JP2023158621A - 土壌微生物の標的制御により重／半金属転化と温室効果ガスの排出削減を同時に実現する方法及びその使用 - Google Patents
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Abstract
【課題】土壌微生物の標的制御により重／半金属転化と温室効果ガスの排出削減を同時に実現する方法及びその使用を提供する。【解決手段】方法は、メチオニンと有機酸塩を含有する製剤を亜ヒ酸イオン及び／又はヒ酸イオン汚染土壌に投入し、ヒ素メチル化とメタンの排出削減を同時に実現するステップを含み、前記有機酸塩はナトリウム、カリウム、カルシウムの酢酸塩、乳酸塩及び酪酸塩のうちの少なくとも１種であり、前記メチオニンと有機酸塩とのモル比が１：５～１：５０であり、前記メチオニンの添加量は反応系中の濃度を０．５～１．５ｍＭにするものである、ことを特徴とする。【選択図】図４
Description
本発明は、微生物と汚染土壌修復間の技術分野であり、具体的には、土壌微生物の標的制御により重／半金属転化と温室効果ガスの排出削減を同時に実現する方法及びその使用に関する。
水田土壌は食糧を生産するという重要な機能を担い、人間の生存をサポートする再生不可能な資源である。しかし、人間の高強度活動と高い地質学的背景が重なった二重の影響を受け、水田土壌では、カドミウムやヒ素などの重（半）金属汚染の問題が深刻であり、米中の重（半）金属の基準値超過を引き起こし、人の健康を脅かしている。また、水田は典型的な人工湿地であり、温室効果ガス（特にメタン）の主な排出源である。メタンの増温効果は二酸化炭素の２５倍と報告されている。そのため、水田土壌は重（半）金属汚染の抑制、食糧の安全生産を実現することを確保しながら、温室効果ガスの排出を効果的に削減することはカーボンニュートラルの目標の実現に対して重要な貢献を持つ。そのため、上記の目標を系統的に実現できる技術戦略を模索することは、世界の水田の持続可能な生産を保障し、気候変動を抑制することに対して重要な意義がある。
現在、重（半）金属汚染水田土壌の修復は主に除去と固定化の２つの方法に基づいており、金属汚染のリスクを低減している。工事措置は主に物理的修復法、土壌交換・切り返し法や表土の除去などの対策を含み、土壌の重（半）金属汚染が一般的に土壌表層に集中するという特性に基づいている。工事実施の量が多く、投資費用が高く、土の構造を破壊し、土壌の肥沃力の低下を引き起こし、小面積の深刻な汚染土壌の修復にのみ適用され、しかもエネルギー消費量が大きいため、温室効果ガスの排出削減には不利であり、持続可能性が不十分である。固定化・安定化技術は主に無機鉱物材料を適用することであり、例えば、中国特許出願２０１７１０４１３１９３号（中国特許出願公開第１０６９７８１９１号：特許文献１）は、石灰質、腐植質などの複合材料を利用して、土壌のｐＨ、有機質の含有量を高めるなどによって土壌中のカドミウムやヒ素を安定化しており、一方、中国特許出願２０１７１０２４３６２３．５号（中国特許出願公開第１０７１１５８４０号：特許文献２）は、わらと鉄塩を利用してバイオ炭材料重（半）金属汚染土壌を調製し、施用量は２２．５～６７．５ｔ／ｈｍ２に達しており、施用量が大きすぎて、大面積の農地の処置に用いることができない。当社の先行特許である中国特許出願２０１８１０８１６８１０．２号（中国特許出願公開第１０８７７２４１８号：特許文献３）は、泥炭土などを利用し、鉄粉、第一鉄塩などと組み合わせて、三層構造のカドミウム・ヒ素同時不動態化剤を発明し、ヒ素とカドミウムを同時に効率的に不動態化することを実現した。ただし、上記の技術は主に重（半）金属安定化性能と応用のみを考慮し、温室効果ガスの排出による影響に言及していない。既存の研究によると、泥炭のほうがメタンの排出に有利であり、温室効果ガスの削減にはむしろ不利であることが示されている（Ｐｅｄｏｓｐｈｅｒｅ ２００９，１９：４０９－４２１）。一方、土壌のヒ素汚染問題に対して、有機ヒ素は毒性がないため、食品基準におけるヒ素に対する制限は無機ヒ素を根拠とすることが多いが、上記の技術は主に物理化学作用によりヒ素の酸化と吸着固定を実現するものであり、米中のより毒性の高い無機ヒ素の全ヒ素に占める割合を効果的に低減することができない。そのため、総量を下げると同時に、無機ヒ素の割合を下げることも米中のヒ素に起因する健康上のリスクを下げるカギとなる。
以上のように、いかに土壌の重（半）金属の活性を効果的に低下させ、最終的に米中の重金属が基準を満たすようにするか、及び温室効果ガスの排出削減という複数の目的で処置を行うことは現在の重大な技術的課題となっている。
本発明の主な目的は、従来技術に存在する欠点及び欠陥を解決するために、土壌微生物の標的制御により重／半金属転化と温室効果ガスの排出削減を同時に実現する方法を提供することである。
本発明の別の目的は、土壌微生物の標的制御により重／半金属転化と温室効果ガスの排出削減を同時に実現する製剤を提供することである。
本発明のさらなる目的は、上記土壌微生物の標的制御により重／半金属転化と温室効果ガスの排出削減を同時に実現する製剤の製造方法を提供することである。
本発明の目的は下記技術案によって達成される。
メチオニン（Ｍｅｔ）と有機酸塩（Ｆａｔ）を含有する製剤を亜ヒ酸イオン及び／又はヒ酸イオン汚染土壌に投入し、ヒ素メチル化とメタンの排出削減を同時に実現する、土壌微生物の標的制御により重／半金属転化と温室効果ガスの排出削減を同時に実現する方法。
さらに、前記有機酸塩はナトリウム、カリウム、カルシウムなどの酢酸塩（Ａｃｅ）、乳酸塩（Ｌａｃ）及び酪酸塩（Ｂｕｔ）のうちの少なくとも１種である。本発明の実施例で使用されるのはナトリウム塩である。
さらに、前記メチオニンと有機酸塩とのモル比が１：５～１：５０、好ましくは１：１０である。
さらに、前記メチオニンの添加量は系中の濃度を０．５～１．５ｍＭ、好ましくは１ｍＭにするものである。
さらに、前記メチル化はモノメチル化、ジメチル化及びトリメチル化のうちの少なくとも１種である。
さらに、前記土壌は水田土壌である。
土壌微生物の標的制御により重／半金属転化と温室効果ガスの排出削減を同時に実現する製剤であって、前記製剤は上記方法における前記メチオニンと有機酸塩を含有する製剤である。
上記土壌微生物の標的制御により重／半金属転化と温室効果ガスの排出削減を同時に実現する製剤の製造方法であって、
