CN114703294A - 用于川金丝猴个体示踪的微卫星检测方法、位点组合及引物组合、试剂盒与应用 - Google Patents
用于川金丝猴个体示踪的微卫星检测方法、位点组合及引物组合、试剂盒与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114703294A CN114703294A CN202210353821.8A CN202210353821A CN114703294A CN 114703294 A CN114703294 A CN 114703294A CN 202210353821 A CN202210353821 A CN 202210353821A CN 114703294 A CN114703294 A CN 114703294A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gsm
- microsatellite
- golden
- dna
- individual
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108091092878 Microsatellite Proteins 0.000 title claims abstract description 82
- 241000718131 Cercopithecus kandti Species 0.000 title claims abstract description 60
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 69
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 14
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 12
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 8
- VMVWLAPASRQXFL-QFWMQHCXSA-N 2-[(2s,4r)-1-[(1r)-1-(4-chlorophenyl)-4-methylpentyl]-2-[4-(trifluoromethyl)phenyl]piperidin-4-yl]acetic acid Chemical compound C1([C@@H]2C[C@H](CC(O)=O)CCN2[C@H](CCC(C)C)C=2C=CC(Cl)=CC=2)=CC=C(C(F)(F)F)C=C1 VMVWLAPASRQXFL-QFWMQHCXSA-N 0.000 claims description 7
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 6
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 6
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 241000282985 Cervus Species 0.000 claims description 3
- BVLMNAGIBUYCDM-AHRSYUTCSA-N 2-[(2s,4r)-1-[(4r)-1,1,1-trifluoro-7-methyloctan-4-yl]-2-[4-(trifluoromethyl)phenyl]piperidin-4-yl]acetic acid Chemical compound CC(C)CC[C@H](CCC(F)(F)F)N1CC[C@@H](CC(O)=O)C[C@H]1C1=CC=C(C(F)(F)F)C=C1 BVLMNAGIBUYCDM-AHRSYUTCSA-N 0.000 claims description 2
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 claims description 2
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 claims description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 3
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 3
- 210000003780 hair follicle Anatomy 0.000 description 3
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 3
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 238000012299 DNA Microextraction Methods 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 231100000640 hair analysis Toxicity 0.000 description 1
- 238000009399 inbreeding Methods 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000036438 mutation frequency Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 1
