CN114713625A - 一种靶向调控土壤微生物同步重/类金属转化与温室气体减排方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种靶向调控土壤微生物同步重/类金属转化与温室气体减排方法与应用，属于微生物和重金属污染土壤修复交叉技术领域。本发明首次发现通过将甲硫氨酸与有机酸盐复合可以显著促进甲硫氨酸靶向性地促进土壤微生物促进砷甲基化，同时有效降低甲硫氨酸存在的情况下的甲烷产生。本发明进一步将甲硫氨酸/有机酸盐制剂负载于具有多孔结构的改性生物炭材料内，达到了缓释的作用，有效解决了甲硫氨酸/在土壤体系快速分解的问题。另外，本发明通过将上述材料结合半胱氨酸，实现了砷汞复合污染土壤选择性甲基化砷的作用。本发明方法可有效降低水稻吸收无机砷，实现了稻米无机砷占总砷比例的大幅下调，同时抑制土壤甲烷排放及减排。

Description

一种靶向调控土壤微生物同步重/类金属转化与温室气体减 排方法与应用

技术领域

本发明属于微生物和污染土壤修复交叉技术领域，具体涉及一种靶向调控土壤微生物同步重/类金属转化与温室气体减排方法与应用。

背景技术

稻田土壤承载着粮食生产的重要功能，是支撑世界人类生存的不可再生资源。但受到人类高强度活动与地质高背景叠加的双重影响，稻田土壤镉砷等重(类)金属污染问题突出，引发稻米重(类)金属超标，威胁人体健康。同时，稻田又是一类典型的人工湿地，是重要的温室气体(特别是甲烷)排放源。据报道，甲烷的增温效应是二氧化碳的25倍。因此，稻田土壤在实现重(类)金属污染控制、粮食安全生产的前期下，有效降低温室气体排放对实现碳中和目标具有重要的贡献。因此，探索一种可系统实现上述目标的技术策略，将对保障世界稻田可持续生产与遏制气候变化具有重要的意义。

目前，重(类)金属污染稻田土壤的修复主要基于去除和固定化两种方法，从而降低其风险。工程措施主要包括客土法、换土翻土和去表土等措施，是基于土壤重(类)金属污染一般集中在土壤表层的特性。实施工程量大、投资费用高，破坏土体结构，引起土壤肥力下降，只适用于小面积严重污染土壤的修复，且能耗大，反而不利于温室气体减排，可持续性不足。固定与稳定化技术主要通过施加无机矿物材料，如专利CN201710413193，利用石灰质、腐殖质等复合材料，提高土壤pH、有机质含量等方式实现对土壤中镉砷稳定化，而发明专利CN201710243623.5利用秸秆与铁盐制备生物炭材料重(类)金属污染土壤，施用量到达了22.5-67.5t/hm²，施用量过大，无法用于大面积农田治理。我们前期的发明专利ZL201810816810.2利用泥炭土等，结合铁粉，亚铁盐等发明了三层结构的镉砷同步钝化剂，实现了砷与镉的同步高效钝化。然后，一方面，上述技术主要仅考虑重(类)金属稳定化性能与应用，没有涉及到温室气体排放的影响。已有的研究表明，泥炭更有利于甲烷的排放，反而不利于温室气体减排(Pedosphere 2009,19:409-421)；另一方面，针对土壤砷污染问题，由于有机砷无毒性，食品标准中对砷的限制往往以无机砷为依据，而上述技术主要是通过物理化学作用，实现对砷的氧化与吸附固定，无法有效降低稻米中毒性更高的无机砷占总砷的比例。因此，降总量的同时，降低无机砷的比例也是降低稻米砷健康风险的关键。

综上所述，如何有效降低土壤重(类)金属的活性，最终实现稻米重金属达标，以及温室气体减排的多目标协同治理仍然是当前面临的重大技术挑战。

发明内容

本发明的首要目的旨在解决现有技术中存在的不足与缺点，提供一种靶向调控土壤微生物同步重/类金属转化与温室气体减排方法。

本发明的另一目的是提供一种靶向调控土壤微生物同步重/类金属转化与温室气体减排制剂。

本发明的再一目的在于提供上述靶向调控土壤微生物同步重/类金属转化与温室气体减排制剂的制备方法。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一种靶向调控土壤微生物同步重/类金属转化与温室气体减排方法，是将含有甲硫氨酸(Met)与有机酸盐(Fat)的制剂同时置于亚砷酸根和/或砷酸根污染土壤中，同步实现砷甲基化和甲烷减排。