メチオニンと有機酸塩とを直接混合する方法I、又は、
メチオニンと有機酸塩を多孔質バイオ炭材料内に担持する方法IIである。
メチオニンと有機酸塩とを直接混合する方法I、又は、
メチオニンと有機酸塩を多孔質バイオ炭材料内に担持する方法IIである。
さらに、前記多孔質バイオ炭材料は、極大の比表面面積を有し、
バイオマス原料、好ましくはバルサ材を粉砕して粒径２ｍｍ未満の粒子とし、洗浄して乾燥するステップ１と、
ステップ１で製造された粒子を真空管状炉に入れて、窒素ガス又は不活性ガスの保護下で５００～１１００℃、好ましくは８００℃に昇温し、１～３時間保温すると、未処理多孔質バイオ炭材料（ＢＣ）を得るステップ２と、
ステップ２で製造された未処理多孔質バイオ炭材料を、ドーパミン含有Ｔｒｉ－ＨＣｌ緩衝溶液、又はドーパミンとシステインを含有するＴｒｉ－ＨＣｌ緩衝溶液に浸漬して反応させ、前記多孔質バイオ炭材料（ＢＣ－ＰＤＰ、ＢＣ－ＰＤＰ－Ｓ）を得るステップ３とを含む方法によって製造される。システインは、システインがＢＣ表層に集まって重合ドーパミン（ＰＤＰ）を形成する過程でチオール官能基を形成する目的で添加される。
バイオマス原料、好ましくはバルサ材を粉砕して粒径２ｍｍ未満の粒子とし、洗浄して乾燥するステップ１と、
ステップ１で製造された粒子を真空管状炉に入れて、窒素ガス又は不活性ガスの保護下で５００～１１００℃、好ましくは８００℃に昇温し、１～３時間保温すると、未処理多孔質バイオ炭材料（ＢＣ）を得るステップ２と、
ステップ２で製造された未処理多孔質バイオ炭材料を、ドーパミン含有Ｔｒｉ－ＨＣｌ緩衝溶液、又はドーパミンとシステインを含有するＴｒｉ－ＨＣｌ緩衝溶液に浸漬して反応させ、前記多孔質バイオ炭材料（ＢＣ－ＰＤＰ、ＢＣ－ＰＤＰ－Ｓ）を得るステップ３とを含む方法によって製造される。システインは、システインがＢＣ表層に集まって重合ドーパミン（ＰＤＰ）を形成する過程でチオール官能基を形成する目的で添加される。
さらに、ステップ１では、前記洗浄して乾燥するステップは、具体的には、得た粒子を２．５Ｍ ＮａＯＨ、０．４Ｍ Ｎａ２ＳＯ３、２．５Ｍ Ｈ２Ｏ２の混合溶液に浸漬し、均一に撹拌し、反応釜に移して、１００℃で１０ｈ保温する。
さらに、ステップ３では、前記Ｔｒｉ－ＨＣｌ緩衝溶液は、濃度１０ｍＭ、ｐＨ＝７．５±０．２である。
さらに、ステップ３では、前記ドーパミン及びシステインの系中の濃度が全て０．５～１．５ｍＭ、好ましくは１ｍＭである。
さらに、ステップ３では、前記反応の条件は、５０～７０ｍｉｎ撹拌反応し、好ましくは６０ｍｉｎ撹拌反応することである。
さらに、方法Iのステップでは、具体的には、メチオニンと有機酸塩を炭酸水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、塩化アンモニウムの混合溶液にて所定の割合で混合する。
さらに、方法IIのステップでは、具体的には、多孔質バイオ炭材料を得た後、メチオニンと有機酸塩を直接加えて撹拌し、メチオニンと有機酸塩を多孔質バイオ炭材料に十分に吸着して複合系を形成し、その後、乾燥して、前記土壌微生物の標的制御により重／半金属転化と温室効果ガスの排出削減を同時に実現する製剤を得る。
さらに、前記メチオニンと有機酸塩の反応系中の濃度が、形成される複合系中のメチオニンと有機酸塩とのモル比を１：５～１：５０、好ましくは１：１０にするものである。
本発明の好適な実施例で得られる土壌微生物の標的制御により重／半金属転化と温室効果ガスの排出削減を同時に実現する製剤においては、Ｍｅｔ／Ｆａｔ＠ＢＣ－ＰＤＰでは、ＭｅｔとＦａｔの質量が全質量の２０．５％を占め、Ｍｅｔ／Ｆａｔ＠ＢＣ－ＰＤＰ－Ｓでは、ＭｅｔとＦａｔの質量が全質量の１９．８％を占める。
上記土壌微生物の標的制御により重／半金属転化と温室効果ガスの排出削減を同時に実現する製剤の使用であって、前記製剤とクロストリジウム属細菌の両方を亜ヒ酸イオン及び／又はヒ酸イオン汚染土壌に投入し、ヒ素メチル化とメタンの排出削減を同時に実現する。
さらに、前記クロストリジウム属細菌は、クロストリジウム・スポロゲネス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）、好ましくはクロストリジウム・スポロゲネスＬＨＡ６である。該菌は、２０２２年１月１４日に中国広東省広州市越秀区先烈中路１００号大院５９号棟の広東省微生物菌種保蔵センター（ＧＤＭＣＣ）に保蔵され、保蔵番号がＧＤＭＣＣ Ｎｏ：６２２１２である。これは発酵による水素生産と同時に嫌気性ヒ素メチル化機能を持つクロストリジウム・スポロゲネスである。
さらに、前記クロストリジウム属細菌の添加量は反応系中の細菌細胞密度ＯＤ６００を０．１にするものである。
土壌微生物の標的制御により重／半金属転化と温室効果ガスの排出削減を同時に実現する複合製剤であって、上記製剤と、上記クロストリジウム属細菌とを含む。
従来技術に比べて、本発明は下記の利点及び効果がある。
Ｍｅｔはメチル供与体として有効であり、ＤＮＡ、ヒ素、水銀、タンパク質などのメチル化反応を効果的に促進できるが、効果的な標的性及び選択性がなく、しかも、環境中で分解が速く、長期間作用性が不十分である。本発明では、Ｍｅｔと特定の有機酸塩（具体的には、酢酸塩、乳酸塩及び酪酸塩）を特定の割合で複合することにより、Ｍｅｔが土壌微生物によるヒ素メチル化の促進を標的に促進することを効果的に促進しつつ、Ｍｅｔが存在する場合のメタンの生成を効果的に低減させる。特に、Ｍｅｔ＋Ａｃｅ、Ｍｅｔ＋Ｌａｃ組み合わせの場合、メタンの排出を対照群（即ち、Ｍｅｔ非添加ヒ素汚染土壌系）よりも低くし、土壌のメタン排出を顕著に低減、抑制する。
上記に基づいて、本発明はさらに、Ｍｅｔ／Ｆａｔ＠ＢＣ－ＰＤＰ－Ｓ及びＭｅｔ／Ｆａｔ＠ＢＣ－ＰＤＰ－Ｓ複合材料を製造し、Ｍｅｔ／Ｆａｔ製剤を多孔質構造の変性バイオ炭材料内に担持することにより、徐放作用を果たし、土壌系におけるＭｅｔの高速分解の課題を効果的に解決する。ドーパミン変性多孔質バイオ炭材料によって、Ｍｅｔ／Ｆａｔのバイオ炭材料表面への親和力を効果的に向上させ、その担持量を大幅に向上させる。また、２種の変性バイオ炭材料のいずれも土壌のメタン排出をさらに低下させることができる。水銀・ヒ素汚染土壌の場合、システインをＰＤＰ変性バイオ炭材料に複合することにより、水銀のメチル化の発生を効果的に抑制し、ヒ素メチル化をよりうまく標的に制御し、このように、無機ヒ素の割合を下げるとともに、メチル水銀の生成を抑える。