- 239000012487 rinsing solution Substances 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000000276 sedentary effect Effects 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开一种用于川金丝猴个体示踪的微卫星检测方法、位点组合及引物组合、试剂盒与应用，克服利用现有方法无法实现川金丝猴个体示踪的难题。首先确定21对微卫星位点组合，核心重复序列为四碱基重复，重复序列重复次数在8次以上，产物在100‑300bp，根据21对微卫星位点组合合成相应微卫星位点引物；之后根据合成的相应微卫星引物组合及川金丝猴个体的基因组DNA，进行PCR扩增反应，获得扩增产物；最后利用毛细管电泳检测方法，检测扩增产物的微卫星多态性；分析检测结果，对比基因型，进行个体鉴定。精确度达到99.999％，具有快速、准确、简便和实现成本较低的优点。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种用于川金丝猴个体示踪的微卫星检测方法、位点组合及引物组合、试剂盒与应用。
背景技术
川金丝猴(Rhinopithecus roxellana)是中国特有的濒危物种，分布于中国的秦岭、岷山和神农架地区。由于气候变化、人口增加、农田开发等种种因素的巨大影响，造成了现在金丝猴栖息地大量破坏和片段化，分布区大大缩小，使其生存状况极度恶化，甚至导致许多地区金丝猴野生种群的灭绝。百年来川金丝猴野生种群快速消失，至此，金丝猴以秦岭分水岭为界，仅分布在秦岭南麓，和秦岭腹地。现今秦岭川金丝猴主要分布在周至、太白、洋县、佛坪、宁强、宁陕等6个县。目前受人类活动的影响，造成川金丝猴栖息地丧失与生境破碎化，各群体间已呈现出相互隔离的状态。由于孤立群间无法进行基因交流，可能导致遗传多样性的丧失和近亲交配，这将导致川金丝猴遗传多样性的丧失。因此研究这些种群的近交状态和群内近交程度是对该物种实施针对性保护的前提，了解川金丝猴现存种群的遗传历史与现状对保护策略的制定具有重要作用。同时，动物园内的繁殖种群也存在谱系不清，个体管理混乱问题。因此，我们需要通过遗传鉴定的方法，识别川金丝猴个体，为保护这些物种提供技术保障。
现有的微卫星标记技术，是一种遗传鉴定技术，可应用于个体示踪及种群关系研究，其微卫星DNA也称为短串联序列重复(short tandem repeat，STR) 或者简单序列重复(simple sequence repeat，SSR)，是一类简单的以核苷酸为基本单位的串联重复序列，微卫星DNA由核心序列和两侧的保守序列组成，其中侧翼序列将微卫星DNA特异的定位于染色体的某一区域，而核心序列的重复数则形成了微卫星DNA的多态性。通常核心序列重复单元长2-6碱基，如(CA) n、(GAG)n、(GACA)n，n为重复次数，为10-60次，由于重复次数不同使其呈现丰富的长度多态性。微卫星DNA多位于编码区附近，也可位于基因内的间隔区、外显子、内含子和调控区域，且分布均匀。微卫星在基因组中数目巨大，据估计，真核基因组中平均每6kb就存在一个微卫星序列。微卫星位点的多态性越高，标记位点数量越多，个体鉴定的准确性就越高。微卫星标记符合孟德尔遗传特征，世代传承，变异频率较慢，但是每个个体又有差异，因此是一种可靠的个体示踪的终身遗传标记。对于川金丝猴这类珍稀物种来说，其微卫星标记的开发和应用研究无疑显得更加迫切，更加必要，更加有意义。但是针对川金丝猴进行个体鉴定时，使用现有文献中提供的近源物种的微卫星位点扩增效果不佳，多态性不足，不能进行个体示踪。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于川金丝猴个体示踪的微卫星检测方法、位点组合及引物组合、试剂盒与应用，选择川金丝猴的21个微卫星位点组合，确定合成相应的引物组合，并进行检测；克服利用现有方法无法实现川金丝猴个体示踪的难题。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术解决方案如下：
一种适用于川金丝猴个体示踪的微卫星检测方法，其特殊之处在于，包括以下步骤：
步骤1、确定21对微卫星位点组合，核心重复序列为四碱基重复，重复序列重复次数在8次以上，产物在100-300bp，根据21对微卫星位点组合合成相应微卫星位点引物；
步骤2、提取川金丝猴个体的基因组DNA；
步骤3、利用步骤1合成的相应微卫星引物组合及步骤2提取的川金丝猴个体的基因组DNA，进行PCR扩增反应，获得扩增产物；
步骤4、利用毛细管电泳检测方法，检测扩增产物的微卫星多态性；
步骤5、分析检测结果，对比基因型，进行个体鉴定。
进一步地，所述步骤1中21对微卫星位点组合分别为：GSM-1至GSM-21；相应微卫星引物组合的序列如下：
进一步地，步骤2具体为：提取川金丝猴个体的基因组DNA提取的是抗凝血DNA、毛发DNA或粪便DNA。
进一步地，步骤3PCR反应体系按10μl计，具体为：
进一步地，21对微卫星位点引物组合PCR程序为：95℃变性，4min；94℃变性，1min；设置不同位点的退火温度，在该温度下复性45s；72℃延伸45s；循环35次；72℃延伸10min；4℃延伸；21对微卫星位点引物退火温度如下所示：
