积(400μL)异丙醇，上下摇匀混合，室温条件下静置15min；

③于4℃、离心力12000g的条件下离心15min，尽可能移除上清液(双枪头法)；

④加入700μL 70-75％乙醇,将总RNA沉淀冲洗,至少2次，并在室温下8000g离心5min后，移除离心管中液体；

⑤室温下干燥5min后，将沉淀用20μL DPEC水溶解得到总的RNA溶液；

⑥用Nanodrop仪器测量总RNA浓度及光密度(OD)值，要求满足A260/A280介于1.8至2.0，而A260/A230则介于2.1至2.3之间；

⑦琼脂糖凝胶电泳表征：配制50mL 1％(重量体积比)琼脂糖溶液(0.5g琼脂糖和50mL 1×TAE)，微波炉中处理1.5-2min(开始30s,每10s混匀一次)，冷却至60-70℃，加5μlGelGreen染料(Beyotime,上海)，均匀混于1％的琼脂糖凝胶溶液中。将混匀好的琼脂糖凝胶溶液倒入胶板模具(避免出现气泡)，冷却30min左右，并放入电泳缓冲液并上样(总RNA质量在200至1000ng)。设置电压110V，运行20-30min。要求提取出来的总RNA满足28S的亮度是18S的两倍且条带无扩散；

⑨利用Agilent 2200生物分析仪检测总RNA的完整性(RIN＞9)。

(2)glycoRNA的制备

请参阅图3，图3为本发明中glycoRNA氧化示意图。Gal和GalNAc被氧化形成醛基。如图3所示，包括如下步骤：

①向总RNA溶液中依次加入一定量的氧化剂并孵育2-3h(pH＝7.0-7.2)获得氧化后的RNA；

②根据总RNA的质量来量取一定量的树脂(总RNA的质量：树脂的体积≈1μg：4μL)，并转到不含有RNase的离心过滤管中，使用DEPC水清洗树脂两次，并加入氧化后的RNA,孵育1-2h，25℃；

③移除离心过滤管中液体，并用500μL DEPC水清洗三遍，保证洗脱液里不含有RNA；

④本步骤请参阅图4，图4为本发明中氧化后的N-glycoRNA与带有氨基的固相结合并获得N-glycoRNA示意图。如图4所示，将离心过滤管的底部密封，并向反应容器中加入一定量的N-内切酶(总RNA的质量：N-内切酶≈5μg：1μL)和相应的缓冲液(pH＝7.0-7.2)，如25mM碳酸氢铵溶液(NH₄HCO₃)或者25mM Tris-HCl，25℃，孵育1-2h，收集洗脱液为N-glycoRNA，保存于-80℃；

⑤使用500μL DEPC水洗脱树脂三遍，保证洗脱液里不含有RNA；

⑥本步骤请参阅图5，图5为本发明中氧化后的O-glycoRNA与带有氨基的固相结合并获得O-glycoRNA示意图。如图5所示，加入一定量的O糖苷酶(总RNA的质量：O糖苷酶≈5μg：1μL)及相应的缓冲液(pH＝7.0-7.2)，如25mM碳酸氢铵溶液(NH₄HCO₃)或者25mM Tris-HCl，25℃，孵育1-2h，收集洗脱液为O-glycoRNA。保存于-80℃。

下面步骤可用于检测glycoRNA制备成功与否

(3)Small RNA的质检和测序

①采用Agilent 2100生物分析仪分别检测上述步骤中获得的N-glycoRNA和O-glycoRNA溶液中RNA长度分布，要求满足40nt内有峰型；

②当质检合格后，进行样品文库的构建并要求qPCR的浓度大于3nM；

③当文库构建成功后，再进行small RNA测序。

(4)生物信息学分析

①测序结果的基本数据处理：图像识别、碱基识别、过滤接头序列、去除低质量序列；

②高级数据处理：统计small RNA长度分布、比较正常和疾病组样本的公共序列和特有序列分析、鉴定已知的microRNA、预测新的microRNA、small RNA注释、两样本差异靶基因的下游分析及可视化。

实施例2

请参考图1，图1为本发明中glycoRNA制备通过固相富集糖基化RNA的工作流程示意图。如图1所示，一种基于固相糖基化RNA富集及N-内切酶酶切分析方法(SPRNA-N)和O-糖苷酶酶切分析方法(SPRNA-O)，包括如下步骤：

(1)Total RNA的提取与质检：

方法一：组织RNA提取

收集临床病人或动物的活体组织样本，并取250mg组织，加入液氮迅速研磨后，转移到RNase-free的EP管中，加入1mL的Trizol试剂(Beyozol,上海)，再加入200μL的氯仿，震摇混匀30s，冰上静置3min。放入4℃离心机，12000g，离心15min，吸取上清400μL，并加入等体积(400μL)异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置15min。再放入4℃离心机12000g，离心15min，移除上清液。再向离心管中加入700μL 70％乙醇,将RNA沉淀漂洗，至少2次，并在室温下8000g离心5min后，移除离心管中液体，室温下干燥5min后，将沉淀用20μL DPEC水溶解。

