CN114711391B - 一种发酵肉制品及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于食品加工技术领域，涉及一种发酵肉制品及其制备方法。包括以下步骤：制备汉逊德巴利酵母X35和季也蒙毕赤酵母J1‑2的发酵剂，对牛腩肉依次进行修整、预腌制、腌制、发酵和烘烤。将菌株用于发酵肉制品制备，一方面能够抑制腐败微生物繁殖，抑制脂肪氧化酸败；另一方面，与传统手工制备腊肉相比，在上述工艺条件下，不受天气情况影响，生产周期缩短至7天，产品中N‑亚硝胺类物质含量低，N‑亚硝胺类物质中NDEA含量最高降低了73.0%（与信阳腊肉相比），其他N‑亚硝胺类物质未检出；且产品水分含量高，口感好、营养丰富，风味、色泽和质地独特，保质期长。
Description
技术领域
本发明属于食品加工技术领域，涉及一种发酵肉制品及其制备方法。
背景技术
发酵肉制品是指在自然或人工控制条件下，利用微生物或酶的发酵作用，使原料肉发生一系列生物化学变化及物理变化，而形成具有特殊风味、色泽和质地以及较长保藏期的肉制品。发酵肉制品种类丰富，但是在我国多采用自然发酵的方法。信阳腊肉等地方特色的腌腊肉制品，风味独特，其制作以腌制后风干自然发酵为主，加工周期长，受环境气候条件变化较大时，产品过氧化值和生物胺过高，而且N-亚硝胺类物质含量高，从而影响质量和安全性。
N-亚硝胺（N-nitrosamines，NAs）是一类亚硝基化合物的总称，通常由二级胺的亚硝化反应生成。食品中常见的亚硝胺有N-亚硝基二甲胺（N-Nitrosodimethylamine，NDMA）、N-亚硝基甲乙胺（N-nitrosomethylethylamine，NMEA）、N-亚硝基二乙胺（N-nitrosodiethylaminen，NDEA）、N-亚硝基吡咯烷（N-Nitrosopyrrolidine，NPYR）、N-亚硝基吗啉（N-nitrosomorpholine，NMOR）、N-亚硝基二丙胺（N-Nitrosodi-n-propylanime，NDPA）、N-亚硝基哌啶（N-Nitrosopiperidine，NPIP）、N-亚硝基二丁胺（N-Nitrosodibutylamine，NDBA）等。其中，国际癌症研究机构把NDMA和NDEA列为2A致癌物，超过10种亚硝胺被列为2B致癌物。因此，开发发酵肉制品中亚硝胺类物质的控制技术和方法是该领域亟需解决的问题。
发酵剂是发酵肉制品的核心，发酵剂的正确使用可以有效地缩短生产周期，提高产品质量和安全性。国内外对发酵剂的研究主要集中在优势发酵菌种发酵剂的筛选，常见的发酵剂有乳酸菌、酵母菌、葡萄球菌和霉菌等，但在信阳腊肉等手工发酵肉制品生产过程中有效利用微生物发酵抑制产品中N-亚硝胺类物质的方法未见报道。
发明内容
针对现有技术中发酵肉制品生产周期长、N-亚硝基类化合物含量高的技术问题，本发明提出一种发酵肉制品及其制备方法，利用筛选的汉逊德巴利酵母X35和季也蒙毕赤酵母J1-2，进行阶段性腌制和控温发酵，显著缩短了生产周期，有效降低了产品中N-亚硝胺类物质含量，改善了肉制品口感和风味，增强肉制品品质。
为了达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种发酵肉制品，以汉逊德巴利酵母和季也蒙毕赤酵母为发酵剂对腌制肉制品进行发酵，得到的发酵肉制品生产周期为7天；与信阳腊肉等手工腊肉产品相比，生产周期短，不受天气情况限制，而且发酵肉制品中N-亚硝胺类物质中NDEA的含量降低了66.0-73.0%，其他N-亚硝胺类物质未检出。