进一步地，步骤5通过Gene Mapper ID V3.2软件获取基因型数据，使用 Cervus3.0中的Identity analysis程序对所有分型个体进行个体鉴定。
本发明还提供一种用于川金丝猴个体示踪的微卫星位点组合及相应引物组合，其特殊之处在于：包括21对微卫星位点组合分别为：GSM-1至GSM-21；
相应微卫星引物组合的序列如下：
本发明还提供一种将上述川金丝猴微卫星位点组合及相应引物组合，应用于川金丝猴个体示踪。
本发明还提供一种用于川金丝猴个体示踪的微卫星试剂盒，其特殊之处在于：包括上述的用于川金丝猴个体示踪的微卫星位点引物组合。
本发明还提供一种将上述的川金丝猴个体示踪的微卫星试剂盒，应用于川金丝猴个体示踪。
本发明的有益效果是：
本发明提供的川金丝猴微卫星位点组合、引物组合、试剂盒及个体示踪应用，通过长期、大量的试验，筛选出了最能反映川金丝猴基因特点的21个微卫星位点，并给出了相应的引物组合、试剂盒，利用引物组合、试剂盒，通过对川金丝猴DNA进行PCR扩增，实现了川金丝猴的高精度个体示踪，精确度达到99.999％，具有快速、准确、简便和实现成本较低的优点。
附图说明
图1是实施例中对扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测的结果示意图；
图2是实施例中对扩增产物进行荧光毛细管电泳检测的结果示意图；
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书附图对本发明的具体实施方式做详细的说明，显然所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明的保护的范围。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
本实施例确定的川金丝猴的21个微卫星位点组合分别为：GSM-1至GSM-21；
相应微卫星引物组合的序列如下：
本实施例还可以将上述川金丝猴微卫星位点组合及引物组合，应用于川金丝猴个体示踪。
本实施例还提供一种用于川金丝猴个体示踪的微卫星试剂盒，该试剂盒包括上述的引物组合。
本实施例还可以将上述川金丝猴微卫星试剂盒，应用于川金丝猴个体示踪。
本实施例通过下述过程实现川金丝猴个体示踪的微卫星检测：
步骤1、DNA模板提取；
1)粪便DNA的提取
本实施例粪便DNA提取是采用QIAamp DNA Stool Kit(QIAGEN)试剂盒，DNA提取的方法参照试剂盒说明书，但根据实际情况，有所调整，具体操作如下：
(1)取大约200mg粪便表面样品入新2ml的离心管中；
(2)取1.6ml ASL裂解缓冲液入有粪便样品的离心管中，振荡均匀，使样本与裂解液充分接触，静置约2h，在静置的过程中，约10～20min振荡一次；
(3)以12,000rpm速度离心2min，取1.4ml上层无残渣的液体转移到新2ml离心管中；
(4)取一片吸附剂片(InhibitEX)，充分振荡，使吸附剂片溶解完全，使剂片与液体充分接触，室温静置1min；
(5)以12,000rpm速度离心l0min，将上层液体转移到新1.5ml的离心管中；
(6)以12,000rpm速度6min；
(7)取25μl蛋白酶K入新2ml的离心管中，将上一步离心管中的上清液移到含蛋白酶K的离心管中，再加入600μl AL缓冲液，充分振荡；
(8)将混匀的溶液放入70℃的水浴锅，温育10mins；
(9)取600μl无水乙醇加入温育好的溶液中，并充分振荡，混匀；
(10)取600μl步骤混合的溶液到QIAamp DNA吸附柱中，以12,000rpm速度离心1min；更换一个新离心管，弃离心液和旧离心管，继续离心完剩下的混合液；
(11)取500μlBufferAW1溶液到吸附柱中，以12,000rpm速度离心1min，弃离心液和旧离心管；再取300μlBufferAW1溶液到吸附柱中，以12,000rpm速度离心1min，弃离心液和旧离心管；
(12)取500μlBufferAW2溶液到吸附柱中，以12,000rpm速度离心1min，弃离心液和旧离心管；再取300μlBufferAW2溶液到吸附柱中，以12,000rpm速度离心1min，弃离心液和旧离心管；
(13)把吸附柱移到已编号的新1.5ml的离心管中，以12,000rpm速度离心2min，以去无水乙醇的余液；
(14)打开盖子，室温静置5～10mins，充分将无水乙醇挥发；
(15)取100μl温育2～5mins的Buffer AE入离心柱底部，静置2mins，以12,000rpm速度离心1min；
(16)重复步骤15，取100μl温育2～5mins的Buffer AE入离心柱底部，静置 2mins，以12,000rpm速度离心2min；并分装DNA，保存于-20℃冰箱备用。
2)毛囊DNA的提取
用TianGen公司的毛样DNA微量提取试剂盒(TIANamp Micro DNA Kit， China)提取毛发样品DNA。
(1)材料处理：含毛囊的头发：在1.5ml离心管里加入250μl缓冲液GA，20 μl蛋白酶K，20μl1 M DTT，混匀。从毛发根部毛囊处取1cm长的一段，与上述溶液涡旋混匀10sec。
(2)在56℃孵育至样本完全降解消化。需要时间至少60min，期间每隔20min 涡旋混匀：或置于水浴震荡仪中消化。简短离心以收集附着在管壁及管盖的液体。
(3)添加300μl缓冲液GB和1μl Carrier RNA储存夜，浓度为1μg/μl,充分混匀。
(4)56℃水浴10min，期间每3min涡旋混匀10sec。
(5)添加300μl无水乙醇，充分涡旋混匀。简短离心以去除管盖内壁的液滴。