全体的には、本願発明の製剤及びその複合材料は水稲による無機ヒ素の吸収を効果的に低減させ、米中の無機ヒ素の全ヒ素に占める割合を大幅に下げつつ、土壌のメタン排出を抑制、削減する。
以下、実施例及び図面を参照しながら本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明の実施方式はこれらに限定されるものではない。
実施例１：各ＦａｔとＭｅｔの組み合わせによる土壌中のメタン排出及びヒ素メチル化の制御効果の比較
中国湖南省の某地から採取したヒ素汚染水田土壌５ｇをガラス試料管２０ｍＬに入れて、滅菌液体培地２．５ｍＬを加え、嫌気性グローブボックスに入れて培養した。液体培地は１０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ、５ｍＭ ＮａＨＣＯ３、１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＬ／Ｌ ビタミン、１ｍＬ／Ｌ 微量元素からなる。グローブボックス内で１５日間嫌気性培養した後、各ＦａｔとＭｅｔの組み合わせをそれぞれ加え（即ちＭｅｔ処理、Ｆａｔ処理、Ｍｅｔ＋Ｆａｔ処理）、ここで、Ｆａｔはギ酸塩、酢酸塩、乳酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩を含み、ＭｅｔとＦａｔとのモル比は１：１０であり、Ｍｅｔの濃度は１ｍＭである。ＭｅｔとＦａｔを加えた後、さらに６０日間反応後、ヘッドスペースガスを採取し、ＧＣ－ＴＣＤによって測定し、土壌懸濁液を抽出し、リン酸二水素アンモニウムを加えて吸着状態のメチルヒ素を脱着し、０．２２μｍの膜を通した後、ＨＰＬＣ－ＩＣＰＭＳによって土壌溶液中のメチルヒ素を測定し、メチルヒ素にはモノメチルヒ素、ジメチルヒ素及びトリメチルヒ素酸化物が含まれる。グローブボックス内で１５日間嫌気性培養した後、いかなる処理も加えずに６０日間静置した系を対照群とした。
中国湖南省の某地から採取したヒ素汚染水田土壌５ｇをガラス試料管２０ｍＬに入れて、滅菌液体培地２．５ｍＬを加え、嫌気性グローブボックスに入れて培養した。液体培地は１０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ、５ｍＭ ＮａＨＣＯ３、１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＬ／Ｌ ビタミン、１ｍＬ／Ｌ 微量元素からなる。グローブボックス内で１５日間嫌気性培養した後、各ＦａｔとＭｅｔの組み合わせをそれぞれ加え（即ちＭｅｔ処理、Ｆａｔ処理、Ｍｅｔ＋Ｆａｔ処理）、ここで、Ｆａｔはギ酸塩、酢酸塩、乳酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩を含み、ＭｅｔとＦａｔとのモル比は１：１０であり、Ｍｅｔの濃度は１ｍＭである。ＭｅｔとＦａｔを加えた後、さらに６０日間反応後、ヘッドスペースガスを採取し、ＧＣ－ＴＣＤによって測定し、土壌懸濁液を抽出し、リン酸二水素アンモニウムを加えて吸着状態のメチルヒ素を脱着し、０．２２μｍの膜を通した後、ＨＰＬＣ－ＩＣＰＭＳによって土壌溶液中のメチルヒ素を測定し、メチルヒ素にはモノメチルヒ素、ジメチルヒ素及びトリメチルヒ素酸化物が含まれる。グローブボックス内で１５日間嫌気性培養した後、いかなる処理も加えずに６０日間静置した系を対照群とした。
図１から分かるように、メチルヒ素の生成は、Ｆａｔ単独処理群又はＭｅｔ単独処理群では、主に０．０４～０．１μＭのレベルに維持され、対照群（０．０６μＭ）に比べて、有意差が認められておらず、一方、Ｆａｔ＋Ｍｅｔ組み合わせ処理群では、有機ヒ素の収率が大幅に向上し、プロピオン酸塩＋メチオニン組み合わせ（０．７μＭ）を除き、残りは４．０～７．６μＭに達し、これは単独処理群よりも５７～１５２倍向上し、全ヒ素のメチル化率は１６％以上に達した。上記結果から明らかなように、Ｆａｔ＋Ｍｅｔ組み合わせはメチルヒ素の生成を顕著に増加し、その中でも、酢酸塩又は乳酸塩＋メチオニン組み合わせでは、メチルヒ素の転化率が最高であり、一方、ギ酸塩＋メチオニン組み合わせは有機ヒ素の生成に対する促進作用が顕著ではなかった。一方、メタンの生成に関しては、Ｆａｔ又はＭｅｔ単独処理群は全て土壌中のメタンを多く排出させ、排出量は対照群の５．５ｍＭに対して１８～２５．７ｍＭと多く増加し、３．３～４．７倍向上した。Ｆａｔ＋Ｍｅｔ組み合わせ処理群では、酪酸塩、乳酸塩、酢酸塩＋メチオニンの３つの処理群においては、メタン排出はそれぞれ３．５ｍＭ、２．２ｍＭ、１．９ｍＭであり、対照群の５．５ｍＭよりも顕著に低く、このことから、この３つの処理群は土壌中のメタンの排出を削減するとともに、土壌のヒ素メチル化を促進することができ、この中でも、酢酸塩＋メチオニン組み合わせは効果が最も優れることが示された。一方、ギ酸塩、プロピオン酸塩＋メチオニン組み合わせはメタンの排出を大幅に向上させ、メタンの排出削減とヒ素メチル化とを同時に実現することができなかった。
上記実験結果に基づいて、酪酸塩、乳酸塩、酢酸塩＋メチオニン処理について、中国湖南省のチン州、広西省の河池、広東省の韶関などの地方由来の複数のヒ素汚染水田土壌への作用を評価した結果、全てヒ素メチル化とメタンの排出削減とが同時に実現された。
実施例２：各割合のＭｅｔ／Ｆａｔによる土壌中のメタンの排出及びヒ素メチル化の制御効果の比較
実施例１に基づいて、酢酸塩＋メチオニン組み合わせの各モル割合でのメタンの排出及びヒ素メチル化への効果を評価した。実験スキームは主に実施例１を参照し、土壌懸濁液にて１５日間嫌気性培養した後、メチオニンと酪酸塩又は酢酸塩とのモル比を０、１：５０、１：２５、１：１０、１：５、１：１とする６つの処理をそれぞれ実施し、ここでは、メチオニン濃度は１ｍＭとした。さらに、６０日間嫌気性培養後、ヘッドスペースガスを収集し、ＧＣ－ＴＣＤによって測定し、土壌懸濁液を抽出し、リン酸二水素アンモニウムを加えて吸着状態のメチルヒ素を脱着し、０．２２μｍ膜を通した後、ＨＰＬＣ－ＩＣＰＭＳによって土壌溶液中のメチルヒ素を測定した。