进一步地，所述的有机酸盐为钠、钾、钙等的醋酸盐(Ace)、乳酸盐(Lac)或丁酸盐(But)中的至少一种。本发明实施例所用的均为钠盐。

进一步地，所述的甲硫氨酸与有机酸盐的摩尔比为1:5～1:50；优选为1:10。

进一步地，所述的甲硫氨酸的添加量按其在体系中的浓度为0.5～1.5mM计；优选为1mM计。

进一步地，所述的甲基化为一甲基化、二甲基化和三甲基化中的至少一种。

进一步地，所述的土壤为稻田土壤。

一种靶向调控土壤微生物同步重/类金属转化与温室气体减排制剂，所述的制剂为上述方法中所述的含有甲硫氨酸与有机酸盐的制剂。

上述靶向调控土壤微生物同步重/类金属转化与温室气体减排制剂的制备方法，为下述方法Ⅰ或方法Ⅱ：

方法Ⅰ：将甲硫氨酸和有机酸盐直接混合；

方法Ⅱ：将甲硫氨酸和有机酸盐负载到多孔生物炭材料中。

进一步地，所述的多孔生物炭材料具有超大比表面面积，通过如下方法制备得到：

步骤1：将生物质原料，优选巴沙轻木，碎至粒径小于2mm的颗粒，清洗并烘干；

步骤2：将步骤1制得的颗粒置于真空管式炉，在氮气或惰性气体保护下升温到500～1100℃，优选800℃，保持1～3小时，制得处理前多孔生物炭材料(BC)；

步骤3：将步骤2制得的处理前多孔生物炭材料浸泡于含多巴胺的Tri-HCl缓冲溶液，或浸泡于含多巴胺和半胱氨酸的Tri-HCl缓冲溶液中，反应，即获得所述的多孔生物炭材料(BC-PDP、BC-PDP-S)。添加半胱氨酸的目的是利用半胱氨酸在BC表层形成聚合多巴胺(PDP)过程中，形成巯基官能团。

进一步地，步骤1中所述的清洗并烘干的具体步骤为：将所得颗粒浸泡在的2.5MNaOH、0.4M Na₂SO₃、2.5M H₂O₂的混合溶液中并搅拌均，转移到反应釜，在100℃中保持10h。

进一步地，步骤3中所述的Tri-HCl缓冲溶液的浓度为10mM、pH＝7.5±0.2。

进一步地，步骤3中所述的多巴胺和半胱氨酸在体系中的浓度均为0.5～1.5mM；优选为1mM。

进一步地，步骤3中所述的反应的条件为搅拌反应50～70min；优选为搅拌反应60min。

进一步地，方法Ⅰ的具体步骤为：将甲硫氨酸和有机酸盐按比例混合于磷酸盐氢钠、氯化镁、氯化钙、氯化铵的混合溶液中。

进一步地，方法Ⅱ的具体步骤为：获得多孔生物炭材料后，直接加入甲硫氨酸和有机酸盐进行搅拌，使得甲硫氨酸和有机酸盐充分与多孔生物炭材料吸附形成复合体系后，晾干，即获得所述的靶向调控土壤微生物同步重/类金属转化与温室气体减排制剂。

进一步地，所述的甲硫氨酸和有机酸盐在反应体系中的浓度，按所形成复合体系中甲硫氨酸和有机酸盐的摩尔比为1:5～1:50；优选为1:10计。

本发明优选实施例中获得的靶向调控土壤微生物同步重/类金属转化与温室气体减排制剂中，Met/Fat@BC-PDP中Met和Fat的质量占总质量的20.5％，Met/Fat@BC-PDP-S中Met和Fat的质量占总质量的19.8％。

上述靶向调控土壤微生物同步重/类金属转化与温室气体减排制剂的应用，将所述的制剂和梭菌属细菌同时置于亚砷酸根和/或砷酸根污染土壤中，同步实现砷甲基化和甲烷减排。

进一步地，所述的梭菌属细菌为生孢梭菌(Clostridium sporogenes)；优选为生孢梭菌LHA6。该菌于2022年1月14日保藏于广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼的广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为：GDMCC No：62212。这是一种具有发酵产氢同步厌氧砷甲基化功能的生孢梭菌。

进一步地，所述的梭菌属细菌的添加量按反应体系中细菌细胞密度OD₆₀₀＝0.1计。

一种靶向调控土壤微生物同步重/类金属转化与温室气体减排复合制剂，包含上述制剂和上述梭菌属细菌。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