方法二：细胞RNA提取

将Mia-paca细胞用1×PBS溶液清洗3次后，加入1mL Trizol(大约5×10⁶细胞)并转移到EP管中，再加入200μL的氯仿，震摇混匀30s，冰上静置3min。放入4℃离心机，12000g，离心15min，吸取上清液400μL，并加入等体积(400μL)异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置15min。再放入4℃离心机12000g，离心15min，移除上清液。再向离心管中加入700μL 70％乙醇，将RNA沉淀漂洗(n≥2)，并在室温下8000g离心5min后，移除离心管中液体。室温下干燥5min，将沉淀用20μL DPEC水溶解。

从方法一(样本1)和方法二(样本2)中获得的总RNA使用Nanodrop测RNA的浓度及OD值来判断RNA的纯度、测试1％琼脂糖凝胶电泳来判断RNA是否降解以及使用安捷伦2200生物分析仪器来质检RNA的完整性。

(2)N糖基化glycoRNA的制备

①糖基化RNA的氧化

Nanodrop检测总RNA浓度，取20-40μg的总RNA并向其中加入100-200μL 20％DMSO,2μL辣根过氧化物(HRP)，10-20M半乳糖氧化酶(GAO)，25℃，孵育2-3h(pH＝7左右)。

②与固相结合

每20-40μg total RNA量取80μL的酰肼树脂(Thermo Fisher Scientific,MA,美国)，并转到RNase-free离心过滤管。使用DEPC水洗hydrazide树脂两次，并加入步骤①中氧化后的RNA，25℃下孵育1-2h。

③N糖基化RNA的制备

移除步骤②离心过滤管中液体，并用500μL DEPC水洗三遍，保证洗脱液里面RNA浓度为0。使用橡皮帽将离心过滤管的底部密封，并向管中加入200μL 25mM NH₄HCO₃(PH＝7)、10-20M PNGase F，25℃，孵育2h，收集洗脱液并保存于-80℃。

④O糖基化glycoRNA的制备

使用500μL DEPC水清洗步骤2中离心过滤管三遍，并保证洗脱液里面RNA浓度为0。向其中加入200μL 25mM Tris-HCl(pH＝7)，10-20M的GalNAcEXO，25℃，孵育1-2h，收集洗脱液，保存于-80℃。

(3)Small RNA测序

①small RNA质检

使用安捷伦2100检测步骤(2)中③和④中获得的glycoRNA的浓度以及长度分布。

②small RNA建库和测序

步骤①中的质检合格后，进行small RNA建库，建库成功后，即可上机测序。

(4)生物信息学分析

测序结果，可利用Cutadapt、Fastqc、bowtie2、miRDeep2、miranda、DESeq、EdgeR、GOseq等软件和R包，操作于Linux系统，进行下游分析和可视化。

(5)初步结果

通过上述方法，成功鉴定了人源胰腺细胞(样本1：Mia-paca)中的N糖基化的RNA(N＝2，M1和M2)，部分数据结果展示如下：

1、总RNA质检

1％琼脂糖凝胶

请参阅图6，图6为本发明中M1和M2样品琼脂糖凝胶电泳结果图，其中，泳道1为1kb的DNA maker；泳道2和3为从Mia-paca提取的总RNA。如图6所示，其结果表明28S是18S亮度的两倍，且无明显降解现象。

2、安捷伦2200生物分析仪质检

请参阅图7，图7为本发明中M1样品在安捷伦2200质检结果图。如图7所示，M1和M2总RNA的RINe值分别为10和9.8。

3、Nanodrop仪器的结果：A260/A280＝1.96,A260/A230＝2.1

综合上述初步结果，可判断此次从人源胰腺细胞(Mia-paca)中提取出的两份(样本1)总RNA质量合格，可以用于下一步实验。

1、Small RNA质检(安捷伦2100)

请参阅图8，图8为本发明中M1样品在安捷伦2100质检结果图。如图8所示，安捷伦2100结果显示样品M1浓度较高，并且含有主峰，可进行文库构建。

2、文库构建

请参阅图9，图9为本发明中M1样品在安捷伦2100的文库片段分布图。如图9所示，安捷伦2100质检结果显示文库片段单一，主峰在147bp、162bp，满足上机要求。QPCR结果显示此样品M1浓度18.85nM。

3、测序结果

请参阅图10，图10为本发明中M1和M2样品中small RNA的长度分布和种类图。如图10所示，本发明的结果与Carolyn R.Bertozzi和Ryan A.Flynn科研团队的结果一致，本发明也鉴定到rRNA、snRNA、snoRNA以及tRNA。不仅如此，使用此方法，还鉴定出了microRNA也存在N糖基化。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供了一种基于固相富集并识别糖基化核糖核酸glycoRNA的方法，通过带氨基固相和氧化后带醛基的RNA反应，从不同的RNA生物样本中富集糖基化的RNA，再利用糖苷内切酶(N糖和O糖)的特异性来分别鉴定N糖基化的glycoRNA和O糖基化glycoRNA的种类和丰度，为疾病诊断标志物的机制阐明、开发及应用奠定了基础。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种基于固相富集糖基化核糖核酸glycoRNA的方法，其特征在于，包括步骤：