(6)将上一步所得溶液和絮状沉淀分两次加入一个吸附柱CR2中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm(～13,400xg)离心30sec，弃废液，将吸附柱CR2 放回收集管中。
(7)向吸附柱CR2中加入500μl缓冲液GD，12,000rpm(～13,400xg)离心 30sec，弃废液，将吸附柱CR2放回收集管中。
(8)向吸附柱CR2中加入600μl漂洗液PW，12,000rpm(～13,400xg)离心 30sec，弃废液，将吸附柱CR2放回收集管中。
(9)重复操作步骤8。
(10)12,000rpm(～13,400xg)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CR2置于室温放置2-5民，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
(11)将吸附柱CR2转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20-50μl洗脱缓冲液TB，室温放置2-5min，12,000rpm(～13,400xg)离心2min，将溶液收集到离心管中。分装DNA，保存于-20℃冰箱备用。
步骤2、DNA质量检测；
所得DNA分别用核酸蛋白仪Nanodrop分光光度计和1.5％琼脂糖凝胶电泳检测浓度和质量。相同条件下的琼脂糖凝胶电泳结果中，DNA条带距离加样点越近，说明其片段越大；DNA条带亮度越高，说明其浓度越大。
步骤3、PCR扩增；
利用上述川金丝猴微卫星引物组合，或者上述川金丝猴微卫星试剂盒，和步骤1)所得DNA模板，进行PCR扩增反应，得到扩增产物；
其中扩增条件为：
其中进行的微卫星位点的PCR反应体系按10μl计，具体为：
21对微卫星位点引物组合PCR程序为：95℃变性，4min；94℃变性，1min；设置不同位点的退火温度，在该温度下复性45s；72℃延伸45s；循环35次；72℃延伸10min；4℃延伸；21对微卫星位点引物退火温度如下所示：
| 引物 | 退火温度(℃) | 引物 | 退火温度(℃) |
| GSM-1 | 54 | GSM-11 | 53 |
| GSM-2 | 56 | GSM-12 | 55 |
| GSM-3 | 54 | GSM-13 | 61 |
| GSM-4 | 53 | GSM-14 | 60 |
| GSM-5 | 55 | GSM-15 | 60 |
| GSM-6 | 61 | GSM-16 | 61 |
| GSM-7 | 60 | GSM-17 | 60 |
| GSM-8 | 61 | GSM-18 | 60 |
| GSM-9 | 52 | GSM-21 | 58 |
| GSM-10 | 58 | GSM-20 | 54 |
| GSM-21 | 61 |
步骤4、扩增产物检测；
对扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，得到条带单一、清晰且长度在相应碱基范围之内的电泳条带，如图1所示，表明21个所述引物对选择合理；
将扩增产物进行荧光毛细管电泳检测，检测结果如图2所示；
步骤5、数据分析；
(1)微卫星分型
使用Gene Mapper ID V3.2软件，判读毛细管电泳结果，获取扩增产物片段长度。由于选取的均为四碱基重复的位点，对大部分的情况，可以以4bp为单位进行舍入，而舍入前后相差超过1bp的等位基因，则需要人工检查峰图，修改错误的判读。为了防止基因分型错误，针对假纯合子和假等位基因，需对杂合子进行至少3次独立重复试验，对纯合子至少进行2次独立重复试验。
(2)个体示踪数据分析
个体示踪是通过对川金丝猴样本的遗传标记检验，判断前后两次或多次出现的样本是否属于同一个体的过程。DNA包含着每个个体所有的遗传信息，与生俱有，并终身保持不变，因此，每个个体的位点基因型应只有一种，检验到两个个体基因型一致时，那这两个个体为同一个体。
结果部分
使用软件Cervus 3.0和SHEsis计算每个位点的哈迪-温伯格平衡、连锁不平衡检验，以保证每个位点在个体示踪中都具有作用。通过Gene Mapper ID V3.2 软件获取基因型数据，使用Cervus 3.0中的Identity analysis程序对所有分型个体进行个体鉴定。本发明使用21个微卫星位点对应的引物对，对川金丝猴进行个体鉴定，针对大量川金丝猴个体样本的测试结果表明，采用本发明的21个微卫星位点的结合，排除概率(CPEI)高达99.999％。
使用本发明的微卫星引物组合或试剂盒时，应将测定的样本重复三次，以确定基因型的准确性。
<110> 西北大学
<120>用于川金丝猴个体示踪的微卫星检测方法、位点组合及引物组合、试剂盒与应用
<160>42
<210> 1
<211>22
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 1
CAGTGGACACTAAACACAATCC
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 2
TAGATTATCTAAATGGTGGATTTCC
<210> 3
<211>21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ACCATGATTTGTCAACTCCTA
<210> 4
<211>21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ACAATGAACATCCATATACCC