进一步，所述的汉逊德巴利酵母分类名为Debaryomyces hansenii X35，保藏号为CCTCC NO: M 2022406，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2022年4月11日，保藏地址为中国.武汉.武汉大学；所述的季也蒙毕赤酵母的分类名为Meyerozyma guilliermondii J1-2，保藏号为CCTCC NO: M 2022405，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2022年4月11日，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
进一步，所述的发酵肉制品的制备方法，步骤如下：
（1）发酵剂的制备：将汉逊德巴利酵母X35和季也蒙毕赤酵母J1-2分别在培养基上进行活化、培养获得汉逊德巴利酵母菌液和季也蒙毕赤酵母菌液，然后按比例混合后经离心浓缩得发酵剂；
（2）肉制品预腌制：将新鲜牛腩肉去除筋腱，修整为大小均匀的块状，然后在无菌容器中，将炒制后的食盐、花椒、八角和香叶混匀加入肉块中，进行预腌制，得到预腌制肉制品；
（3）预腌制肉制品的腌制：向步骤（2）所得的预腌制的肉制品加入50-55°白酒、白砂糖、小茴香粉、姜粉、大蒜粉、白胡椒粉和亚硝酸钠，继续腌制，期间翻倒至少3次，得到腌制肉制品；
（4）腌制肉制品的发酵：将步骤（1）所得的汉逊德巴利酵母和季也蒙毕赤酵母的发酵剂混合后按一定接种比例接种到步骤（3）所得的腌制肉制品中，进行发酵；
（5）将步骤（4）所得的发酵好的肉块放入烟熏炉中，进行烘制，即为成品。
进一步，所述步骤（1）中菌液的制备方法为：在无菌条件下挑取单菌落接种于含50mL液体培养基的250mL摇瓶中，28℃、200rpm、培养48h，制得菌液；再在4500rpm条件下离心，将菌液浓缩为5mL，得到发酵剂。
进一步，所述步骤（2）中牛腩肉的大小为30cm*20cm*2cm，食盐、花椒、八角和香叶添加量分别为牛腩肉质量的5%，0.02%，0.01%，0.005%，预腌制时间为24h，预腌制温度为4℃。
进一步，所述步骤（3）中50-55°白酒添加量为牛腩肉质量的1%、白砂糖添加量为牛腩肉质量的2%、小茴香粉添加量为牛腩肉质量的0.2%、姜粉添加量为牛腩肉质量的0.05%、大蒜粉添加量为牛腩肉质量的0.2%、白胡椒粉添加量为牛腩肉质量的0.05%、亚硝酸钠添加量为牛腩肉质量的0.05%。
进一步，所述步骤（3）中翻倒为每隔12h翻倒一次，腌制温度为4℃。
进一步，所述步骤（4）中汉逊德巴利酵母和季也蒙毕赤酵母发酵剂的混合比例为1：（0.5-2）。
进一步，所述步骤（4）中混合后的接种比例为106 CFU/g，发酵温度为30℃，发酵时间为48h。
进一步，所述步骤（5）中烘制温度为40℃，烘制时间为48h。
本发明具有以下有益效果：
1、利用本发明制备方法制备的发酵肉制品，能够将传统手工腊肉生产周期缩短为7天。
2、本发明基于对发酵过程的分析以及相关实验，证明发酵肉制品中NDEA等N-亚硝胺类化合物含量的减少是微生物的作用，微生物发酵降低了发酵肉制品中N-亚硝胺类化合物的含量，特别是两种菌株联用后，效果显著。与传统手工腊肉，特别是信阳腊肉相比，NDEA含量最高降低了73%，其他N-亚硝胺类物质未检出。同时两种菌株在抑制发酵肉制品的组胺值、过氧化值、肠杆菌科数、霉菌和酵母数等均具有较好的效果。
3、本发明提出一种发酵肉制品及其制备方法，所用菌株均从地方特色腊肉中筛选出来，发酵产物食品安全性高，可以直接用于发酵肉制品的生产，能够抑制腐败微生物繁殖，抑制脂肪氧化酸败，产品具有含水量高，口感好，营养丰富，风味、色泽和质地独特，保质期长等优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明季也蒙毕赤酵母J1-2镜检图。
图2为本发明汉逊德巴利酵母X35镜检图。
图3为本发明季也蒙毕赤酵母J1-2基因进化树。