実施例１に基づいて、酢酸塩＋メチオニン組み合わせの各モル割合でのメタンの排出及びヒ素メチル化への効果を評価した。実験スキームは主に実施例１を参照し、土壌懸濁液にて１５日間嫌気性培養した後、メチオニンと酪酸塩又は酢酸塩とのモル比を０、１：５０、１：２５、１：１０、１：５、１：１とする６つの処理をそれぞれ実施し、ここでは、メチオニン濃度は１ｍＭとした。さらに、６０日間嫌気性培養後、ヘッドスペースガスを収集し、ＧＣ－ＴＣＤによって測定し、土壌懸濁液を抽出し、リン酸二水素アンモニウムを加えて吸着状態のメチルヒ素を脱着し、０．２２μｍ膜を通した後、ＨＰＬＣ－ＩＣＰＭＳによって土壌溶液中のメチルヒ素を測定した。
図２から分かるように、酢酸塩とメチオニン塩とのモル比が０から１：１０に増えるにつれて、土壌懸濁液中のメチルヒ素の生成量は０．１μＭから７．６μＭに増え、７６倍も増えているが、酢酸塩のモル比がさらに増えても、メチルヒ素の生成量はほぼ７．２～７．７μＭのレベルに維持された。メタンの生成に関しては、酢酸塩の割合の上昇につれて、メタンの生成量はメチオニン単独処理群の１８．７ｍＭから、１：１０の条件での１．９ｍＭに減少し、酢酸塩の割合がさらに１：２に上昇すると、メタンの生成量は１８．３ｍＭに急増した。その比較として、ギ酸塩とメチオニンも各モル割合で類似の傾向を示したが、この組み合わせはヒ素メチル化をある程度促進できるが、この系では、所定の割合の範囲でも、メタンの生成は実施例１に示す対照群のメタン排出量よりもはるかに大きく、メタンの排出削減とヒ素メチル化促進の２つの目的を同時に達成できなかった。以上より、有機酸塩とメチオニンの割合及び種類別の組み合わせは、いずれも、メタンの排出削減とヒ素メチル化促進とを同時に実現することに重要な影響を与えることが分かった。
実施例３：Ｍｅｔ／Ｆａｔによる土壌機能性微生物の遺伝子発現及びバイオマスの制御についての分析評価
上記実施例１及び実施例２で異なる処理を受けた土壌試料について、ＲＮｅａｓｙ ＰｏｗｅｒＳｏｉｌ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｋｉｔキットによって土壌全ＲＮＡを抽出し、ゲノムＤＮＡを除去した後、ＲＮＡを逆転写して二本鎖ｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡを用いて機能遺伝子ＰＣＲライブラリを構築し、次に、アンプリコンシーケンシングを行い、機能遺伝子群集構造及び関連する微生物の存在量を得た。蛍光定量ＰＣＲ装置（ＣＦＸ ３８４ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて、ｃＤＮＡ中のａｒｓＭ及びｍｃｒＡ遺伝子を絶対的に定量化した。ａｒｓＭ遺伝子増幅に使用されるプライマーはａｒｓＭＦ１／ａｒｓＭＲ２であり、断片長が約３５０ｂｐであり、ｍｃｒＡ遺伝子増幅に使用されるプライマーはｍｌａｓ／ｍｃｒＡ－ｒｅｖであり、断片長が約４５０ｂｐである。ｑＰＣＲ増幅系は２０μＬとし、ＴＢ Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑプレミックス１０μＬ、上流プライマーと下流プライマー０．２μＭ、ｃＤＮＡテンプレート１０ｎｇ及びＲＮＡ－ｆｒｅｅ水を含む。プラスミド標準品の構築には、ベクターｐＵＣ１９とａｒｓＭ又はｍｃｒＡ遺伝子ＰＣＲ産物とを連結し、モノクローナルを選択して、プラスミドＤＮＡを抽出し、Ｑｕｂｉｔ ３．０ ＦｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒによってＤＮＡ濃度を測定し、遺伝子コピー数を算出した後、ＥＡＳＹ ｄｉｌｕｔｉｏｎ希釈液で１０２～１０８（単位はコピー数／μＬ）の標準曲線に希釈した。蛍光定量における全ての試料及び陰性対照について３つの重複を設置し、増幅効率を９０％～１００％、標準曲線の関連係数＞０．９とした。ａｒｓＭ及びｍｃｒＡ遺伝子増幅に使用されるプライマー情報及び反応工程は以下に示される。
arsMF1:5'-TCYCTCGGCTGCGGCAAYCCVAC-3'(SEQ ID NO.1)
arsMR2:5'-CGWCCGCCWGGCTTWAGYACCCG-3'(SEQ ID NO.2)
mlas:5'-GGTGGTGTMGGDTTCACMCARTA-3'(SEQ ID NO.3)
mcrA-rev:5'-CGTTCATBGCGTAGTTVGGRTAGT-3'(SEQ ID NO.4)
ａｒｓＭ増幅反応工程：９５℃ １０ｍｉｎ；９５℃ ３０ｓ、６０℃ ４５ｓ、７２℃ １ｍｉｎ、４０サイクル；７２℃で１０ｍｉｎ伸長；
ｍｃｒＡ増幅反応工程：９５℃ １０ｍｉｎ；９５℃ １５ｓ、５８℃ ３０ｓ、７２℃ ３０ｓ、４０サイクル；７２℃で２ｍｉｎ伸長。
上記実施例１及び実施例２で異なる処理を受けた土壌試料について、ＲＮｅａｓｙ ＰｏｗｅｒＳｏｉｌ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｋｉｔキットによって土壌全ＲＮＡを抽出し、ゲノムＤＮＡを除去した後、ＲＮＡを逆転写して二本鎖ｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡを用いて機能遺伝子ＰＣＲライブラリを構築し、次に、アンプリコンシーケンシングを行い、機能遺伝子群集構造及び関連する微生物の存在量を得た。蛍光定量ＰＣＲ装置（ＣＦＸ ３８４ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて、ｃＤＮＡ中のａｒｓＭ及びｍｃｒＡ遺伝子を絶対的に定量化した。ａｒｓＭ遺伝子増幅に使用されるプライマーはａｒｓＭＦ１／ａｒｓＭＲ２であり、断片長が約３５０ｂｐであり、ｍｃｒＡ遺伝子増幅に使用されるプライマーはｍｌａｓ／ｍｃｒＡ－ｒｅｖであり、断片長が約４５０ｂｐである。ｑＰＣＲ増幅系は２０μＬとし、ＴＢ Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑプレミックス１０μＬ、上流プライマーと下流プライマー０．２μＭ、ｃＤＮＡテンプレート１０ｎｇ及びＲＮＡ－ｆｒｅｅ水を含む。プラスミド標準品の構築には、ベクターｐＵＣ１９とａｒｓＭ又はｍｃｒＡ遺伝子ＰＣＲ産物とを連結し、モノクローナルを選択して、プラスミドＤＮＡを抽出し、Ｑｕｂｉｔ ３．０ ＦｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒによってＤＮＡ濃度を測定し、遺伝子コピー数を算出した後、ＥＡＳＹ ｄｉｌｕｔｉｏｎ希釈液で１０２～１０８（単位はコピー数／μＬ）の標準曲線に希釈した。蛍光定量における全ての試料及び陰性対照について３つの重複を設置し、増幅効率を９０％～１００％、標準曲線の関連係数＞０．９とした。ａｒｓＭ及びｍｃｒＡ遺伝子増幅に使用されるプライマー情報及び反応工程は以下に示される。