<210> 5
<211>24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
TCATGACAAAACAGAAATTAAGTG
<210> 6
<211>23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
AGTAAATGGAATTGCTTGTTACC
<210> 7
<211>20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ATCCCAACTCTTAAATGGGC
<210> 8
<211>20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
TTCCATGGCAGAAATTGTTT
<210>9
<211>20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>9
CAGGTTTTGCAATTGCTTTC
<210>10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>10
AACCATCTCCACCCACATAA
<210>11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>11
ATGTTGGTCAGGCTGACTATG
<210>12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>12
GATTCCACATTTATCCTCATTGAC
<210>13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>13
AGGCTGTGGTGAGCTATGAC
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>14
GTGTCCCTAGCACCTAGCAA
<210>15
<211>19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>15
GTCCAAGGAGACAGAGCCA
<210>16
<211>19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>16
ACTGTGCCTGACTTCTGCT
<210>17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>17
AAAGCTACATCCAAATTAGGTAGG
<210>18
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>18
TGACAAAGAAACTAAAATGTCCC
<210>19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>19
GCTGGAAACTGATAAGGGCT
<210>20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>20
GCCACCCTGGCTAAGTTACT
<210>21
<211> 24
<212> DNA
<213>人工序列
<400>21
GCAGTAAATGTCTATGAAACAAGG
<210>22
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>22
ATGATAGGTAGATGGATCAATTAGA
<210>23
<211>21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>23
TAAGTCAAACAAGCAAAGTGC
<210>24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>24
CCTCCTATTGCTTTTTCCAAA
<210>25
<211>20
<212> DNA
<213>人工序列
<400>25
GAGAACAGACCCCCAAATCT
<210> 26
<211>23
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 26
ATTCAGTTTTACTATGTGCATGC
<210>27
<211>20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>27
TTGTTGAGGGTCTTTCTCCA
<210>28
<211>24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>28
TCTTCTTATTTGGAAAAGTAACCC
<210>29
<211>20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>29
TTCAAGTGGTTGGGTTCACT
<210>30
<211>20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>30
TGGGTCTAGTCCAGTGGTGT
<210>31
<211>20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>31