图4为本发明汉逊德巴利酵母X35基因进化树。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
下述实施例中，所述汉逊德巴利酵母X35（Debaryomyces hansenii）和季也蒙毕赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）J1-2均筛选自地方特色手工腊肉中，并且保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号分别为CCTCC NO:M 2022406和CCTCC NO:M2022405。其菌剂的制备方法不受特别限制，可以培养成液体菌剂，也可以通过冻干、风干、喷雾干燥等方法制备成固体菌剂，使用时培养成菌液，按照CFU/mL进行定量。
pH测定：按照GB 5009.237-2016 食品安全国家标准 食品pH值的测定进行。
水分活度测定：按照GB 5009.238-2016 食品安全国家标准 食品水分活度的测定进行。
组胺定量：按照GB 5009.208-2016 食品安全国家标准食品中生物胺含量的测定进行。
微生物检测：按照GB 4789-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验进行。
过氧化值定量：按照GB 5009.227-2016 食品安全国家标准食品中过氧化值的测定进行。
N-亚硝胺类化合物的检测：按照GB 5009.26-2016 食品安全国家标准 食品中N-亚硝胺类化合物的测定进行。
本发明所用孟加拉红固体培养基的配方为：蛋白胨0.5%，葡萄糖1%，KH2PO4 0.1%，MgSO4 0.05%，琼脂2%，孟加拉红0.0033%，氯霉素0.01%，121℃灭菌15min。
本发明所用液体培养基的配方为：蛋白胨0.5%，葡萄糖1%，KH2PO4 0.1%，MgSO40.05%，孟加拉红0.0033%，氯霉素0.01%，121℃灭菌15min。
实施例1
本实施例发酵肉制品的制备方法：步骤如下：
（1）汉逊德巴利酵母X35酵母的分离、筛选和鉴定
1.1）采样：本发明涉及菌株从河南信阳地方特色手工腊肉中筛选而来。
1.2）分离和筛选：在无菌条件下，称取25g样品，剪碎，加入225mL无菌生理盐水，放入无菌均质袋中，用均质器进行均质。用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释涂布平板，在28℃条件下倒置培养48h。挑取平板上不同形态的菌株，观察菌落形态，将获得的单菌落进行平板划线处理，进行多次纯化，用作初筛菌株。
挑取生长较好、性状不同初筛菌株接种于孟加拉红固体培养基上，28℃条件下倒置培养48h，进行复筛。选择有30-150菌落的平板，选择菌落为单一的，大小不一的，光泽度不一的菌落，进行划线纯化培养；用美兰染色法进行镜检，直至镜检下为纯种的菌株。
1.3）鉴定：将纯化好的单菌落进行美兰染色处理，观察菌落形态，如图2所示。采用16S rDNA通用PCR引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）作为上下游引物进行PCR扩增反应，扩增条件见表1，PCR产物4℃保藏。由北京六合华大基因科技有限公司（武汉分公司）完成测序（结果见表2），采用16SrDNA测序方法对菌株进行分子学生物鉴定。经BLAST比对，用NeighborJoining构建目标菌株的系统发育树，结果如图4所示。菌株X35与多株汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）同源性达到99%，与模式菌株汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）OK267918.1处于同一分支，可鉴定菌株X35为汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）。