Met是一种有效的甲基供体，可以有效促进包括DNA，砷，汞、蛋白等甲基化反应，但Met缺乏有效的靶向性与选择性，且在环境中分解快速，长效性不足。本发明通过将Met与特定的有机酸盐(具体指乙酸盐、乳酸盐和丁酸盐)按照特定的比例复合后，可以显著促进Met靶向性地促进土壤微生物促进砷甲基化，同时有效降低Met存在的情况下的甲烷产生；特别地，当组合方式为Met+Ace，Met+Lac可以使得甲烷的排放低于对照组(即未添加Met的砷污染土壤体系)，显著降低和抑制土壤甲烷排放。

在上述基础上，本发明进一步构建了Met/Fat@BC-PDP-S和Met/Fat@BC-PDP-S复合材料，成功的将Met/Fat制剂负载于具有多孔结构的改性生物炭材料内，达到了缓释的作用，有效解决了Met在土壤体系快速分解的问题；利用多巴胺改性多孔生物炭材料，显著提升了Met/Fat在生物炭表面的亲和力，从而大幅度提高其负载量。另外，两种改性生物炭材料均可进一步降低土壤甲烷排放；针对汞砷污染土壤，经过半胱氨酸复合PDP改性的生物炭材料，有效抑制汞的甲基化发生，更好地靶向调控砷甲基化，在降低无机砷比例同时，抑制甲基汞的发生。

总体上，本申请发明制剂及其复合材料可有效降低水稻吸收无机砷，实现了稻米无机砷占总砷比例的大幅下调，同时抑制土壤甲烷排放及减排。

附图说明

图1为不同的Fat和Met组合处理土壤中的甲基砷含量和甲烷排放量统计图；

图2为不同比例Met/Fat处理土壤中的甲基砷含量和甲烷排放量统计图；

图3为不同的Fat和Met组合处理土壤中含arsM基因Clostridium菌和沉积物未携带arsM基因的sedimentibacter菌丰度与砷甲基化率的关系图；

图4为Met/Fat和LHA6菌株联合处理土壤中的甲基砷含量和甲烷排放量统计图；

图5为Met/Ace@BC-PDP与Met/Ace@BC-PDP-S复合材料的结合与官能团表征图；其中，(a)为Met/Ace@BC-PDP，(b)为Met/Ace@BC-PDP-S，(c)为红外光谱图谱；

图6为Met/Ace@BC-PDP与Met/Ace@BC-PDP-S在土壤溶液中缓释Met效果图；

图7为Met/Ace@BC-PDP与Met/Ace@BC-PDP-S处理土壤中甲基砷含量和甲基汞含量统计图；

图8为Met/Fat@BC-PDP联合LHA6菌株调控土壤砷甲基化与降低稻米砷效率评估图；其中，A为稻米重量，B为稻米总砷含量，C为稻米无机砷比例，D为土壤甲基砷含量。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：不同Fat与Met组合调控土壤中的甲烷排放和砷甲基化的效果比较

取5克采自湖南某地砷污染稻田土壤于20mL玻璃样品管内，加入2.5mL的灭菌培养液，并放置于厌氧手套箱培养。培养液由10mM NH₄Cl，5mM NaHCO₃，1mM KH₂PO₄，0.5mM MgCl₂，0.5CaCl₂，1mL L^-1维他命，1mL/L微量元素组成；在手套箱内厌氧培养15天后，分别加入不同的Fat和Met组合(即Met处理，Fat处理，Met+Fat处理)，其中Fat包括甲酸盐、乙酸盐、乳酸盐、丙酸盐、丁酸盐，Met与Fat的摩尔比为1:10，其中Met的浓度为1mM，加入Met和Fat后，进一步反应60天后，采集顶空气体，利用GC-TCD测定，提取土壤悬浊液，并加入磷酸盐二氢铵脱附吸附态甲基砷，过0.22微米膜后，利用HPLC-ICPMS测定土壤溶液中的甲基砷，包括一甲基砷，二甲基砷以及三甲基砷氧化物。以手套箱内厌氧培养15天后，不加任何处理，静置60天的体系作为对照组。