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ａｒｓＭ増幅反応工程：９５℃ １０ｍｉｎ；９５℃ ３０ｓ、６０℃ ４５ｓ、７２℃ １ｍｉｎ、４０サイクル；７２℃で１０ｍｉｎ伸長；
ｍｃｒＡ増幅反応工程：９５℃ １０ｍｉｎ；９５℃ １５ｓ、５８℃ ３０ｓ、７２℃ ３０ｓ、４０サイクル；７２℃で２ｍｉｎ伸長。
その結果から明らかに、土壌対照群では、ヒ素メチル化遺伝子ａｒｓＭ及びメタン産生遺伝子ｍｃｒＡの転写コピー数はそれぞれ、９５０及び１．５×１０６コピー数／ｇ土壌であり、一方、メチオニン単独処理群では、ａｒｓＭ及びｍｃｒＡの転写コピー数はそれぞれ、１２００及び２．０×１０７コピー数／ｇ土壌であり、両方ともに対照群よりも有意に上昇し、酢酸塩＋メチオニン（モル比：１：１０）混合処理群では、ａｒｓＭ及びｍｃｒＡの転写コピー数はそれぞれ、１．８×１０４及び１．４×１０４コピー数／ｇ土壌であり、土壌対照群に対して、それぞれ１８．９上昇し、２桁低下し、このことから、この処理は土壌微生物群落のヒ素メチル化遺伝子の転写アップレギュレーションとメタン産生転写のダウンレギュレーションとを同時に実現できることが示された。図３に示すように、異なる有機酸とメチオニンとの組み合わせによって、土壌中のａｒｓＭ遺伝子を持つクロストリジウムＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍの存在量がアップレギュレートされ、ヒ素メチル化が実現され、また、ａｒｓＭ遺伝子を持たないセジメンチバクター菌がダウンレギュレートされ、このような菌と共生する土壌メタン産生菌のエネルギー源が効果的に減少したり遮断されたり、効率が効果的に低下したりし、これにより、土壌メタン産生菌の活性及びメタンの生成や排出が効果的に抑制される。特に、酢酸塩＋メチオニン組み合わせは、ヒ素メチル化機能遺伝子を持つａｒｓＭ遺伝子の発現を顕著に向上し、メタン産生菌のｍｃｒＡ遺伝子発現を最大限に抑えた。
実施例４：Ｍｅｔ／Ｆａｔとクロストリジウム・スポロゲネスＬＨＡ６の複合による土壌のヒ素メチル化とメタン排出削減の制御についての評価
スクリーニングされたａｒｓＭ遺伝子を持つクロストリジウム・スポロゲネス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）ＬＨＡ６を、Ｍｅｔ／Ｆａｔと組み合わせた。この菌株は２０２２年１月１４日に中国広東省広州市越秀区先烈中路１００号大院５９号棟の広東省微生物菌種保蔵センター（ＧＤＭＣＣ）に保蔵され、保蔵番号がＧＤＭＣＣ Ｎｏ：６２２１２である。実施例１の実験スキームを参照して、土壌懸濁液にて１５日間嫌気性培養した後、亜ヒ酸を外部から添加し、土壌懸濁液中の亜ヒ酸（Ａｓ（ＩＩＩ））の総含有量を０．２ｍＭとし、モル比１：１０のメチオニンと酢酸塩を加え、ここで、メチオニン濃度が１ｍＭであった。さらに、得たＬＨＡ６菌株の菌液を一定量で加え、反応系中のＯＤ６００＝０．１とした後、６０日間嫌気性培養し、ヘッドスペースガスを収集し、ＧＣ－ＴＣＤによって測定し、土壌懸濁液を抽出し、リン酸二水素アンモニウムを加えて吸着状態のメチルヒ素を脱着し、０．２２μｍ膜を通した後、ＨＰＬＣ－ＩＣＰＭＳによって土壌溶液中のメチルヒ素を測定した。
スクリーニングされたａｒｓＭ遺伝子を持つクロストリジウム・スポロゲネス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）ＬＨＡ６を、Ｍｅｔ／Ｆａｔと組み合わせた。この菌株は２０２２年１月１４日に中国広東省広州市越秀区先烈中路１００号大院５９号棟の広東省微生物菌種保蔵センター（ＧＤＭＣＣ）に保蔵され、保蔵番号がＧＤＭＣＣ Ｎｏ：６２２１２である。実施例１の実験スキームを参照して、土壌懸濁液にて１５日間嫌気性培養した後、亜ヒ酸を外部から添加し、土壌懸濁液中の亜ヒ酸（Ａｓ（ＩＩＩ））の総含有量を０．２ｍＭとし、モル比１：１０のメチオニンと酢酸塩を加え、ここで、メチオニン濃度が１ｍＭであった。さらに、得たＬＨＡ６菌株の菌液を一定量で加え、反応系中のＯＤ６００＝０．１とした後、６０日間嫌気性培養し、ヘッドスペースガスを収集し、ＧＣ－ＴＣＤによって測定し、土壌懸濁液を抽出し、リン酸二水素アンモニウムを加えて吸着状態のメチルヒ素を脱着し、０．２２μｍ膜を通した後、ＨＰＬＣ－ＩＣＰＭＳによって土壌溶液中のメチルヒ素を測定した。
図４に示すように、ＬＨＡ６菌株＋Ｍｅｔ／Ａｃｅ処理群では、土壌中のメチルヒ素の収率は１８０．５μＭに達し、ＬＨＡ６菌株＋Ｍｅｔ処理群の１２２．５μＭ、及びＬＨＡ６単独処理の場合の６０．３μＭよりもはるかに高く、Ｍｅｔ／Ａｃｅ処理群に対しては、Ｍｅｔ／ＡｃｅとＬＨＡ６菌株とをさらに組み合わせたものは、Ｍｅｔ／Ａｃｅ及びＬＨＡ６単独処理よりもそれぞれ２２．８倍及び２倍向上し、このことから、Ｍｅｔ／ＡｃｅとＬＨＡ６の組み合わせは土壌中のヒ素のメチル化を顕著に促進できることが示された。一方、ＬＨＡ６単独処理では、メタンの排出も１６．４ｍＭまで向上し、ＬＨＡ６＋Ｍｅｔ組み合わせでは、メタンの排出は１５．３ｍＭまで向上し、一方、Ｍｅｔ／Ａｃｅ＋ＬＨＡ６組み合わせは、メタンを２．８ｍＭに抑え、土壌対照群の５．５ｍＭの５０％しかなかった。上記結果から明らかなように、ＬＨＡ６＋Ｍｅｔ／Ａｃｅ組み合わせは、土壌のヒ素メチル化効率を顕著に高めるとともに、メタン排出を効率よく抑制できた。
実施例５：Ｍｅｔ／Ａｃｅ＠ＢＣ－ＰＤＰ及びＭｅｔ／Ａｃｅ＠ＢＣ－ＰＤＰ－Ｓ複合材料の製造及び特徴付け
ステップ１：バルサ材を破砕処理して、粒径２ｍｍ未満の粒子を得て、５０ｍＬ ２．５ Ｍ ＮａＯＨ、０．４ Ｍ Ｎａ２ＳＯ３、２．５ Ｍ Ｈ２Ｏ２混合溶液に浸漬し、均一に撹拌し、反応釜に移して、１００℃で１０ｈ保温した。