（2）发酵剂的制备：将培养的汉逊德巴利酵母菌株X35在无菌条件下挑取单菌落接种于含50mL液体培养基的250mL摇瓶中，28℃、200rpm、培养48h，即制得菌液；再在4500rpm条件下离心，将菌液浓缩为5mL，得到发酵剂。
（3）发酵流程：先将新鲜牛腩肉去除筋腱，整理为30cm*20cm*2cm大小均匀的块状，备用。然后，在无菌容器中将炒制后的5%牛腩肉质量的食盐、0.02%牛腩肉质量的花椒、0.01%牛腩肉质量的八角和0.005%牛腩肉质量的香叶混匀加入肉块中，在4℃条件下，进行初步腌制24h；之后，添加1%牛腩肉质量的50-55°白酒、2%牛腩肉质量的白砂糖、0.2%牛腩肉质量的小茴香粉、0.05%牛腩肉质量的姜粉、0.2%牛腩肉质量的大蒜粉、0.05%牛腩肉质量的白胡椒粉和0.05%牛腩肉质量的亚硝酸钠，每隔12h翻倒一次，进行4次翻倒后，腌制48h即可，按照106 CFU/g的接种比例将汉逊德巴利酵母接种到肉块中，在30℃条件下发酵48 h；最后，将发酵好的肉放入烟熏炉中，在40℃条件下烘制48h，即为成品。这种发酵肉制品，和不确定加工时长（约15-30天）的传统自然腊肉相比，加工周期更短，仅为7天，而且不受天气情况的影响，能够精确控制。
对本实施例发酵肉制品的pH、水分活度、理化及微生物指标以及N-亚硝胺化合物的含量按照国家标准进行测定，同时对发酵肉制品的感官品质进行评价，结果如表3、表4、表5、表6及表7所示。
实施例2
本实施例发酵肉制品的制备方法：步骤如下：
（1）季也蒙毕赤酵母J1-2的分离、筛选和鉴定
1.1）采样：本发明涉及菌株从河南信阳地方特色手工腊肉中筛选而来。
1.2）分离和筛选：在无菌条件下，称取25g样品，剪碎，加入225mL无菌生理盐水，放入无菌均质袋中，用均质器进行均质。用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释涂布平板，在28℃条件下倒置培养48h。挑取平板上不同形态的菌株，观察菌落形态，将获得的单菌落进行平板划线处理，进行多次纯化，用作初筛菌株。
挑取生长较好、性状不同初筛菌株接种于孟加拉红固体培养基上，28℃条件下倒置培养48h，进行复筛。选择有30-150菌落的平板，选择菌落为单一的，大小不一的，光泽度不一的菌落，进行划线纯化培养；用美兰染色法进行镜检，直至镜检下为纯种的菌株。
1.3）鉴定：将纯化好的单菌落进行美兰染色处理，观察菌落形态，如图1所示。采用16S rDNA通用PCR引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）作为上下游引物进行PCR扩增反应，扩增条件见表1，PCR产物4℃保藏。由北京六合华大基因科技有限公司（武汉分公司）完成测序（结果见表2），采用16SrDNA测序方法对菌株进行分子学生物鉴定。经BLAST比对，用NeighborJoining构建目标菌株的系统发育树，结果如图3所示。菌株J1-2与多株季也蒙毕赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）同源性达到99%，与模式菌株季也蒙毕赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）OK267918.1处于同一分支，可鉴定菌株J1-2为季也蒙毕赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）。
表1 PCR反应体系和反应条件