由图1可知，针对甲基砷的生成，单一Fat处理组或Met处理组中主要维持在0.04–0.1μM的水平，较对照组(0.06μM)没有显著性差异，而Fat与Met组合处理组，有机砷的产率大大提高，除了丙酸盐与甲硫氨酸的组合(0.7μM)之外，均达到了4.0–7.6μM，比单一处理组提升了57–152倍，总砷的甲基化率达到了16％以上。上述结果表明，Fat+Met的组合可显著提升甲基砷的产生，而其中，乙酸盐或乳酸盐和甲硫氨酸的组合甲基砷的转化率最高，而甲酸盐与甲硫氨酸的组合对有机砷产生的促进作用不显著。另一方面，针对甲烷的产生，单一Fat或Met处理组均显著导致了土壤中甲烷的排放，排放量相对于对照组的5.5mM，显著增加到了18–25.7mM，提高了3.3–4.7倍；而Fat+Met组合处理组中，丁酸盐、乳酸盐、乙酸盐和甲硫氨酸的三个处理组的甲烷排放分别为3.5mM、2.2mM、1.9mM，显著低于对照组的5.5mM，说明了这三个处理组可实现土壤中甲烷的减排，并同步实现促进土壤砷的甲基化，其中乙酸盐与甲硫氨酸的组合效果最佳。而甲酸盐、丙酸盐与甲硫氨酸的组合则导致了甲烷排放的大大提升，无法实现甲烷减排与砷甲基化的协同。

在上述实验结果的基础上，进一步评估了丁酸盐、乳酸盐、乙酸盐和甲硫氨酸的处理对来自湖南郴州、广西河池、广东韶关等地多个砷污染稻田土壤的作用，结果显示均实现了砷甲基化和甲烷减排的协同。

实施例2：不同比例Met/Fat调控土壤中甲烷排放与砷甲基化的效果比较

在实施例1的基础上，分别评估了乙酸盐与甲硫氨酸组合，在不同摩尔比例的条件下的甲烷排放和砷甲基化的效果。实验方案主要参考实施例1，在土壤悬浊液厌氧培养15天后，分别加入甲硫氨酸与丁酸盐或乙酸盐的摩尔比为：0、1:50、1:25、1:10、1:5、1:1等六个处理，其中，甲硫氨酸浓度为1mM；在此基础上，进一步厌氧培养60天后，采集顶空气体，利用GC-TCD测定，提取土壤悬浊液，并加入磷酸盐二氢铵脱附吸附态甲基砷，过0.22微米膜后，利用HPLC-ICPMS测定土壤溶液中的甲基砷。

由图2可知，随着乙酸盐与甲硫氨酸盐的摩尔比从0增加到1:10，土壤悬浊液中甲基砷产生逐渐从0.1μM增加到7.6μM，增加了76倍，而进一步随着乙酸盐的摩尔比增加，甲基砷产生量基本维持在7.2–7.7μM的水平；而针对甲烷的产生，随着乙酸盐比例的增加，甲烷的产生由单一甲硫氨酸处理组的18.7mM，逐渐减少至1:10条件下的1.9mM，进一步增加乙酸盐的比例到1:2，甲烷的产生迅速增加至18.3mM。而作为对比，甲酸盐与甲硫氨酸在不同摩尔比例下，也具有类似的趋势，但该组合虽然能一定程度上促进砷的甲基化，但是该体系无论在所设定的比例范围内，甲烷的产生远大于如实施例1中所示的对照组的甲烷排放量，无法实现甲烷减排与促进砷甲基化目标的协同。可见，有机酸盐与甲硫氨酸的比例以及类别的组合均对甲烷减排与砷甲基化促进的协同具有重要的影响。

实施例3：Met/Fat调控土壤功能微生物基因表达与生物量的分析评估

针对上述实施例1和实施例2中不同处理的土壤样品，采用RNeasy PowerSoilTotal RNA Kit试剂盒提取土壤总RNA，去除基因组DNA后，将RNA反转录合成双链cDNA。用cDNA进行功能基因PCR建库，然后进行扩增子测序，得到功能基因群落结构及相关微生物丰度；利用荧光定量PCR仪(CFX 384Real-Time PCR Detection System)对cDNA中arsM和mcrA基因进行绝对定量。arsM基因扩增所用引物为arsMF1/arsMR2，片段长度约350bp；mcrA基因扩增引物为mlas/mcrA-rev，片段长度约450bp。qPCR扩增体系为20μL，包括10μL TB GreenPremix Ex Taq预混液，0.2μM上下游引物，10ng cDNA模板和RNA-free水。质粒标准品的构建由载体pUC19与arsM或mcrA基因PCR产物进行连接，挑取单克隆后，提取质粒DNA，用Qubit3.0Fluorometer测定DNA浓度，计算基因拷贝数，然后用EASY dilution稀释液稀释为10²-10⁸(单位为拷贝数每μL)的标准曲线。荧光定量的所有样品和阴性对照设置三个重复，扩增效率为90％-100％，标准曲线相关系数>0.9。arsM和mcrA基因扩增所用引物信息和反应程序如下：