ステップ２：前処理後のバイオマス粉末粒子を真空管状炉に入れて、窒素ガスの保護下で８００℃に昇温して１ｈ熱分解し、多孔質バイオ炭材料ＢＣを得た。
ステップ３：上記で得た多孔質バイオ炭材料ＢＣを、１ｍＭドーパミン含有Ｔｒｉ－ＨＣｌ緩衝溶液（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ濃度１０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ ７．５）５０ｍＬに浸漬し、１時間撹拌反応し、変性バイオ炭材料ＢＣ－ＰＤＰを得て、酢酸塩＋メチオニン組み合わせを例として、全モル濃度が５Ｍであり且つモル比が１：１０程度であるＭｅｔ／Ａｃｅを直接加え、さらに１ｈ撹拌した後、遠心分離により水分を除去し、常温で乾燥し、Ｍｅｔ／Ａｃｅ＠ＢＣ－ＰＤＰ複合材料を得た。
ステップ１：バルサ材を破砕処理して、粒径２ｍｍ未満の粒子を得て、５０ｍＬ ２．５ Ｍ ＮａＯＨ、０．４ Ｍ Ｎａ２ＳＯ３、２．５ Ｍ Ｈ２Ｏ２混合溶液に浸漬し、均一に撹拌し、反応釜に移して、１００℃で１０ｈ保温した。
ステップ２：前処理後のバイオマス粉末粒子を真空管状炉に入れて、窒素ガスの保護下で８００℃に昇温して１ｈ熱分解し、多孔質バイオ炭材料ＢＣを得た。
ステップ３：上記で得た多孔質バイオ炭材料ＢＣを、１ｍＭドーパミン含有Ｔｒｉ－ＨＣｌ緩衝溶液（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ濃度１０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ ７．５）５０ｍＬに浸漬し、１時間撹拌反応し、変性バイオ炭材料ＢＣ－ＰＤＰを得て、酢酸塩＋メチオニン組み合わせを例として、全モル濃度が５Ｍであり且つモル比が１：１０程度であるＭｅｔ／Ａｃｅを直接加え、さらに１ｈ撹拌した後、遠心分離により水分を除去し、常温で乾燥し、Ｍｅｔ／Ａｃｅ＠ＢＣ－ＰＤＰ複合材料を得た。
得たＭｅｔ／Ａｃｅの最終的なモル比濃度は抽出後にＨＰＬＣ及びＩＣによって測定され、初期の添加比を調整することにより、最終的には、モル比１：１０のＭｅｔ／Ａｃｅが得られた。
ステップ１～２を参照して多孔質バイオ炭材料ＢＣを製造し、１ｍＭドーパミンと１ｍＭシステインを含有するＴｒｉ－ＨＣｌ緩衝溶液（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ濃度１０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ ７．５）５０ｍＬに浸漬し、１ｈ撹拌反応し、変性バイオ炭材料ＢＣ－ＰＤＰ－Ｓを得て、酢酸塩＋メチオニン組み合わせを例として、全モル濃度が５Ｍであり且つモル比が１：１０程度であるＭｅｔ／Ａｃｅを直接加え、さらに１ｈ撹拌反応した後、遠心分離により水分を除去し、常温で乾燥し、Ｍｅｔ／Ａｃｅ＠ＢＣ－ＰＤＰ－Ｓ複合材料を得た。
得たＭｅｔ／Ａｃｅの最終的なモル比濃度は抽出後にＨＰＬＣ及びＩＣによって測定され、最初の添加比を調整することにより、最終的に、モル比が１：１０のＭｅｔ／Ａｃｅが得られた。
Ｍｅｔ／Ａｃｅ＠ＢＣ－ＰＤＰ及びＭｅｔ／Ａｃｅ＠ＢＣ－ＰＤＰ－Ｓ材料を定量的に分析した結果、Ｍｅｔ／Ａｃｅ＠ＢＣ－ＰＤＰでは、Ｍｅｔ含有量は０．４０ｍｍｏｌ／ｇ、Ａｃｅ含有量は３．１０ｍｍｏｌ／ｇ、Ｍｅｔ：Ａｃｅ＝０．１３であり、Ｍｅｔ／Ａｃｅ＠ＢＣ－ＰＤＰ－Ｓでは、Ｍｅｔ含有量は０．３２ｍｍｏｌ／ｇ、Ａｃｅ含有量は２．８０ｍｍｏｌ／ｇ、Ｍｅｔ：Ａｃｅ＝０．１１であった。
図５に示すように、Ｍｅｔ／Ａｃｅ＠ＢＣ－ＰＤＰ（図５の（ａ））及びＭｅｔ／Ａｃｅ＠ＢＣ－ＰＤＰ－Ｓ（図５の（ｂ））材料は、全て優れた多孔質構造を持ち、さらに、赤外線スペクトル（図５の（ｃ））と組み合わせて分析した結果、Ｍｅｔ／Ａｃｅ＠ＢＣ－ＰＤＰ及びＭｅｔ／Ａｃｅ＠ＢＣ－ＰＤＰ－Ｓ材料は、１５８７ｃｍ－１、８８６ｃｍ－１に明らかな面内屈曲振動βＮ－Ｈ及びγＮ－Ｈを有し、このピークは主にメチオニン又はポリドーパミンの振動に由来するものであり、また、Ｍｅｔ／Ａｃｅ＠ＢＣ－ＰＤＰ－Ｓ材料は１１８７ｃｍ－１に明らかなνＣ－Ｓ振動を有し、主にシステインの振動ピークに由来すると考えられる。
実施例６：Ｍｅｔ／Ａｃｅ＠ＢＣ－ＰＤＰ及びＭｅｔ／Ａｃｅ＠ＢＣ－ＰＤＰ－Ｓの土壌溶液でのＭｅｔ徐放効果
実施例１の実験スキームに基づいて、実施例４で製造されたＭｅｔ／Ａｃｅ＠ＢＣ－ＤＰ及びＭｅｔ／Ａｃｅ＠ＢＣ－ＰＤＰ－Ｓを用いて、土壌嫌気性培養系において、グローブボックス内で土壌懸濁液を１５日間嫌気性培養した後、Ｍｅｔ／Ａｃｅ＠ＢＣ－ＤＰ及びＭｅｔ／Ａｃｅ＠ＢＣ－ＰＤＰ－Ｓ材料を、メチオニンの系中の濃度が１ｍＭとなるようにそれぞれ添加した。さらに６０日間嫌気性培養した。異なる時点に土壌懸濁液を採取し、メタノールなどを加えて土壌及び材料内のメチオニンを脱着し、超音波で増強した後、０．２２μｍ膜を通した後、ＨＰＬＣによって溶液中のメチオニン含有量を測定した。
実施例１の実験スキームに基づいて、実施例４で製造されたＭｅｔ／Ａｃｅ＠ＢＣ－ＤＰ及びＭｅｔ／Ａｃｅ＠ＢＣ－ＰＤＰ－Ｓを用いて、土壌嫌気性培養系において、グローブボックス内で土壌懸濁液を１５日間嫌気性培養した後、Ｍｅｔ／Ａｃｅ＠ＢＣ－ＤＰ及びＭｅｔ／Ａｃｅ＠ＢＣ－ＰＤＰ－Ｓ材料を、メチオニンの系中の濃度が１ｍＭとなるようにそれぞれ添加した。さらに６０日間嫌気性培養した。異なる時点に土壌懸濁液を採取し、メタノールなどを加えて土壌及び材料内のメチオニンを脱着し、超音波で増強した後、０．２２μｍ膜を通した後、ＨＰＬＣによって溶液中のメチオニン含有量を測定した。
図６から分かるように、Ｍｅｔ／Ａｃｅ混合物処理単独では、Ｍｅｔは反応の時間が経るにつれて迅速に減少し、約３０日間後、検出可能な限界よりも低くなり、一方、Ｍｅｔ／Ａｃｅ＠ＢＣ－ＤＰ及びＭｅｔ／Ａｃｅ＠ＢＣ－ＤＰ－Ｓ材料では、Ｍｅｔの放出速度論が明らかに延長し、３０日間の時点になっても、Ｍｅｔ／Ａｃｅ＠ＢＣ－ＤＰ及びＭｅｔ／Ａｃｅ＠ＢＣ－ＤＰ－Ｓ処理群の系では、Ｍｅｔの含有量はそれぞれ０．４ｍＭ及び０．５１ｍＭと高かった。６０日間反応後、上記の２つの処理群では、Ｍｅｔはまだ０．１ｍＭ及び０．１８ｍＭ残留されており、このように、Ｍｅｔの土壌系中の存在時間が明らかに長くなり、良好な徐放効果が得られた。