表2 菌株测序结果
（2）发酵剂的制备：将培养的季也蒙毕赤酵母菌株J1-2在无菌条件下挑取单菌落接种于含50mL液体培养基的250mL摇瓶中，28℃、200rpm、培养48h，即制得菌液；再在4500rpm条件下离心，将菌液浓缩为5mL，得到发酵剂。
（3）发酵流程：先将新鲜牛腩肉去除筋腱，整理为30cm*20cm*2cm大小均匀的块状，备用。然后，在无菌容器中将炒制后的5%牛腩肉质量的食盐、0.02%牛腩肉质量的花椒、0.01%牛腩肉质量的八角和0.005%牛腩肉质量的香叶混匀加入肉块中，在4℃条件下，进行初步腌制24h；之后，添加1%牛腩肉质量的50-55°白酒、2%牛腩肉质量的白砂糖、0.2%牛腩肉质量的小茴香粉、0.05%牛腩肉质量的姜粉、0.2%牛腩肉质量的大蒜粉、0.05%牛腩肉质量的白胡椒粉和0.05%牛腩肉质量的亚硝酸钠，每隔12h翻倒一次，进行4次翻倒后，腌制48h即可，按照106 CFU/g的接种比例将季也蒙毕赤酵母接种到肉块中，在30℃条件下发酵48 h；最后，将发酵好的肉放入烟熏炉中，在40℃条件下烘制48h，即为成品。
对本实施例发酵肉制品的pH、水分活度、理化及微生物指标以及N-亚硝胺化合物的含量按照国家标准进行测定，同时对发酵肉制品的感官品质进行评价，结果如表3、表4、表5、表6及表7所示。
实施例3
本实施例发酵肉制品的制备方法：步骤如下：
（1）发酵剂的制备：将培养的汉逊德巴利酵母菌株X35和季也蒙毕赤酵母菌株J1-2分别在无菌条件下挑取单菌落接种于含50mL液体培养基的250mL摇瓶中，28℃、200rpm、培养48h，即制得菌液；再在4500rpm条件下离心，将菌液浓缩为5mL，得到汉逊德巴利酵母发酵剂和季也蒙毕赤酵母发酵剂。
（2）发酵流程：先将新鲜牛腩肉去除筋腱，整理为30cm*20cm*2cm大小均匀的块状，备用。然后，在无菌容器中将炒制后的5%牛腩肉质量的食盐、0.02%牛腩肉质量的花椒、0.01%牛腩肉质量的八角、0.005%牛腩肉质量的香叶混匀加入肉块中，在4℃条件下，进行初步腌制24h；之后，添加1%牛腩肉质量的50-55°白酒、2%牛腩肉质量的白砂糖、0.2%牛腩肉质量的小茴香粉、0.05%牛腩肉质量的姜粉、0.2%牛腩肉质量的大蒜粉、0.05%牛腩肉质量的白胡椒粉、0.05%牛腩肉质量的亚硝酸钠，每隔12h翻倒一次，进行4次翻倒后，腌制48h即可，按照106 CFU/g的接种比例将混合比例为1:1的汉逊德巴利酵母和季也蒙毕赤酵母接种到肉块中，在30℃条件下发酵48h；最后，将发酵好的肉放入烟熏炉中，在40℃条件下烘制48h，即为成品。
对本实施例发酵肉制品的pH、水分活度、理化及微生物指标以及N-亚硝胺化合物的含量按照国家标准进行测定，同时对发酵肉制品的感官品质进行评价，结果如表3、表4、表5、表6及表7所示。
实施例4
本实施例发酵肉制品的制备方法：步骤如下：
（1）发酵剂的制备：将培养的汉逊德巴利酵母菌株X35和季也蒙毕赤酵母菌株J1-2分别在无菌条件下挑取单菌落接种于含50mL液体培养基的250mL摇瓶中，28℃、200rpm、培养48h，即制得菌液；再在4500rpm条件下离心，将菌液浓缩为5mL，得到汉逊德巴利酵母发酵剂和季也蒙毕赤酵母发酵剂。
（2）发酵流程：先将新鲜牛腩肉去除筋腱，整理为30cm*20cm*2cm大小均匀的块状，备用。然后，在无菌容器中将炒制后的5%牛腩肉质量的食盐、0.02%牛腩肉质量的花椒、0.01%牛腩肉质量的八角、0.005%牛腩肉质量的香叶混匀加入肉块中，在4℃条件下，进行初步腌制24h；之后，添加1%牛腩肉质量的50-55°白酒、2%牛腩肉质量的白砂糖、0.2%牛腩肉质量的小茴香粉、0.05%牛腩肉质量的姜粉、0.2%牛腩肉质量的大蒜粉、0.05%牛腩肉质量的白胡椒粉、0.05%牛腩肉质量的亚硝酸钠，每隔12h翻倒一次，进行4次翻倒后，腌制48h即可，按照106 CFU/g的接种比例将混合比例为1:2的汉逊德巴利酵母和季也蒙毕赤酵母接种到肉块中，在30℃条件下发酵48h；最后，将发酵好的肉放入烟熏炉中，在40℃条件下烘制48h，即为成品。