TGTGAGCAGAGAGATGGACA
<210>32
<211>22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>32
ACAGTGAGTTTGATCTCTAGCA
<210>33
<211>20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>33
ACCACATGAGCCAATTCTGT
<210>34
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>34
ACCCAATTATGGTGTTGTTACC
<210>35
<211>20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>35
GAATGCAGGACTGTTTCTGG
<210>36
<211>25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>36
TATATTTCTTGGGAAAGATAGATGG
<210>37
<211>20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>37
CTCTCTTCATCCACCATTGG
<210> 38
<211>20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>38
GCTGTCAGAGACCTGTGTTG
<210> 39
<211>20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>39
GTGGGAAAATTGGCCTAAGT
<210> 40
<211>20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>40
CTTCTGAGCCTCACACCTCT
<210> 41
<211>20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>41
GCACAGAACAGGCACTTAGG
<210> 42
<211>18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>42
CCAAAATTGAACTCCTCA
Claims (10)
1.一种用于川金丝猴个体示踪的微卫星检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、确定21对微卫星位点组合，核心重复序列为四碱基重复，重复序列重复次数在8次以上，产物在100-300bp，根据21对微卫星位点组合合成相应微卫星位点引物；
步骤2、提取川金丝猴个体的基因组DNA；
步骤3、利用步骤1合成的相应微卫星引物组合及步骤2提取的川金丝猴个体的基因组DNA，进行PCR扩增反应，获得扩增产物；
步骤4、利用毛细管电泳检测方法，检测扩增产物的微卫星多态性；
步骤5、分析检测结果，对比基因型，进行个体鉴定。
2.根据权利要求1所述的用于川金丝猴个体示踪的微卫星检测方法，其特征在于，所述步骤1中21对微卫星位点组合分别为：GSM-1至GSM-21；
相应微卫星引物组合的序列如下：
3.根据权利要求1或2所述的用于川金丝猴个体示踪的微卫星检测方法，其特征在于，步骤2具体为：提取川金丝猴个体的基因组DNA提取的是抗凝血DNA、毛发DNA或粪便DNA。
4.根据权利要求3所述的用于川金丝猴个体示踪的微卫星检测方法，其特征在于，步骤3PCR反应体系按10μl计，具体为：
5.根据权利要求4所述的用于川金丝猴个体示踪的微卫星检测方法，其特征在于，21对微卫星位点引物组合PCR程序为：95℃变性，4min；94℃变性，1min；设置不同位点的退火温度，在该温度下复性45s；72℃延伸45s；循环35次；72℃延伸10min；4℃延伸；21对微卫星位点引物退火温度如下所示：
。
6.根据权利要求5所述的用于川金丝猴个体示踪的微卫星检测方法，其特征在于，步骤5通过Gene Mapper ID V3.2软件获取基因型数据，使用Cervus 3.0中的Identityanalysis程序对所有分型个体进行个体鉴定。
7.一种用于川金丝猴个体示踪的微卫星位点组合及引物组合，其特征在于：包括21对微卫星位点组合分别为：GSM-1至GSM-21；
相应微卫星引物组合的序列如下：
8.将权利要求7所述川金丝猴微卫星位点组合及引物组合，应用于川金丝猴个体示踪。
9.一种用于川金丝猴个体示踪的微卫星试剂盒，其特征在于：包括权利要求7所述的用于川金丝猴个体示踪的微卫星位点引物组合。
10.将权利要求9所述的川金丝猴个体示踪的微卫星试剂盒，应用于川金丝猴个体示踪。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210353821.8A CN114703294A (zh) | 2022-04-02 | 2022-04-02 | 用于川金丝猴个体示踪的微卫星检测方法、位点组合及引物组合、试剂盒与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210353821.8A CN114703294A (zh) | 2022-04-02 | 2022-04-02 | 用于川金丝猴个体示踪的微卫星检测方法、位点组合及引物组合、试剂盒与应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114703294A true CN114703294A (zh) | 2022-07-05 |