実施例７：Ｍｅｔ／Ａｃｅ＠ＢＣ－ＰＤＰ及びＭｅｔ／Ａｃｅ＠ＢＣ－ＰＤＰ－Ｓの土壌ヒ素メチル化及びメタン排出削減の制御効率についての評価
実施例４で製造された材料に基づいて、実施例１の実験スキームを参照して、中国貴州省でヒ素・水銀複合汚染土壌を採取し、グローブボックス内で土壌懸濁液を１５日間嫌気性培養した後、Ｍｅｔ／Ａｃｅ＠ＢＣ－ＰＤＰ及びＭｅｔ／Ａｃｅ＠ＢＣ－ＰＤＰ－Ｓ材料を、メチオニンの系中の濃度が１ｍＭとなるようにそれぞれ加えた。さらに６０日間嫌気性培養した後、ヘッドスペースガスを収集し、ＧＣ－ＴＣＤによって測定し、土壌懸濁液を抽出し、リン酸二水素アンモニウムを加えて吸着状態のメチルヒ素を脱着し、０．２２μｍ膜を通した後、ＨＰＬＣ－ＩＣＰＭＳによって土壌溶液中のメチルヒ素を測定した。メチル水銀の分析は主にガスクロマトグラフィー冷蒸気原子蛍光分析（ＧＣ－ＣＶＡＦＳ）に基づいた。
実施例４で製造された材料に基づいて、実施例１の実験スキームを参照して、中国貴州省でヒ素・水銀複合汚染土壌を採取し、グローブボックス内で土壌懸濁液を１５日間嫌気性培養した後、Ｍｅｔ／Ａｃｅ＠ＢＣ－ＰＤＰ及びＭｅｔ／Ａｃｅ＠ＢＣ－ＰＤＰ－Ｓ材料を、メチオニンの系中の濃度が１ｍＭとなるようにそれぞれ加えた。さらに６０日間嫌気性培養した後、ヘッドスペースガスを収集し、ＧＣ－ＴＣＤによって測定し、土壌懸濁液を抽出し、リン酸二水素アンモニウムを加えて吸着状態のメチルヒ素を脱着し、０．２２μｍ膜を通した後、ＨＰＬＣ－ＩＣＰＭＳによって土壌溶液中のメチルヒ素を測定した。メチル水銀の分析は主にガスクロマトグラフィー冷蒸気原子蛍光分析（ＧＣ－ＣＶＡＦＳ）に基づいた。
図７から分かるように、Ｍｅｔ／Ａｃｅ＠ＢＣ－ＰＤＰ及びＭｅｔ／Ａｃｅ＠ＢＣ－ＰＤＰ－Ｓ材料処理群では、土壌のメチルヒ素はそれぞれ１０．２μＭ及び１１．５μＭに達し、同当量のＭｅｔ／Ａｃｅ処理単独の場合よりもはるかに高く、また、土壌対照群の０．０４μＭよりも高く、この結果から、製造されたＭｅｔ／Ａｃｅ徐放材料がＭｅｔ／Ａｃｅの土壌中の微生物への制御作用を効果的に向上させ、また、メチルヒ素の生成を促進する役割を果たすことが十分に証明されており、一方、上記の２種の徐放材料処理群でも、メタンの生成は効果的に抑制され、それぞれ１．５ｍＭ及び１．８ｍＭであり、これらの抑制効果はＭｅｔ／Ａｃｅ単独の場合の２．１ｍＭよりも僅かに優れた。より重要なことには、Ｍｅｔ／Ａｃｅ＠ＢＣ－ＰＤＰ－Ｓ処理群以外、残りの２つの処理のいずれでも、土壌中に共存する汚染物である水銀のメチル水銀の生成が上昇し、それぞれ０．９２μｍｏｌ／ｋｇ及び０．８５μｍｏｌ／ｋｇに達し、土壌対照群の０．０８μｍｏｌ／ｋｇよりもはるかに高かった。メチルヒ素と異なり、メチル水銀が生成されると、水銀の毒性が指数関数的に上昇し、リスクが生じる。一方、Ｍｅｔ／Ａｃｅ＠ＢＣ－ＰＤＰ－Ｓ処理群では、メタンの生成や排出及びメチルヒ素の生成促進が効果的に実現されるに加えて、メチル水銀の生成も対照群のレベル（０．０９μｍｏｌ／ｋｇ）に抑えられ、これによっても、システイン変性によれば、メチル水銀の生成が確実に抑制され、メチルヒ素の生成に対する選択性が優れたことがさらに示された。
実施例８：ポット実験によるＭｅｔ／Ｆａｔ＠ＢＣ－ＰＤＰ複合ＬＨＡ６の土壌のヒ素メチル化への制御及び米中のヒ素の低減効率についての評価
水田土壌は中国湖南省の湘潭にあるＡｓ汚染水田から採取されたものであり、採取する際には土壌の表層にある落葉や動物の残体などの遺物を除去し、表層から０～２０ｃｍ深さの土壌を採取した。土壌を実験室に持ち帰って乾燥し、土壌に残留された植物や動物の残体を除去し、２ｍｍ篩にかけた。試験土壌の物理化学的性質は、それぞれ、ｐＨ ５．８、土壌有機炭素総量１８．５７ｇ／ｋｇ、全ヒ素４０．３ｍｇ／ｋｇである。ポット実験においては、対照（ＣＫ）、質量比０．５％のＭｅｔ／Ｆａｔ＠ＢＣ－ＤＰ粉末、ＬＨＡ６菌単独（用量ＯＤ６００＝０．５の菌液１００ｍＬ）及び両方の組み合わせという４つの処理を設置した。ポットごとの土壌量を約３ｋｇとした。ポット実験に先立って、水稲の種子を６％ ＮａＣｌＯ溶液にて３０ｍｉｎ滅菌し、次に、脱イオン水で洗浄して、恒温培養室に入れて、約３週間育苗し、本実験では、水稲の品種は黄華占（粤審稲２００５０１０）とした。幼苗移植１ｄ前に、Ｋ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ：０．３４４ ｇ／ｋｇ；ＫＨ２ＰＯ４：０．０３８ ｇ／ｋｇ；ＣＯ（ＮＨ２）２：０．２１ ｇ／ｋｇの添加量でポットごとに肥料を加えた。水稲の育苗が終わった後、水稲の苗を実験ポットに移植して水没培養を行った。実験ポットをビニルハウスにて１００日間連続して培養し、水稲が成熟すると、米を収穫して送風乾燥箱に入れて十分に乾燥した後、地上部分植物の乾燥重量を秤量し、植物試料中の重金属の分析に用いた。土壌を収集して、リン酸二水素アンモニウムを加えて吸着状態のメチルヒ素を脱着し、０．２２μｍ膜を通した後、抽出した重金属についてＨＰＬＣ－ＩＣＰＭＳによってヒ素の形態を検出した。
水田土壌は中国湖南省の湘潭にあるＡｓ汚染水田から採取されたものであり、採取する際には土壌の表層にある落葉や動物の残体などの遺物を除去し、表層から０～２０ｃｍ深さの土壌を採取した。土壌を実験室に持ち帰って乾燥し、土壌に残留された植物や動物の残体を除去し、２ｍｍ篩にかけた。試験土壌の物理化学的性質は、それぞれ、ｐＨ ５．８、土壌有機炭素総量１８．５７ｇ／ｋｇ、全ヒ素４０．３ｍｇ／ｋｇである。ポット実験においては、対照（ＣＫ）、質量比０．５％のＭｅｔ／Ｆａｔ＠ＢＣ－ＤＰ粉末、ＬＨＡ６菌単独（用量ＯＤ６００＝０．５の菌液１００ｍＬ）及び両方の組み合わせという４つの処理を設置した。ポットごとの土壌量を約３ｋｇとした。ポット実験に先立って、水稲の種子を６％ ＮａＣｌＯ溶液にて３０ｍｉｎ滅菌し、次に、脱イオン水で洗浄して、恒温培養室に入れて、約３週間育苗し、本実験では、水稲の品種は黄華占（粤審稲２００５０１０）とした。幼苗移植１ｄ前に、Ｋ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ：０．３４４ ｇ／ｋｇ；ＫＨ２ＰＯ４：０．０３８ ｇ／ｋｇ；ＣＯ（ＮＨ２）２：０．２１ ｇ／ｋｇの添加量でポットごとに肥料を加えた。水稲の育苗が終わった後、水稲の苗を実験ポットに移植して水没培養を行った。実験ポットをビニルハウスにて１００日間連続して培養し、水稲が成熟すると、米を収穫して送風乾燥箱に入れて十分に乾燥した後、地上部分植物の乾燥重量を秤量し、植物試料中の重金属の分析に用いた。土壌を収集して、リン酸二水素アンモニウムを加えて吸着状態のメチルヒ素を脱着し、０．２２μｍ膜を通した後、抽出した重金属についてＨＰＬＣ－ＩＣＰＭＳによってヒ素の形態を検出した。