对本实施例发酵肉制品的pH、水分活度、理化及微生物指标以及N-亚硝胺化合物的含量按照国家标准进行测定，同时对发酵肉制品的感官品质进行评价，结果如表3、表4、表5、表6及表7所示。
实施例5
本实施例发酵肉制品的制备方法：步骤如下：
（1）发酵剂的制备：将培养的汉逊德巴利酵母菌株X35和季也蒙毕赤酵母菌株J1-2分别在无菌条件下挑取单菌落接种于含50mL液体培养基的250mL摇瓶中，28℃、200rpm、培养48h，即制得菌液；再在4500rpm条件下离心，将菌液浓缩为5mL，得到汉逊德巴利酵母发酵剂和季也蒙毕赤酵母发酵剂。
（2）发酵流程：先将新鲜牛腩肉去除筋腱，整理为30cm*20cm*2cm大小均匀的块状，备用。然后，在无菌容器中将炒制后的5%牛腩肉质量的食盐、0.02%牛腩肉质量的花椒、0.01%牛腩肉质量的八角、0.005%牛腩肉质量的香叶混匀加入肉块中，在4℃条件下，进行初步腌制24h；之后，添加1%牛腩肉质量的50-55°白酒、2%牛腩肉质量的白砂糖、0.2%牛腩肉质量的小茴香粉、0.05%牛腩肉质量的姜粉、0.2%牛腩肉质量的大蒜粉、0.05%牛腩肉质量的白胡椒粉、0.05%牛腩肉质量的亚硝酸钠，每隔12h翻倒一次，进行4次翻倒后，腌制48h即可，按照106 CFU/g的接种比例将混合比例为2:1的汉逊德巴利酵母和季也蒙毕赤酵母接种到肉块中，在30℃条件下发酵48h；最后，将发酵好的肉放入烟熏炉中，在40℃条件下烘制48h，即为成品。
对本实施例发酵肉制品的pH、水分活度、理化及微生物指标以及N-亚硝胺化合物的含量按照国家标准进行测定，同时对发酵肉制品的感官品质进行评价，结果如表3、表4、表5、表6及表7所示。
对比例1：空白
本对比例空白的制备方法，步骤如下：
先将新鲜牛腩肉去除筋腱，整理为30cm*20cm*2cm大小均匀的块状，备用。然后，在无菌容器中将炒制后的5%牛腩肉质量的食盐、0.02%牛腩肉质量的花椒、0.01%牛腩肉质量的八角、0.005%牛腩肉质量的香叶混匀加入肉块中，在4℃条件下，进行初步腌制24h；之后，添加1%牛腩肉质量的50-55°白酒、2%牛腩肉质量的白砂糖、0.2%牛腩肉质量的小茴香粉、0.05%牛腩肉质量的姜粉、0.2%牛腩肉质量的大蒜粉、0.05%牛腩肉质量的白胡椒粉、0.05%牛腩肉质量的亚硝酸钠，每隔12h翻倒一次，进行4次翻倒后，腌制48h即可，不进行接种，在30℃条件下进行自然发酵48h；最后，将发酵好的肉放入烟熏炉中，在40℃条件下烘制48h，即为成品。
对空白的pH、水分活度、理化及微生物指标以及N-亚硝胺化合物的含量按照国家标准进行测定，同时对发酵肉制品的感官品质进行评价，结果如表3、表4、表5、表6及表7所示。
对比例2：四川腊肉
本对比例四川腊肉的制备方法，步骤如下：
选用前夹、后腿、保肋三线等部位新鲜鲜猪肉，剔去骨头，整修成形，再切成长35cm*6cm的肉条；然后将8%精盐、0.15% 50-55°白酒、1%白糖、0.15%五香粉、0.05%硝酸钠混匀，再均匀搓抹在肉块；肉面向上，皮向下，平放在瓷盆中，腌制4~5天，翻倒一次，再腌4~5天；腌好的肉条用温水洗刷干净，穿绳，挂在通风处，自然晾干水分，冬季大约需要7-20天。
对四川腊肉的pH、水分活度、理化及微生物指标以及N-亚硝胺化合物的含量按照国家标准进行测定，同时对发酵肉制品的感官品质进行评价，结果如表3、表4、表5、表6及表7所示。
对比例3：湖南腊肉
本对比例湖南腊肉的制备方法，步骤如下：