arsMF1：5'-TCYCTCGGCTGCGGCAAYCCVAC-3'(SEQ ID NO.1)

arsMR2：5'-CGWCCGCCWGGCTTWAGYACCCG-3'(SEQ ID NO.2)

mlas：5'-GGTGGTGTMGGDTTCACMCARTA-3'(SEQ ID NO.3)

mcrA-rev：5'-CGTTCATBGCGTAGTTVGGRTAGT-3'(SEQ ID NO.4)

arsM扩增反应程序：95℃10min；95℃30s、60℃45s、72℃1min，40个循环；72℃延伸10min；

mcrA扩增反应程序：95℃10min；95℃15s、58℃30s、72℃30s，40个循环；72℃延伸2min。

结果显示，土壤对照组中砷甲基化基因arsM和产甲烷基因mcrA的转录拷贝数分别为950和1.5*10⁶拷贝数/g土，而单一甲硫氨酸处理组中，arsM和mcrA转录拷贝数分别为1200和2.0*10⁷拷贝数/g土，较对照组均显著提升；而乙酸盐和甲硫氨酸(摩尔比：1:10)混合处理组，arsM和mcrA转录拷贝数分别为1.8*10⁴和1.4*10⁴拷贝数/g土，相对于土壤对照组，分别提升了18.9和降低了两个数量级，证明该处理可实现对土壤微生物群落砷甲基化基因转录上调和产甲烷转录下调的同步。如图3所示，通过不同有机酸与甲硫氨酸的组合，可以实现土壤中携带arsM基因的梭菌Clostridium的丰度上调，从而促进砷甲基化，同时，可以是实现对不携带arsM基因的Sedimentibacter菌的下调，有效降低甚至切断了与该类菌互营的土壤产甲烷菌的能量获取途径和效率，从而有效抑制了土壤产甲烷菌活性及甲烷的产生排放。特别地，乙酸盐与甲硫氨酸的组合，可显著提升携带砷甲基化功能基因的arsM基因表达，而最大化的降低了产甲烷菌mcrA基因表达。

实施例4：Met/Fat与生孢梭菌LHA6复合调控土壤中砷甲基化与甲烷减排的评估

基于前期我们筛选的携带arsM基因的生孢梭菌(Clostridium sporogenes)LHA6，进一步与Met/Fat进行组合。该菌株已于2022年1月14日保藏于广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼的广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为：GDMCC No：62212。参考实施例1的实验方案，在土壤悬浊液厌氧培养15天后，并外源添加亚砷酸使得土壤悬浊液中总亚砷酸(As(III))含量达到0.2mM，加入甲硫氨酸与乙酸盐，摩尔比例为1:10，其中，甲硫氨酸浓度为1mM；在上述处理的基础上，加入一定量获得的LHA6菌株的菌液，使得反应体系中OD600＝0.1后，进一步厌氧培养60天后，采集顶空气体，利用GC-TCD测定，提取土壤悬浊液，并加入磷酸盐二氢铵脱附吸附态甲基砷，过0.22微米膜后，利用HPLC-ICPMS测定土壤溶液中的甲基砷。

如图4所示，LHA6菌株与Met/Ace的处理组，土壤中甲基砷的产率达到了180.5μM，远高于LHA6菌株与Met处理组的122.5μM，以及单一LHA6处理的60.3μM；相对于Met/Ace的处理组，Met/Ace与LHA6菌株的进一步组合，较Met/Ace以及单一LHA6处理分别提高了22.8倍和2倍，说明了Met/Ace与LHA6的组合可显著促进土壤中砷的甲基化。另一方面，单一的LHA6处理，同步提升了甲烷的排放，达到了16.4mM，而LHA6和Met的组合，则进一步提高了甲烷排放至15.3mM，而Met/Ace与LHA6的组合，显著抑制了甲烷至2.8mM，仅为土壤对照组的5.5mM的50％左右。上述结果表明，LHA6与Met/Ace的组合，显著促进了土壤砷甲基化效率，而同时甲烷排放得到了很好的抑制。

实施例5：Met/Ace@BC-PDP与Met/Ace@BC-PDP-S复合材料制备与表征

步骤1：将巴沙轻木进行破碎处理，获得粒径小于2mm的颗粒，进一步浸泡在50mL的2.5M NaOH，0.4M的Na₂SO₃，2.5M H₂O₂混合溶液中并搅拌均，转移到反应釜，在100℃中保持10h；