図８から分かるように、Ｍｅｔ／Ａｃｅ＠ＢＣ－ＤＰ処理群及びＬＨＡ６処理群は両方ともに米中の総ヒ素含有量を低下させ、１．５ｍｇ／ｋｇから０．５ｍｇ／ｋｇ、及び０．７２ｍｇ／ｋｇにそれぞれ低下し、一方、Ｍｅｔ／Ａｃｅ＠ＢＣ－ＤＰ＋ＬＨＡ６組み合わせは、米中の総ヒ素含有量を０．４５ｍｇ／ｋｇにさらに低下させた。さらに重要なことは、この組み合わせ処理は、米中の無機ヒ素の割合を大幅に下げ、１５．７％にし、対照群の７４．５％、Ｍｅｔ／Ａｃｅ＠ＢＣ－ＤＰ単独処理群の２１．４％、及びＬＨＡ６処理群の５５．７％よりも大幅に低下した。無機ヒ素は毒性がより強く、使用が管理された唯一なヒ素形態である。このことから、Ｍｅｔ／Ａｃｅ＠ＢＣ－ＤＰ＋ＬＨＡ６組み合わせは米中の総ヒ素及び無機ヒ素の割合を低下させる特徴を有することが分かり、同様に、さまざまな処理群のうち、Ｍｅｔ／Ａｃｅ＠ＢＣ－ＤＰ＋ＬＨＡ６組み合わせは土壌中のメチルヒ素の割合を大幅に向上させ、１８９．５μＭにし、土壌対照群の１０．５μＭに対しては、１８倍以上向上した。また、Ｍｅｔ／Ａｃｅ＠ＢＣ－ＤＰ＋ＬＨＡ６組み合わせ処理では、米の増産が大幅に促進され、米の産量は対照群の８．９ｇ／本から、１１．２ｇ／本に向上した。全体的には、ポット実験は土壌ヒ素汚染修復、米のヒ素リスク低減の分野における本技術の将来性を確かめた。
上記実施例は本発明の好適な実施形態であるが、本発明の実施形態は前記実施例によって制限されるものではなく、本発明の主旨及び原理を逸脱することなく行われる変化、修飾、置換、組み合わせ、簡素化は全て等価置換の形態となり、本発明の特許請求の範囲に含まれるものとする。
Claims (9)
- 土壌微生物の標的制御によりヒ素転化と温室効果ガスの排出削減を同時に実現する方法であって、
メチオニンと有機酸塩を含有する製剤を亜ヒ酸イオン及び／又はヒ酸イオン汚染土壌に投入し、ヒ素メチル化とメタンの排出削減を同時に実現するステップを含み、
前記有機酸塩はナトリウム、カリウム、カルシウムの酢酸塩、乳酸塩及び酪酸塩のうちの少なくとも１種であり、
前記メチオニンと有機酸塩とのモル比が１：５～１：５０であり、
前記メチオニンの添加量は反応系中の濃度を０．５～１．５ｍＭにするものである、ことを特徴とする方法。 - 前記メチオニンと有機酸塩とのモル比が１：１０であり、
前記メチオニンの添加量は反応系中の濃度を１ｍＭにするものであり、
前記メチル化はモノメチル化、ジメチル化及びトリメチル化のうちの少なくとも１種であり、
前記土壌は水田土壌である、ことを特徴とする請求項１に記載の土壌微生物の標的制御によりヒ素転化と温室効果ガスの排出削減を同時に実現する方法。 - 請求項１～２のいずれか１項に記載の前記メチオニンと有機酸塩を含有する製剤である、ことを特徴とする土壌微生物の標的制御によりヒ素転化と温室効果ガスの排出削減を同時に実現する製剤。
- メチオニンと有機酸塩とを直接混合する方法I、又は、メチオニンと有機酸塩を多孔質バイオ炭材料内に担持する方法IIである、ことを特徴とする請求項３に記載の土壌微生物の標的制御によりヒ素転化と温室効果ガスの排出削減を同時に実現する製剤の製造方法。
- 前記多孔質バイオ炭材料は、
バイオマス原料を破砕して粒径２ｍｍ未満の粒子とし、洗浄して乾燥するステップ１と、
ステップ１で製造された粒子を真空管状炉に入れて、窒素ガス又は不活性ガスの保護下で５００～１１００℃に昇温し、１～３時間保温すると、未処理多孔質バイオ炭材料を得るステップ２と、
ステップ２で製造された未処理多孔質バイオ炭材料を、ドーパミン含有Ｔｒｉ－ＨＣｌ緩衝溶液、又はドーパミンとシステインを含有するＴｒｉ－ＨＣｌ緩衝溶液に浸漬して反応させ、前記多孔質バイオ炭材料を得るステップ３とを含む方法によって製造され、
ステップ１では、前記洗浄して乾燥するステップは、具体的には、得られた粒子を２．５Ｍ ＮａＯＨ、０．４Ｍ Ｎａ２ＳＯ３、２．５Ｍ Ｈ２Ｏ２の混合溶液に浸漬して均一に撹拌し、反応釜に移して、１００℃で１０ｈ保温することであり、
ステップ３では、前記Ｔｒｉ－ＨＣｌ緩衝溶液は、濃度１０ｍＭ、ｐＨ＝７．５±０．２であり、
ステップ３では、前記ドーパミン及びシステインの反応系中の濃度が全て０．５～１．５ｍＭであり、
ステップ３では、前記反応の条件は、５０～７０ｍｉｎ撹拌反応することである、ことを特徴とする請求項４に記載の製造方法。 - 方法Iのステップでは、具体的には、メチオニンと有機酸塩を炭酸水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、塩化アンモニウムの混合溶液にて混合し、
方法IIのステップでは、具体的には、多孔質バイオ炭材料を得た後、メチオニンと有機酸塩を直接加えて撹拌し、メチオニンと有機酸塩を多孔質バイオ炭材料に十分に吸着して複合系を形成し、その後、乾燥して、前記土壌微生物の標的制御によりヒ素転化と温室効果ガスの排出削減を同時に実現する製剤を得て、前記メチオニンと有機酸塩の反応系中の濃度が、形成される複合系中のメチオニンと有機酸塩とのモル比を１：５～１：５０にするものである、ことを特徴とする請求項４に記載の製造方法。 - 前記製剤とクロストリジウム属細菌の両方を亜ヒ酸イオン及び／又はヒ酸イオン汚染土壌に投入し、ヒ素メチル化とメタンの排出削減を同時に実現する、ことを特徴とする請求項３に記載の土壌微生物の標的制御によりヒ素転化と温室効果ガスの排出削減を同時に実現する製剤の使用。
- 前記クロストリジウム属細菌はクロストリジウム・スポロゲネス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）ＬＨＡ６である、ことを特徴とする請求項７に記載の使用。
- 請求項３に記載の製剤と、請求項７に記載のクロストリジウム属細菌とを含む、ことを特徴とする土壌微生物の標的制御によりヒ素転化と温室効果ガスの排出削減を同時に実現する複合製剤。
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