将新鲜猪肉去骨，修整为35cm*3cm，重5000g左右的肉条；加入6%食盐，0.1%花椒，0.05%硝酸钠，0.025%酱油、0.15% 50-55°白酒、1%白糖、0.1%桂皮、0.2%八角、0.1%小茴香、0.2%胡椒，腌制5-7天；取出肉条，给肉条穿上长约25cm的线绳，将腌肉挂晒在干净，通风，阴凉的地方，晾晒5-7天；把晾干的肉坯悬挂在熏房内，悬挂的肉块之间应留出0.5-1m距离，然后点燃木炭和锯末，紧闭房门，熏制3-15天，烟熏均匀即可。
对湖南腊肉的pH、水分活度、理化及微生物指标以及N-亚硝胺化合物的含量按照国家标准进行测定，同时对发酵肉制品的感官品质进行评价，结果如表3、表4、表5、表6及表7所示。
对比例4：信阳腊肉
本对比例信阳腊肉的制备方法，步骤如下：
先将新鲜猪五花肉去除筋腱，整理为30cm*20cm*2cm大小均匀的块状，备用；然后，加入6%食盐进行初步腌制3h；之后，将除50-55°白酒之外的辅料（8%生抽、3%老抽、2%白砂糖、0.05%花椒粒、0.01%八角）混合均匀，烧开，晾凉，将腌制好的肉块放入其中，加入2% 55°白酒，搅拌均匀，进行密封腌制5-10天；腌制完把肉块拿出来，去除粘在肉上的花椒大料，用绳子把肉给绑起来，放在阴凉通风的地方晾晒7-15天，即为成品。
对信阳腊肉的pH、水分活度、理化及微生物指标以及N-亚硝胺化合物的含量按照国家标准进行测定，同时对发酵肉制品的感官品质进行评价，结果如表3、表4、表5、表6及表7所示。
检测试验
在上述条件下，空白、四川腊肉、湖南腊肉以及信阳腊肉和本实施例1-5发酵肉制品的pH见表3，水分活度(Aw)见表4，感官品质见表5，理化及微生物指标见表6，N-亚硝胺化合物含量（μg/kg）见表7。
表3 发酵牛肉的pH
表3为对照品和本发明实施例1-5发酵牛肉的pH数据。由表3可知，本发明制备的发酵肉制品pH值符合国家标准。
表4 发酵牛肉的水分活度(Aw)
表4为对照品和本发明实施例1-5发酵牛肉的水分活度数据。由表4可知，本发明制备的发酵牛肉具有较高的水分活度，符合国家标准。
表5 发酵牛肉的感官品质
表5为对照品和本发明实施例1-5发酵牛肉的感官评价，由表5可知，经过本发明方法制备的发酵肉制品在色泽上脂肪较透明，瘦肉较红，皮较金黄色，口感上鲜嫩爽口，硬度适中，有弹性，气味上有较浓郁的腊香味，滋味上无哈喇味，咸味、鲜味适口，无齁味，组织状态上组织紧密，肌丝保持原有状态。
表6 发酵牛肉理化及微生物指标
表6为对照品和本发明实施例1-5发酵牛肉理化及微生物指标。由表6可知，在空白以及各类腊肉制品中，本发明制备的发酵肉制品的组胺含量较低，相对于信阳腊肉组胺含量为18.39mg/kg，本发明发酵肉制品组胺含量为10.33-11.78mg/kg，降幅为35.9-43.8%；相对于信阳腊肉过氧化值为1.54g/kg，本发明发酵肉制品中过氧化值含量为0.17-0.21，降幅为86.4%-89.0%；相对于信阳腊肉的肠杆菌科含量为6 CFU/g，霉菌和酵母含量为9 CFU/g，本发明发酵肉制品肠杆菌科和霉菌和酵母含量为0，降幅100%。本发明发酵肉制品的各项理化及微生物指标均符合国家标准，且过氧化值和组胺含量低于空白，显著低于市场产品，具有非常突出的效果。
表7 发酵牛肉中N-亚硝胺化合物含量（μg/kg）
表7为对照品和本发明实施例1-5发酵牛肉中N-亚硝胺化合物的含量测定数据，由表7可知，空白和各类传统手工腊肉中的NDEA含量处于较高水平。与空白相比，实施例1产品中NDEA含量降低了55%；实施例2产品中NDEA含量降低了50%；实施例3-5产品中N-亚硝基二乙胺含量最高降低了60%，显著低于市场产品；其他N-二乙基N-亚硝胺类化合物未检出。特别是相对于信阳腊肉中NDEA的含量72.60μg/kg，利用本发明所选菌株进行联合发酵后，实施例1-2 NDEA的含量为21.82μg/kg和24.70μg/kg，降解率分别为69.9%和66.0%，实施例3-5NDEA含量为19.76μg/kg、20.62μg/kg和19.61μg/kg，降解率分别为72.8%、71.6%、73.0%，效果显著。