步骤2：将前处理后生物质粉末颗粒，放置于真空管式炉，在氮气保护下升温至800℃进行热解1h，获得多孔生物炭材料BC；

步骤3：将上述获得的多孔生物炭材料BC浸泡于50mL含1mM多巴胺的Tri-HCl缓冲溶液(Tris-HCl浓度为10mmol/L，pH 7.5)，搅拌反应1小时，获得改性生物炭材料BC-PDP；以乙酸盐与甲硫氨酸的组合为例，直接加入总摩尔浓度为5M，且直接加入摩尔比为1:10左右的Met/Ace，进一步搅拌1h后，离心去除水分，在常温下晾干，获得Met/Ace@BC-PDP复合材料。

获得的Met/Ace最终摩尔比浓度根据提取后，在HPLC和IC上测定获得，并进而调整初始加入的比例，最终获得摩尔比为1:10的Met/Ace。

参考步骤1-2制备得到多孔生物炭材料BC并浸泡于50mL含1mM多巴胺和1mM半胱氨酸的Tri-HCl缓冲溶液(Tris-HCl浓度为10mmol/L，pH 7.5)，搅拌反应1h，获得改性生物炭材料BC-PDP-S；以乙酸盐与甲硫氨酸的组合为例，直接加入总摩尔浓度为5M，且摩尔比为1:10左右的Met/Ace，继续搅拌反应1h后，离心去除水分，在常温下晾干，获得Met/Ace@BC-PDP-S复合材料。

获得的Met/Ace最终摩尔比浓度根据提取后，在HPLC和IC上测定获得，并进而调整初始加入的比例，最终获得摩尔比为1:10的Met/Ace。

Met/Ace@BC-PDP与Met/Ace@BC-PDP-S材料的定量分析结果：Met/Ace@BC-PDP中Met含量0.40mmol/g、Ace含量3.10mmol/g、Met:Ace＝0.13，Met/Ace@BC-PDP-S中Met含量0.32mmol/g、Ace含量2.80mmol/g、Met:Ace＝0.11。

如图5所示，Met/Ace@BC-PDP(图5中的(a))与Met/Ace@BC-PDP-S(图5中的(b))材料均具有良好的多孔结构；进一步结合红外光谱图谱(图5中的(c))分析表明，在Met/Ace@BC-PDP和Met/Ace@BC-PDP-S材料在1587cm^-1、886cm^-1有显著的面内弯曲振动β_N-H和γ_N-H，该峰主要来自甲硫氨酸或聚合多巴胺的振动，此外，Met/Ace@BC-PDP-S材料在1187cm^-1处具有明显的ν_c-s振动，可能主要是来自半胱氨酸的振振动峰。

实施例6：Met/Ace@BC-PDP与Met/Ace@BC-PDP-S在土壤溶液中缓释Met效果

在实施例1的实验方案基础上，利用实施例4制备的Met/Ace@BC-DP与Met/Ace@BC-PDP-S在土壤厌氧培养体系中，将土壤悬浊液手套箱内厌氧培养15天后，分别加入Met/Ace@BC-DP以及Met/Ace@BC-PDP-S材料，材料的添加量按甲硫氨酸在体系中的浓度为1mM计；进一步厌氧培养60天；在不同的时间点，采集土壤悬浊液，并加入甲醇等脱附土壤与材料内的甲硫氨酸，并超声强化后，过0.22微米膜后，利用HPLC测定溶液中的甲硫氨酸的含量。

由图6可知，单一的Met/Ace混合物处理，Met随着反应时间迅速下降，并在30天左右后，低于检测线；而Met/Ace@BC-DP和Met/Ace@BC-DP-S材料中，Met的释放动力学明显延长，在到达同样的30天培养时间点时，Met/Ace@BC-DP和Met/Ace@BC-DP-S处理组体系中，Met的含量仍然分别高达0.4mM和0.51mM。反应60天后，上述两个处理组中，Met仍然还剩余0.1和0.18mM，显著提升了Met在土壤体系中存在时间，显示出良好的缓释效果。

实施例7：Met/Ace@BC-PDP与Met/Ace@BC-PDP-S调控土壤砷甲基化与甲烷减排的效率评估

基于实施例4制备的材料的基础上，参考实施例1的实验方案，取用来自贵州某砷汞复合污染土壤，将土壤悬浊液手套箱内厌氧培养15天后，分别加入Met/Ace@BC-PDP以及Met/Ace@BC-PDP-S材料，材料的添加量按甲硫氨酸在体系中的浓度为1mM计；进一步厌氧培养60天后，采集顶空气体，利用GC-TCD测定，提取土壤悬浊液，并加入磷酸盐二氢铵脱附吸附态甲基砷，过0.22微米膜后，利用HPLC-ICPMS测定土壤溶液中的甲基砷，甲基汞的分析主要基于气相色谱冷蒸汽原子荧光(GC-CVAFS)。