Family
ID=82172530
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210353821.8A Pending CN114703294A (zh) | 2022-04-02 | 2022-04-02 | 用于川金丝猴个体示踪的微卫星检测方法、位点组合及引物组合、试剂盒与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114703294A (zh) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110791573A (zh) * | 2019-12-05 | 2020-02-14 | 云南大学 | 适用于滇金丝猴个体鉴定的微卫星位点与引物 |
-
2022
- 2022-04-02 CN CN202210353821.8A patent/CN114703294A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110791573A (zh) * | 2019-12-05 | 2020-02-14 | 云南大学 | 适用于滇金丝猴个体鉴定的微卫星位点与引物 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 吴帆: ""秦岭川金丝猴交配体系研究"", 《中国硕士电子期刊》, no. 1, pages 1 - 64 * |
| 李宇立: ""秦岭地区川金丝猴的种群结构与历史动态及其全雄群在栖息地破碎化下促进群体之间基因流机制的研究"", 《中国博士电子期刊》, no. 3, pages 1 - 77 * |
| 石智慧: ""秦岭川金丝猴繁殖群内雄性等级及繁殖成功的关系研究"", 《中国硕士电子期刊》, no. 2, pages 1 - 61 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN112251518B (zh) | 山羊rsad2基因中与产羔数、生长性状关联的分子标记及其应用 | |
| EP3354749A1 (en) | Method and kit for dna typing of hla gene | |
| JP6798697B2 (ja) | Ｈｌａ遺伝子のｐｃｒプライマーセット及びそれを用いたシークエンス法 | |
| CN109234442B (zh) | 一种与绵羊多羔性状相关的snp分子标记及其检测试剂盒和应用 | |
| CN107354211B (zh) | 林麝四碱基微卫星遗传标记位点及其筛选方法 | |
| CN114657261B (zh) | 一种与绵羊胸椎数相关的snp分子标记、引物组、试剂盒及检测方法和应用 | |
| CN113913530B (zh) | 一种与绵羊体高相关的分子标记及其应用 | |
| CN108060237B (zh) | 基于55个y染色体snp遗传标记的法医学复合检测试剂盒 | |
| CN107586857B (zh) | 用于快速鉴定猪的红黑毛色基因的核酸、试剂盒及方法 | |
| CN112481392A (zh) | 一种与绵羊多羔相关的snp分子标记及其应用 | |
| CN115141889A (zh) | 与中国南方荷斯坦奶牛产奶性状相关的snp标记及其应用 | |
| CN106755371B (zh) | 利用pcr-rflp检测绵羊pcnp基因单核苷酸多态性的方法及其应用 | |
| CN110564861A (zh) | 人类Y染色体STR基因座和InDel位点的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用 | |
| CN109207611A (zh) | 一种与绵羊发情性状相关的snp分子标记及其检测试剂盒和应用 | |
| CN114350818B (zh) | 与番鸭产蛋性状相关的催乳素基因snp分子标记及其应用 | |
| CN108315435B (zh) | 与绵羊产羔数性状相关的snp分子标记及应用 | |
| CN114703294A (zh) | 用于川金丝猴个体示踪的微卫星检测方法、位点组合及引物组合、试剂盒与应用 | |
| CN100503839C (zh) | 一种检测牛cvm有害基因的方法 | |
| CN107586856A (zh) | 一种基于snp位点的川金丝猴亲子鉴定和个体识别方法 | |
| CN107354203B (zh) | 用于鉴定烤烟毕纳1号的引物组合及试剂盒、应用及检测方法 | |
| CN108642190B (zh) | 基于14个常染色体snp遗传标记的法医学复合检测试剂盒 | |
| CN107354205B (zh) | 用于鉴定烤烟中烟100的引物组合及试剂盒、应用及检测方法 | |
| CN107354206B (zh) | 用于鉴定烤烟南江3号的引物组合及试剂盒、应用及检测方法 | |
| CN107858448B (zh) | 用于鉴定桃花粉育性性状的单核苷酸多态性标记位点、引物对、试剂盒及应用 | |
| CN107354201B (zh) | 用于鉴定烤烟云烟97的引物组合及试剂盒、应用及检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20220705 |