(1)提取总RNA：

①向样本中加入Trizol试剂，再加入氯仿，震摇混匀，冰上静置；

②离心，吸取上清液，并加入等体积异丙醇，上下摇匀混合，室温静置；

③离心，移除上清液，留存沉淀；

④将所述沉淀用乙醇冲洗多次，并在室温下离心，移除管中液体；

⑤室温下干燥，将沉淀用DEPC水溶解，得到总RNA溶液；

(2)制备glycoRNA：

①向所述总RNA溶液中加入氧化剂并孵育，获得氧化后的RNA；

②根据步骤(1)中获得的总RNA的质量来量取树脂，并转到不含有RNase的离心过滤管中，使用DEPC水清洗所述树脂多次，并加入所述氧化后的RNA，孵育；

③移除所述离心过滤管中液体，并用DEPC水清洗多遍，使得洗脱液里不含有RNA；

④将所述离心过滤管的底部密封，并向所述离心过滤管中加入N-内切酶和缓冲液，孵育，收集洗脱液为N-glycoRNA，保存于-80℃；

⑤使用DEPC水清洗树脂多遍，保证洗脱液里不含有RNA；

⑥向所述离心过滤管中加入O糖苷酶和缓冲液，孵育，收集洗脱液为O-glycoRNA，保存于-80℃。

2.根据权利要求1所述的一种基于固相富集糖基化核糖核酸glycoRNA的方法，其特征在于，在步骤(1)的⑤之后，还包括步骤：

⑥用Nanodrop仪器测量总RNA溶液浓度及光密度值；

⑦配制琼脂糖溶液，放入微波炉中处理，冷却，获得琼脂糖凝胶溶液，将GelGreen染料均匀混于所述琼脂糖凝胶溶液中，将混匀好的琼脂糖凝胶溶液倒入胶板模具，冷却，放入电泳缓冲液并上样，提取总RNA；

⑧用生物分析仪检测总RNA的完整性。

3.根据权利要求2所述的一种基于固相富集糖基化核糖核酸glycoRNA的方法，其特征在于：在步骤⑥中，所述总RNA溶液浓度及光密度值的A260/A280为1.8-2.0，A260/A230为2.1-2.3。

4.根据权利要求2所述的一种基于固相富集糖基化核糖核酸glycoRNA的方法，其特征在于：在步骤⑦中，所述琼脂糖溶液由琼脂糖和1×三醋酸乙二胺四乙酸缓冲液组成，所述琼脂糖和1×三醋酸乙二胺四乙酸缓冲液的比例为1g:100mL，所述上样的样品中总RNA质量为200-1000ng，所述提取总RNA满足28S的亮度是18S的亮度的两倍且条带无扩散。

5.根据权利要求2所述的一种基于固相富集糖基化核糖核酸glycoRNA的方法，其特征在于：在步骤⑧中，RIN＞9。

6.根据权利要求1所述的一种基于固相富集糖基化核糖核酸glycoRNA的方法，其特征在于：在步骤(2)的②中，所述总RNA的质量与所述树脂的体积之比为1μg：4μL。

7.根据权利要求1所述的一种基于固相富集糖基化核糖核酸glycoRNA的方法，其特征在于：在步骤(2)的④中，所述总RNA的质量与所述N-内切酶的体积之比为5μg：1μL。

8.根据权利要求1所述的一种基于固相富集糖基化核糖核酸glycoRNA的方法，其特征在于：在步骤(2)的⑥中，所述总RNA的质量与所述O糖苷酶的体积之比为5μg：1μL。

9.一种基于固相识别糖基化核糖核酸glycoRNA的方法，其特征在于，包括步骤：

(1)通过权利要求1至8任意一项所述的一种基于固相富集糖基化核糖核酸glycoRNA的方法获得N-glycoRNA、O-glycoRNA；

(2)Small RNA的质检和测序：

①采用生物分析仪分别检测所述N-glycoRNA和O-glycoRNA溶液中RNA长度分布，当40nt内有峰型时，质检合格；

②当质检合格后，进行样品文库的构建，当qPCR的浓度大于3nM时，文库构建成功，再进行small RNA测序。

10.根据权利要求9所述的一种基于固相识别糖基化核糖核酸glycoRNA的方法，其特征在于，在步骤(2)所述的SmallRNA的质检和测序之后还包括：

(3)生物信息学分析：

①对所述smallRNA测序的测序结果进行基本数据处理：图像识别、碱基识别、过滤接头序列、去除低质量序列；

②高级数据处理：统计small RNA长度分布、比较正常和疾病组样本的公共序列和特有序列分析、鉴定已知的microRNA、预测新的microRNA、small RNA注释、两样本差异靶基因的下游分析及可视化。

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