由图7可知，Met/Ace@BC-PDP以及Met/Ace@BC-PDP-S材料处理组中土壤甲基砷分别达到了10.2μM和11.5μM，显著高于同等当量的单纯Met/Ace处理，也远高于土壤对照组的0.04μM，该结果充分说明了制备的Met/Ace缓释材料有效提升了Met/Ace对土壤中微生物的调控作用，对甲基砷的产生起到了很好的促进作用；另一方面，上述两个缓释材料处理组也很好的抑制的甲烷的产生，分别为1.5mM和1.8mM，其抑制效果比单纯的Met/Ace的2.1mM略好。更重要地是，除了Met/Ace@BC-PDP-S处理组，其他两个处理均显著提升了土壤中共存污染物汞的甲基汞生成，分别达到了0.92和0.85μmol/kg，远高于土壤对照组的0.08μmol/kg。不同于甲基砷，甲基汞的产生会导致汞的毒性的指数型增长，从而带来风险。而Met/Ace@BC-PDP-S处理组中，除了很好的抑制甲烷产生排放以及促进甲基砷的生成，还很好的将甲基汞的生成很好的抑制在对照组的水平(0.09μmol/kg)，进一步说明了通过半胱氨酸改性后，很好地抑制了甲基汞的生成，对甲基砷的产生具有较好的选择性。

实施例8：基于盆栽实验对Met/Fat@BC-PDP复合LHA6调控土壤砷甲基化与降低稻米砷效率评估

稻田土壤采自湖南省湘潭As污染的稻田，采样时去除土壤表层的落叶和动物残体等杂物，采集表层0～20cm深度的土壤。将土壤带回实验室风干，进一步去除土壤中的动植物残体并过2mm筛。试供土壤的理化性质分别为：pH 5.8；土壤总有机碳：18.57g/kg；总砷：40.3mg/kg。盆栽实验设置4个处理：对照(CK)、质量比0.5％的Met/Fat@BC-DP粉末、单一LHA6菌(剂量OD600＝0.5的菌液100mL)以及两者的组合。每盆土壤量约为3kg。在盆栽实验开始前，先将水稻种子在6％NaClO溶液中灭菌30min，再用去离子水洗涤后置于恒温培养室内育苗，育苗时间约三周，本实验水稻品种为黄华占(粤审稻2005010)；在幼苗移栽前1d，向每桶中加入肥料，添加量为K₂HPO₄·3H₂O：0.344g/kg；KH₂PO₄：0.038g/kg；CO(NH2)₂：0.21g/kg。待水稻育苗结束，移栽水稻秧苗至实验盆进行淹水培养。实验盆在温室连续培养100天水稻成熟后，收集稻米置于鼓风干燥箱内充分烘干，然后称量地上部分植物干重用于植物样品中重金属的分析；收集土壤，并加入磷酸盐二氢铵脱附吸附态甲基砷，过0.22微米膜后。提取后的重金属通过HPLC-ICPMS测定砷的形态。

由图8可知，Met/Ace@BC-DP处理和LHA6处理组均能有效降低稻米总砷含量，分别从1.5mg/kg降低到0.5mg/kg和0.72mg/kg，而Met/Ace@BC-DP+LHA6的组合，进一步降低了稻米的总砷含量至0.45mg/kg；更重要地是，该组合处理大幅度下调了稻米无机砷的比例，达到了15.7％，相对于对照组的74.5％，单一Met/Ace@BC-DP处理组的21.4％，以及LHA6处理组的55.7％均有大幅度的下调。无机砷作为毒性更强，且是唯一作为管控的砷形态组分。可见，Met/Ace@BC-DP+LHA6的组合可同步实现降低稻米总砷和无机砷比例的特点；相似地，不同的处理组中，Met/Ace@BC-DP+LHA6的组合可大大提高土壤中的甲基砷的比例，达到了189.5μM，相对于土壤对照组的10.5，提升幅度达到了18倍以上。与此同时，Met/Ace@BC-DP+LHA6的组合处理可有效促进稻米增产，稻米产量从对照组的8.9g/株，提高到11.2g/株。总体上，我们通过盆栽实验进一步验证了本技术对修复土壤砷污染，降低稻米砷风险等方面的应用潜力。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受所述的实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 广东省科学院生态环境与土壤研究所