从表3-7所测数据表明：发酵肉制品中组胺、过氧化值、肠杆菌科数值、霉菌和酵母数值以及NDEA等N-亚硝胺类化合物含量的减少是微生物的作用，并且两种微生物联用效果更显著。同时经过微生物发酵后的肉制品风味更佳、口感好，安全性也更高。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种发酵肉制品，其特征在于：以汉逊德巴利酵母和季也蒙毕赤酵母为发酵剂对腌制肉制品进行发酵，所述的汉逊德巴利酵母分类名为Debaryomyces hansenii X35，保藏号为CCTCC NO: M 2022406，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2022年4月11日，保藏地址为中国武汉的武汉大学；所述的季也蒙毕赤酵母的分类名为Meyerozyma guilliermondii J1-2，保藏号为CCTCC NO: M 2022405，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2022年4月11日，保藏地址为中国武汉的武汉大学，所述的发酵肉制品的制备方法，步骤如下：
（1）发酵剂的制备：将汉逊德巴利酵母X35和季也蒙毕赤酵母J1-2分别在培养基上进行活化、培养获得汉逊德巴利酵母X35菌液和季也蒙毕赤酵母J1-2菌液，然后经离心浓缩得发酵剂，所述菌液的制备方法为：在无菌条件下挑取单菌落接种于含50mL液体培养基的250mL摇瓶中，28℃、200rpm、培养48h，制得菌液；再在4500rpm条件下离心，将菌液浓缩为5mL，得到发酵剂；
（2）肉制品预腌制：将新鲜牛腩肉去除筋腱，修整为大小均匀的块状，然后在无菌容器中，将炒制后的食盐、花椒、八角和香叶混匀加入肉块中，进行预腌制，得到预腌制肉制品；
（3）预腌制肉制品的腌制：向步骤（2）所得的预腌制的肉制品加入50-55°白酒、白砂糖、小茴香粉、姜粉、大蒜粉、白胡椒粉和亚硝酸钠，继续腌制，期间翻倒至少3次，得到腌制肉制品；
（4）腌制肉制品的发酵：将步骤（1）所得的汉逊德巴利酵母和季也蒙毕赤酵母的发酵剂混合后按一定接种比例接种到步骤（3）所得的腌制肉制品中，进行发酵，所述汉逊德巴利酵母和季也蒙毕赤酵母发酵剂的混合比例为1：（0.5-2），混合后的接种比例为106 CFU/g，发酵温度为30℃，发酵时间为48h；
（5）将步骤（4）所得的发酵好的肉块放入烟熏炉中，进行烘制，即为成品。
2.根据权利要求1所述的发酵肉制品，其特征在于：所述步骤（2）中牛腩肉的大小为30cm*20cm*2cm，食盐、花椒、八角和香叶添加量分别为牛腩肉质量的5%，0.02%，0.01%，0.005%，预腌制时间为24h，预腌制温度为4℃。
3.根据权利要求1所述的发酵肉制品，其特征在于：所述步骤（3）中50-55°白酒添加量为牛腩肉质量的1%、白砂糖添加量为牛腩肉质量的2%、小茴香粉添加量为牛腩肉质量的0.2%、姜粉添加量为牛腩肉质量的0.05%、大蒜粉添加量为牛腩肉质量的0.2%、白胡椒粉添加量为牛腩肉质量的0.05%、亚硝酸钠添加量为牛腩肉质量的0.05%。
4.根据权利要求1所述的发酵肉制品，其特征在于：所述步骤（3）中翻倒为每隔12h翻倒一次，腌制温度为4℃。
5.根据权利要求1所述的发酵肉制品，其特征在于：所述步骤（5）中烘制温度为40℃，烘制时间为48h。
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