<120> 一种靶向调控土壤微生物同步重/类金属转化与温室气体减排方法与应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> arsMF1

<400> 1

tcyctcggct gcggcaaycc vac 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> arsMR2

<400> 2

cgwccgccwg gcttwagyac ccg 23

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> mlas

<400> 3

ggtggtgtmg gdttcacmca rta 23

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> mcrA-rev

<400> 4

cgttcatbgc gtagttvggr tagt 24

Claims (10)

1.一种靶向调控土壤微生物同步重/类金属转化与温室气体减排方法，其特征在于：将含有甲硫氨酸与有机酸盐的制剂同时置于亚砷酸根和/或砷酸根污染土壤中，同步实现砷甲基化和甲烷减排。

2.根据权利要求1所述的靶向调控土壤微生物同步重/类金属转化与温室气体减排方法，其特征在于：

所述的有机酸盐为钠、钾、钙的醋酸盐、乳酸盐或丁酸盐中的至少一种；

所述的甲硫氨酸与有机酸盐的摩尔比为1:5～1:50；

所述的甲硫氨酸的添加量按其在体系中的浓度为0.5～1.5mM计。

3.根据权利要求1或2所述的靶向调控土壤微生物同步重/类金属转化与温室气体减排方法，其特征在于：

所述的甲硫氨酸与有机酸盐的摩尔比为1:10；

所述的甲硫氨酸的添加量按其在体系中的浓度为1mM计；

所述的甲基化为一甲基化、二甲基化和三甲基化中的至少一种；

所述的土壤为稻田土壤。

4.一种靶向调控土壤微生物同步重/类金属转化与温室气体减排制剂，其特征在于：所述的制剂为权利要求1～3任一项中所述的含有甲硫氨酸与有机酸盐的制剂。

5.权利要求4中所述的靶向调控土壤微生物同步重/类金属转化与温室气体减排制剂的制备方法，其特征在于：为下述方法Ⅰ或方法Ⅱ：

方法Ⅰ：将甲硫氨酸和有机酸盐直接混合；

方法Ⅱ：将甲硫氨酸和有机酸盐负载到多孔生物炭材料中。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：

所述的多孔生物炭材料通过如下方法制备得到：

步骤1：将生物质原料碎至粒径小于2mm的颗粒，清洗并烘干；

步骤2：将步骤1制得的颗粒置于真空管式炉，在氮气或惰性气体保护下升温到500～1100℃，保持1～3小时，制得处理前多孔生物炭材料；

步骤3：将步骤2制得的处理前多孔生物炭材料浸泡于含多巴胺的Tri-HCl缓冲溶液，或浸泡于含多巴胺和半胱氨酸的Tri-HCl缓冲溶液中，反应，即获得所述的多孔生物炭材料；

步骤1中所述的清洗并烘干的具体步骤为：将所得颗粒浸泡在的2.5M NaOH、0.4MNa₂SO₃、2.5M H₂O₂的混合溶液中并搅拌均，转移到反应釜，在100℃中保持10h；

步骤3中所述的Tri-HCl缓冲溶液的浓度为10mM、pH＝7.5±0.2；

步骤3中所述的多巴胺和半胱氨酸在体系中的浓度均为0.5～1.5mM；

步骤3中所述的反应的条件为搅拌反应50～70min。

7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于：

方法Ⅰ的具体步骤为：将甲硫氨酸和有机酸盐混合于磷酸盐氢钠、氯化镁、氯化钙、氯化铵的混合溶液中；

方法Ⅱ的具体步骤为：获得多孔生物炭材料后，直接加入甲硫氨酸和有机酸盐进行搅拌，使得甲硫氨酸和有机酸盐充分与多孔生物炭材料吸附形成复合体系后，晾干，即获得所述的靶向调控土壤微生物同步重/类金属转化与温室气体减排制剂；

所述的甲硫氨酸和有机酸盐在反应体系中的浓度，按所形成复合体系中甲硫氨酸和有机酸盐的摩尔比为1:5～1:50计。

8.权利要求4中所述的靶向调控土壤微生物同步重/类金属转化与温室气体减排制剂的应用，其特征在于：将所述的制剂和梭菌属细菌同时置于亚砷酸根和/或砷酸根污染土壤中，同步实现砷甲基化和甲烷减排。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：

所述的梭菌属细菌为生孢梭菌(Clostridium sporogenes)LHA6。

10.一种靶向调控土壤微生物同步重/类金属转化与温室气体减排复合制剂，其特征在于：包含权利要求4中所述的制剂和权利要求8或9中所述的梭菌属细菌。

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